2024年6月13日发(作者：文城)

(19)中华人民共和国国家知识产权局

(12)发明专利说明书

(21)申请号 CN2.4

(22)申请日 2012.05.11

(71)申请人 北京美康生物技术研究中心

地址 100070 北京市丰台区南四环西路188号总部基地15区5号楼7-8层

(72)发明人 金鑫

(74)专利代理机构 北京科龙寰宇知识产权代理有限责任公司

代理人 孙皓晨

(51)

G01N33/569

G01N33/574

(10)申请公布号 CN 102662059 A

(43)申请公布日 2012.09.12

权利要求说明书 说明书 幅图

(54)发明名称

一种用于测定幽门螺杆菌抗体的胶

乳增强免疫比浊试剂盒及其制备方法和应

用

(57)摘要

本发明公开了一种测定幽门螺杆菌

抗体的胶乳增强免疫比浊试剂盒及其制备

方法和应用。该试剂盒的组成包括：稀释

液、幽门螺杆菌抗原的胶乳试剂和空白

液，还可包括校准品和质控品。所述的幽

门螺杆菌抗原为幽门螺杆菌抗原，可为幽

门螺杆菌全菌体蛋白抗原、幽门螺杆菌尿

素酶抗原、幽门螺杆菌细胞毒素相关蛋白

A抗原或幽门螺杆菌细胞空泡毒素A抗原

中的一种或多种，所述胶乳试剂为已吸附

幽门螺杆菌抗原的两种不同粒径胶乳颗粒

的混合物，制备所述校准品、质控品所需

的幽门螺杆菌抗体源自感染幽门螺杆菌患

者血清中IgM和/或IgG。本发明适用于各

类型全自动生化分析仪和半自动生化分析

仪，具有检测快速、敏感度高、特异性强

和准确性好等优点。

法律状态

法律状态公告日

法律状态信息

法律状态

权 利 要 求 说 明 书

1.一种用于测定幽门螺杆菌抗体的胶乳增强免疫比浊试剂盒，其特征在于包

所述的幽门螺杆菌抗原的胶乳试剂为已吸附幽门螺杆菌抗原的两种不同粒径

2.按照权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：所述的稀释液为含有反应增

强剂的缓冲液，所述的缓冲液为Tris/HCl缓冲液、磷酸盐缓冲液、HE PES

甘氨酸缓冲液、巴比妥缓冲液、MOPSO缓冲液、

的任一种，优选为磷酸盐缓冲液；

PEG6000中的任一

的胶乳颗粒的混合物，所述的胶乳颗粒为聚苯乙烯微球。

括：稀释液、幽门螺杆菌抗原的胶乳试剂及空白液；

缓冲液、

DIPSO缓冲液或HEPPS缓冲液中

所述的反应增强剂为PEG-300、PEG2000或

种或几种，优选为PEG6000；更优选的所述的稀释液中还含有

2mol/L的氯化钠。

3.按照权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：所述的胶乳试剂为已吸附幽

门螺杆菌抗原的粒径为60－90nm和粒径为160－200nm的胶乳颗粒的混合

物。

4.按照权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：所述的胶乳试剂按照以下方

法制备得到：

（1）胶乳前处理

取1ml未标记的胶乳颗粒加入10ml 0.02M pH7.4磷酸缓冲液中，离心机

10000rpm离心20min，去掉上清液、再用10ml 0.02M pH7.4磷酸缓冲液重

离心机10000rpm离心20min，去掉上清并用

保存待用；

悬颗粒，

5ml 0.02M pH7.4磷酸缓冲液重悬、4℃

（2）胶乳颗粒标记

将步骤（1）处理后胶乳用0.02M pH6.1MES缓冲液将胶乳颗粒稀释成10mg/ml

浓度，然后加入1mg EDC，混匀活化15分钟，离心8000rpm弃去上

PH7.4磷酸缓冲液重悬，加入1mg幽门螺杆菌抗

温混匀2－4小时，离心机

颗粒使

清，并用0.02M

原于10mg/ml 2ml胶乳液体中，室

8000rpm离心15分钟，将上清分离到另外的容器中备用，

用封闭液重悬，并室温混匀1小时，离心机8000rpm离心15min，沉淀复溶

（3）使用上述步骤分别对粒径60－90nm和160－200nm的胶乳进行分别标

记，标记结束后将所述60－90nm胶乳和所述160－200nm胶乳进行混合，

体积百分比计，使60－90nm胶乳的浓度为0.673-

浓度为

于分散液，将标记完成的胶乳颗粒分装成1ml/支，4℃保存；

按质量

0.732％，使160－200nm胶乳的

0.135-0.323％，混合后进行保存，优选的使用上述流程分别对粒径70－90nm

和160－180nm的胶乳进行分别标记，标记结束后将所述70－90nm

－180nm胶乳进行混合，按质量体积百分比计，

0.708-0.732％，使160－180nm胶乳浓度

胶乳和所述160

使70－90nm胶乳浓度为

为0.135-0.235％，混合后进行保存；

所述的封闭液为含有5g/L BSA的0.02M PH7.4的磷酸缓冲液；

所述的分散液由BSA，吐温-20、PVP-K30以及生物防腐剂通过0.02M PH7.4

的磷酸缓冲液配制而成，其中BSA浓度为1g/L，吐温-20浓度为

PVP-K30浓度为2g/L，生物防腐剂浓度为0.05%0.05%（v/v），

（v/v）。

5.按照权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：所述抗原包括幽门螺杆菌全

菌体蛋白抗原、幽门螺杆菌尿素酶抗原、幽门螺杆菌细胞毒素相关蛋白A

门螺杆菌细胞空泡毒素A抗原中的一种或多种。 抗原或幽

6.按照权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：还含有标准稀释液、校准品

7.按照权利要求7所述的试剂盒，其特征在于：所述的标准稀释液为Tris/HCl

缓冲液、磷酸盐缓冲液、HE PES缓冲液、甘氨酸缓冲液、巴比妥缓

缓冲液、DIPSO缓冲液或HEPPS缓冲液中的任

和质控品。

冲液、MOPSO

一种，优选为磷酸盐缓冲液。

8.按照权利要求7所述的试剂盒，其特征在于：所述的校准品、质控品是一

种幽门螺杆菌抗体溶液，其中包括PBS缓冲液、稳定剂、防腐剂以及幽门

螺杆菌特

异性抗体；

所述稳定剂选自蛋白质、氨基酸、无机盐、表面活性剂中的一种或多种

所述防腐剂选自0.1%的叠氮钠、Proclin-300、庆大霉素中的一种或多种。

9.权利要求1-9任一项所述的试剂盒在制备测定幽门螺杆菌抗体试剂中的应

10.一种用于诊断胃病或胃癌的三联检试剂盒，其特征在于包括权利要求1-8

任一项所述的试剂盒，还包括胃蛋白酶原I检测试剂盒及胃蛋白酶原II检测

用。

试剂盒。

说 明 书

技术领域

本发明涉及一种检测试剂盒，特别涉及一种用于检测人体血清中幽门螺杆菌抗

背景技术

幽门螺杆菌（Helicobacter pylori，简称HP)是一种单极、多鞭毛、末端钝圆、

螺旋形弯曲的细菌，呈革兰染色阴性，在胃粘膜上皮细胞表面常呈典型的螺

弧形。

体的胶乳免疫试剂盒及其制备方法。本发明属于生物检测技术领域

旋状或

幽门螺杆菌感染是慢性活动性胃炎、消化性胃溃殇以及胃动膜相关淋巴组织

(MALT)淋巴瘤的主要致病因素，并且与胃癌的发生密切相关.1994年世界卫

国际癌症研究机构(WHO/IARC)将幽门螺杆菌定为I类致癌原。

粘膜活检标本中幽门螺杆菌检出率可达80%～90%.而

95%以上，甚至接近100%。胃癌由于局

报道不一。幽门螺杆菌的感

传播与流行及

生组织/

慢性胃炎患者的胃

消化性胃溃殇患者更高，可达

部上皮细胞己发生异化，因此其检出率高低

染己是个世界性问题，对其进行准确诊断有利于控制HP

根除HP感染治疗的监测。

目前，国内外已建立的HP检测方法从检测手段上分为侵入性和非侵入性两大

一、侵入性检测方法

这类方法的特点是使用内窥镜取得胃活检组织后进行检测，试验方法主要有快

速尿酶试验法、病理学检测法及细菌培养法。

类。

1、快速尿酶检测法:依据HP具有丰富的尿素酶可分解尿素产生氨气，由pH指

示剂显色。该法简便、迅速、灵敏，但也有可能因含尿素酶的其他细菌存在

生假阳性。此外，近期使用过降低胃部细菌量或直接抑制尿素酶活性

可产生假阴性。

而产

的药物的样品

2、病理学检测法:通过对胃粘膜组织进行切片染色检查，可直接显示HP菌体

而证实，其中银染法检测率高，但不同病理学家观察的差异性对于胃萎缩样

断具有一定的困难性。 品的诊

3、细菌培养法取胃粘膜活组织作HP培养，因培养细菌较少、操作过程较复杂、

二、非侵入性检测方法

此类方法特点是不需要使用内窥镜采取胃活检组织，从而避免病人因反复做胃

窥镜而带来的侵害痛苦或发生其它类型的感染。试验方法主要有尿素呼吸试

检测法和免疫血清学法。

时间周期较氏、费用昂贵而不适宜普遍应用。

验、PCR

1、尿素呼吸试验:由于HP富含尿素酶，用13C或14C标记的尿素由受试者服

用后，根据气体核素质谱仪检测到分解产生的带同位素标记的二氧化碳标本

HP感染程度。该法灵敏度高，可定量，但有一定的放射性危

难于普遍推广。

来判断

险，并且受设备限制

2、PCR检测法:主要检测胃液、粘膜中HP尿素酶(UReA)基因和毒素相关蛋白A

(CagA)基因，但操作复杂，易污染，对检验人员的专业知识及操作技术的要

且大大增加患者的经济开支，因此在临床上的应用也较为有限。求较高，

3、免疫血清学法:目前已有方法包括酶联免疫法、免疫印迹法和胶体金法，为

HP的流行病学调查提供了有利便捷手段，但检测速度慢，除酶联免疫法可

自动酶免分析仪(且需2~3小时、步骤多)外，其余都需手工操

果为定性分析，不适于治疗监控及疗效评估。

使用全

作，患者获得检测结

目前，虽然检测幽门螺旋杆菌感染的方法繁多，但还没有一种合适的生化分析

仪，能够简便、快速、大批量且定量的进行检测。如能建立该种方法，则能

测过程大为简便化，操作人员只需设置好上机参数，将试剂和样本置

生化分析仪即可全自动完成检测，并能够迅速得到结果，

应用，对于幽门螺旋杆菌的防治具有重大的临床

使检

于相应位置后，

易于在各级医疗机构推广

意义和普及价值。

发明内容

本发明的目的在于克服现有方法及技术的缺陷，提供一种测定幽门螺杆菌抗体

的胶乳免疫试剂盒及其制备方法以及使用该试剂进行临床样本检测的方法。

适用于各类型生化分析仪，具有样本无需稀释、操作简单、快

性好、稳定性好、敏感度高、特异性强的特点。

该试剂

速、定量准确、重复

为实现本发明的目的，采用了如下的技术方案:

本发明的一种用于测定幽门螺杆菌抗体的胶乳增强免疫比浊试剂盒，其特征在

其中，所述的幽门螺杆菌抗原的胶乳试剂为已吸附幽门螺杆菌抗原的两种不同

粒径的胶乳颗粒的混合物，所述的胶乳颗粒为聚苯乙烯微球。

于包括：稀释液、幽门螺杆菌抗原的胶乳试剂及空白液；

在本发明中，优选的，所述的稀释液为含有表面活性剂及反应增强剂的缓冲液，

所述的缓冲液为Tris/HCl缓冲液、磷酸盐缓冲液、HE PES缓冲液、甘氨酸

巴比妥缓冲液、MOPSO缓冲液、DIPSO缓冲液或HEPPS缓

为磷酸盐缓冲液；所述的反应增强剂为PEG-300、

种或几种，优选为PEG6000；更优选的

缓冲液、

冲液中的任一种，优选

PEG2000或PEG6000中的任一

所述的稀释液中还含有2mol/L的氯化钠。

其中，无机盐氯化钠可以调节离子强度，反应增强剂可以加快抗原抗体的免疫

反应速度，缩短检测时间，表面活性剂（Tween 20）可以去除非特异性的结

合反应。

在本发明中，优选的，所述的胶乳试剂为已吸附幽门螺杆菌抗原的粒径为60

优选的，所述的胶乳颗粒为聚苯乙烯纳米微球，这种组合既能够提高反应的灵

在本发明中，优选的，所述的胶乳试剂可以按照以下方法制备得到：

（1）胶乳前处理

取1ml未标记的胶乳颗粒加入10ml 0.02M pH7.4磷酸缓冲液中，离心机

10000rpm离心20min，去掉上清液、再用10ml 0.02M pH7.4磷酸缓冲液重

离心机10000rpm离心20min，去掉上清并用5ml 0.02M pH7.4

保存待用；

敏度，而且也能够提高试剂的检测范围。

－90nm和粒径为160－200nm的胶乳颗粒的混合物。

悬颗粒，

磷酸缓冲液重悬、4℃

（2）胶乳颗粒标记

将步骤（1）处理后胶乳用0.02M pH6.1MES缓冲液将胶乳颗粒稀释成10mg/ml

浓度，然后加入1mg EDC，混匀活化15分钟，离心8000rpm弃去上清，并

PH7.4磷酸缓冲液重悬，加入1mg幽门螺杆菌抗原于

温混匀2－4小时，离心机8000rpm离心

颗粒使用封闭液重悬，并室

于分散液，将标记完

用0.02M

10mg/ml 2ml胶乳液体中，室

15分钟，将上清分离到另外的容器中备用，

温混匀1小时，离心机8000rpm离心15min，沉淀复溶

成的胶乳颗粒分装成1ml/支，4℃保存；

（3）使用上述步骤分别对粒径60－90nm和160－200nm的胶乳进行分别标

记，标记结束后将所述60-90nm胶乳和所述160-200nm胶乳进行混合，按

体积百分比计，使60－90nm胶乳的浓度

浓度为0.135-0.323％，混合后进

和160－180nm的胶

－

质量

为0.673-0.732％，使160－200nm胶乳的

行保存，优选的使用上述流程分别对粒径70－90nm

乳进行分别标记，标记结束后将所述70－90nm胶乳和所述160

180nm胶乳进行混合，按质量体积百分比计，使70－90nm胶乳浓度为

所述的封闭液为含有5g/L BSA的0.02M PH7.4的磷酸缓冲液；

所述的分散液由BSA，吐温-20、PVP-K30以及生物防腐剂通过0.02M PH7.4

的磷酸缓冲液配制而成，其中BSA浓度为1g/L，吐温-20浓度为0.05%

PVP-K30浓度为2g/L，生物防腐剂浓度为0.05%（v/v）。

0.708-0.732％，使160－180nm胶乳浓度为0.135-0.235％，混合后进行保存；

（v/v），

在本发明中，优选的，所述抗原包括幽门螺杆菌全菌体蛋白、幽门螺杆菌尿素

酶、幽门螺杆菌细胞毒素相关蛋白A(Cytotoxin associated gene A，Cag A)或

杆菌细胞空泡毒素A(Vacuolating cytotoxinA，VacA)中的一种幽门螺

或多种。

幽门螺杆菌可以产生大量的尿素酶，该尿素酶对细菌在体内的定植及致病发挥

着重要作用。尿素酶主要由A(UreA)和B(UreB)两个亚单位组成，分子量分

30kD和63kD，业已证实尿素酶B亚单位(ureB)是幽门螺杆菌

原。

别约为

的一个重要保护性抗

现有研究进一步表明，大约占50-60%的幽门螺杆菌能在体外产生细胞毒素活

性，其中细胞毒素的表达与暴露在幽门螺杆菌表面的细胞毒素相关基因A

该基因表达的蛋白仅存在于产细胞毒素的幽门螺杆菌中，并具

现在认为，该蛋白作为抗原能为临床胃部疾患的

密切相关，

有良好的免疫原性，

诊断提供依据。

细胞空泡毒素A(VacA)也是幽门螺杆菌的特异性表达蛋白，对于临床幽门螺杆

本发明所述幽门螺杆菌抗原的制备步骤包括:

步骤1细菌培养，包括固态培养、液态小量培养和液态大量培养;

步骤2:细菌鉴定、破碎、离心、提取上清、纯化及蛋白浓度测定。

在本发明具体实施例中，作为参考公开了一种制备幽门螺杆菌全菌体抗原的方

在本发明所述的试剂盒中，优选的，还含有标准稀释液、校准品和质控品。

优选的，所述的标准稀释液为Tris/HCl缓冲液、磷酸盐缓冲液、HE PES缓冲

法。

菌的检测具有重要的参考价值。

液、甘氨酸缓冲液、巴比妥缓冲液、MOPSO缓冲液、DIPSO缓冲液或

液中的任一种，优选为磷酸盐缓冲HEPPS缓冲

液。

在本发明中，所述校准品、质控品是一种用来与样本比较，进行结果计算和质

量控制的幽门螺杆菌抗体溶液，优选的，所述的校准品、质控品是一种幽门

抗体溶液，其中包括PBS缓冲液、稳定剂、防腐剂以及幽门

螺杆菌

螺杆菌特异性抗体；

所述稳定剂选自蛋白质、氨基酸、无机盐、表面活性剂中的一种或多种，优选

所述防腐剂选自0.1%的叠氮钠、Procl in-300、庆大霉素中的一种或多种。

校准品的浓度可以是高浓度单点参考校准品，在使用时用生理盐水稀释成多个

不同浓度的参考校准品，也可以直接制备成多个不同浓度的参考校准品，还

固定浓度的单点参考校准品，与生理盐水共同绘制校准曲线。

的单点参考校准品，校准品、质控品的浓度分别

施例中，公开了一种制备校准品、

为含0.05%BSA的磷酸盐缓冲液，

可以是

本发明优选固定浓度

为50AU/mL、31AU/mL。在具体实

质控品的方法。

本发明还公开了所述的试剂盒在制备测定幽门螺杆菌抗体试剂中的应用。

进一步的，本发明还提供了一种用于诊断胃病或胃癌的三联检试剂盒，其特征

在于包括本发明所述的用于测定幽门螺杆菌抗体的胶乳增强免疫比浊试剂盒，

括胃蛋白酶原I检测试剂盒及胃蛋白酶原II检测试剂盒。

还包

作为参考，在本发明的具体实施例部分给出了胃蛋白酶原I检测试剂盒及胃蛋

白酶原II检测试剂盒的制备方法。

本发明测定样本的原理是胶乳增强免疫比浊法，所选样本为人体血清，样本与

试剂Rl预孵育3-5分钟后(使样本中的抗体结合位点充分暴露)，加入试剂

螺杆菌抗原胶乳试剂)，继续孵育3-5分钟，人体血清中的幽

试剂R2中的幽门螺杆菌抗原结合，形成不溶性

浊度，其泊、度高低与检测样本中

不溶性抗原抗体复合

行比较，

R2(幽门

门螺杆菌特异性抗体与

的抗原一抗体复合物，产生一定的

的特异性抗体浓度成正比。在规定波长下测定该

物的吸光度值，与己知浓度的幽门螺杆菌特异性抗体校准品进

则可计算出样本中幽门螺杆菌抗体的浓度。

本发明提供的试剂为液体双试剂，适用于各类型全自动生化分析仪和半自动生

1、定量检测，灵敏度高，可达到/mL，线性范围广，可达到245AU/mL;

2、检测准确度和精密度好;

3、特异性强，且不易受干扰:

4、稳定性好，2-8℃可避光贮存至少12个月，各试剂开瓶后至少可以保存14

5、样本不用预稀释、操作简单、快速，从检测到出结果仅需10分钟，特别

附图说明

适用于大批量筛查，检测速度可随生化分析仪检测速度的提高而提高。

天:

化分析仪，与现有技术相比，具有以下特点·

图1为本发明所述试剂盒线性范围相关性示意图；

图2为使用本发明的试剂盒进行检测的流程示意图。

图3为胃蛋白酶原I与胃部胃底和胃体的胃粘膜状况关系图；

图4为胃蛋白酶原II与胃部胃窦和胃角部位的胃粘膜状况关系图。

具体实施方式

本发明公开了一种测定幽门螺杆菌抗体的胶乳免疫试剂及其制备与应用，本领

域技术人员可以借鉴本文内容，通过适当改进工艺参数而实现。特别需要指

所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，

本发明所要求保护的技术方案之内。本发明的产

了描述，相关人员明显能在不脱离

应用进行改动或适当

出的是，

它们都被视为包括在

品及应用已经通过较佳实施例进行

本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和

变更与组合，来实现和应用本发明技术。

为使本发明更加容易理解，下面结合具体实施例，进一步阐述本发明，这些实

本发明实施例所涉及主要材料及试剂的购买来源：

Q-2阴离子交换层析柱、DEAE-Sephadex A52（DEAE-52）层析柱购买自美

弗氏完全佐剂，生物防腐剂Proclin-300、2-(N-吗啡啉)乙磺酸（MES）购买自

SIGMA；

国GE公司；

施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。

10％（w/w）聚苯乙烯纳米微球溶液购买自美国Bangs；

胃蛋白酶原Ⅰ抗体PGI-8003和PGI-8015购买自Medix批号：0021636，

胃蛋白酶原Ⅱ抗体PGII-8103和PGII-8101购买自Medix批号：0023880

PVP-K30（Polyvinylpyrrolidone）、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、磷酸二氢钾、氯

化钠、氯化钾PFG-6000、EDC（1-(3-二甲氨基

-20等购自国药集团；

丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐、吐温

牛血清白蛋白（BSA）购自元亨金马；

HP菌种购自上海天呈科技有限公司,编号43504；

幽门螺杆菌抗体购自上海领潮生物公司，编号：L1H01202；

实施例1幽门螺杆菌抗原的制备(以全菌体蛋白抗原为例)

