2024年9月29日发(作者：枝力夫)
Bisulfite Sequencing
1. General Information
As the first discovered mark, DNA methylation plays a vital role in genome
dynamics. It is implicated in repression of transcriptional activity and in animals
it predominantly involves the addition of a methyl group to the carbon-5
position of residues at cytosine guanine dinucleotide (CpG) sites.
Bisulfite sequencing is a powerful technique to study DNA methylation.
Treatment of DNA with bisulfite converts cytosine residues to uracil, but leaves
5-methylcytosine residues unaffected. The following PCR amplification
treatment converts uracil to thymine. Thus, bisulfite treatment introduces
specific changes in the DNA sequence that depends on the methylation status
of individual cytosine residues. Coupled with new-generation sequencing
technology, it allows for an unbiased genome-wide analysis of DNA
methylation and various analyses can be performed on the altered sequence.
Bisulfite-seq is the golden standard for DNA methylation analysis. Process
includes: treating of DNA with bisulfite to convert cytosine residues to uracil,
while leaving 5-methylcytosine residues unaffected; running PCR to convert all
the uracil to thymines; in the end, sequencing the PCR product and performing
the bioinformatics analysis compared with the untreated genome to profile
quantitive regional methylation pattern.
Compared to Sanger sequencing, Bisulfite sequencing is a low-cost method
with high reliability and accuracy to determine each cytosine methylation state.
Based on new-generation sequencing technology, it avoids mass work of
clone sequencing and complicated process. The sequencing primers which
will be added to the DNA fragments to process sequencing also can be treated
as random amplication primer for DNA samples. Thus, primer designing is not
necessary and work of PCR will be decreased when compared to Sanger
sequencing to profile genome-wide DNA methylation pattern.
2. Experimental Pipeline
Bisulfite treatment of sample DNA and DNA sequencing
Perform the bisulfite treatment of qualified DNA and forward to TA clone test.
Then the DNA sequencing is carried out using on the new-generation
sequencing technology.
DNA was extracted and processed by bisulfite sodium and subjected to
Illumina GA sequencing with methylated adaptor. The detailed pipeline is
showed as following (Figure 6-2-1):
3. Bioinformatics Analysis
The bioinformatics analysis of Bisulfite sequencing is based on the SOAP
alignment with C T mismatches tolerated. Ideally, this method would determine
the methylation status separately for each allele, even each single strand. The
methylation status for each allele is the most important information to detect
differentially methylated region as the candidate of imprinting gene. The
methylation status for each single strand could be used to describe the
hemi-methylation (Figure 6-2-2) .
3.1 Basic bioinformatics analysis
Data production statistics includes image recognition, base calling, filtering
adapter sequences and detecting contaminants of sample.
3.2 Advanced bioinformatics analysis
Map bisulfite-seq reads to reference
Get the methylation profile of the mapped reads.
Gather the methylation information of each base of the mapped reads.
Get the methylation rate information of all methylated C in CpG of each
chromosome.
Get the methylation rate information of all dispersed C of each chromosome.
Provide the methylated CpG information in different gene regions.
Provide the methylated dispersed C information in different gene regions.
Provide the methylated CpG information of genome sequence with different
features.
Provide the methylated dispersed C information of genome sequence with
different features.
4. Case Studies
4.1 Study on an individual human genome
The match information of all the base sites is gathered and decoded after
SOAP alignment. At each base site, tags number which suggests this site to
be methylated or not will be given. In the following analysis, the C bases with
copy number > 1.5 and quality < 14 are filtered out. The methylated rate of
CpG or non-CpG is based on tags number which supports this site to be
methylated comparing with and number of all effective tags.
5. Frequently Asked Questions
1) How many nucleotides are required for Bisulfite sequencing
analysis?
In order to ensure at least 10X coverage of genome size,we suggest 10 g of
DNA to be provided as the mininum amount required.
2) How to ensure all the unmethylated C bases to be converted to T
bases in the bisulfite treatment of DNA?
Our experimental pipeline normally ensures the conversion rate of
unmethylated C to T to meet the bioinformatics analysis requirement. Here we
used standard DNA and H19 for quality control.
3) How to classify the methylation level?
We can classify the methylation level through the proportion of total C and total
T sequenced in a certain region. For example, if we get 6C and 4T (which in
the reference sequencing is C), the methylation level in this region is
considered as 6/ (4+6)= 60%.
4) Which factors will influence the result of bisulfite-seq?
From the scientific view, uncertain factors of DNA methylation research are
mainly from undiscovered area, such as methylation difference of individual
cell from cell lines, time differences and dynamic changes of methylation
during developmental process or pathological process; from the technical view,
the length of sample DNA, the conversion rate of DNA during bisulfate
treatment and sequencing depth may influence the result of bisulfate-seq.
