2024年5月20日发(作者：圣芫)
稳定表达人BACE1启动子及荧光素酶报告基因HEK293细
胞株的建立
邓常青;朱炳林;龙艳;罗伟;陈国俊
【摘 要】目的 对人β位点裂解酶-1(BACE1)基因核心启动子进行克隆,构建携带
BACEI基因启动子的荧光素酶报告载体,筛选稳定表达细胞株并分析其转录活性.方
法 提取人胚肾HEK293细胞基因组DNA,以其为模板,PCR扩增BACE1核心启动
子(-691～+67)并克隆至荧光素酶报告载体pGL4.21中,构建BACE1基因启动子
荧光素酶报告载体pGL4.21-BACE1,将其转染HEK293细胞(无启动子的pGL4.21
载体作阴性对照),利用嘌呤霉素筛选稳定表达株后检测其转录活性.结果 成功扩增
到758 bp的BACE1核心启动子,pGL4.21-BACE1载体经双酶切鉴定正
确;HEK293细胞被该载体转染后经嘌呤霉素筛选得到6株稳定表达BACE1启动子
的细胞株,其转录活性分别是对照组(HEK293/pGL4.21)的(134.7±22.3)、
(634.0±13.9)、(437.6±6.1)、(805.5±5.5)、(492.8±59.1)、(1 021.1±46.6)倍
(P=0.001).结论 成功构建了人BACE1基因启动子荧光素酶报告载体.
【期刊名称】《重庆医学》
【年(卷),期】2017(046)003
【总页数】3页(P302-304)
【关键词】β位点裂解酶-1;核心启动子;荧光素酶报告载体;高通量药物筛选
【作 者】邓常青;朱炳林;龙艳;罗伟;陈国俊
【作者单位】重庆医科大学附属第一医院神经病学重点实验室,重庆400016;重钢
总医院重症医学科,重庆400037;重庆医科大学附属第一医院神经病学重点实验室,
重庆400016;重庆医科大学附属第一医院神经病学重点实验室,重庆400016;重庆
医科大学附属第一医院神经病学重点实验室,重庆400016;重庆医科大学附属第一
医院神经病学重点实验室,重庆400016
【正文语种】中 文
【中图分类】Q291
阿尔茨海默病(Alzheimer′s disease,AD)是一种神经退行疾病，近年来其发病率不
断增高。现有许多证据支持淀粉样蛋白(amyloid beta,Aβ)的沉积是AD主要致病
机制之一[1]。因此，减少Aβ沉积成为治疗AD的一条重要途径。β位点裂解酶-
1(BACE1)是体内主要的β-分泌酶，是裂解淀粉样前体蛋白(APP)产生Aβ的限速
酶。Aβ具有神经毒性，可引起神经突触功能障碍、神经元丢失，进而导致认知功
能受损[2]。研究表明，在小鼠脑内注射BACE1的小干扰RNA可减轻APP转基因
小鼠的Aβ沉积和提高认知功能[3-6]，这说明抑制BACE1表达会改善Aβ相关的
认知功能障碍，因此β-分泌酶BACE1被作为开发AD药物的潜在靶点。
目前，BACE1基因单核苷酸多态性与AD发病是否相互作用尚未定论[7-8]，而针
对BACE1分子的靶向治疗有望为治疗AD提供新思路，但对于BACE1分子的上
游调控机制仍不清楚。为此本试验通过克隆人BACE1基因核心启动子区，构建荧
光素酶报告系统并筛选其稳定表达细胞株，为进一步研究BACE1基因转录调控、
多态性分析及其高通量药物筛选提供有力工具。
1.1 材料 人胚肾HEK293细胞为本实验室保存；Phanta HS高保真DNA聚合酶
购自Vazyme公司；限制性内切酶、T4 DNA连接酶购自NEB公司；无内毒素质
粒抽提试剂盒、胶回收试剂盒、荧光素酶报告质粒pGL4.21、荧光素酶检测试剂
购自Promega公司；TRIzol、脂质体2000购自Invitrogen公司；DMEM培养
基、Opti-MEM培养基、胎牛血清购自Gibco公司；嘌呤霉素、二甲基亚砜
(DMSO)购自Sigma公司；感受态细胞DH5α购自北京鼎国公司；引物由上海英
骏生物技术有限公司合成。其余试剂为进口分析纯。
1.2 方法
1.2.1 人基因组模板的制备 取对数生长期的HEK293细胞，采用TRIzol法[9]提取
基因组DNA，置于-20 ℃保存备用。
1.2.2 人BACE1基因启动子的扩增 以基因组DNA为模板，采用 Phanta HS高保
真DNA聚合酶以特异性引物扩增BACE1基因上游约758 bp的核心启动子(-
691～+67)区，上游引物：5′-CTA GCT AGC CAG CCA TTT CTC CTC AGT
CTG-3′，下游引物：5′-CCG CTC CTC GAG TCA GGC CAC CAT AAT CCA