(1)细菌培养

(a)固态培养：将HP菌种接种于巧克力培养基中，37℃培养3-4天，即产生扁

平带点透明而似胶状菌落，此即为幽门螺旋杆菌，以接种环挑起数个菌落，

于巧克力培养基上用三区划线法划开后，37℃培养3-4天，每

持菌的活性。

将细菌

隔四天传代一次以保

(b)小量液态培养：将回态培养出的幽门螺旋杆菌菌落，以接种环挂下数个菌落，

并抖落于125ml锥形瓶中，瓶内盛有BHI培养液50ml，其中含1ml新生小

和O.1ml幽门螺旋杆菌筛选液，将锥形瓶瓶口以棉塞覆盖紧，牛血清

37℃培养3~4天。

(c)大量液态培养：吸取0.5ml小量培养菌液，进行初步尿素鉴定以及外观观察，

确认没有受到其他杂菌污染。吸取15ml菌液加入500ml锥形瓶中，瓶内盛

培养液250ml，其中含5ml新生小牛血清和O.5ml幽门螺旋杆菌筛选

瓶口以棉塞覆盖紧，置于37℃培养3~4天。

有BHI

液，将锥形瓶

(2)细菌鉴定、破碎、离心和提取上清

(a)细菌鉴定：外观型态观察:观察菌落在巧克力培养基上的生长型态，为扁平带

尿素检验法:幽门螺杆菌的尿素酶极为丰富，约含菌体蛋白的15%尿素酶催化

尿素水解可产生氨气。取0.5ml尿素测试溶液置于试管中，加入0.5ml菌液，

反应约半小时。若含有幽门螺旋杆菌，则测试溶液会由黄色转

点透明而似胶状菌落。

于37℃

变为粉红色。

(b)细菌破碎、离心和提取上清：取250mL幽门螺旋杆菌菌液，于8000rpm离

心20分钟，弃上请，沉淀加入10m10.05M甘氨酸缓冲液(pH=7.0)清洗，于

离心20分钟，弃上清，沉淀加入lOml 0.05M甘氨酸缓冲液

声破菌，于l8.000rpm离心20分钟，取出上清

8000rpm

(pH=7.0)混合均匀，超

液并将其放置80℃备用。

(c)抗原蛋白浓度测定：以Bio-Rad蛋白测定试剂盒定量幽门螺杆菌抗原蛋白浓

度，首先将胎牛血清蛋白(BSA)溶于PBS中制备

/ml、O.2mg/ml、O.3mg/ml、

释分析缓冲液(含考马斯亮

冲液，最后分

下列各浓度的标准品:Omg/mL、

0.4mg/ml、O.5mg/ml时，然后以二次水5倍稀

兰R-250).接着在96微孔盘中加入100μl稀释后的分析缓

别加入10μl各浓度标准品及(2)中所获幽门螺杆菌抗原蛋白质溶液， 于室温

反应5分钟，以可见分光光度计或酶标仪在595nm波长下读取OD值，绘制

实施例2本发明试剂盒的组装

1缓冲液配置

1.1稀释液(试剂R1)的配制

将下表1中试剂称量好放入洁净容器中，加纯化水混匀，测定pH值为7.4，定

表1稀释液(试剂R1)的配制

1.2标准稀释液的配制

将下表2中试剂称量好放入洁净容器中，加纯化水溶解混匀,测定pH值为7.4，

表2标准稀释液的配制

氯化钾

BSA

丙三醇

吐温-20

Proclin-300

加纯化水至

2.2胶乳前处理

2.2.1取1ml未标记胶乳颗粒，即将1ml 10%聚苯乙烯纳米微球溶液加入10ml

0.02M pH7.4磷酸缓冲液中，离心机10000rpm离心20min，去掉上清液、再

0.02M pH7.4磷酸缓冲液重悬颗粒，离心机10000rpm离心

5ml 0.02M pH7.4磷酸缓冲液重悬、4℃保存待用。

用10ml

20min，去掉上清并用

2.3胶乳颗粒标记

根据胶乳颗粒的质量将2.2处理后胶乳用0.02M pH6.1MES缓冲液将胶乳颗粒

稀释成10mg/ml浓度，加入1mg EDC（1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺

混匀活化15分钟，离心8000rpm弃去上清，并用

加入1mg幽门螺杆菌抗原（实施例1制

匀2－4小时，离心机

粒使用封闭液

分散液；

盐酸盐），

0.02M PH7.4磷酸缓冲液重悬，

备得到）于10mg/ml 2ml胶乳液体，室温混

8000rpm离心15分钟，将上清分离到另外的容器中备用；颗

重悬，并室温混匀1小时，离心机8000rpm离心15min，沉淀复溶于

将标记完成的胶乳颗粒分装成1ml/支4℃保存。

使用上述流程分别对粒径75nm和167nm的胶乳进行分别标记，标记结束后将

所述75nm胶乳和所述167nm胶乳进行混合，使75nm胶乳浓度为0.724％

使167nm胶乳浓度为0.147%（w/v）。 （w/v），

5、确定稀释倍数

取抗原标记剩余上清液体分别用OD₂₆₀和OD₂₈₀测量其

吸光度值，利用测量结 果并根据以下公式计算剩余上清液中抗原的浓度

确定稀释倍数。 和标记效率；最后根据标记蛋白量

抗原浓度=1.45*A₂₈₀-0.74*A₂₆₀

标记抗原量＝标记总蛋白量-上清中蛋白量

标记效率=（标记总蛋白量-上清中蛋白量）/标记总蛋白量*100%

6、胶乳颗粒稀释

按照抗原过量原则，根据已定所需标记抗原浓度用分散液对标记的抗原进行稀

稀释方法：将标记完成的胶乳试剂进行稀释，稀释比例为1：8；1：9；1：10，

7、分装

将检测合格的胶乳微粒工作液进行分装，贴上标签后，置于2～8℃保存。

8、校准品及质控品配制

取大小合适的容器3个，使用标准稀释液配制浓度点为0、50AU/ml的校准品，

以及31AU/ML的质控品，各浓度点要与依次加入的原料浓溶液混匀。

分别使用稀释后的胶乳试剂进行定标测试，选取线性最优为最佳稀释比例。

释。

9、分装

经检验合格后，将配制好的校准品和质控品分装到1ml塑料瓶中，1.0ml/瓶。

质控品的目的：在定标完成以后，首先测试质控品，其浓度应在标示的范围之

内，如超出则认为试剂盒定标不成功或者试剂盒失效。本实施例中质控品浓

31AU/ML，若检测浓度为26－36AU/ML之间，则认为试剂盒有效，

认定测定结果无效。

度为

超出该范围则

实施例2幽门螺杆菌抗体胶乳免疫试剂的测定方法

本试剂盒采用的基本原理为胶乳增强免疫比浊法。将幽门螺旋杆菌抗原吸附于

乳胶粒颗粒上，通过孵育使稀释的人血清中的特异性抗体与抗原结合，经孵

产生的吸光度变化量与检测样本中的特异性抗体浓度成正比。育后，

表5本发明试剂盒的主要组成成份

储存条件及有效期：试剂盒应在2-8℃下干燥保存，贮存时避免重压并应防潮、

本试剂盒适用于贝克曼、日立、奥林巴斯、东芝、罗氏、雅培、西门子、迈瑞

1.试剂配置：试剂开瓶即用，缓冲液及乳液试剂在测定前要充分混匀；

2.试验条件：

先加入R1试剂200ul，再加入血清样本5ul，37℃反应5分钟后加入R2试剂

30ul读取OD，反应5分钟后在578nm的波长下

行检测的流程示意图如图2所示。

等品牌的全自动或半自动生化分析仪，测定方法如下:

避光、避热；有效期：12个月。

读取数据，使用本发明的试剂盒进

3.结果计算：以标准品浓度做标准曲线，样品中的抗原浓度通过标准曲线读出。

实施例3利用本发明试剂盒对幽门螺杆菌抗体的测定

1、采用本发明试剂盒按照实施例5的方法分析了无胃病人群280名（体检后证

实无消化道疾病，肝、肾疾病，无胃痛史的人群）及胃病组329例（均经胃

病理确诊。分为5组：十二指肠球部溃疡组75例；胃溃疡组

镜检查，

55例；萎缩性胃炎组61

例；胃癌组113例；贲门癌组5例。结果见表4：

表6利用本发明试剂盒对幽门螺杆菌抗体的测定

根据临床试验结果，结合文献研究，本发明试剂盒采用以下的诊断指标，本

HP≤12AU/ml，无胃部疾病，胃癌风险指数低（1X）；

12AU/ml≤HP≤29AU/ml，轻度幽门螺杆菌感染，胃癌风险指数低（1X）

30AU/ml≤HP≤60AU/ml，高度幽门螺杆菌感染，胃癌风险指数较高（7-9X）,

HP≥60AU/ml，重度幽门螺杆菌感染，胃癌风险指数（9-10X），建议内窥

建议内窥镜检查。

评价以1-10X作为评价胃癌风险程度，其中1X最低，10X最高：

镜检查以确诊。

2、采用本发明试剂盒对典型病例进行诊断的结果

病例1

病例2

病例3

实施例4一种用于诊断胃病或胃癌的三联检试剂盒的组装

该试剂盒中包括实施例2制备得到幽门螺杆菌抗体检测试剂盒及胃蛋白酶原I、

一、胃蛋白酶原II检测试剂盒的制备：

1缓冲液配置

1.1稀释液(R1)的配制

将下表7中试剂称量好放入洁净容器中，加纯化水混匀，测定pH值为7.4，定

胃蛋白酶原II检测试剂盒。

容1000ml。

表7稀释液(R1)的配制

BSA

吐温-20

Proclin-300

加纯化水至

氢二钠 1.44g

磷酸二氢钾

氯化钠

氯化钾

BSA

吐温-20

1.36g

8g

0.2g

10g

0.5mL

0.5ml

1000ml

Proclin-300

加纯化水至

2含胃蛋白酶原II抗体的胶乳试剂（试剂2）制备

2.1缓冲液的配置如表9所示

表9缓冲液的配置

2.2胶乳前处理

2.2.1取1ml未标记胶乳颗粒，即将1ml 10%聚苯乙烯纳米微球溶液加入10ml

0.02M pH7.4磷酸缓冲液中，离心机10000rpm离心20min，去掉上清液、再

0.02M pH7.4磷酸缓冲液重悬颗粒，离心机10000rpm离心

5ml 0.02M pH7.4磷酸缓冲液重悬、4℃保存待用。

用10ml

20min，去掉上清并用

2.3胶乳颗粒标记

根据胶乳颗粒的质量将2.2处理后胶乳用0.02M pH6.1MES缓冲液将胶乳颗粒

稀释成10mg/ml浓度，加入1mg EDC（1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺

混匀活化15分钟，离心8000rpm弃去上清，并用

加入针对胃蛋白酶原Ⅱ表面的不同抗原决

0.5mg PGII-8101的混合物，抗体

离心机8000rpm离

重悬，

盐酸盐），

0.02M PH7.4磷酸缓冲液重悬，

定簇的单克隆抗体0.5mg PGII-8103和

于10mg/ml 2ml胶乳液体，室温混匀2－4小时，

心15分钟，将上清分离到另外的容器中备用；颗粒使用封闭液

并室温混匀1小时，离心机8000rpm离心15min，沉淀复溶于分散液；将标

使用上述流程分别对粒径70nm和170nm的胶乳进行分别标记，标记结束后将

所述70nm胶乳和所述170nm胶乳进行混合，使70nm胶乳浓度为0.691％

使170nm胶乳浓度为0.191%（w/v）。

记完成的胶乳颗粒分装成1ml/支4℃保存。

（w/v），

5、确定稀释倍数

取抗体标记剩余上清液体分别用OD₂₆₀和OD₂₈₀测量其

吸光度值，利用测量结 果并根据以下公式计算剩余上清液中抗体的浓度

确定稀释倍数。 和标记效率；最后根据标记抗体量

抗体浓度=1.45*A₂₈₀-0.74*A₂₆₀

标记抗体量＝标记总蛋白量-上清中蛋白量

标记效率=（标记总蛋白量-上清中蛋白量）/标记总蛋白量*100%

6、胶乳颗粒稀释

按照抗体过量原则，根据已定所需标记抗体浓度用分散液对标记的抗体进行稀

稀释方法：将标记完成的胶乳试剂进行稀释，稀释比例为1：8；1：9；1：10，

分别使用稀释后的胶乳试剂进行定标测试，选取

释。

线性最优为最佳稀释比例。

7、分装

将检测合格的胶乳微粒工作液进行分装，贴上标签后，置于2～8℃保存。

8、校准品及质控品配制

取大小合适的容器6个，使用标准稀释液配制浓度点依次为0、5.4、15.0、31.0、

64.5、107.8μg/L的校准品各点，以及10μg/L的质控品，各浓度点要与依次

原料浓溶液混匀。

加入的

9、分装

经检验合格后，将配制好的标准品和质控品分装到1ml塑料瓶中，1.0ml/瓶。

质控品的目的：在定标完成以后，首先测试质控品，其浓度应在标示的范围之

内，如超出则认为试剂盒定标不成功或者试剂盒失效。本实施例中质控品浓

10μg/L，若检测浓度为9-12μg/L之间，则认为试剂盒有效，超出该

结果无效。

度为

范围则认定测定

二、胃蛋白酶原I检测试剂盒的制备：

1缓冲液配置

1.1稀释液(R1)的配制

将下表10中试剂称量好放入洁净容器中，加纯化水混匀，测定pH值为7.4，

1.2标准稀释液的配制

将下表11中的试剂称量好放入洁净容器中，加纯化水溶解混匀,测定pH值为

表11标准稀释液的配制

氯化钾

BSA

吐温-20

Proclin-300

加纯化水至

用10ml

20min，去掉上清并用

酸缓冲液重悬、4℃保存待用。

2.3胶乳颗粒标记

根据胶乳颗粒的质量将2.2处理后胶乳用0.02M pH6.1MES缓冲液将胶乳颗粒

稀释成10mg/ml浓度，加入1mg EDC（1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺

混匀活化15分钟，离心8000rpm弃去上清，并用

加入0.5mg PGI-8003抗体和0.5mg PGI-

匀2－4小时，离心机

粒使用封闭液

分散液；

盐酸盐），

0.02M PH7.4磷酸缓冲液重悬，

8015抗体于10mg/ml 2ml胶乳液体，室温混

8000rpm离心15分钟，将上清分离到另外的容器中备用；颗

重悬，并室温混匀1小时，离心机8000rpm离心15min，沉淀复溶于

将标记完成的胶乳颗粒分装成1ml/支4℃保存。

使用上述流程分别对粒径75nm和167nm的胶乳进行分别标记，标记结束后将

所述75nm胶乳和所述167nm胶乳进行混合，使75nm胶乳浓度为0.679％

使167nm胶乳浓度为0.178%（w/v）。混合后进行保存。 （w/v），

2.4确定稀释倍数

取抗体标记剩余上清液体分别用OD₂₆₀和OD₂₈₀测量其

吸光度值，利用测量结 果并根据一下公式计算剩余上清液中抗体的浓度

确定稀释倍数。 和标记效率；最后根据标记抗体量

抗体浓度=1.45*A₂₈₀-0.74*A₂₆₀

标记抗体量＝标记总蛋白量-上清中蛋白量

标记效率=（标记总蛋白量-上清中蛋白量）/标记总蛋白量*100%

经过测量计算得出上清液中蛋白量为0.367mg，标记抗体量为1.633mg，标记

2.5胶乳颗粒稀释

按照抗体过量原则，根据已定所需标记抗体浓度用分散液对标记的抗体进行稀

稀释方法：将标记完成的胶乳试剂进行稀释，稀释比例为1：8；1：9；1：10，

2.6分装

将检测合格的胶乳微粒工作液进行分装，贴上标签后，置于2～8℃保存。

3校准品及质控品

3.1校准品及质控品配制方法

3.1.1采用逐点加样法配制；

3.1.2A为标准稀释液；

3.1.3取大小合适的容器6个，用标准稀释液配制浓度点依次为0、13.2、33.3、

67.0、150.5、245.0μg/L的A、B、C、D、E、F校准品各点，以及30μg/L

各浓度点要依次加入的原料浓溶液混匀。

分别使用稀释后的胶乳试剂进行定标测试，选取线性最优为最佳稀释比例。

释。

效率为81.65％。

的质控品，

3.2分装

经检验合格后，将配制好的标准品和质控品分装到1ml塑料瓶中，1.0ml/瓶。

质控品的目的：在定标完成以后，首先测试质控品，其浓度应在标示的范围之

内，如超出则认为试剂盒定标不成功或者试剂盒失效。本实施例中质控品浓

30μg/L，若检测浓度为26-36μg/L之间，则认为试剂盒有效，超出该

结果无效。

度为

范围则认定测定

实施例5用于诊断胃病或胃癌的三联检试剂盒的应用

通过检测血液中胃蛋白酶原I、胃蛋白酶原II和幽门螺杆菌抗体含量，对三个

结果综合分析从而反应胃粘膜状态。胃蛋白酶原I主要反映胃部胃底和胃体

膜状况，其主要表现如图3所示；胃蛋白酶原II主要反映胃

粘膜状况，其主要表现如图4所示；幽门螺杆菌

抗体的检测对反映胃部整体胃粘膜

的胃粘

部胃窦和胃角部位的胃

是胃部疾病发生的主要致病菌，HP

的状况具有非常重要的作用。

检验原理：采用免疫比浊法，以乳胶增强免疫比浊法为测定原理。分别对样品

中的幽门螺杆菌抗体、PG Ⅰ以及PG II进行测定，幽门螺杆菌抗体、PG Ⅰ

分别与标记了幽门螺杆菌抗原以及抗PG Ⅰ抗体、抗PG II抗

的抗原抗体反应，形成免疫复合物，从而引起吸

品中的幽门螺杆菌抗体、PG Ⅰ以

抗体、PG Ⅰ以及

杆菌抗

以及PG II

体的乳胶颗粒发生特异性

光度的变化。此吸光度的变化与样

及PG II浓度呈正比。分别用已知浓度的幽门螺杆菌

PG II标准品制作工作曲线，从该曲线上即可计算出样品中的幽门螺

体、PG Ⅰ以及PG II含量。

储存条件及有效期：试剂盒应在2-8℃下干燥保存，贮存时避免重压并应防潮、

避光、避热；有效期：12个月。

适用仪器：东芝（TBA-40FR）、迪瑞（CS-T300）、劳拉(FAITH-1000)、奥林巴

样本要求：病人标本无需特殊处理，采用常规医用技术收集全血标本，离心

分离后吸取血清用于检测。待测血清如在24小

需长期存放应保存在-20℃以下，

疸标本。

斯(AU-1000)、迈瑞(BS-200)等生化分析仪。

时之内使用，可于2～8℃保存，若

并避免反复冻融。请不要使用严重溶血、脂血或黄

对样品中的幽门螺杆菌抗体、PG Ⅰ以及PG II的测定分别按照以下方法进行：

检验方法：

1.试剂配置：试剂开瓶即用，缓冲液及乳液试剂在测定前要充分混匀；

2.试验条件：

血清标本：5ul

R1：200ul R2：30ul 波长：578nm 反应温度：37℃

先加入R1试剂200ul，再加入血清样本5ul，37℃反应5分钟后加入R2试剂

3、结果计算：以标准品浓度做标准曲线，样品中的抗原浓度通过标准曲线读

出。

30ul读取OD，反应5分钟后在578nm的波长下读取数据。

4、检测结果

采用本发明试剂盒按照实施例5的方法分析了无胃病人群280名（体检后证实无

消化道疾病，肝、肾疾病，无胃痛史的人群）及胃病组329例（均经胃镜检

理确诊。分为5组：十二指肠球部溃疡组75例；胃溃疡组55

胃癌组113例；贲门癌组5例。结果见表13：

查，病

例；萎缩性胃炎组61例；

表13检测结果

根据临床试验结果，结合文献研究，本发明试剂盒采用以下的诊断指标，本

评价以1-10X作为评价胃癌风险程度，其中1X最低，10X最高：

PG Ⅰ≥67ng/ml，PG Ⅰ/PG Ⅱ≥7.5，HP≤12AU/ml，无胃部疾病，胃癌风险指

数低（1X）；

PG Ⅰ≥67ng/ml，PG Ⅰ/PG Ⅱ≤7.5，12AU/ml≤HP≤29AU/ml，十二指肠球部溃

疡或胃溃疡，胃癌风险指数低（1X）

35ng/ml≤PG Ⅰ≤67ng/ml，PG Ⅰ/PG Ⅱ≤3.0，HP≥30AU/ml，诊断为萎缩性

胃炎，胃癌风险指数高（7-9X）,建议内窥镜检查。

PG Ⅰ<35ng/ml，PG Ⅰ/PG Ⅱ≤1.5，HP≥60AU/ml诊断为胃癌，胃癌风险指

数（9-10X），建议内窥镜检查以确诊。

2、采用本发明试剂盒对典型病例进行诊断的结果

病例1

病例2

病例3

病例4

试验例1单一粒径的胶乳和两种粒径的混合胶乳的灵敏度及线性范围比较

测试所使用生化仪为迪瑞CS-T300。

灵敏度对比实验：使用单一75nm粒径标记后的胶乳和75nm与167nm标记后混合

的胶乳对零值校准品进行重复测定20次的浊度变化值，计算平均值，则浊

越小灵敏度越高。

度变化值

线性范围对比实验：使用单一167nm粒径标记后的胶乳和75nm与167nm标记后

混合的胶乳对50AU/ml校准品进行重复测定20次的浊度变化值，计算平均

度变化值越大线性范围越大。测定结果如表14所示。 值，则浊

表14灵敏度及线性范围测定结果

单一使用粒径低于100nm的胶乳则出现检测灵敏度达不到要求，单一使用粒径

为200nm左右的胶乳则线性范围较小，故使用单一粒径胶乳无法同时兼顾

度和线性范围，使用本发明的复合胶乳进行标记后，可以提高

宽检测线性范围，对疾病，特别是胃病或胃癌的

特异性强和准确性好等优点。

检测灵敏

检测灵敏度，又可拓

检测来说具有检测快速、敏感度高、

2024年6月13日发(作者：文城)