目前, 基因的甲基化研究主要结合亚硫酸氢钠处理和PCR技术，分为甲基化特
异性PCR（Methylation specific PCR,MSP）和硫化测序PCR（Bisulfite
sequencing PCR, BSP）。
技术原理：
DNA经亚硫酸氢盐硫化处理后,DNA双链中的“C”转化为“U”,通过随后的PCR,将
“U”转化为“T”,但亚硫酸氢盐不能使已发生了甲基化的DNA的“C”发生上述转化,
因此,根据经亚硫酸氢盐处理的DNA模板设计引物时,先输入感兴趣的DNA序列,
程序将会显示2种序列:一种是输入的源DNA序列;另一种是硫化处理后的DNA
序列,除了CpG岛上的5甲基胞嘧啶(5mC)之外,所有非甲基化的“C”都转换成了
“T”,根据转化后的序列设计引物,进行BSP和MSP。
1.
MSP
：DNA经亚硫酸氢钠处理后，所有未甲基化的胞嘧啶发生脱氨基变为尿嘧
啶，而甲基化的胞嘧啶无此改变。DNA的甲基化差异转变为序列差异，设计两
对分别针对甲基化与非甲基化等位基因的引物，结合PCR扩增就可以将甲基化
与非甲基化等位基因区分开。这种方法灵敏度高，对DNA的质和量需要少。
2.
BSP
：甲基化的胞嘧啶在亚硫酸氢钠发生脱氨基后不会转变，用一对特异性引
物扩增后测序，再与DNA原始序列比对确定甲基化位点。测序法克服了只能针对
单个位点检测，并且这些位点必须是限制性内切酶识别位点的缺点，可以对任何
基因序列的甲基化状态进行检测。
我把肿瘤所的protocol和《Current protocols of Human Genetics》里面翻译了并作一个比较，
如下（红色字体为肿瘤所的，蓝色为翻译的protocol）：
第一天
1．稀释2ugDNA（用双蒸水）至10ul（1.5ml离心管）
稀释1ug DNA（用双蒸水）至50ul（1.5ml离心管）
2．加1.1ul 3M的NaOH,混匀；1.5g NaOH+12.5ml H2O----3M NaOH
加5.5ul 2M的NaOH，混匀；
3． 7度温浴10min(水浴)
37度培养10min
4． 6 ul 10Mm的氢鲲(hydroquinone)----色转黄
氢鲲的配置(需现配):
55mg氢鲲+50ml H2O-----10Mm的氢鲲
加30ul新配置的10mM 氢鲲到每个管
5. 轻轻摇匀
6. 加104ul的亚硫酸氢钠(Bisulfite)(3.6M)( Ph5.0 ,用NaOH调Ph)
亚硫酸氢钠(需现配): 可用8份
2.88g亚硫酸氢钠+5mlH2O
0.85ml 3M NaOH稀释上述5ml液体至pH 5.0
加520ul新配置的3M 亚硫酸氢钠到每个管，并确认混匀
7. 加200ul 矿物油至管顶端, 50度温浴18小时(过夜)
加～50ul矿物油覆盖液面，50度培养16小时
第二天
8. 1%琼脂糖，每管加1ml，样品数*2，放200ulTip头，凝固。
9. 把样品吸出，至孔中，1小时后转移至另一孔，再放置1小时。
10. 离心,洗脱(最大转速为13000转/分)
11. 加11ul 3M NaOH 至洗脱液,37度，15分钟。
1g NaOH+8.3ml H2O----3M NaOH
12. 加44ul 8M NH4Oac，1ul的糖原（glycogen）及三倍体积（约300ul）冰冷乙醇（100%），
负20度过夜。
0.6166g+1ml H2O----8M NH4Oac
加1ml DNA Wizard cleanup reagent到每个管并将混合物加入kit中提供的miniprep column
中；
使用真空装置，用80%的isopropanol 洗脱。将column置于干净的，已经做了标记的
1.5mlmicrocentrfuge tube中，加50ul60度到70度的热水，1分钟离心。
加5.5ul 3M NaOH 到每个管，室温培养5min；
加1ul 10mg/ml的glycogen做为载体，再加17ul 10M醋酸胺和3倍体积的冰乙醇。－20度
沉淀，数小时到过夜。
第三天
13 4度离心4min（14500转/min），以70%乙醇洗沉淀物
真空干燥，加30ul H2O，37度促融，-70度冰存
离心25min，弃上清，70％冰乙醇洗脱，再用20-30ul双蒸水。
亚硫酸氢钠测序法(bisulfite genomic sequencing)
直接测序法是建立在MSP基础上进一步深入研究CpG岛各个位点甲基化情况的方法。重亚
硫酸盐使DNA中未发生甲基化的胞嘧啶脱氨基转变成尿嘧啶，而甲基化的胞嘧啶保持不变，
行PCR扩增(引物设计时尽量避免有CpG，以免受甲基化因素的影响)所需片段，则尿嘧啶
全部转化成胸腺嘧啶。最后，对PCR产物进行测序，并且与未经处理的序列比较，判断是
否CpG位点发生甲基化。此方法一种可靠性及精确度很高的方法，能明确目的片段中每一
个CpG位点的甲基化状态。在寻找有意义的关键性CpG位点上，有其他方法无法比拟的优
点。测序法以CpG岛两侧不含CpG点的一段序列为引物配对区，所以能够同时扩增出甲基
化和非甲基化靶序列。它的不足是耗费时间和耗资过多，至少要测序10个以上的克隆才能
获得可靠数据，需要大量的克隆及质粒提取测序，过程较为繁琐、昂贵。
第一部分 基因组DNA的提取
这一步没有悬念，完全可以购买供细胞或组织使用的DNA提取试剂盒，如果实验室条件成
熟，自己配试剂提取完全可以。DNA比较稳定，只要在操作中不要使用暴力，提出的基因
组DNA应该是完整的。
此步重点在于DNA的纯度，即减少或避免RNA、蛋白的污染很重要。因此在提取过程中需