GCT-3′，下划线分别为NheI和XhoI酶切位点。PCR反应体系为：10×PCR缓
冲液3.0 μL，dNTPs 1.0 μL，上下游引物各0.5 μL (10 μmol/L)，Phanta HS酶
0.5 μL，基因组DNA 3.0 μL，加ddH2O补至30.0 μL。反应条件：95 ℃预变性
3 min；95 ℃变性30 s，56 ℃退火60 s，72 ℃延伸30 s，共30个循环；72 ℃
延伸7 min，PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳鉴定。
1.2.3 BACE1基因启动子荧光素酶报告载体的构建 PCR产物和pGL4.21载体经
NheI和XhoI双酶切后，在T4 DNA连接酶作用下16 ℃连接过夜并转化入
DH5α感受态细胞，挑取2个氨苄青霉素筛选的阳性克隆。再经NheI和XhoI双
酶切鉴定后送上海英骏公司测序，测序正确的命名为pGL4.21-BACE1，提取质粒
后-20 ℃保存备用。
1.2.4 细胞培养及稳定表达株的筛选 HEK293细胞培养于含有10%胎牛血清，100
U/mL青霉素和 100 μg/mL链霉素的 DMEM培养基，置于37 ℃、5%CO2的培
养箱中培养。将汇合度约80%的HEK293细胞以4×105接种6孔板，待细胞贴
壁生长至约70%～80%汇合度时进行转染。用Opti-MEM培养基分别稀释载体
pGL4.21-BACE1(每孔5 μg)和脂质体(每孔5 μL)(单独转染pGL4.21作为阴性对
照组)，室温孵育5 min，载体和脂质体混合后室温孵育20 min，加入HEK293
细胞中，37 ℃、5%CO2的培养箱中培养。转染后48 h采用1 μg/mL浓度的嘌
呤霉素筛选，筛选第14天时采用96孔板有限稀释法克隆化，待单细胞长满后转
至24孔板继续培养，然后依次转至12孔板、6孔板及10 cm培养皿继续扩大培
养(此过程2～3个月)。得到来自6株单克隆扩大培养的稳定表达细胞株，用化学
发光仪检测其转录活性。选取荧光强度最高的进行后续试验并命名为
HEK293/pGL4.21-BACE1(阴性对照组命名为HEK293/pGL4.21)。
1.2.5 荧光素酶活性测定 荧光素酶活性测定按照荧光素酶活性检测试剂盒说明书进
行操作。简单来说，将HEK293/pGL4.21-BACE1和HEK293/pGL4.21(阴性对照
组)细胞以2×104接种96孔板(各3个重复孔)，培养24 h后每孔加与培养基等体
积的Luciferase Reagent，轻轻混匀。室温裂解10 min后在化学发光仪Glomax
96(Promega)中测量萤火虫荧光素酶活性。
1.3 统计学处理 采用SAS14.0的统计软件进行统计分析，计量资料用表示，采用
Excel student′s t检验分析，检验水准α=0.05，以P<0.05为差异有统计学意义。
2.1 BACE1基因启动子扩增产物的鉴定 提取HEK293细胞基因组DNA，以其为
模板进行PCR扩增BACE1基因上游长度758 bp的核心启动子(-691～+67)，
PCR产物经1%琼脂糖电泳可见大小约758 bp的条带，与目的片段大小相符，见
图1。
2.2 荧光素酶报告载体pGL4.21-BACE1的构建与鉴定 758 bp的PCR产物与携带
萤火虫荧光素酶基因的pGL4.21分别以NheI和XhoI双酶切，连接并转化DH5α
后挑取2个阳性克隆子。经NheI和XhoI双酶切后可见大小约5 532
bp(pGL4.21)与758 bp(BACE1启动子)的2个片段出现(图2A)。测序验证也正确，
这说明本研究成功构建携带BACE1启动子的荧光素酶报告载体，见图2B。
2.3 构建稳定表达BACE1启动子的细胞系 pGL4.21-BACE1和阴性对照pGL4.21
转染HEK293细胞(6孔板)后48 h，培养基中加入嘌呤霉素进行稳定筛选。培养
第14天时采用有限稀释法克隆化，最后筛选得到6株单克隆稳定表达细胞株
HEK293/pGL4.21-BACE1(克隆子1～6)。
2.4 稳定表达细胞株具有转录活性 本研究对筛选到的6株稳定表达细胞株进行荧
光素酶活性检测(把阴性对照组HEK293/pGL4.21的荧光值看作1)。结果表明，
克隆子1～6均具有较强的荧光活性，其荧光值分别为对照组(HEK293/pGL4.21)
