2024年6月12日发(作者：似城)
第60卷第5期
2021年3月
余海军，王
湖北农业科学
湖
Hubei
北
Agricultural
农业
Sciences
科学
Vol.60No.5
2021年
Mar.，2021
茜.探讨DNA条形码对摇蚊属物种界定的有效性［J］.湖北农业科学，2021，60（5）：144-148．
探讨DNA条形码对摇蚊属物种界定的有效性
余海军，王茜
300384）（天津农学院水产学院/天津市水生生态及养殖重点实验室，天津
摘要：以摇蚊属的12种物种为研究对象，结合BarcodeofLifeDatabase（BOID）和Genbank数据库下载的
条形码数据，采用AutomaticBarcodeGapDiscovery（ABGD）和邻接法（Neighborjoining，NJ）对所获取的
749条DNA条形码进行分析，探究DNA条形码在摇蚊属物种界定的有效性。结果表明，基于ABGD的分
析，显示物种遗传距离之间存在空白区；通过分析邻接树，得到60个分子分类操作单元，与形态学鉴定
结果一致，并将数据库中11修正为Chironomuspseudothummi。研究在一定程度上补充
了中国摇蚊科DNA条形码研究，也为摇蚊科DNA条形码数据库的构建和完善提供了数据支持。
关键词：摇蚊属；DNA条形码；物种界定
中国分类号：Q969.44；Q523文献标识码：A
开放科学（资源服务）标识码（OSID）：
文章编号：0439-8114（2021）05-0144-05
DOI:10.14088/0439-8114.2021.05.028
ExploringtheutilityofDNAbarcodinginspeciesidentificationofChironomus
YUHai-jun，WANGQian
（CollegeofFishery，TianjinAgriculturalUniversityKeyLaboratoryofAquatic-EcologyandAquacultureofTianjin，Tianjin300384，China）
Abstract：Theresearchanalyzed749DNAbarcodescollectedthe12speciesofChironomusspeciesanddownloadedbarcodesin
BOLDandGenbankdatabasebyABGD（AutomaticBarcodeGapDiscovery）andNJ（Neighbor-joining）.TheresultshowedthatAB⁃
GDanalysedgeneticdistance，existed“DNAbarcodegap”.TheNJtreesupported60molecularoperationaltaxonomicunits，and
tion，basedonthedataarefound，11frompubliclibrary
andprovidedatasupportforestablishingandperfectingtheChineseDNAbarcodesdatabaseofChironominae.
Keywords：Chironomus；DNAbarcoding；speciesidentification
ultisanimportantsupplementfortheChineseDNAbarcodesstudyofChironominae，
摇蚊属（Chironomus）隶属于双翅目摇蚊亚科
（Diptera：Chironomidae），该属由德国昆虫学家Mei⁃
gen于1803年建立，迄今为止全世界已记录种类达
303种；摇蚊属的幼虫可以生存于各种水体（尚未污
ronomus）在缺乏营养的水体中较为丰富，并且能耐
受酸性环境，另一些摇蚊亚属喜欢生长在盐分较高
的环境中，对重金属污染具有耐受性
［1］
。摇蚊属部
分种类雄成虫能引起人类过敏性疾病；裸露在外和
正在产卵的摇蚊属种类可以成为新鲜水体中鱼类
（鳟鱼）的主要食物来源；在日常生活中，某些垂钓者
收稿日期：2020-06-29
基金项目：国家自然科学基金项目（NSFC31672264）
所用诱饵也为摇蚊属幼虫
［2］
。
摇蚊属是摇蚊科最古老的属之一，由于种种历
史原因，该属的研究在世界上一直存在很大的争议，
属内物种的分类地位至今没有获得广泛的认可。依
据中国摇蚊名录中统计，中国已有该属种类共23种，
其中只有13种具有明确记录，另包括3种可疑种和7
种只进行鉴定而没有正式发表的
［3］
。因此，摇蚊属的
物种界定一直存在争议
［3］
。随着DNA条形码的提
出，其通过将基因组的标准部分提取一个或几个相
5］
对较短的基因序列，用于识别物种
［4，
；虽然使用DNA
染至严重污染的水体），其中宽叶摇蚊亚属（Lobochi⁃
序列识别生物并不新颖
［6］
，但DNA条形码能快速且
作者简介：余海军（1994-），男，贵州雷山人，在读硕士研究生，研究方向为分子系统学，（电话）183****0463（电子信箱）yhj@163.