使用蛋白酶K及RNA酶以去除两者。
使用两者的细节：
1：蛋白酶K可以使用灭菌双蒸水配制成20mg/ml；
2：RNA酶必须要配制成不含DNA酶的RNA酶，即在购买市售RNA酶后进行再处理，配
制成10mg/ml。否则可能的后果是不仅没有RNA，连DNA也被消化了。两者均于-20度保
存。
验证提取DNA的纯度的方法有二：
1：紫外分光光度计计算OD比值；
2：1%-1.5%的琼脂糖凝胶电泳。
我倾向于第二种方法，这种方法完全可以明确所提基因组DNA的纯度，并根据Marker的
上样量估计其浓度，以用于下一步的修饰。
第二部分 亚硫酸氢钠修饰基因组DNA
如不特别指出，所用双蒸水（DDW）均经高压蒸汽灭菌。
1：将约2ugDNA于1.5mlEP管中使用DDW稀释至50ul；
2：加5.5ul新鲜配制的3M NaOH；
3： 42℃水浴30min；
水浴期间配制：
4：10mM对苯二酚（氢醌），加30ul至上述水浴后混合液中；（溶液变成淡黄色）
5： 3.6M亚硫酸氢钠（Sigma，S9000），配制方法：1.88g亚硫酸氢钠使用DDW稀释，并
以3M NaOH滴定溶液至PH 5.0，最终体积为5ml。这么大浓度的亚硫酸氢钠很难溶，但加
入NaOH后会慢慢溶解，需要有耐心。PH一定要准确为5.0。加520ul至上述水浴后溶液中。
6：EP管外裹以铝箔纸，避光，轻柔颠倒混匀溶液。
7：加200 ul 石蜡油，防止水分蒸发，限制氧化。
8：50℃避光水浴16h。
一般此步在4pm开始做，熟练的话不到5pm即可完成，水浴16h正好至次日8am以后收，
时间上很合适。
这一步细节：
1：基因组DNA的量不需十分精确，宁多勿少，因为在以后纯化回收步骤中会有丢失，且
此方法修饰最多可至4ug。
2：所有试剂均须新鲜配制，所以配液的技术要过关，既要快，又要精确。
3：亚硫酸氢钠溶液呈强酸性，一定用碱将PH调制5.0，否则PH不合适会影响后续纯化吸
收。
4：水浴最好达16小时，虽可以短至8小时，但后者修饰会有不完全。
第三部分 修饰后DNA纯化回收
EP管如无特别说明均为高压蒸汽灭菌的。
1. 将移液器枪头伸入石蜡油层下，先轻轻加压使其中一小段石蜡油排出，然后吸取混合液
至一洁净1.5mlEP管中。
2：以下使用Promega Wizard Cleanup DNA纯化回收系统（Promega，A7280）
1）70℃水浴预热DDW；配制80%异丙醇；
2）加1ml Promega’s Wizard DNA Clean-up resin，轻柔颠倒混匀，使DNA充分与树脂结合；
3）由于该试剂盒中仅配备针筒没有针栓，如果有真空负压吸引器，使用起来很方便；如果
没有，需要自备3ml-5ml注射器。将注射器针筒与试剂盒提供的回收小柱紧密连接后，将上
述混合物用移液器移至针筒内，用2ml以上的EP管放置小柱下接收废液。加针栓，轻轻加
压，将液体挤出，此时可见小柱内有白色的树脂沉积。
4）将注射器与小柱分离后拔出针栓，再将针筒与小柱连接，向针筒内加入2ml 80％的异丙
醇，插入针栓，轻轻加压，将异丙醇挤出。此为洗涤步骤。
5）将注射器与小柱分离，将小柱置于洁净1.5ml洁净EP管上，离心12000rpm，2min，以
甩去残余异丙醇成分，使树脂干燥。此时，修饰后DNA处于与树脂结合状态。
6）将小柱取下置于另一洁净1.5mlEP管上，移液器加50ul预热好的DDW，室温放置5min。
7）离心12000rpm，20s，此为洗脱步骤，此时EP管内液体即为洗脱的修饰后DNA溶液，
终体积为50ul。
3：加5.5ul 新鲜配制的3M NaOH，室温放置15min。
4：加33ul 10M乙酸铵，以中和NaOH，使溶液PH于7.0左右。
5：加4ul 10mg/ml糖原，此作为沉淀指示剂，因为其与乙醇混合后可产生沉淀，便于以后
离心后辨别回收物的位置，以防在吸取残余乙醇时将回收物吸走。其实，加入这些糖原究竟
能起多大作用，不好说。不过有国产糖原卖，包装不大，也很便宜，买来一用，算严格遵守
文献的步骤吧。
6：加270ul 冰无水乙醇，置于-20度，过夜沉淀。有人为沉淀最短可至2小时，但我认为
时间长些可能会更好。并且做到此步骤时，一般会到中午，如果样本多的话要到下午，不妨
放置过夜，日程可以轻松些，顺便做些其他试验。如果想当天做完，没有问题，但我认为最
好多沉淀些时候，至少6小时吧（这是经验，我做过最少6小时，也是可以的，再短就不敢
发表意见了）
7：4度，12000rpm离心，30min，倒去上清液，收集沉淀。不必吸净。
8：加500ul 70%乙醇，不要将沉淀吹打起来，只要把乙醇加上即可。轻柔倾斜EP管，旋转
一圈，再次离心，4度12000rpm，5min。离心后倒掉上清，再加同量乙醇，同样再做一遍。
此为洗涤步骤，共2次。
9：倒掉上清，并常温简短离心后，将附壁乙醇离至EP管底，移液器小心将残余液体吸净，
室温干燥5min，或沉淀由不透明变为半透明或透明时，加入20ul- 30ulDDW，溶解沉淀。
至此，已完成了修饰后DNA的纯化回收，所得为修饰后DNA溶液，可用于此后的进一步
实验。
10：-20℃保存DNA溶液。
此步细节：
1：在使用注射器时，一定要用力均匀且轻，如使用暴力，会将小柱内的薄膜挤破，失去作
用。
2：乙酸铵、糖原不需新鲜配制，糖原配好后放在-20度保存，乙酸铵室温即可，因为这样
浓度的乙酸铵非常难溶，一旦放在4度，取出用时也会有很多溶质析出。
3：异丙醇、70%乙醇都不需要新鲜配制，但如果用量大，现场配也很方便。