(19)中华人民共和国国家知识产权局

(12)发明专利说明书

(21)申请号 CN2.4

(22)申请日 2012.05.11

(71)申请人 北京美康生物技术研究中心

地址 100070 北京市丰台区南四环西路188号总部基地15区5号楼7-8层

(72)发明人 金鑫

(74)专利代理机构 北京科龙寰宇知识产权代理有限责任公司

代理人 孙皓晨

(51)

G01N33/569

G01N33/574

(10)申请公布号 CN 102662059 A

(43)申请公布日 2012.09.12

权利要求说明书 说明书 幅图

(54)发明名称

一种用于测定幽门螺杆菌抗体的胶

乳增强免疫比浊试剂盒及其制备方法和应

用

(57)摘要

本发明公开了一种测定幽门螺杆菌

抗体的胶乳增强免疫比浊试剂盒及其制备

方法和应用。该试剂盒的组成包括：稀释

液、幽门螺杆菌抗原的胶乳试剂和空白

液，还可包括校准品和质控品。所述的幽

门螺杆菌抗原为幽门螺杆菌抗原，可为幽

门螺杆菌全菌体蛋白抗原、幽门螺杆菌尿

素酶抗原、幽门螺杆菌细胞毒素相关蛋白

A抗原或幽门螺杆菌细胞空泡毒素A抗原

中的一种或多种，所述胶乳试剂为已吸附

幽门螺杆菌抗原的两种不同粒径胶乳颗粒

的混合物，制备所述校准品、质控品所需

的幽门螺杆菌抗体源自感染幽门螺杆菌患

者血清中IgM和/或IgG。本发明适用于各

类型全自动生化分析仪和半自动生化分析

仪，具有检测快速、敏感度高、特异性强

和准确性好等优点。

法律状态

法律状态公告日

法律状态信息

法律状态

权 利 要 求 说 明 书

1.一种用于测定幽门螺杆菌抗体的胶乳增强免疫比浊试剂盒，其特征在于包

所述的幽门螺杆菌抗原的胶乳试剂为已吸附幽门螺杆菌抗原的两种不同粒径

2.按照权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：所述的稀释液为含有反应增

强剂的缓冲液，所述的缓冲液为Tris/HCl缓冲液、磷酸盐缓冲液、HE PES

甘氨酸缓冲液、巴比妥缓冲液、MOPSO缓冲液、

的任一种，优选为磷酸盐缓冲液；

PEG6000中的任一

的胶乳颗粒的混合物，所述的胶乳颗粒为聚苯乙烯微球。

括：稀释液、幽门螺杆菌抗原的胶乳试剂及空白液；

缓冲液、

DIPSO缓冲液或HEPPS缓冲液中

所述的反应增强剂为PEG-300、PEG2000或

种或几种，优选为PEG6000；更优选的所述的稀释液中还含有

2mol/L的氯化钠。

3.按照权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：所述的胶乳试剂为已吸附幽

门螺杆菌抗原的粒径为60－90nm和粒径为160－200nm的胶乳颗粒的混合

物。

4.按照权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：所述的胶乳试剂按照以下方

法制备得到：

（1）胶乳前处理

取1ml未标记的胶乳颗粒加入10ml 0.02M pH7.4磷酸缓冲液中，离心机

10000rpm离心20min，去掉上清液、再用10ml 0.02M pH7.4磷酸缓冲液重

离心机10000rpm离心20min，去掉上清并用

保存待用；

悬颗粒，

5ml 0.02M pH7.4磷酸缓冲液重悬、4℃

（2）胶乳颗粒标记

将步骤（1）处理后胶乳用0.02M pH6.1MES缓冲液将胶乳颗粒稀释成10mg/ml

浓度，然后加入1mg EDC，混匀活化15分钟，离心8000rpm弃去上

PH7.4磷酸缓冲液重悬，加入1mg幽门螺杆菌抗

温混匀2－4小时，离心机

颗粒使

清，并用0.02M

原于10mg/ml 2ml胶乳液体中，室

8000rpm离心15分钟，将上清分离到另外的容器中备用，

用封闭液重悬，并室温混匀1小时，离心机8000rpm离心15min，沉淀复溶

（3）使用上述步骤分别对粒径60－90nm和160－200nm的胶乳进行分别标

记，标记结束后将所述60－90nm胶乳和所述160－200nm胶乳进行混合，

体积百分比计，使60－90nm胶乳的浓度为0.673-

浓度为

于分散液，将标记完成的胶乳颗粒分装成1ml/支，4℃保存；

按质量

0.732％，使160－200nm胶乳的

0.135-0.323％，混合后进行保存，优选的使用上述流程分别对粒径70－90nm

和160－180nm的胶乳进行分别标记，标记结束后将所述70－90nm

－180nm胶乳进行混合，按质量体积百分比计，

0.708-0.732％，使160－180nm胶乳浓度

胶乳和所述160

使70－90nm胶乳浓度为

为0.135-0.235％，混合后进行保存；

所述的封闭液为含有5g/L BSA的0.02M PH7.4的磷酸缓冲液；

所述的分散液由BSA，吐温-20、PVP-K30以及生物防腐剂通过0.02M PH7.4

的磷酸缓冲液配制而成，其中BSA浓度为1g/L，吐温-20浓度为

PVP-K30浓度为2g/L，生物防腐剂浓度为0.05%0.05%（v/v），

（v/v）。

5.按照权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：所述抗原包括幽门螺杆菌全

菌体蛋白抗原、幽门螺杆菌尿素酶抗原、幽门螺杆菌细胞毒素相关蛋白A

门螺杆菌细胞空泡毒素A抗原中的一种或多种。 抗原或幽

6.按照权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：还含有标准稀释液、校准品

7.按照权利要求7所述的试剂盒，其特征在于：所述的标准稀释液为Tris/HCl

缓冲液、磷酸盐缓冲液、HE PES缓冲液、甘氨酸缓冲液、巴比妥缓

缓冲液、DIPSO缓冲液或HEPPS缓冲液中的任

和质控品。

冲液、MOPSO

一种，优选为磷酸盐缓冲液。

8.按照权利要求7所述的试剂盒，其特征在于：所述的校准品、质控品是一

种幽门螺杆菌抗体溶液，其中包括PBS缓冲液、稳定剂、防腐剂以及幽门

螺杆菌特

异性抗体；

所述稳定剂选自蛋白质、氨基酸、无机盐、表面活性剂中的一种或多种

所述防腐剂选自0.1%的叠氮钠、Proclin-300、庆大霉素中的一种或多种。

9.权利要求1-9任一项所述的试剂盒在制备测定幽门螺杆菌抗体试剂中的应

10.一种用于诊断胃病或胃癌的三联检试剂盒，其特征在于包括权利要求1-8

任一项所述的试剂盒，还包括胃蛋白酶原I检测试剂盒及胃蛋白酶原II检测

用。

试剂盒。

说 明 书

技术领域

本发明涉及一种检测试剂盒，特别涉及一种用于检测人体血清中幽门螺杆菌抗

背景技术

幽门螺杆菌（Helicobacter pylori，简称HP)是一种单极、多鞭毛、末端钝圆、

螺旋形弯曲的细菌，呈革兰染色阴性，在胃粘膜上皮细胞表面常呈典型的螺

弧形。

体的胶乳免疫试剂盒及其制备方法。本发明属于生物检测技术领域

旋状或

幽门螺杆菌感染是慢性活动性胃炎、消化性胃溃殇以及胃动膜相关淋巴组织

(MALT)淋巴瘤的主要致病因素，并且与胃癌的发生密切相关.1994年世界卫

国际癌症研究机构(WHO/IARC)将幽门螺杆菌定为I类致癌原。

粘膜活检标本中幽门螺杆菌检出率可达80%～90%.而

95%以上，甚至接近100%。胃癌由于局

报道不一。幽门螺杆菌的感

传播与流行及

生组织/

慢性胃炎患者的胃

消化性胃溃殇患者更高，可达

部上皮细胞己发生异化，因此其检出率高低

染己是个世界性问题，对其进行准确诊断有利于控制HP

根除HP感染治疗的监测。

目前，国内外已建立的HP检测方法从检测手段上分为侵入性和非侵入性两大

一、侵入性检测方法

这类方法的特点是使用内窥镜取得胃活检组织后进行检测，试验方法主要有快

速尿酶试验法、病理学检测法及细菌培养法。

类。

1、快速尿酶检测法:依据HP具有丰富的尿素酶可分解尿素产生氨气，由pH指

示剂显色。该法简便、迅速、灵敏，但也有可能因含尿素酶的其他细菌存在

生假阳性。此外，近期使用过降低胃部细菌量或直接抑制尿素酶活性

可产生假阴性。

而产

的药物的样品

2、病理学检测法:通过对胃粘膜组织进行切片染色检查，可直接显示HP菌体

而证实，其中银染法检测率高，但不同病理学家观察的差异性对于胃萎缩样

断具有一定的困难性。 品的诊

3、细菌培养法取胃粘膜活组织作HP培养，因培养细菌较少、操作过程较复杂、

二、非侵入性检测方法

此类方法特点是不需要使用内窥镜采取胃活检组织，从而避免病人因反复做胃

窥镜而带来的侵害痛苦或发生其它类型的感染。试验方法主要有尿素呼吸试

检测法和免疫血清学法。

时间周期较氏、费用昂贵而不适宜普遍应用。

验、PCR

1、尿素呼吸试验:由于HP富含尿素酶，用13C或14C标记的尿素由受试者服

用后，根据气体核素质谱仪检测到分解产生的带同位素标记的二氧化碳标本

HP感染程度。该法灵敏度高，可定量，但有一定的放射性危

难于普遍推广。

来判断

险，并且受设备限制

2、PCR检测法:主要检测胃液、粘膜中HP尿素酶(UReA)基因和毒素相关蛋白A

(CagA)基因，但操作复杂，易污染，对检验人员的专业知识及操作技术的要

且大大增加患者的经济开支，因此在临床上的应用也较为有限。求较高，

3、免疫血清学法:目前已有方法包括酶联免疫法、免疫印迹法和胶体金法，为

HP的流行病学调查提供了有利便捷手段，但检测速度慢，除酶联免疫法可

自动酶免分析仪(且需2~3小时、步骤多)外，其余都需手工操

果为定性分析，不适于治疗监控及疗效评估。

使用全

作，患者获得检测结

目前，虽然检测幽门螺旋杆菌感染的方法繁多，但还没有一种合适的生化分析

仪，能够简便、快速、大批量且定量的进行检测。如能建立该种方法，则能

测过程大为简便化，操作人员只需设置好上机参数，将试剂和样本置

生化分析仪即可全自动完成检测，并能够迅速得到结果，

应用，对于幽门螺旋杆菌的防治具有重大的临床

使检

于相应位置后，

易于在各级医疗机构推广

意义和普及价值。

发明内容

本发明的目的在于克服现有方法及技术的缺陷，提供一种测定幽门螺杆菌抗体

的胶乳免疫试剂盒及其制备方法以及使用该试剂进行临床样本检测的方法。

适用于各类型生化分析仪，具有样本无需稀释、操作简单、快

性好、稳定性好、敏感度高、特异性强的特点。

该试剂

速、定量准确、重复

为实现本发明的目的，采用了如下的技术方案:

本发明的一种用于测定幽门螺杆菌抗体的胶乳增强免疫比浊试剂盒，其特征在

其中，所述的幽门螺杆菌抗原的胶乳试剂为已吸附幽门螺杆菌抗原的两种不同

粒径的胶乳颗粒的混合物，所述的胶乳颗粒为聚苯乙烯微球。

于包括：稀释液、幽门螺杆菌抗原的胶乳试剂及空白液；

在本发明中，优选的，所述的稀释液为含有表面活性剂及反应增强剂的缓冲液，

所述的缓冲液为Tris/HCl缓冲液、磷酸盐缓冲液、HE PES缓冲液、甘氨酸

巴比妥缓冲液、MOPSO缓冲液、DIPSO缓冲液或HEPPS缓

为磷酸盐缓冲液；所述的反应增强剂为PEG-300、

种或几种，优选为PEG6000；更优选的

缓冲液、

冲液中的任一种，优选

PEG2000或PEG6000中的任一

所述的稀释液中还含有2mol/L的氯化钠。

其中，无机盐氯化钠可以调节离子强度，反应增强剂可以加快抗原抗体的免疫

反应速度，缩短检测时间，表面活性剂（Tween 20）可以去除非特异性的结

合反应。

在本发明中，优选的，所述的胶乳试剂为已吸附幽门螺杆菌抗原的粒径为60

优选的，所述的胶乳颗粒为聚苯乙烯纳米微球，这种组合既能够提高反应的灵

在本发明中，优选的，所述的胶乳试剂可以按照以下方法制备得到：

（1）胶乳前处理

取1ml未标记的胶乳颗粒加入10ml 0.02M pH7.4磷酸缓冲液中，离心机

10000rpm离心20min，去掉上清液、再用10ml 0.02M pH7.4磷酸缓冲液重

离心机10000rpm离心20min，去掉上清并用5ml 0.02M pH7.4

保存待用；

敏度，而且也能够提高试剂的检测范围。

－90nm和粒径为160－200nm的胶乳颗粒的混合物。

悬颗粒，

磷酸缓冲液重悬、4℃

（2）胶乳颗粒标记

将步骤（1）处理后胶乳用0.02M pH6.1MES缓冲液将胶乳颗粒稀释成10mg/ml

浓度，然后加入1mg EDC，混匀活化15分钟，离心8000rpm弃去上清，并

PH7.4磷酸缓冲液重悬，加入1mg幽门螺杆菌抗原于

温混匀2－4小时，离心机8000rpm离心

颗粒使用封闭液重悬，并室

于分散液，将标记完

用0.02M

10mg/ml 2ml胶乳液体中，室

15分钟，将上清分离到另外的容器中备用，

温混匀1小时，离心机8000rpm离心15min，沉淀复溶

成的胶乳颗粒分装成1ml/支，4℃保存；

（3）使用上述步骤分别对粒径60－90nm和160－200nm的胶乳进行分别标

记，标记结束后将所述60-90nm胶乳和所述160-200nm胶乳进行混合，按

体积百分比计，使60－90nm胶乳的浓度

浓度为0.135-0.323％，混合后进

和160－180nm的胶

－

质量

为0.673-0.732％，使160－200nm胶乳的

行保存，优选的使用上述流程分别对粒径70－90nm

乳进行分别标记，标记结束后将所述70－90nm胶乳和所述160

180nm胶乳进行混合，按质量体积百分比计，使70－90nm胶乳浓度为

所述的封闭液为含有5g/L BSA的0.02M PH7.4的磷酸缓冲液；

所述的分散液由BSA，吐温-20、PVP-K30以及生物防腐剂通过0.02M PH7.4

的磷酸缓冲液配制而成，其中BSA浓度为1g/L，吐温-20浓度为0.05%

PVP-K30浓度为2g/L，生物防腐剂浓度为0.05%（v/v）。

0.708-0.732％，使160－180nm胶乳浓度为0.135-0.235％，混合后进行保存；

（v/v），

在本发明中，优选的，所述抗原包括幽门螺杆菌全菌体蛋白、幽门螺杆菌尿素

酶、幽门螺杆菌细胞毒素相关蛋白A(Cytotoxin associated gene A，Cag A)或

杆菌细胞空泡毒素A(Vacuolating cytotoxinA，VacA)中的一种幽门螺

或多种。

幽门螺杆菌可以产生大量的尿素酶，该尿素酶对细菌在体内的定植及致病发挥

着重要作用。尿素酶主要由A(UreA)和B(UreB)两个亚单位组成，分子量分

30kD和63kD，业已证实尿素酶B亚单位(ureB)是幽门螺杆菌

原。

别约为

的一个重要保护性抗

现有研究进一步表明，大约占50-60%的幽门螺杆菌能在体外产生细胞毒素活

性，其中细胞毒素的表达与暴露在幽门螺杆菌表面的细胞毒素相关基因A

该基因表达的蛋白仅存在于产细胞毒素的幽门螺杆菌中，并具

现在认为，该蛋白作为抗原能为临床胃部疾患的

密切相关，

有良好的免疫原性，

诊断提供依据。

细胞空泡毒素A(VacA)也是幽门螺杆菌的特异性表达蛋白，对于临床幽门螺杆

本发明所述幽门螺杆菌抗原的制备步骤包括:

步骤1细菌培养，包括固态培养、液态小量培养和液态大量培养;

步骤2:细菌鉴定、破碎、离心、提取上清、纯化及蛋白浓度测定。

在本发明具体实施例中，作为参考公开了一种制备幽门螺杆菌全菌体抗原的方

在本发明所述的试剂盒中，优选的，还含有标准稀释液、校准品和质控品。

优选的，所述的标准稀释液为Tris/HCl缓冲液、磷酸盐缓冲液、HE PES缓冲

法。

菌的检测具有重要的参考价值。

液、甘氨酸缓冲液、巴比妥缓冲液、MOPSO缓冲液、DIPSO缓冲液或

液中的任一种，优选为磷酸盐缓冲HEPPS缓冲

液。

在本发明中，所述校准品、质控品是一种用来与样本比较，进行结果计算和质

量控制的幽门螺杆菌抗体溶液，优选的，所述的校准品、质控品是一种幽门

抗体溶液，其中包括PBS缓冲液、稳定剂、防腐剂以及幽门

螺杆菌

螺杆菌特异性抗体；

所述稳定剂选自蛋白质、氨基酸、无机盐、表面活性剂中的一种或多种，优选

所述防腐剂选自0.1%的叠氮钠、Procl in-300、庆大霉素中的一种或多种。

校准品的浓度可以是高浓度单点参考校准品，在使用时用生理盐水稀释成多个

不同浓度的参考校准品，也可以直接制备成多个不同浓度的参考校准品，还

固定浓度的单点参考校准品，与生理盐水共同绘制校准曲线。

的单点参考校准品，校准品、质控品的浓度分别

施例中，公开了一种制备校准品、

为含0.05%BSA的磷酸盐缓冲液，

可以是

本发明优选固定浓度

为50AU/mL、31AU/mL。在具体实

质控品的方法。

本发明还公开了所述的试剂盒在制备测定幽门螺杆菌抗体试剂中的应用。

进一步的，本发明还提供了一种用于诊断胃病或胃癌的三联检试剂盒，其特征

在于包括本发明所述的用于测定幽门螺杆菌抗体的胶乳增强免疫比浊试剂盒，

括胃蛋白酶原I检测试剂盒及胃蛋白酶原II检测试剂盒。

还包

作为参考，在本发明的具体实施例部分给出了胃蛋白酶原I检测试剂盒及胃蛋

白酶原II检测试剂盒的制备方法。

本发明测定样本的原理是胶乳增强免疫比浊法，所选样本为人体血清，样本与

试剂Rl预孵育3-5分钟后(使样本中的抗体结合位点充分暴露)，加入试剂

螺杆菌抗原胶乳试剂)，继续孵育3-5分钟，人体血清中的幽

试剂R2中的幽门螺杆菌抗原结合，形成不溶性

浊度，其泊、度高低与检测样本中

不溶性抗原抗体复合

行比较，

R2(幽门

门螺杆菌特异性抗体与

的抗原一抗体复合物，产生一定的

的特异性抗体浓度成正比。在规定波长下测定该

物的吸光度值，与己知浓度的幽门螺杆菌特异性抗体校准品进

则可计算出样本中幽门螺杆菌抗体的浓度。

本发明提供的试剂为液体双试剂，适用于各类型全自动生化分析仪和半自动生

1、定量检测，灵敏度高，可达到/mL，线性范围广，可达到245AU/mL;

2、检测准确度和精密度好;

3、特异性强，且不易受干扰:

4、稳定性好，2-8℃可避光贮存至少12个月，各试剂开瓶后至少可以保存14

5、样本不用预稀释、操作简单、快速，从检测到出结果仅需10分钟，特别

附图说明

适用于大批量筛查，检测速度可随生化分析仪检测速度的提高而提高。

天:

化分析仪，与现有技术相比，具有以下特点·

图1为本发明所述试剂盒线性范围相关性示意图；

图2为使用本发明的试剂盒进行检测的流程示意图。

图3为胃蛋白酶原I与胃部胃底和胃体的胃粘膜状况关系图；

图4为胃蛋白酶原II与胃部胃窦和胃角部位的胃粘膜状况关系图。

具体实施方式

本发明公开了一种测定幽门螺杆菌抗体的胶乳免疫试剂及其制备与应用，本领

域技术人员可以借鉴本文内容，通过适当改进工艺参数而实现。特别需要指

所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，

本发明所要求保护的技术方案之内。本发明的产

了描述，相关人员明显能在不脱离

应用进行改动或适当

出的是，

它们都被视为包括在

品及应用已经通过较佳实施例进行

本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和

变更与组合，来实现和应用本发明技术。

为使本发明更加容易理解，下面结合具体实施例，进一步阐述本发明，这些实

本发明实施例所涉及主要材料及试剂的购买来源：

Q-2阴离子交换层析柱、DEAE-Sephadex A52（DEAE-52）层析柱购买自美

弗氏完全佐剂，生物防腐剂Proclin-300、2-(N-吗啡啉)乙磺酸（MES）购买自

SIGMA；

国GE公司；

施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。

10％（w/w）聚苯乙烯纳米微球溶液购买自美国Bangs；

胃蛋白酶原Ⅰ抗体PGI-8003和PGI-8015购买自Medix批号：0021636，

胃蛋白酶原Ⅱ抗体PGII-8103和PGII-8101购买自Medix批号：0023880

PVP-K30（Polyvinylpyrrolidone）、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、磷酸二氢钾、氯

化钠、氯化钾PFG-6000、EDC（1-(3-二甲氨基

-20等购自国药集团；

丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐、吐温

牛血清白蛋白（BSA）购自元亨金马；

HP菌种购自上海天呈科技有限公司,编号43504；

幽门螺杆菌抗体购自上海领潮生物公司，编号：L1H01202；

实施例1幽门螺杆菌抗原的制备(以全菌体蛋白抗原为例)