com；通信作者，王
****************。
茜（1971-），女，副教授，博士，主要从事水生动物及昆虫分子系统学的研究，（电话）136****4584（电子信箱）
第5期
余海军等：探讨DNA条形码对摇蚊属物种界定的有效性
145
可靠地识别所有生命形式的物种层次，包括动物、植
物、真菌、微生物；其在论证物种群落组成、食物链和
种内遗传变异方面也有所研究
［7-9］
；同时也扮演着生
物安全和淡水生态监测中一个不可缺少的角色
［10-13］
。
Lin等
［14］
使用DNA条形码对长跗摇蚊属（Tanytarsus）
121
DNA
个形态种进行物种鉴定有效性分析，
究分类的长跗摇蚊属物种；
条形码明确区分出94.6%
结果表明
Song
的先前通过形态学研
等
［15］
使用DNA条形
码对多足摇蚊属（Polypedilum）161个形态种进行物
种鉴定有效性分析，结果表明现已有研究中多足摇
蚊属94.4%的种类能有效被DNA条形码区分。
本研究基于编码细胞色素C氧化酶甲基（ICOI）
基因对摇蚊属157种的749条DNA条形码进行分
析研究，并利用相关软件对摇蚊属类群进行了遗传
距离和系统发育树的分析，目的是探索DNA条形码
在摇蚊属物种界定方面的有效性，同时为完善摇蚊
科DNA条形码数据库提供参考，以填补当前国内该
属的研究空白。
1材料与方法
1.1分类抽取和收集信息
研究中695条DNA条形码数据为BOID和Gen⁃
bank
夏、海南、
数据库提供，
贵州、广西、
54条为收集样本，
天津、浙江等地；
采集于新疆、
采集方式包括
宁
灯诱、马氏网、D型网、扫网；将采集后的幼虫样本保
存于95%乙醇中，成虫样本保存于85%乙醇中，并
存于4℃冰箱，用于后续的形态学和分子学研究。
1.2DNA提取和PCR扩增
本研究通过QiagenDNABloodandTissuekit试
剂盒，采用摇蚊成虫的头、胸部和幼虫的腹部提取基
因组DNA。提取后成虫的头、胸部保存到与翅、足
和触角一致的玻片标本上，用Euparal树胶封片，凭
证标本均存于天津农学院水产遗传育种实验室。
使用通用引物LCO1490和HCO2198扩增COI条
形码
［16］
。PCR扩增反应体系为25μL，包含12.5μL
2×Es
8.75
TaqMasterMix，上下游引物各0.625μL，ddH
2
O
进行扩增，
μL，DNA
扩增程序为
模板2.5μL
98
。通过
℃预变性
Master
10
Cycler
s，94℃
Gradient
5min，
35
72
个循环
℃延伸
（94
5min
℃
；
1
10
min
℃
，51
保存。
℃1min
PCR
，72
扩增产物经
℃1min），
1.5%
最后
琼脂糖凝胶电泳检测后，送北京六合华大基因科技
股份有限公司进行纯化测序。
1.3序列分析和对比
各个基因片段都采用双向测序，根据测序公司
返回的测序结果，使用软件SeqMan7.1.0.44观察峰
图质量编辑序列
［17］
。将编辑好的FASTA文件导入
MEGA7.0
用MEGA7.0
后选择标准密码子进行后续密码子比对。
软件分析对比后，对各样本碱基的
组成、简约信息位点、变异位点（Variablesites）、保守
位点、自裔位点、平均碱基含量、遗传距离和碱基转
换与颠换比值进行统计。选用Kimura-2-parameter
（K2P）分子进化模型，节点处置信度为1000，其他
设置均为默认值，建立邻接树。
利用ABGD软件分析mOTU的数量
［18］
：将编辑
好的FASTA文件在线提交到ABGD网站（http：//ww⁃
/public/abgd/
差异先验值P为0.001~0.100
）
，
，
相对
选择
gap
K2P
宽度值
模型，种内
X为
1.0
DNA
，其
序列及其相关信息均已上传
余参数设置为默认值
［15］
。本研究的54条
）数据库。
BOLD（http：//www.
2结果与分析
2.1序列特征
研究共获得摇蚊属749条DNA条形码，其中实
验室获得54条DNA条形码，695条来自BOID和
Genbank
的平均含量分别为
数据库，所有序列的长度均为
A=26.56%，T=37.67%
658
，C=18.82%
bp，各碱基
，
G=16.92%
低于A+T的含量，
，序列存在碱基的偏倚性，
特别是第三核酸位点
C+G的含量显著
A+T的含量
为85.15%。通过比对序列得出，信息位点有244个，
占37.08%；变异位点有261个，占39.67%。大部分
的变异位点都集中在第三核酸位点，其比例为
78.16%
2.2遗传距离
，表明在第三核酸位点上的碱基进化速率快。
在DNA条形码研究中，种内与种间遗传距离的
差异是一项非常重要的指标，当种间遗传距离大于
种内遗传距离，就会形成一个明显的空白区
［15，19］
。
实验室共获得54条DNA条形码，形态鉴定约
为12种。结合BOID和Genbank数据库已下载的数
据，分析统计共获得形态种约50种。在MEGA7.0
软件中，对所有形态种进行分组，即60个组。种内
遗传距离为0~7.21%，平均值为1.10%；种间遗传距
离为0.2%~19.4%，平均值为14.25%；种间平均遗传
距离是种内平均遗传距离的12.95倍，因此本研究
的749条形码数据存在明显的空白区。
5］
通过对无脊椎动物及脊椎动物11
门13
Hebert
320个物种进行了
等
［
DNA条形码的研究，并提
出了种间平均遗传距离大于种内平均遗传距离的