此步关键是在树脂与DNA的结合上，这就再次强调第二部分调亚硫酸钠PH值得重要性。
因为树脂与DNA结合需要有一个适当的PH，如前一步没做好，此步树脂不能与DNA很好
结合，将会带来灾难性后果，即DNA随着液体被挤出了，洗脱时实际已没有任何DNA了。
第四部分 修饰后DNA用于PCR
这一步也没有悬念。我主要谈一下这里面的几个比较棘手的问题：
1：引物问题：我感觉自己设计引物有相当的难度，我曾设计过几对引物，并且试验了一下，
但以失败告终。如果时间充裕、作的又是比较新的基因文献不多，自己设计引物没有问题。
如果不是这样，还是参考文献更好些。首先查阅SCI分值高的文献，然后是著名实验室的
文献，如果国内有做的，更好了，可以直接联系咨询。查到序列后，一定要和Genbank中
的序列进行比对，防止有印刷错误造成的个别碱基的差别。然后再到google上搜一下，看
用的人多否，体系条件是否一样。用的人多、体系条件一样，表明可重复性比较强。我也是
按此行事，算比较顺利。
2：Taq酶问题：有文献用高保真的金牌 Taq（Platinum），但我感觉只要体系正确、变性退
火等条件合适，一般的热启动酶是可以的。我开始使用的是Takara的LA Taq，很好用，配
有10x含mg++的LA缓冲液。有时候用没了，暂时以Takara 的普通Taq酶也可以。如何选
择，可以根据自己的情况。初作者还是用好一点的酶。
3：PCR的条件：变性一般都选择95度，3min。其余我感觉还是根据文献，退火可以根据
你的引物的退火温度在小范围内尝试。一般和文献报道差别不大。只是扩增片断特异性的问
题。建议根据文献。
4：做PCR的EP管最好选择进口的，壁薄且厚度均匀，这可以保证温度的迅速变化可以及
时传递给管内的反应液，使体系真正在所设定的温度下运行。
5：PCR仪：如果在某一个仪器上作出来了，最好一直用此仪器继续。不同的仪器“脾气”
也不一样，但EP管必要和仪器内的插孔紧密结合方好，留有空隙，我认为会影响温度的传
递。
这一部分有些啰嗦，只是个人一些不成熟经验。有疑问处，请大家指出，交流。今天先到这
里，现写一些内容，比较费劲，总是不能一挥而就。望见谅。歇息一会准备写最后蓝白斑筛
选克隆这一部分。
第五部分 PCR产物的凝胶回收
这一步比较简单，可以购买一个凝胶PCR产物回收试剂盒，国产的就很好、价格也合理，
比如TIANGEN的产品（用过）。把切下来的胶按说明书操作即可。
几个细节：
1：PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，要使用新配的电泳液。凝胶浓度1%-2%均可。
2：凝胶DNA回收时在300nm紫外灯下观察条带位置，切取目的片断所在位置的凝胶，尽
量小，保证特异性。
3：紫外照射时间不能过长，否则对DNA有损伤。
4：回收后的DNA如不马上用就储存于-20度，在数月内是很稳定的。
第六部分 PCR产物与T载体的连接和转化、蓝白斑筛选
1：连接T载体（本实验使用的是Promega的试剂盒）
15ul体系
T-easy 1ul
Ligase 1ul
2xbuffer 7.5ul
DNA 5.5ul
4度，过夜。
2：连接产物的转化
1）-70度冰箱内取出感受态细菌，融化后置于冰上；
2）连接产物15ul 全部加入，至于冰上30分钟；
3）42度， 90秒钟；
4）冰上2分钟；
5）800ul LB培养基；
6）280rpm，37度，摇床45分钟（将管放水平了摇，保证菌液摇匀）；
7）8000rpm，1分钟；在超净台内去上清，留100-150ul；
8）涂板：37度孵箱过夜；（板为含有氨苄青霉素的固体LB培养基）
先涂：X-gar 35ul
IPTG 25ul
后涂：混悬液
过夜后可见板上长出很多蓝色或白色斑点，取白色斑点，尤其是蓝色斑点周围的白色斑点，
此处自联率较低。
3：取白斑，划种于新板上
新板：先涂：X-gar 35ul
IPTG 25ul
然后于板底划出分区，进行标记。根据需要，一般一板作50个克隆没有问题。
针头挑白斑划2道于板上相应区域内。
37度，孵箱过夜。
4：联系测序公司送测序。一般一个克隆在35-45元。
这一部分的细节：
1：涂板要均匀，保证Xgar和IPTG均匀分布在板面上；
2：不要让蓝白斑长得太满，否则选取克隆时容易一下挑2个。
2024年9月29日发(作者：枝力夫)
Bisulfite Sequencing
1. General Information
As the first discovered mark, DNA methylation plays a vital role in genome
dynamics. It is implicated in repression of transcriptional activity and in animals
it predominantly involves the addition of a methyl group to the carbon-5
position of residues at cytosine guanine dinucleotide (CpG) sites.
Bisulfite sequencing is a powerful technique to study DNA methylation.
Treatment of DNA with bisulfite converts cytosine residues to uracil, but leaves