的(134.7±22.3)、(634.0±13.9)、(437.6±6.1)、(805.5±5.5)、(492.8±59.1)、(1
021.1±46.6)倍(P=0.001)。其中，6号克隆子荧光活性最强，作为后续试验使用。
BACE1是人体内唯一的β分泌酶，它能剪切APP生成Aβ，且在AD患者脑中，
Aβ是淀粉样炎症斑的主要组成成分，Aβ沉积在AD的发生、发展中起着关键作
用。抑制BACE1活性以降低Aβ生成成为治疗AD的靶点。目前对AD治疗的研
究均致力于开发β-和γ-分泌酶抑制剂，以抑制Aβ的产生[10-13]，但是APP还
可以被α-和γ-分泌酶裂解产生可溶性且具有神经营养和神经保护作用的sAPPα
片段。所以非特异性地抑制γ-分泌酶会导致生理功能紊乱[14]。有报道称在AD
发病过程中，Aβ随着BACE1的上调而增多，并与AD发病呈正相关[15]；用
BACE1 siRNA处理神经干细胞后Aβ产生明显减少[6]。BACE1过表达或活性增
强可能导致Aβ过度产生，最终诱导认知功能损伤。因此，针对BACE1的靶向治
疗可能成为治疗AD的一种新途径[10-12]。因此，构建携带BACE1基因的荧光
素酶报告载体来研究BACE1基因的调控和功能具有重要意义。
利用荧光素酶报告载体研究启动子对下游基因的调控，可以避免下游基因表达产物
对启动子的干扰，能较好地反映外在因素对调控序列的影响。近年来，利用荧光素
酶报告基因载体的药物筛选方法得到广泛应用。本试验通过克隆人BACE1基因核
心启动子，构建萤火虫荧光素酶报告载体pGL4.21-BACE1，并成功筛选到6株稳
定表达该启动子的HEK293细胞株。本研究构建的HEK293/pGL4.21-BACE1细
胞株具有较强的转录活性，虽然比瞬时转染时的转录活性低1～2个数量级，但是
稳定表达更利于药物的高通量筛选，减少了组间差异。
综上所述，本试验成功构建BACE1启动子驱动的荧光素酶报告载体，并筛选到了
稳定表达细胞株，将为高通量药物筛选及进一步研究BACE1基因的转录调控提供
重要的细胞学研究手段。
【相关文献】
[1]Goldeck D,Witkowski JM,Fülop T,et eral immune signatures in Alzheimer
disease[J].Curr Alzheimer Res,2016,13(7):739-749.
[2]Kim DH,Yeo SH,Park JM,et c markers for diagnosis and pathogenesis of
Alzheimer′s disease[J].Gene,2014,45(2):185-193.
[3]Laird FM,Cai H,Savonenko AV,et 1,a major determinant of selective vulnerability
of the brain to amyloid-beta amyloidogenesis,is essential for cognitive,emotional,and
synaptic functions[J].J Neurosci,2005,25(50):11693-11709.
[4]Singer O,Marr RA,Rockenstein E,et ing BACE1 with siRNAs ameliorates
Alzheimer disease neuropathology in a transgenic model[J].Nat Neurosci,2005,8(10):1343-
1349.
[5]Kandalepas PC,Vassar normal and pathologic roles of the Alzheimer′s β-
secretase,BACE1[J].Curr Alzheimer Res,2014,11(5):441-449.
[6]Liu Z,Li S,Liang Z,et ing β-secretase with RNAi in neural stem cells for
Alzheimer′s disease therapy[J].Neural Regen Res,2013,8(33):3095-3106.
[7]Zhou W,Cai F,Li Y,et 1 gene promoter single-nucleotide polymorphisms in
Alzheimer′s disease[J].J Mol Neurosci,2010,42(1):127-133.