10
入研究，
倍作为区分物种的标准；
不同领域的学者对该标准进行了验证，
随着DNA条形码的深
在
摇蚊科不同类群中也出现了相应的研究，详细结果
见表1。
146
湖北农业科学
2021年
表1
类群
长跗摇蚊属（
Tanytarsus
）
摇蚊属（
Chironomus
）
多足摇蚊属（
Polypedilum
）
多足摇蚊属（
Polypedilum
）
摇蚊属（
Chironomus
）
文献
［14］
［20］
［15］
［17］
本研究
摇蚊科不同类群遗传距离比较
遗传距离//%
种间平均与种内
种间最小
0.70
0.80
5.90
1.50
0.20
平均遗传距离比例
7.43
6.62
9.40
12.95
6.76
种间平均
15.90
17.20
15.80
13.93
14.25
种内最大
17.30
18.30
7.50
7.21
8.50
种内平均
2.14
2.60
1.68
2.06
1.10
2.3系统发育树结果
本研究采用DNA条形码分析中最常用的邻接
法，基于54条DNA条形码明显分离出13个分类操
作单元，代表摇蚊亚科中12个已命名的物种，结果
显示DNA条形码的鉴别结果与形态学鉴定结果一
致（图1）。
Chironomusflaviplumus|GZCH12|
0.02
Chironomusflaviplumus||HJ30|
Chironomusflaviplumus|GZCH16|
Chironomusflaviplumus|GZCH13|
Chironomusflaviplumus|HJ90|
Chironomusflaviplumus|HJ06|
Chironomusflaviplumus|GXCH45|
83
96
Chironomusflaviplumus|GXCH41|
Chironomusflaviplumus|GXCH42|
lumus
Chironomusflaviplumus|HJ02|
100
74
96
Chironomusflaviplumus|GZCH23|
Chironomusflaviplumus|HJ08|
Chironomusflaviplumus|GZCH05|
94
92
Chironomusflaviplumus|GZCH10|
Chironomusflaviplumus|HJ04|
Chironomusincertipenis|GZCH48|
ipenis
Chironomuscircumdatus|CJL142
Chironomuscircumdatus|cjl177
Chironomuscircumdatus|cjl5
100
Chironomuscircumdatus|CJL168
Chironomuscircumdatus|cjl176
datus
Chironomuscircumdatus|cj7
Chironomuscircumdatus|cj4
Chironomuscircumdatus|cj173
Chironomuscircumdatus|CJL174
100
Chironomusdorsalis|CH233|
Chironomusdorsalis|LX06|
is
100
81
Chironomusdorsalis|CH23|
Chironomussp.3SC|GZCH49|
Chironomussp.3SC|GZCH10|
.3SC
Chironomussp.3SC|XL579|
Chironomusriparius|us
100
Chironomusjavanus|GXCH09|
Chironomusjavanus|GXCH46|
s
Chironomuskiiensis|CH34|
100
84
Chironomuskiiensis|HJ105|
Chironomuskiiensis|HJ106|
98
Chironomuskiiensis|HJ103|
is
Chironomuskiiensis|CH252|
Chironomuskiiensis|HJ72|
Chironomuskiiensis|XJ07|
Chironomuspseudothummi|CH325|thummi
Chironomustentans|XL584|
100
93
Chironomustentans|CH323|s
Chironomustentans|CH324|
100
Chironomusannularius|LX01|
Chironomusannularius|XL585|
rius
100
Chironomusnovosibiricus|CH198|
Chironomusnovosibiricus|CH220|
biricus
Chironomusplumosus|HJ386
100
Chironomusplumosus|HJ389
Chironomusplumosus|HJ387
us
Chironomusplumosus|HJ252
Chironomusplumosus|HJ388
图154条DNA条形码邻接树
2.4ABGD评估结果
离，当种间最小遗传距离大于种内最大遗传距离时
ABGD在线软件通过比较种内和种间的遗传距
则出现空白区，DNA条形码空白区的存在很容易将
物种分开（图2）。
68991
量
62
数
55
091
的
较
48
192
比
41
293
列
序
34
394
对
成
27
495
20
596
13
697
6
798
899
0369258
0000111
.......