5-methylcytosine residues unaffected. The following PCR amplification
treatment converts uracil to thymine. Thus, bisulfite treatment introduces
specific changes in the DNA sequence that depends on the methylation status
of individual cytosine residues. Coupled with new-generation sequencing
technology, it allows for an unbiased genome-wide analysis of DNA
methylation and various analyses can be performed on the altered sequence.
Bisulfite-seq is the golden standard for DNA methylation analysis. Process
includes: treating of DNA with bisulfite to convert cytosine residues to uracil,
while leaving 5-methylcytosine residues unaffected; running PCR to convert all
the uracil to thymines; in the end, sequencing the PCR product and performing
the bioinformatics analysis compared with the untreated genome to profile
quantitive regional methylation pattern.
Compared to Sanger sequencing, Bisulfite sequencing is a low-cost method
with high reliability and accuracy to determine each cytosine methylation state.
Based on new-generation sequencing technology, it avoids mass work of
clone sequencing and complicated process. The sequencing primers which
will be added to the DNA fragments to process sequencing also can be treated
as random amplication primer for DNA samples. Thus, primer designing is not
necessary and work of PCR will be decreased when compared to Sanger
sequencing to profile genome-wide DNA methylation pattern.
2. Experimental Pipeline
Bisulfite treatment of sample DNA and DNA sequencing
Perform the bisulfite treatment of qualified DNA and forward to TA clone test.
Then the DNA sequencing is carried out using on the new-generation
sequencing technology.
DNA was extracted and processed by bisulfite sodium and subjected to
Illumina GA sequencing with methylated adaptor. The detailed pipeline is
showed as following (Figure 6-2-1):
3. Bioinformatics Analysis
The bioinformatics analysis of Bisulfite sequencing is based on the SOAP
alignment with C T mismatches tolerated. Ideally, this method would determine
the methylation status separately for each allele, even each single strand. The
methylation status for each allele is the most important information to detect
differentially methylated region as the candidate of imprinting gene. The
methylation status for each single strand could be used to describe the
hemi-methylation (Figure 6-2-2) .