[8]Wang S,Jia er polymorphisms which modulate BACE1 expression are
associated with sporadic Alzheimer′s disease[J].Am J Med Genet B Neuropsychiatr
Genet,2010,53(1):159-166.
[9]杨宇虹，梁东春，郭刚，等.改进TRIZOL法提取基因组DNA[J].医学分子生物学杂志，2006，
3(2):105-107.
[10]Ohno mer′s therapy targeting the β-secretase enzyme BACE1:benefits and
potential limitations from the perspective of animal model studies[J].Brain Res
Bull,2016:126(2):183-198.
[11]Yan ng closer to treating Alzheimer′s disease patients with BACE1 inhibitor
drugs[J].Transl Neurodegener,2016(5):13-15.
[12]Yan R,Vassar ing the β-secretase BACE1 for Alzheimer′s disease
therapy[J].Lancet Neurol,2014,13(3):319-329.
[13]Neumann U,Rueeger H,Machauer R,et al.A novel BACE inhibitor NB-360 shows a
superior pharmacological profile and robust reduction of amyloid-β and
neuroinflammation in APP transgenic mice[J].Mol Neurodegener,2015(10):44-47.
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secretases in Alzheimer disease and beyond[J].Annu Rev Pharmacol Toxicol,2014(55):419-
437.
[15]Li R,Lindholm K,Yang LB,et d beta peptide load is correlated with increased
beta-secretase activity in sporadic Alzheimer′s disease patients[J].Proc Natl Acad Sci
USA,2004,101(10):3632-3637.
2024年5月20日发(作者：圣芫)
稳定表达人BACE1启动子及荧光素酶报告基因HEK293细
胞株的建立
邓常青;朱炳林;龙艳;罗伟;陈国俊
【摘 要】目的 对人β位点裂解酶-1(BACE1)基因核心启动子进行克隆,构建携带
BACEI基因启动子的荧光素酶报告载体,筛选稳定表达细胞株并分析其转录活性.方
法 提取人胚肾HEK293细胞基因组DNA,以其为模板,PCR扩增BACE1核心启动
子(-691～+67)并克隆至荧光素酶报告载体pGL4.21中,构建BACE1基因启动子
荧光素酶报告载体pGL4.21-BACE1,将其转染HEK293细胞(无启动子的pGL4.21
载体作阴性对照),利用嘌呤霉素筛选稳定表达株后检测其转录活性.结果 成功扩增
到758 bp的BACE1核心启动子,pGL4.21-BACE1载体经双酶切鉴定正
确;HEK293细胞被该载体转染后经嘌呤霉素筛选得到6株稳定表达BACE1启动子
的细胞株,其转录活性分别是对照组(HEK293/pGL4.21)的(134.7±22.3)、
(634.0±13.9)、(437.6±6.1)、(805.5±5.5)、(492.8±59.1)、(1 021.1±46.6)倍
(P=0.001).结论 成功构建了人BACE1基因启动子荧光素酶报告载体.
【期刊名称】《重庆医学》
【年(卷),期】2017(046)003
【总页数】3页(P302-304)
【关键词】β位点裂解酶-1;核心启动子;荧光素酶报告载体;高通量药物筛选
【作 者】邓常青;朱炳林;龙艳;罗伟;陈国俊
【作者单位】重庆医科大学附属第一医院神经病学重点实验室,重庆400016;重钢
总医院重症医学科,重庆400037;重庆医科大学附属第一医院神经病学重点实验室,