0000000
遗传距离
图2749条DNA条形码基于K2P模型得到的遗传距离分类
基于ABGD在线软件评估摇蚊亚科OTUs的数
量，即通过设定不同的阈值P，得到不同的OTUs数
量；随着P增大，OTUs的数量减少（图3）。当P为
0.002
P为0.026
637时，
827
749
时，
条
被分为
DNA条形码被分为
61OTUs。即
104
OTUs
OTUs
的置
；
信区间可为61~104，ABGD所评估的OTUs的数量
略大于形态评估的种类。当P为0.037276时，被分
为58OTUs，最为接近邻接树法评估的分子操作单
元数量，因此ABGD方法评估749条摇蚊亚科DNA
110
100
90
80
s
70
U
T
60
O
50
40
30
20
10
0
0.001
阀值
0.010.020.030.040.06
图3ABGD在线评估OTUs的数量随P的变化
第5期
余海军等：探讨DNA条形码对摇蚊属物种界定的有效性
147
条形码的遗传距离阈值为3%~4%。
3讨论
目前为止，DNA条形码技术存在5种分析方法，
即遗传距离的分析、遗传相似度的分析、系统发育树
的分析、序列特征的分析和统计分类法的分析
［21］
，
而在摇蚊DNA条形码研究中，主要是基于遗传距离
和系统发育树的分析
［22-28］
。
基于遗传距离的分析，即通过计算DNA条形码
序列的遗传距离，从而实现物种的区分，主要分析方
法包括DNA条形码间隙和遗传距离阈值分析
［21］
。
DNA
间遗传距离的差异，
条形码间隙的一项非常重要指标是种内与种
当种间遗传距离大于种内遗传
距离，就会形成一个明显的空白区。本研究中种内
平均遗传为距离为1.10%，种间平均遗传距离为
14.25%
区。遗传距离阈值是指物种在能形成空白区的前提
，后者大约是前者的12.95倍，形成了空白
下，使用物种种间遗传距离与参比的遗传距离阈值
进行对比，当种间遗传距离大于参比的阈值，则可以
将物种区分为不同物种。阈值法在DNA条形码的
物种鉴定中起着不可替代的作用，然而随着DNA条
形码的研究不断出现，有学者发现不同物种DNA条
形码的阈值各不相同，没有一个统一的标准阈
值
［29］
。BOLD数据库最初将遗传距离1%作为生物
物种的划分阈值，由于其阈值宽泛，在一定程度上造
成了物种的鉴别过度，导致同种异名的出现，为了不
使物种混乱，近年来BOLD系统默认鉴别阈值为
3%
［30］
；Meier等
［31］
在对449个双翅目昆虫物种的研
究中，发现在物种划分时，其遗传距离大于3%；He⁃
bert等
［5］
以3%作为阈值对200个鳞翅目昆虫物种
进行鉴别；蜉蝣目
［32-34］
、襀翅目和毛翅目
［35，36］
的物种
以2%的阈值就能将物种区分开。本试验研究的物
种隶属于双翅目，通过使用ABGD方法评估得到的
遗传距离阈值为3%~4%，与Meier等
［31］
的研究相
符，且与摇蚊亚科中其他属研究的阈值差异不大，
Song等
［15］
区分多足摇蚊属的遗传距离阈值为5%~
8%，Lin等
［14］
区分长跗摇蚊属的遗传距离阈值为
其属于摇蚊亚科中比较大的属级之一，
4%~5%。本研究是分析摇蚊属物种的DNA
属内物种的
条形码，
丰富度极高，但由于时间有限，加之中国地大物博，
从而不能完全覆盖已记录所有物种和一些隐种；为
此还需要更深入的研究，才能达到对中国地区摇蚊
属遗传距离的准确界定。
系统发育树能直观地反映物种之间的亲缘关
系，本研究采用的是邻接树法，其基于遗传距离和最
小进化原理，通过自举检验法进行聚类，并通过统计
给定树分支的可信度，得出最优树
［37］
。在邻接树
中，基于54条来自实验室的DNA条形码明显分离
出12个物种，与形态学鉴定结果一致，匹配率达
92.3%
条DNA
；通过结合
条形码，分离出
BOID和
50
Genbank
个形态种，
数据库中的
其中发现本试
695
验数据Chironomuspseudothummi与参比数据Chi⁃
11聚为一支（图4），由于数据库中参
比数据11不能提供证据标本与本
研究比较，将基于本研究的数据将参比数据Chi⁃
11修改为Chironomuspseudothummi，
并将相关信息上传至BOLD数据库。
0.005
88
11
11|B|OUG07603-H11|KM967408
99
11|B|OUG08857-B05|KM909600
Chironomuspseudothummi|CH325|
11|CH-OSF86|
99
11|Finnmark434|JN265051
11|Finnmark578|JF870939
11|Finnmark725|JN265114
11|TRD-CH299|
11|TRD-CH378|
99
Chironomuspseudothummi|CH-OSF190|JN265016
Chironomuspseudothummi|CH-OSF36
12
图4Chironomuspseudothummi类群邻接树
4结论
本研究通过采集中国地区的摇蚊属昆虫12种
54
据，
个样本，
共计749
结合
条DNA
BOID
条形码，
和Genbank
运用
数据库中的相关数
ABDG法分析该数
据集遗传距离，结果显示种内与种间存在一个明显
的空白区；基于邻接树结果得出数据集分离出50个
物种，与传统形态学鉴定一致，匹配率高达92.3%，
并修正数据库中11为Chironomus