3.1 Basic bioinformatics analysis
Data production statistics includes image recognition, base calling, filtering
adapter sequences and detecting contaminants of sample.
3.2 Advanced bioinformatics analysis
Map bisulfite-seq reads to reference
Get the methylation profile of the mapped reads.
Gather the methylation information of each base of the mapped reads.
Get the methylation rate information of all methylated C in CpG of each
chromosome.
Get the methylation rate information of all dispersed C of each chromosome.
Provide the methylated CpG information in different gene regions.
Provide the methylated dispersed C information in different gene regions.
Provide the methylated CpG information of genome sequence with different
features.
Provide the methylated dispersed C information of genome sequence with
different features.
4. Case Studies
4.1 Study on an individual human genome
The match information of all the base sites is gathered and decoded after
SOAP alignment. At each base site, tags number which suggests this site to
be methylated or not will be given. In the following analysis, the C bases with
copy number > 1.5 and quality < 14 are filtered out. The methylated rate of
CpG or non-CpG is based on tags number which supports this site to be
methylated comparing with and number of all effective tags.
5. Frequently Asked Questions
1) How many nucleotides are required for Bisulfite sequencing
analysis?
In order to ensure at least 10X coverage of genome size,we suggest 10 g of
DNA to be provided as the mininum amount required.
2) How to ensure all the unmethylated C bases to be converted to T
bases in the bisulfite treatment of DNA?
Our experimental pipeline normally ensures the conversion rate of
unmethylated C to T to meet the bioinformatics analysis requirement. Here we
used standard DNA and H19 for quality control.
3) How to classify the methylation level?
We can classify the methylation level through the proportion of total C and total
T sequenced in a certain region. For example, if we get 6C and 4T (which in
the reference sequencing is C), the methylation level in this region is
considered as 6/ (4+6)= 60%.
4) Which factors will influence the result of bisulfite-seq?
From the scientific view, uncertain factors of DNA methylation research are
mainly from undiscovered area, such as methylation difference of individual
cell from cell lines, time differences and dynamic changes of methylation
during developmental process or pathological process; from the technical view,
the length of sample DNA, the conversion rate of DNA during bisulfate
treatment and sequencing depth may influence the result of bisulfate-seq.
目前, 基因的甲基化研究主要结合亚硫酸氢钠处理和PCR技术，分为甲基化特
异性PCR（Methylation specific PCR,MSP）和硫化测序PCR（Bisulfite
sequencing PCR, BSP）。
技术原理：
DNA经亚硫酸氢盐硫化处理后,DNA双链中的“C”转化为“U”,通过随后的PCR,将
“U”转化为“T”,但亚硫酸氢盐不能使已发生了甲基化的DNA的“C”发生上述转化,
因此,根据经亚硫酸氢盐处理的DNA模板设计引物时,先输入感兴趣的DNA序列,
程序将会显示2种序列:一种是输入的源DNA序列;另一种是硫化处理后的DNA
序列,除了CpG岛上的5甲基胞嘧啶(5mC)之外,所有非甲基化的“C”都转换成了
“T”,根据转化后的序列设计引物,进行BSP和MSP。
1.
MSP
：DNA经亚硫酸氢钠处理后，所有未甲基化的胞嘧啶发生脱氨基变为尿嘧
啶，而甲基化的胞嘧啶无此改变。DNA的甲基化差异转变为序列差异，设计两
对分别针对甲基化与非甲基化等位基因的引物，结合PCR扩增就可以将甲基化
与非甲基化等位基因区分开。这种方法灵敏度高，对DNA的质和量需要少。
2.