重庆400016;重庆医科大学附属第一医院神经病学重点实验室,重庆400016;重庆
医科大学附属第一医院神经病学重点实验室,重庆400016;重庆医科大学附属第一
医院神经病学重点实验室,重庆400016
【正文语种】中 文
【中图分类】Q291
阿尔茨海默病(Alzheimer′s disease,AD)是一种神经退行疾病，近年来其发病率不
断增高。现有许多证据支持淀粉样蛋白(amyloid beta,Aβ)的沉积是AD主要致病
机制之一[1]。因此，减少Aβ沉积成为治疗AD的一条重要途径。β位点裂解酶-
1(BACE1)是体内主要的β-分泌酶，是裂解淀粉样前体蛋白(APP)产生Aβ的限速
酶。Aβ具有神经毒性，可引起神经突触功能障碍、神经元丢失，进而导致认知功
能受损[2]。研究表明，在小鼠脑内注射BACE1的小干扰RNA可减轻APP转基因
小鼠的Aβ沉积和提高认知功能[3-6]，这说明抑制BACE1表达会改善Aβ相关的
认知功能障碍，因此β-分泌酶BACE1被作为开发AD药物的潜在靶点。
目前，BACE1基因单核苷酸多态性与AD发病是否相互作用尚未定论[7-8]，而针
对BACE1分子的靶向治疗有望为治疗AD提供新思路，但对于BACE1分子的上
游调控机制仍不清楚。为此本试验通过克隆人BACE1基因核心启动子区，构建荧
光素酶报告系统并筛选其稳定表达细胞株，为进一步研究BACE1基因转录调控、
多态性分析及其高通量药物筛选提供有力工具。
1.1 材料 人胚肾HEK293细胞为本实验室保存；Phanta HS高保真DNA聚合酶
购自Vazyme公司；限制性内切酶、T4 DNA连接酶购自NEB公司；无内毒素质
粒抽提试剂盒、胶回收试剂盒、荧光素酶报告质粒pGL4.21、荧光素酶检测试剂
购自Promega公司；TRIzol、脂质体2000购自Invitrogen公司；DMEM培养
基、Opti-MEM培养基、胎牛血清购自Gibco公司；嘌呤霉素、二甲基亚砜
(DMSO)购自Sigma公司；感受态细胞DH5α购自北京鼎国公司；引物由上海英
骏生物技术有限公司合成。其余试剂为进口分析纯。
1.2 方法
1.2.1 人基因组模板的制备 取对数生长期的HEK293细胞，采用TRIzol法[9]提取
基因组DNA，置于-20 ℃保存备用。
1.2.2 人BACE1基因启动子的扩增 以基因组DNA为模板，采用 Phanta HS高保
真DNA聚合酶以特异性引物扩增BACE1基因上游约758 bp的核心启动子(-
691～+67)区，上游引物：5′-CTA GCT AGC CAG CCA TTT CTC CTC AGT
CTG-3′，下游引物：5′-CCG CTC CTC GAG TCA GGC CAC CAT AAT CCA
GCT-3′，下划线分别为NheI和XhoI酶切位点。PCR反应体系为：10×PCR缓
冲液3.0 μL，dNTPs 1.0 μL，上下游引物各0.5 μL (10 μmol/L)，Phanta HS酶
0.5 μL，基因组DNA 3.0 μL，加ddH2O补至30.0 μL。反应条件：95 ℃预变性
3 min；95 ℃变性30 s，56 ℃退火60 s，72 ℃延伸30 s，共30个循环；72 ℃
延伸7 min，PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳鉴定。
1.2.3 BACE1基因启动子荧光素酶报告载体的构建 PCR产物和pGL4.21载体经
NheI和XhoI双酶切后，在T4 DNA连接酶作用下16 ℃连接过夜并转化入
DH5α感受态细胞，挑取2个氨苄青霉素筛选的阳性克隆。再经NheI和XhoI双
酶切鉴定后送上海英骏公司测序，测序正确的命名为pGL4.21-BACE1，提取质粒
后-20 ℃保存备用。
1.2.4 细胞培养及稳定表达株的筛选 HEK293细胞培养于含有10%胎牛血清，100
U/mL青霉素和 100 μg/mL链霉素的 DMEM培养基，置于37 ℃、5%CO2的培
养箱中培养。将汇合度约80%的HEK293细胞以4×105接种6孔板，待细胞贴
壁生长至约70%～80%汇合度时进行转染。用Opti-MEM培养基分别稀释载体
pGL4.21-BACE1(每孔5 μg)和脂质体(每孔5 μL)(单独转染pGL4.21作为阴性对
照组)，室温孵育5 min，载体和脂质体混合后室温孵育20 min，加入HEK293
细胞中，37 ℃、5%CO2的培养箱中培养。转染后48 h采用1 μg/mL浓度的嘌
呤霉素筛选，筛选第14天时采用96孔板有限稀释法克隆化，待单细胞长满后转
至24孔板继续培养，然后依次转至12孔板、6孔板及10 cm培养皿继续扩大培