pseudothummi，证明DNA条形码能有效鉴别摇蚊属
昆虫。本研究的数据均已上传中国DNA条形码数
据库，在丰富中国摇蚊科数据库的同时，也为探索
DNA
础数据。
条形码在摇蚊昆虫中鉴别的有效性提供了基
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2024年6月12日发(作者：似城)
第60卷第5期
2021年3月
余海军，王
湖北农业科学
湖
Hubei
北
Agricultural
农业
Sciences
科学
Vol.60No.5
2021年
Mar.，2021
茜.探讨DNA条形码对摇蚊属物种界定的有效性［J］.湖北农业科学，2021，60（5）：144-148．
探讨DNA条形码对摇蚊属物种界定的有效性
余海军，王茜
300384）（天津农学院水产学院/天津市水生生态及养殖重点实验室，天津
摘要：以摇蚊属的12种物种为研究对象，结合BarcodeofLifeDatabase（BOID）和Genbank数据库下载的
条形码数据，采用AutomaticBarcodeGapDiscovery（ABGD）和邻接法（Neighborjoining，NJ）对所获取的
749条DNA条形码进行分析，探究DNA条形码在摇蚊属物种界定的有效性。结果表明，基于ABGD的分
析，显示物种遗传距离之间存在空白区；通过分析邻接树，得到60个分子分类操作单元，与形态学鉴定
结果一致，并将数据库中11修正为Chironomuspseudothummi。研究在一定程度上补充
了中国摇蚊科DNA条形码研究，也为摇蚊科DNA条形码数据库的构建和完善提供了数据支持。
关键词：摇蚊属；DNA条形码；物种界定
中国分类号：Q969.44；Q523文献标识码：A
开放科学（资源服务）标识码（OSID）：
文章编号：0439-8114（2021）05-0144-05
DOI:10.14088/0439-8114.2021.05.028
ExploringtheutilityofDNAbarcodinginspeciesidentificationofChironomus
YUHai-jun，WANGQian
（CollegeofFishery，TianjinAgriculturalUniversityKeyLaboratoryofAquatic-EcologyandAquacultureofTianjin，Tianjin300384，China）
Abstract：Theresearchanalyzed749DNAbarcodescollectedthe12speciesofChironomusspeciesanddownloadedbarcodesin
BOLDandGenbankdatabasebyABGD（AutomaticBarcodeGapDiscovery）andNJ（Neighbor-joining）.TheresultshowedthatAB⁃
GDanalysedgeneticdistance，existed“DNAbarcodegap”.TheNJtreesupported60molecularoperationaltaxonomicunits，and
tion，basedonthedataarefound，11frompubliclibrary
andprovidedatasupportforestablishingandperfectingtheChineseDNAbarcodesdatabaseofChironominae.
Keywords：Chironomus；DNAbarcoding；speciesidentification
ultisanimportantsupplementfortheChineseDNAbarcodesstudyofChironominae，
摇蚊属（Chironomus）隶属于双翅目摇蚊亚科
（Diptera：Chironomidae），该属由德国昆虫学家Mei⁃
gen于1803年建立，迄今为止全世界已记录种类达
303种；摇蚊属的幼虫可以生存于各种水体（尚未污
ronomus）在缺乏营养的水体中较为丰富，并且能耐
受酸性环境，另一些摇蚊亚属喜欢生长在盐分较高
的环境中，对重金属污染具有耐受性
［1］
。摇蚊属部
分种类雄成虫能引起人类过敏性疾病；裸露在外和
正在产卵的摇蚊属种类可以成为新鲜水体中鱼类
（鳟鱼）的主要食物来源；在日常生活中，某些垂钓者
收稿日期：2020-06-29
基金项目：国家自然科学基金项目（NSFC31672264）
所用诱饵也为摇蚊属幼虫
［2］
。
摇蚊属是摇蚊科最古老的属之一，由于种种历
史原因，该属的研究在世界上一直存在很大的争议，
属内物种的分类地位至今没有获得广泛的认可。依
据中国摇蚊名录中统计，中国已有该属种类共23种，
其中只有13种具有明确记录，另包括3种可疑种和7
种只进行鉴定而没有正式发表的
［3］
。因此，摇蚊属的
物种界定一直存在争议
［3］
。随着DNA条形码的提
出，其通过将基因组的标准部分提取一个或几个相
5］
对较短的基因序列，用于识别物种
［4，
；虽然使用DNA
染至严重污染的水体），其中宽叶摇蚊亚属（Lobochi⁃
序列识别生物并不新颖
［6］
，但DNA条形码能快速且
作者简介：余海军（1994-），男，贵州雷山人，在读硕士研究生，研究方向为分子系统学，（电话）183****0463（电子信箱）yhj@163.