BSP
：甲基化的胞嘧啶在亚硫酸氢钠发生脱氨基后不会转变，用一对特异性引
物扩增后测序，再与DNA原始序列比对确定甲基化位点。测序法克服了只能针对
单个位点检测，并且这些位点必须是限制性内切酶识别位点的缺点，可以对任何
基因序列的甲基化状态进行检测。
我把肿瘤所的protocol和《Current protocols of Human Genetics》里面翻译了并作一个比较，
如下（红色字体为肿瘤所的，蓝色为翻译的protocol）：
第一天
1．稀释2ugDNA（用双蒸水）至10ul（1.5ml离心管）
稀释1ug DNA（用双蒸水）至50ul（1.5ml离心管）
2．加1.1ul 3M的NaOH,混匀；1.5g NaOH+12.5ml H2O----3M NaOH
加5.5ul 2M的NaOH，混匀；
3． 7度温浴10min(水浴)
37度培养10min
4． 6 ul 10Mm的氢鲲(hydroquinone)----色转黄
氢鲲的配置(需现配):
55mg氢鲲+50ml H2O-----10Mm的氢鲲
加30ul新配置的10mM 氢鲲到每个管
5. 轻轻摇匀
6. 加104ul的亚硫酸氢钠(Bisulfite)(3.6M)( Ph5.0 ,用NaOH调Ph)
亚硫酸氢钠(需现配): 可用8份
2.88g亚硫酸氢钠+5mlH2O
0.85ml 3M NaOH稀释上述5ml液体至pH 5.0
加520ul新配置的3M 亚硫酸氢钠到每个管，并确认混匀
7. 加200ul 矿物油至管顶端, 50度温浴18小时(过夜)
加～50ul矿物油覆盖液面，50度培养16小时
第二天
8. 1%琼脂糖，每管加1ml，样品数*2，放200ulTip头，凝固。
9. 把样品吸出，至孔中，1小时后转移至另一孔，再放置1小时。
10. 离心,洗脱(最大转速为13000转/分)
11. 加11ul 3M NaOH 至洗脱液,37度，15分钟。
1g NaOH+8.3ml H2O----3M NaOH
12. 加44ul 8M NH4Oac，1ul的糖原（glycogen）及三倍体积（约300ul）冰冷乙醇（100%），
负20度过夜。
0.6166g+1ml H2O----8M NH4Oac
加1ml DNA Wizard cleanup reagent到每个管并将混合物加入kit中提供的miniprep column
中；
使用真空装置，用80%的isopropanol 洗脱。将column置于干净的，已经做了标记的
1.5mlmicrocentrfuge tube中，加50ul60度到70度的热水，1分钟离心。
加5.5ul 3M NaOH 到每个管，室温培养5min；
加1ul 10mg/ml的glycogen做为载体，再加17ul 10M醋酸胺和3倍体积的冰乙醇。－20度
沉淀，数小时到过夜。
第三天
13 4度离心4min（14500转/min），以70%乙醇洗沉淀物
真空干燥，加30ul H2O，37度促融，-70度冰存
离心25min，弃上清，70％冰乙醇洗脱，再用20-30ul双蒸水。
亚硫酸氢钠测序法(bisulfite genomic sequencing)
直接测序法是建立在MSP基础上进一步深入研究CpG岛各个位点甲基化情况的方法。重亚
硫酸盐使DNA中未发生甲基化的胞嘧啶脱氨基转变成尿嘧啶，而甲基化的胞嘧啶保持不变，
行PCR扩增(引物设计时尽量避免有CpG，以免受甲基化因素的影响)所需片段，则尿嘧啶
全部转化成胸腺嘧啶。最后，对PCR产物进行测序，并且与未经处理的序列比较，判断是
否CpG位点发生甲基化。此方法一种可靠性及精确度很高的方法，能明确目的片段中每一
个CpG位点的甲基化状态。在寻找有意义的关键性CpG位点上，有其他方法无法比拟的优
点。测序法以CpG岛两侧不含CpG点的一段序列为引物配对区，所以能够同时扩增出甲基
化和非甲基化靶序列。它的不足是耗费时间和耗资过多，至少要测序10个以上的克隆才能
获得可靠数据，需要大量的克隆及质粒提取测序，过程较为繁琐、昂贵。
第一部分 基因组DNA的提取
这一步没有悬念，完全可以购买供细胞或组织使用的DNA提取试剂盒，如果实验室条件成
熟，自己配试剂提取完全可以。DNA比较稳定，只要在操作中不要使用暴力，提出的基因
组DNA应该是完整的。
此步重点在于DNA的纯度，即减少或避免RNA、蛋白的污染很重要。因此在提取过程中需
使用蛋白酶K及RNA酶以去除两者。
使用两者的细节：
1：蛋白酶K可以使用灭菌双蒸水配制成20mg/ml；
2：RNA酶必须要配制成不含DNA酶的RNA酶，即在购买市售RNA酶后进行再处理，配
制成10mg/ml。否则可能的后果是不仅没有RNA，连DNA也被消化了。两者均于-20度保
存。
验证提取DNA的纯度的方法有二：
1：紫外分光光度计计算OD比值；
2：1%-1.5%的琼脂糖凝胶电泳。
我倾向于第二种方法，这种方法完全可以明确所提基因组DNA的纯度，并根据Marker的