养(此过程2～3个月)。得到来自6株单克隆扩大培养的稳定表达细胞株，用化学
发光仪检测其转录活性。选取荧光强度最高的进行后续试验并命名为
HEK293/pGL4.21-BACE1(阴性对照组命名为HEK293/pGL4.21)。
1.2.5 荧光素酶活性测定 荧光素酶活性测定按照荧光素酶活性检测试剂盒说明书进
行操作。简单来说，将HEK293/pGL4.21-BACE1和HEK293/pGL4.21(阴性对照
组)细胞以2×104接种96孔板(各3个重复孔)，培养24 h后每孔加与培养基等体
积的Luciferase Reagent，轻轻混匀。室温裂解10 min后在化学发光仪Glomax
96(Promega)中测量萤火虫荧光素酶活性。
1.3 统计学处理 采用SAS14.0的统计软件进行统计分析，计量资料用表示，采用
Excel student′s t检验分析，检验水准α=0.05，以P<0.05为差异有统计学意义。
2.1 BACE1基因启动子扩增产物的鉴定 提取HEK293细胞基因组DNA，以其为
模板进行PCR扩增BACE1基因上游长度758 bp的核心启动子(-691～+67)，
PCR产物经1%琼脂糖电泳可见大小约758 bp的条带，与目的片段大小相符，见
图1。
2.2 荧光素酶报告载体pGL4.21-BACE1的构建与鉴定 758 bp的PCR产物与携带
萤火虫荧光素酶基因的pGL4.21分别以NheI和XhoI双酶切，连接并转化DH5α
后挑取2个阳性克隆子。经NheI和XhoI双酶切后可见大小约5 532
bp(pGL4.21)与758 bp(BACE1启动子)的2个片段出现(图2A)。测序验证也正确，
这说明本研究成功构建携带BACE1启动子的荧光素酶报告载体，见图2B。
2.3 构建稳定表达BACE1启动子的细胞系 pGL4.21-BACE1和阴性对照pGL4.21
转染HEK293细胞(6孔板)后48 h，培养基中加入嘌呤霉素进行稳定筛选。培养
第14天时采用有限稀释法克隆化，最后筛选得到6株单克隆稳定表达细胞株
HEK293/pGL4.21-BACE1(克隆子1～6)。
2.4 稳定表达细胞株具有转录活性 本研究对筛选到的6株稳定表达细胞株进行荧
光素酶活性检测(把阴性对照组HEK293/pGL4.21的荧光值看作1)。结果表明，
克隆子1～6均具有较强的荧光活性，其荧光值分别为对照组(HEK293/pGL4.21)
的(134.7±22.3)、(634.0±13.9)、(437.6±6.1)、(805.5±5.5)、(492.8±59.1)、(1
021.1±46.6)倍(P=0.001)。其中，6号克隆子荧光活性最强，作为后续试验使用。
BACE1是人体内唯一的β分泌酶，它能剪切APP生成Aβ，且在AD患者脑中，
Aβ是淀粉样炎症斑的主要组成成分，Aβ沉积在AD的发生、发展中起着关键作
用。抑制BACE1活性以降低Aβ生成成为治疗AD的靶点。目前对AD治疗的研
究均致力于开发β-和γ-分泌酶抑制剂，以抑制Aβ的产生[10-13]，但是APP还
可以被α-和γ-分泌酶裂解产生可溶性且具有神经营养和神经保护作用的sAPPα
片段。所以非特异性地抑制γ-分泌酶会导致生理功能紊乱[14]。有报道称在AD
发病过程中，Aβ随着BACE1的上调而增多，并与AD发病呈正相关[15]；用
BACE1 siRNA处理神经干细胞后Aβ产生明显减少[6]。BACE1过表达或活性增
强可能导致Aβ过度产生，最终诱导认知功能损伤。因此，针对BACE1的靶向治
疗可能成为治疗AD的一种新途径[10-12]。因此，构建携带BACE1基因的荧光
素酶报告载体来研究BACE1基因的调控和功能具有重要意义。
利用荧光素酶报告载体研究启动子对下游基因的调控，可以避免下游基因表达产物
对启动子的干扰，能较好地反映外在因素对调控序列的影响。近年来，利用荧光素
酶报告基因载体的药物筛选方法得到广泛应用。本试验通过克隆人BACE1基因核
心启动子，构建萤火虫荧光素酶报告载体pGL4.21-BACE1，并成功筛选到6株稳
定表达该启动子的HEK293细胞株。本研究构建的HEK293/pGL4.21-BACE1细
胞株具有较强的转录活性，虽然比瞬时转染时的转录活性低1～2个数量级，但是
稳定表达更利于药物的高通量筛选，减少了组间差异。
综上所述，本试验成功构建BACE1启动子驱动的荧光素酶报告载体，并筛选到了
稳定表达细胞株，将为高通量药物筛选及进一步研究BACE1基因的转录调控提供
重要的细胞学研究手段。
【相关文献】
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