com；通信作者，王
****************。
茜（1971-），女，副教授，博士，主要从事水生动物及昆虫分子系统学的研究，（电话）136****4584（电子信箱）
第5期
余海军等：探讨DNA条形码对摇蚊属物种界定的有效性
145
可靠地识别所有生命形式的物种层次，包括动物、植
物、真菌、微生物；其在论证物种群落组成、食物链和
种内遗传变异方面也有所研究
［7-9］
；同时也扮演着生
物安全和淡水生态监测中一个不可缺少的角色
［10-13］
。
Lin等
［14］
使用DNA条形码对长跗摇蚊属（Tanytarsus）
121
DNA
个形态种进行物种鉴定有效性分析，
究分类的长跗摇蚊属物种；
条形码明确区分出94.6%
结果表明
Song
的先前通过形态学研
等
［15］
使用DNA条形
码对多足摇蚊属（Polypedilum）161个形态种进行物
种鉴定有效性分析，结果表明现已有研究中多足摇
蚊属94.4%的种类能有效被DNA条形码区分。
本研究基于编码细胞色素C氧化酶甲基（ICOI）
基因对摇蚊属157种的749条DNA条形码进行分
析研究，并利用相关软件对摇蚊属类群进行了遗传
距离和系统发育树的分析，目的是探索DNA条形码
在摇蚊属物种界定方面的有效性，同时为完善摇蚊
科DNA条形码数据库提供参考，以填补当前国内该
属的研究空白。
1材料与方法
1.1分类抽取和收集信息
研究中695条DNA条形码数据为BOID和Gen⁃
bank
夏、海南、
数据库提供，
贵州、广西、
54条为收集样本，
天津、浙江等地；
采集于新疆、
采集方式包括
宁
灯诱、马氏网、D型网、扫网；将采集后的幼虫样本保
存于95%乙醇中，成虫样本保存于85%乙醇中，并
存于4℃冰箱，用于后续的形态学和分子学研究。
1.2DNA提取和PCR扩增
本研究通过QiagenDNABloodandTissuekit试
剂盒，采用摇蚊成虫的头、胸部和幼虫的腹部提取基
因组DNA。提取后成虫的头、胸部保存到与翅、足
和触角一致的玻片标本上，用Euparal树胶封片，凭
证标本均存于天津农学院水产遗传育种实验室。
使用通用引物LCO1490和HCO2198扩增COI条
形码
［16］
。PCR扩增反应体系为25μL，包含12.5μL
2×Es
8.75
TaqMasterMix，上下游引物各0.625μL，ddH
2
O
进行扩增，
μL，DNA
扩增程序为
模板2.5μL
98
。通过
℃预变性
Master
10
Cycler
s，94℃
Gradient
5min，
35
72
个循环
℃延伸
（94
5min
℃
；
1
10
min
℃
，51
保存。
℃1min
PCR
，72
扩增产物经
℃1min），
1.5%
最后
琼脂糖凝胶电泳检测后，送北京六合华大基因科技
股份有限公司进行纯化测序。
1.3序列分析和对比
各个基因片段都采用双向测序，根据测序公司
返回的测序结果，使用软件SeqMan7.1.0.44观察峰
图质量编辑序列
［17］
。将编辑好的FASTA文件导入
MEGA7.0
用MEGA7.0
后选择标准密码子进行后续密码子比对。
软件分析对比后，对各样本碱基的
组成、简约信息位点、变异位点（Variablesites）、保守
位点、自裔位点、平均碱基含量、遗传距离和碱基转
换与颠换比值进行统计。选用Kimura-2-parameter
（K2P）分子进化模型，节点处置信度为1000，其他
设置均为默认值，建立邻接树。
利用ABGD软件分析mOTU的数量
［18］
：将编辑
好的FASTA文件在线提交到ABGD网站（http：//ww⁃
/public/abgd/
差异先验值P为0.001~0.100
）
，
，
相对
选择
gap
K2P
宽度值
模型，种内
X为
1.0
DNA
，其
序列及其相关信息均已上传
余参数设置为默认值
［15］
。本研究的54条
）数据库。
BOLD（http：//www.
2结果与分析
2.1序列特征
研究共获得摇蚊属749条DNA条形码，其中实
验室获得54条DNA条形码，695条来自BOID和
Genbank
的平均含量分别为
数据库，所有序列的长度均为
A=26.56%，T=37.67%
658
，C=18.82%
bp，各碱基
，
G=16.92%
低于A+T的含量，
，序列存在碱基的偏倚性，
特别是第三核酸位点
C+G的含量显著
A+T的含量
为85.15%。通过比对序列得出，信息位点有244个，
占37.08%；变异位点有261个，占39.67%。大部分
的变异位点都集中在第三核酸位点，其比例为
78.16%
2.2遗传距离
，表明在第三核酸位点上的碱基进化速率快。
在DNA条形码研究中，种内与种间遗传距离的
差异是一项非常重要的指标，当种间遗传距离大于
种内遗传距离，就会形成一个明显的空白区
［15，19］
。
实验室共获得54条DNA条形码，形态鉴定约
为12种。结合BOID和Genbank数据库已下载的数
据，分析统计共获得形态种约50种。在MEGA7.0
软件中，对所有形态种进行分组，即60个组。种内
遗传距离为0~7.21%，平均值为1.10%；种间遗传距
离为0.2%~19.4%，平均值为14.25%；种间平均遗传
距离是种内平均遗传距离的12.95倍，因此本研究
的749条形码数据存在明显的空白区。
5］
通过对无脊椎动物及脊椎动物11
门13
Hebert
320个物种进行了
等
［
DNA条形码的研究，并提
出了种间平均遗传距离大于种内平均遗传距离的