(1)细菌培养

(a)固态培养：将HP菌种接种于巧克力培养基中，37℃培养3-4天，即产生扁

平带点透明而似胶状菌落，此即为幽门螺旋杆菌，以接种环挑起数个菌落，

于巧克力培养基上用三区划线法划开后，37℃培养3-4天，每

持菌的活性。

将细菌

隔四天传代一次以保

(b)小量液态培养：将回态培养出的幽门螺旋杆菌菌落，以接种环挂下数个菌落，

并抖落于125ml锥形瓶中，瓶内盛有BHI培养液50ml，其中含1ml新生小

和O.1ml幽门螺旋杆菌筛选液，将锥形瓶瓶口以棉塞覆盖紧，牛血清

37℃培养3~4天。

(c)大量液态培养：吸取0.5ml小量培养菌液，进行初步尿素鉴定以及外观观察，

确认没有受到其他杂菌污染。吸取15ml菌液加入500ml锥形瓶中，瓶内盛

培养液250ml，其中含5ml新生小牛血清和O.5ml幽门螺旋杆菌筛选

瓶口以棉塞覆盖紧，置于37℃培养3~4天。

有BHI

液，将锥形瓶

(2)细菌鉴定、破碎、离心和提取上清

(a)细菌鉴定：外观型态观察:观察菌落在巧克力培养基上的生长型态，为扁平带

尿素检验法:幽门螺杆菌的尿素酶极为丰富，约含菌体蛋白的15%尿素酶催化

尿素水解可产生氨气。取0.5ml尿素测试溶液置于试管中，加入0.5ml菌液，

反应约半小时。若含有幽门螺旋杆菌，则测试溶液会由黄色转

点透明而似胶状菌落。

于37℃

变为粉红色。

(b)细菌破碎、离心和提取上清：取250mL幽门螺旋杆菌菌液，于8000rpm离

心20分钟，弃上请，沉淀加入10m10.05M甘氨酸缓冲液(pH=7.0)清洗，于

离心20分钟，弃上清，沉淀加入lOml 0.05M甘氨酸缓冲液

声破菌，于l8.000rpm离心20分钟，取出上清

8000rpm

(pH=7.0)混合均匀，超

液并将其放置80℃备用。

(c)抗原蛋白浓度测定：以Bio-Rad蛋白测定试剂盒定量幽门螺杆菌抗原蛋白浓

度，首先将胎牛血清蛋白(BSA)溶于PBS中制备

/ml、O.2mg/ml、O.3mg/ml、

释分析缓冲液(含考马斯亮

冲液，最后分

下列各浓度的标准品:Omg/mL、

0.4mg/ml、O.5mg/ml时，然后以二次水5倍稀

兰R-250).接着在96微孔盘中加入100μl稀释后的分析缓

别加入10μl各浓度标准品及(2)中所获幽门螺杆菌抗原蛋白质溶液， 于室温

反应5分钟，以可见分光光度计或酶标仪在595nm波长下读取OD值，绘制

实施例2本发明试剂盒的组装

1缓冲液配置

1.1稀释液(试剂R1)的配制

将下表1中试剂称量好放入洁净容器中，加纯化水混匀，测定pH值为7.4，定

表1稀释液(试剂R1)的配制

1.2标准稀释液的配制

将下表2中试剂称量好放入洁净容器中，加纯化水溶解混匀,测定pH值为7.4，

表2标准稀释液的配制

氯化钾

BSA

丙三醇

吐温-20

Proclin-300

加纯化水至

2.2胶乳前处理

2.2.1取1ml未标记胶乳颗粒，即将1ml 10%聚苯乙烯纳米微球溶液加入10ml

0.02M pH7.4磷酸缓冲液中，离心机10000rpm离心20min，去掉上清液、再

0.02M pH7.4磷酸缓冲液重悬颗粒，离心机10000rpm离心

5ml 0.02M pH7.4磷酸缓冲液重悬、4℃保存待用。

用10ml

20min，去掉上清并用

2.3胶乳颗粒标记

根据胶乳颗粒的质量将2.2处理后胶乳用0.02M pH6.1MES缓冲液将胶乳颗粒

稀释成10mg/ml浓度，加入1mg EDC（1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺

混匀活化15分钟，离心8000rpm弃去上清，并用

加入1mg幽门螺杆菌抗原（实施例1制

匀2－4小时，离心机

粒使用封闭液

分散液；

盐酸盐），

0.02M PH7.4磷酸缓冲液重悬，

备得到）于10mg/ml 2ml胶乳液体，室温混

8000rpm离心15分钟，将上清分离到另外的容器中备用；颗

重悬，并室温混匀1小时，离心机8000rpm离心15min，沉淀复溶于

将标记完成的胶乳颗粒分装成1ml/支4℃保存。

使用上述流程分别对粒径75nm和167nm的胶乳进行分别标记，标记结束后将

所述75nm胶乳和所述167nm胶乳进行混合，使75nm胶乳浓度为0.724％

使167nm胶乳浓度为0.147%（w/v）。 （w/v），

5、确定稀释倍数

取抗原标记剩余上清液体分别用OD₂₆₀和OD₂₈₀测量其

吸光度值，利用测量结 果并根据以下公式计算剩余上清液中抗原的浓度

确定稀释倍数。 和标记效率；最后根据标记蛋白量

抗原浓度=1.45*A₂₈₀-0.74*A₂₆₀

标记抗原量＝标记总蛋白量-上清中蛋白量

标记效率=（标记总蛋白量-上清中蛋白量）/标记总蛋白量*100%

6、胶乳颗粒稀释

按照抗原过量原则，根据已定所需标记抗原浓度用分散液对标记的抗原进行稀

稀释方法：将标记完成的胶乳试剂进行稀释，稀释比例为1：8；1：9；1：10，

7、分装

将检测合格的胶乳微粒工作液进行分装，贴上标签后，置于2～8℃保存。

8、校准品及质控品配制

取大小合适的容器3个，使用标准稀释液配制浓度点为0、50AU/ml的校准品，

以及31AU/ML的质控品，各浓度点要与依次加入的原料浓溶液混匀。

分别使用稀释后的胶乳试剂进行定标测试，选取线性最优为最佳稀释比例。

释。

9、分装

经检验合格后，将配制好的校准品和质控品分装到1ml塑料瓶中，1.0ml/瓶。

质控品的目的：在定标完成以后，首先测试质控品，其浓度应在标示的范围之

内，如超出则认为试剂盒定标不成功或者试剂盒失效。本实施例中质控品浓

31AU/ML，若检测浓度为26－36AU/ML之间，则认为试剂盒有效，

认定测定结果无效。

度为

超出该范围则

实施例2幽门螺杆菌抗体胶乳免疫试剂的测定方法

本试剂盒采用的基本原理为胶乳增强免疫比浊法。将幽门螺旋杆菌抗原吸附于

乳胶粒颗粒上，通过孵育使稀释的人血清中的特异性抗体与抗原结合，经孵

产生的吸光度变化量与检测样本中的特异性抗体浓度成正比。育后，

表5本发明试剂盒的主要组成成份

储存条件及有效期：试剂盒应在2-8℃下干燥保存，贮存时避免重压并应防潮、

本试剂盒适用于贝克曼、日立、奥林巴斯、东芝、罗氏、雅培、西门子、迈瑞

1.试剂配置：试剂开瓶即用，缓冲液及乳液试剂在测定前要充分混匀；

2.试验条件：

先加入R1试剂200ul，再加入血清样本5ul，37℃反应5分钟后加入R2试剂

30ul读取OD，反应5分钟后在578nm的波长下

行检测的流程示意图如图2所示。

等品牌的全自动或半自动生化分析仪，测定方法如下:

避光、避热；有效期：12个月。

读取数据，使用本发明的试剂盒进

3.结果计算：以标准品浓度做标准曲线，样品中的抗原浓度通过标准曲线读出。

实施例3利用本发明试剂盒对幽门螺杆菌抗体的测定

1、采用本发明试剂盒按照实施例5的方法分析了无胃病人群280名（体检后证

实无消化道疾病，肝、肾疾病，无胃痛史的人群）及胃病组329例（均经胃

病理确诊。分为5组：十二指肠球部溃疡组75例；胃溃疡组

镜检查，

55例；萎缩性胃炎组61

例；胃癌组113例；贲门癌组5例。结果见表4：

表6利用本发明试剂盒对幽门螺杆菌抗体的测定

根据临床试验结果，结合文献研究，本发明试剂盒采用以下的诊断指标，本

HP≤12AU/ml，无胃部疾病，胃癌风险指数低（1X）；

12AU/ml≤HP≤29AU/ml，轻度幽门螺杆菌感染，胃癌风险指数低（1X）

30AU/ml≤HP≤60AU/ml，高度幽门螺杆菌感染，胃癌风险指数较高（7-9X）,

HP≥60AU/ml，重度幽门螺杆菌感染，胃癌风险指数（9-10X），建议内窥

建议内窥镜检查。

评价以1-10X作为评价胃癌风险程度，其中1X最低，10X最高：

镜检查以确诊。

2、采用本发明试剂盒对典型病例进行诊断的结果

病例1

病例2

病例3

实施例4一种用于诊断胃病或胃癌的三联检试剂盒的组装

该试剂盒中包括实施例2制备得到幽门螺杆菌抗体检测试剂盒及胃蛋白酶原I、

一、胃蛋白酶原II检测试剂盒的制备：

1缓冲液配置

1.1稀释液(R1)的配制

将下表7中试剂称量好放入洁净容器中，加纯化水混匀，测定pH值为7.4，定

胃蛋白酶原II检测试剂盒。

容1000ml。

表7稀释液(R1)的配制

BSA

吐温-20

Proclin-300

加纯化水至

氢二钠 1.44g

磷酸二氢钾

氯化钠

氯化钾

BSA

吐温-20

1.36g

8g

0.2g

10g

0.5mL

0.5ml

1000ml

Proclin-300

加纯化水至

2含胃蛋白酶原II抗体的胶乳试剂（试剂2）制备

2.1缓冲液的配置如表9所示

表9缓冲液的配置

2.2胶乳前处理

2.2.1取1ml未标记胶乳颗粒，即将1ml 10%聚苯乙烯纳米微球溶液加入10ml

0.02M pH7.4磷酸缓冲液中，离心机10000rpm离心20min，去掉上清液、再

0.02M pH7.4磷酸缓冲液重悬颗粒，离心机10000rpm离心

5ml 0.02M pH7.4磷酸缓冲液重悬、4℃保存待用。

用10ml

20min，去掉上清并用

2.3胶乳颗粒标记

根据胶乳颗粒的质量将2.2处理后胶乳用0.02M pH6.1MES缓冲液将胶乳颗粒

稀释成10mg/ml浓度，加入1mg EDC（1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺

混匀活化15分钟，离心8000rpm弃去上清，并用

加入针对胃蛋白酶原Ⅱ表面的不同抗原决

0.5mg PGII-8101的混合物，抗体

离心机8000rpm离

重悬，

盐酸盐），

0.02M PH7.4磷酸缓冲液重悬，

定簇的单克隆抗体0.5mg PGII-8103和

于10mg/ml 2ml胶乳液体，室温混匀2－4小时，

心15分钟，将上清分离到另外的容器中备用；颗粒使用封闭液

并室温混匀1小时，离心机8000rpm离心15min，沉淀复溶于分散液；将标

使用上述流程分别对粒径70nm和170nm的胶乳进行分别标记，标记结束后将

所述70nm胶乳和所述170nm胶乳进行混合，使70nm胶乳浓度为0.691％

使170nm胶乳浓度为0.191%（w/v）。

记完成的胶乳颗粒分装成1ml/支4℃保存。

（w/v），

5、确定稀释倍数

取抗体标记剩余上清液体分别用OD₂₆₀和OD₂₈₀测量其

吸光度值，利用测量结 果并根据以下公式计算剩余上清液中抗体的浓度

确定稀释倍数。 和标记效率；最后根据标记抗体量

抗体浓度=1.45*A₂₈₀-0.74*A₂₆₀

标记抗体量＝标记总蛋白量-上清中蛋白量

标记效率=（标记总蛋白量-上清中蛋白量）/标记总蛋白量*100%

6、胶乳颗粒稀释

按照抗体过量原则，根据已定所需标记抗体浓度用分散液对标记的抗体进行稀

稀释方法：将标记完成的胶乳试剂进行稀释，稀释比例为1：8；1：9；1：10，

分别使用稀释后的胶乳试剂进行定标测试，选取

释。

线性最优为最佳稀释比例。

7、分装

将检测合格的胶乳微粒工作液进行分装，贴上标签后，置于2～8℃保存。

8、校准品及质控品配制

取大小合适的容器6个，使用标准稀释液配制浓度点依次为0、5.4、15.0、31.0、

64.5、107.8μg/L的校准品各点，以及10μg/L的质控品，各浓度点要与依次

原料浓溶液混匀。

加入的

9、分装

经检验合格后，将配制好的标准品和质控品分装到1ml塑料瓶中，1.0ml/瓶。

质控品的目的：在定标完成以后，首先测试质控品，其浓度应在标示的范围之

内，如超出则认为试剂盒定标不成功或者试剂盒失效。本实施例中质控品浓

10μg/L，若检测浓度为9-12μg/L之间，则认为试剂盒有效，超出该

结果无效。

度为

范围则认定测定

二、胃蛋白酶原I检测试剂盒的制备：

1缓冲液配置

1.1稀释液(R1)的配制

将下表10中试剂称量好放入洁净容器中，加纯化水混匀，测定pH值为7.4，

1.2标准稀释液的配制

将下表11中的试剂称量好放入洁净容器中，加纯化水溶解混匀,测定pH值为

表11标准稀释液的配制

氯化钾

BSA

吐温-20

Proclin-300

加纯化水至

用10ml

20min，去掉上清并用

酸缓冲液重悬、4℃保存待用。

2.3胶乳颗粒标记

根据胶乳颗粒的质量将2.2处理后胶乳用0.02M pH6.1MES缓冲液将胶乳颗粒

稀释成10mg/ml浓度，加入1mg EDC（1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺

混匀活化15分钟，离心8000rpm弃去上清，并用

加入0.5mg PGI-8003抗体和0.5mg PGI-

匀2－4小时，离心机

粒使用封闭液

分散液；

盐酸盐），

0.02M PH7.4磷酸缓冲液重悬，

8015抗体于10mg/ml 2ml胶乳液体，室温混

8000rpm离心15分钟，将上清分离到另外的容器中备用；颗

重悬，并室温混匀1小时，离心机8000rpm离心15min，沉淀复溶于

将标记完成的胶乳颗粒分装成1ml/支4℃保存。

使用上述流程分别对粒径75nm和167nm的胶乳进行分别标记，标记结束后将

所述75nm胶乳和所述167nm胶乳进行混合，使75nm胶乳浓度为0.679％

使167nm胶乳浓度为0.178%（w/v）。混合后进行保存。 （w/v），

2.4确定稀释倍数

取抗体标记剩余上清液体分别用OD₂₆₀和OD₂₈₀测量其

吸光度值，利用测量结 果并根据一下公式计算剩余上清液中抗体的浓度

确定稀释倍数。 和标记效率；最后根据标记抗体量

抗体浓度=1.45*A₂₈₀-0.74*A₂₆₀

标记抗体量＝标记总蛋白量-上清中蛋白量

标记效率=（标记总蛋白量-上清中蛋白量）/标记总蛋白量*100%

经过测量计算得出上清液中蛋白量为0.367mg，标记抗体量为1.633mg，标记

2.5胶乳颗粒稀释

按照抗体过量原则，根据已定所需标记抗体浓度用分散液对标记的抗体进行稀

稀释方法：将标记完成的胶乳试剂进行稀释，稀释比例为1：8；1：9；1：10，

2.6分装

将检测合格的胶乳微粒工作液进行分装，贴上标签后，置于2～8℃保存。

3校准品及质控品

3.1校准品及质控品配制方法

3.1.1采用逐点加样法配制；

3.1.2A为标准稀释液；

3.1.3取大小合适的容器6个，用标准稀释液配制浓度点依次为0、13.2、33.3、

67.0、150.5、245.0μg/L的A、B、C、D、E、F校准品各点，以及30μg/L

各浓度点要依次加入的原料浓溶液混匀。

分别使用稀释后的胶乳试剂进行定标测试，选取线性最优为最佳稀释比例。

释。

效率为81.65％。

的质控品，

3.2分装

经检验合格后，将配制好的标准品和质控品分装到1ml塑料瓶中，1.0ml/瓶。

质控品的目的：在定标完成以后，首先测试质控品，其浓度应在标示的范围之

内，如超出则认为试剂盒定标不成功或者试剂盒失效。本实施例中质控品浓

30μg/L，若检测浓度为26-36μg/L之间，则认为试剂盒有效，超出该

结果无效。

度为

范围则认定测定

实施例5用于诊断胃病或胃癌的三联检试剂盒的应用

通过检测血液中胃蛋白酶原I、胃蛋白酶原II和幽门螺杆菌抗体含量，对三个

结果综合分析从而反应胃粘膜状态。胃蛋白酶原I主要反映胃部胃底和胃体

膜状况，其主要表现如图3所示；胃蛋白酶原II主要反映胃

粘膜状况，其主要表现如图4所示；幽门螺杆菌

抗体的检测对反映胃部整体胃粘膜

的胃粘

部胃窦和胃角部位的胃

是胃部疾病发生的主要致病菌，HP

的状况具有非常重要的作用。

检验原理：采用免疫比浊法，以乳胶增强免疫比浊法为测定原理。分别对样品

中的幽门螺杆菌抗体、PG Ⅰ以及PG II进行测定，幽门螺杆菌抗体、PG Ⅰ

分别与标记了幽门螺杆菌抗原以及抗PG Ⅰ抗体、抗PG II抗

的抗原抗体反应，形成免疫复合物，从而引起吸

品中的幽门螺杆菌抗体、PG Ⅰ以

抗体、PG Ⅰ以及

杆菌抗

以及PG II

体的乳胶颗粒发生特异性

光度的变化。此吸光度的变化与样

及PG II浓度呈正比。分别用已知浓度的幽门螺杆菌

PG II标准品制作工作曲线，从该曲线上即可计算出样品中的幽门螺

体、PG Ⅰ以及PG II含量。

储存条件及有效期：试剂盒应在2-8℃下干燥保存，贮存时避免重压并应防潮、

避光、避热；有效期：12个月。

适用仪器：东芝（TBA-40FR）、迪瑞（CS-T300）、劳拉(FAITH-1000)、奥林巴

样本要求：病人标本无需特殊处理，采用常规医用技术收集全血标本，离心

分离后吸取血清用于检测。待测血清如在24小

需长期存放应保存在-20℃以下，

疸标本。

斯(AU-1000)、迈瑞(BS-200)等生化分析仪。

时之内使用，可于2～8℃保存，若

并避免反复冻融。请不要使用严重溶血、脂血或黄

对样品中的幽门螺杆菌抗体、PG Ⅰ以及PG II的测定分别按照以下方法进行：

检验方法：

1.试剂配置：试剂开瓶即用，缓冲液及乳液试剂在测定前要充分混匀；

2.试验条件：

血清标本：5ul

R1：200ul R2：30ul 波长：578nm 反应温度：37℃

先加入R1试剂200ul，再加入血清样本5ul，37℃反应5分钟后加入R2试剂

3、结果计算：以标准品浓度做标准曲线，样品中的抗原浓度通过标准曲线读

出。

30ul读取OD，反应5分钟后在578nm的波长下读取数据。

4、检测结果

采用本发明试剂盒按照实施例5的方法分析了无胃病人群280名（体检后证实无

消化道疾病，肝、肾疾病，无胃痛史的人群）及胃病组329例（均经胃镜检

理确诊。分为5组：十二指肠球部溃疡组75例；胃溃疡组55

胃癌组113例；贲门癌组5例。结果见表13：

查，病

例；萎缩性胃炎组61例；

表13检测结果

根据临床试验结果，结合文献研究，本发明试剂盒采用以下的诊断指标，本

评价以1-10X作为评价胃癌风险程度，其中1X最低，10X最高：

PG Ⅰ≥67ng/ml，PG Ⅰ/PG Ⅱ≥7.5，HP≤12AU/ml，无胃部疾病，胃癌风险指

数低（1X）；

PG Ⅰ≥67ng/ml，PG Ⅰ/PG Ⅱ≤7.5，12AU/ml≤HP≤29AU/ml，十二指肠球部溃

疡或胃溃疡，胃癌风险指数低（1X）

35ng/ml≤PG Ⅰ≤67ng/ml，PG Ⅰ/PG Ⅱ≤3.0，HP≥30AU/ml，诊断为萎缩性

胃炎，胃癌风险指数高（7-9X）,建议内窥镜检查。

PG Ⅰ<35ng/ml，PG Ⅰ/PG Ⅱ≤1.5，HP≥60AU/ml诊断为胃癌，胃癌风险指

数（9-10X），建议内窥镜检查以确诊。

2、采用本发明试剂盒对典型病例进行诊断的结果

病例1

病例2

病例3

病例4

试验例1单一粒径的胶乳和两种粒径的混合胶乳的灵敏度及线性范围比较

测试所使用生化仪为迪瑞CS-T300。

灵敏度对比实验：使用单一75nm粒径标记后的胶乳和75nm与167nm标记后混合

的胶乳对零值校准品进行重复测定20次的浊度变化值，计算平均值，则浊

越小灵敏度越高。

度变化值

线性范围对比实验：使用单一167nm粒径标记后的胶乳和75nm与167nm标记后

混合的胶乳对50AU/ml校准品进行重复测定20次的浊度变化值，计算平均

度变化值越大线性范围越大。测定结果如表14所示。 值，则浊

表14灵敏度及线性范围测定结果

单一使用粒径低于100nm的胶乳则出现检测灵敏度达不到要求，单一使用粒径

为200nm左右的胶乳则线性范围较小，故使用单一粒径胶乳无法同时兼顾

度和线性范围，使用本发明的复合胶乳进行标记后，可以提高

宽检测线性范围，对疾病，特别是胃病或胃癌的

特异性强和准确性好等优点。

检测灵敏

检测灵敏度，又可拓

检测来说具有检测快速、敏感度高、