10
入研究，
倍作为区分物种的标准；
不同领域的学者对该标准进行了验证，
随着DNA条形码的深
在
摇蚊科不同类群中也出现了相应的研究，详细结果
见表1。
146
湖北农业科学
2021年
表1
类群
长跗摇蚊属（
Tanytarsus
）
摇蚊属（
Chironomus
）
多足摇蚊属（
Polypedilum
）
多足摇蚊属（
Polypedilum
）
摇蚊属（
Chironomus
）
文献
［14］
［20］
［15］
［17］
本研究
摇蚊科不同类群遗传距离比较
遗传距离//%
种间平均与种内
种间最小
0.70
0.80
5.90
1.50
0.20
平均遗传距离比例
7.43
6.62
9.40
12.95
6.76
种间平均
15.90
17.20
15.80
13.93
14.25
种内最大
17.30
18.30
7.50
7.21
8.50
种内平均
2.14
2.60
1.68
2.06
1.10
2.3系统发育树结果
本研究采用DNA条形码分析中最常用的邻接
法，基于54条DNA条形码明显分离出13个分类操
作单元，代表摇蚊亚科中12个已命名的物种，结果
显示DNA条形码的鉴别结果与形态学鉴定结果一
致（图1）。
Chironomusflaviplumus|GZCH12|
0.02
Chironomusflaviplumus||HJ30|
Chironomusflaviplumus|GZCH16|
Chironomusflaviplumus|GZCH13|
Chironomusflaviplumus|HJ90|
Chironomusflaviplumus|HJ06|
Chironomusflaviplumus|GXCH45|
83
96
Chironomusflaviplumus|GXCH41|
Chironomusflaviplumus|GXCH42|
lumus
Chironomusflaviplumus|HJ02|
100
74
96
Chironomusflaviplumus|GZCH23|
Chironomusflaviplumus|HJ08|
Chironomusflaviplumus|GZCH05|
94
92
Chironomusflaviplumus|GZCH10|
Chironomusflaviplumus|HJ04|
Chironomusincertipenis|GZCH48|
ipenis
Chironomuscircumdatus|CJL142
Chironomuscircumdatus|cjl177
Chironomuscircumdatus|cjl5
100
Chironomuscircumdatus|CJL168
Chironomuscircumdatus|cjl176
datus
Chironomuscircumdatus|cj7
Chironomuscircumdatus|cj4
Chironomuscircumdatus|cj173
Chironomuscircumdatus|CJL174
100
Chironomusdorsalis|CH233|
Chironomusdorsalis|LX06|
is
100
81
Chironomusdorsalis|CH23|
Chironomussp.3SC|GZCH49|
Chironomussp.3SC|GZCH10|
.3SC
Chironomussp.3SC|XL579|
Chironomusriparius|us
100
Chironomusjavanus|GXCH09|
Chironomusjavanus|GXCH46|
s
Chironomuskiiensis|CH34|
100
84
Chironomuskiiensis|HJ105|
Chironomuskiiensis|HJ106|
98
Chironomuskiiensis|HJ103|
is
Chironomuskiiensis|CH252|
Chironomuskiiensis|HJ72|
Chironomuskiiensis|XJ07|
Chironomuspseudothummi|CH325|thummi
Chironomustentans|XL584|
100
93
Chironomustentans|CH323|s
Chironomustentans|CH324|
100
Chironomusannularius|LX01|
Chironomusannularius|XL585|
rius
100
Chironomusnovosibiricus|CH198|
Chironomusnovosibiricus|CH220|
biricus
Chironomusplumosus|HJ386
100
Chironomusplumosus|HJ389
Chironomusplumosus|HJ387
us
Chironomusplumosus|HJ252
Chironomusplumosus|HJ388
图154条DNA条形码邻接树
2.4ABGD评估结果
离，当种间最小遗传距离大于种内最大遗传距离时
ABGD在线软件通过比较种内和种间的遗传距
则出现空白区，DNA条形码空白区的存在很容易将
物种分开（图2）。
68991
量
62
数
55
091
的
较
48
192
比
41
293
列
序
34
394
对
成
27
495
20
596
13
697
6
798
899
0369258
0000111
.......
0000000
遗传距离
图2749条DNA条形码基于K2P模型得到的遗传距离分类
基于ABGD在线软件评估摇蚊亚科OTUs的数
量，即通过设定不同的阈值P，得到不同的OTUs数
量；随着P增大，OTUs的数量减少（图3）。当P为
0.002
P为0.026
637时，
827
749
时，
条
被分为
DNA条形码被分为
61OTUs。即
104
OTUs
OTUs
的置
；
信区间可为61~104，ABGD所评估的OTUs的数量
略大于形态评估的种类。当P为0.037276时，被分
为58OTUs，最为接近邻接树法评估的分子操作单
元数量，因此ABGD方法评估749条摇蚊亚科DNA
110
100
90
80
s
70
U
T
60
O
50
40
30
20
10
0
0.001
阀值
0.010.020.030.040.06
图3ABGD在线评估OTUs的数量随P的变化
第5期
余海军等：探讨DNA条形码对摇蚊属物种界定的有效性
147
条形码的遗传距离阈值为3%~4%。
3讨论
目前为止，DNA条形码技术存在5种分析方法，
即遗传距离的分析、遗传相似度的分析、系统发育树
的分析、序列特征的分析和统计分类法的分析
［21］
，
而在摇蚊DNA条形码研究中，主要是基于遗传距离
和系统发育树的分析
［22-28］
。
基于遗传距离的分析，即通过计算DNA条形码
序列的遗传距离，从而实现物种的区分，主要分析方
法包括DNA条形码间隙和遗传距离阈值分析
［21］
。
DNA
间遗传距离的差异，
条形码间隙的一项非常重要指标是种内与种
当种间遗传距离大于种内遗传
距离，就会形成一个明显的空白区。本研究中种内
平均遗传为距离为1.10%，种间平均遗传距离为
14.25%
区。遗传距离阈值是指物种在能形成空白区的前提
，后者大约是前者的12.95倍，形成了空白
下，使用物种种间遗传距离与参比的遗传距离阈值
进行对比，当种间遗传距离大于参比的阈值，则可以
将物种区分为不同物种。阈值法在DNA条形码的
物种鉴定中起着不可替代的作用，然而随着DNA条
形码的研究不断出现，有学者发现不同物种DNA条
形码的阈值各不相同，没有一个统一的标准阈
值
［29］
。BOLD数据库最初将遗传距离1%作为生物
物种的划分阈值，由于其阈值宽泛，在一定程度上造
成了物种的鉴别过度，导致同种异名的出现，为了不
使物种混乱，近年来BOLD系统默认鉴别阈值为
3%
［30］
；Meier等
［31］
在对449个双翅目昆虫物种的研
究中，发现在物种划分时，其遗传距离大于3%；He⁃
bert等
［5］
以3%作为阈值对200个鳞翅目昆虫物种
进行鉴别；蜉蝣目
［32-34］
、襀翅目和毛翅目
［35，36］
的物种
以2%的阈值就能将物种区分开。本试验研究的物
种隶属于双翅目，通过使用ABGD方法评估得到的
遗传距离阈值为3%~4%，与Meier等
［31］
的研究相
符，且与摇蚊亚科中其他属研究的阈值差异不大，
Song等
［15］
区分多足摇蚊属的遗传距离阈值为5%~
8%，Lin等
［14］
区分长跗摇蚊属的遗传距离阈值为
其属于摇蚊亚科中比较大的属级之一，
4%~5%。本研究是分析摇蚊属物种的DNA
属内物种的
条形码，
丰富度极高，但由于时间有限，加之中国地大物博，
从而不能完全覆盖已记录所有物种和一些隐种；为
此还需要更深入的研究，才能达到对中国地区摇蚊
属遗传距离的准确界定。
系统发育树能直观地反映物种之间的亲缘关
系，本研究采用的是邻接树法，其基于遗传距离和最
小进化原理，通过自举检验法进行聚类，并通过统计
给定树分支的可信度，得出最优树
［37］
。在邻接树
中，基于54条来自实验室的DNA条形码明显分离
出12个物种，与形态学鉴定结果一致，匹配率达
92.3%
条DNA
；通过结合
条形码，分离出
BOID和
50
Genbank
个形态种，
数据库中的
其中发现本试
695
验数据Chironomuspseudothummi与参比数据Chi⁃
11聚为一支（图4），由于数据库中参
比数据11不能提供证据标本与本
研究比较，将基于本研究的数据将参比数据Chi⁃
11修改为Chironomuspseudothummi，
并将相关信息上传至BOLD数据库。
0.005
88
11
11|B|OUG07603-H11|KM967408
99
11|B|OUG08857-B05|KM909600
Chironomuspseudothummi|CH325|
11|CH-OSF86|
99
11|Finnmark434|JN265051
11|Finnmark578|JF870939
11|Finnmark725|JN265114
11|TRD-CH299|
11|TRD-CH378|
99
Chironomuspseudothummi|CH-OSF190|JN265016
Chironomuspseudothummi|CH-OSF36
12
图4Chironomuspseudothummi类群邻接树
4结论
本研究通过采集中国地区的摇蚊属昆虫12种
54
据，
个样本，
共计749
结合
条DNA
BOID
条形码，
和Genbank
运用
数据库中的相关数
ABDG法分析该数
据集遗传距离，结果显示种内与种间存在一个明显
的空白区；基于邻接树结果得出数据集分离出50个
物种，与传统形态学鉴定一致，匹配率高达92.3%，
并修正数据库中11为Chironomus
pseudothummi，证明DNA条形码能有效鉴别摇蚊属
昆虫。本研究的数据均已上传中国DNA条形码数
据库，在丰富中国摇蚊科数据库的同时，也为探索
DNA
础数据。
条形码在摇蚊昆虫中鉴别的有效性提供了基
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