上样量估计其浓度，以用于下一步的修饰。
第二部分 亚硫酸氢钠修饰基因组DNA
如不特别指出，所用双蒸水（DDW）均经高压蒸汽灭菌。
1：将约2ugDNA于1.5mlEP管中使用DDW稀释至50ul；
2：加5.5ul新鲜配制的3M NaOH；
3： 42℃水浴30min；
水浴期间配制：
4：10mM对苯二酚（氢醌），加30ul至上述水浴后混合液中；（溶液变成淡黄色）
5： 3.6M亚硫酸氢钠（Sigma，S9000），配制方法：1.88g亚硫酸氢钠使用DDW稀释，并
以3M NaOH滴定溶液至PH 5.0，最终体积为5ml。这么大浓度的亚硫酸氢钠很难溶，但加
入NaOH后会慢慢溶解，需要有耐心。PH一定要准确为5.0。加520ul至上述水浴后溶液中。
6：EP管外裹以铝箔纸，避光，轻柔颠倒混匀溶液。
7：加200 ul 石蜡油，防止水分蒸发，限制氧化。
8：50℃避光水浴16h。
一般此步在4pm开始做，熟练的话不到5pm即可完成，水浴16h正好至次日8am以后收，
时间上很合适。
这一步细节：
1：基因组DNA的量不需十分精确，宁多勿少，因为在以后纯化回收步骤中会有丢失，且
此方法修饰最多可至4ug。
2：所有试剂均须新鲜配制，所以配液的技术要过关，既要快，又要精确。
3：亚硫酸氢钠溶液呈强酸性，一定用碱将PH调制5.0，否则PH不合适会影响后续纯化吸
收。
4：水浴最好达16小时，虽可以短至8小时，但后者修饰会有不完全。
第三部分 修饰后DNA纯化回收
EP管如无特别说明均为高压蒸汽灭菌的。
1. 将移液器枪头伸入石蜡油层下，先轻轻加压使其中一小段石蜡油排出，然后吸取混合液
至一洁净1.5mlEP管中。
2：以下使用Promega Wizard Cleanup DNA纯化回收系统（Promega，A7280）
1）70℃水浴预热DDW；配制80%异丙醇；
2）加1ml Promega’s Wizard DNA Clean-up resin，轻柔颠倒混匀，使DNA充分与树脂结合；
3）由于该试剂盒中仅配备针筒没有针栓，如果有真空负压吸引器，使用起来很方便；如果
没有，需要自备3ml-5ml注射器。将注射器针筒与试剂盒提供的回收小柱紧密连接后，将上
述混合物用移液器移至针筒内，用2ml以上的EP管放置小柱下接收废液。加针栓，轻轻加
压，将液体挤出，此时可见小柱内有白色的树脂沉积。
4）将注射器与小柱分离后拔出针栓，再将针筒与小柱连接，向针筒内加入2ml 80％的异丙
醇，插入针栓，轻轻加压，将异丙醇挤出。此为洗涤步骤。
5）将注射器与小柱分离，将小柱置于洁净1.5ml洁净EP管上，离心12000rpm，2min，以
甩去残余异丙醇成分，使树脂干燥。此时，修饰后DNA处于与树脂结合状态。
6）将小柱取下置于另一洁净1.5mlEP管上，移液器加50ul预热好的DDW，室温放置5min。
7）离心12000rpm，20s，此为洗脱步骤，此时EP管内液体即为洗脱的修饰后DNA溶液，
终体积为50ul。
3：加5.5ul 新鲜配制的3M NaOH，室温放置15min。
4：加33ul 10M乙酸铵，以中和NaOH，使溶液PH于7.0左右。
5：加4ul 10mg/ml糖原，此作为沉淀指示剂，因为其与乙醇混合后可产生沉淀，便于以后
离心后辨别回收物的位置，以防在吸取残余乙醇时将回收物吸走。其实，加入这些糖原究竟
能起多大作用，不好说。不过有国产糖原卖，包装不大，也很便宜，买来一用，算严格遵守
文献的步骤吧。
6：加270ul 冰无水乙醇，置于-20度，过夜沉淀。有人为沉淀最短可至2小时，但我认为
时间长些可能会更好。并且做到此步骤时，一般会到中午，如果样本多的话要到下午，不妨
放置过夜，日程可以轻松些，顺便做些其他试验。如果想当天做完，没有问题，但我认为最
好多沉淀些时候，至少6小时吧（这是经验，我做过最少6小时，也是可以的，再短就不敢
发表意见了）
7：4度，12000rpm离心，30min，倒去上清液，收集沉淀。不必吸净。
8：加500ul 70%乙醇，不要将沉淀吹打起来，只要把乙醇加上即可。轻柔倾斜EP管，旋转
一圈，再次离心，4度12000rpm，5min。离心后倒掉上清，再加同量乙醇，同样再做一遍。
此为洗涤步骤，共2次。
9：倒掉上清，并常温简短离心后，将附壁乙醇离至EP管底，移液器小心将残余液体吸净，
室温干燥5min，或沉淀由不透明变为半透明或透明时，加入20ul- 30ulDDW，溶解沉淀。
至此，已完成了修饰后DNA的纯化回收，所得为修饰后DNA溶液，可用于此后的进一步
实验。
10：-20℃保存DNA溶液。
此步细节：
1：在使用注射器时，一定要用力均匀且轻，如使用暴力，会将小柱内的薄膜挤破，失去作
用。
2：乙酸铵、糖原不需新鲜配制，糖原配好后放在-20度保存，乙酸铵室温即可，因为这样
浓度的乙酸铵非常难溶，一旦放在4度，取出用时也会有很多溶质析出。
3：异丙醇、70%乙醇都不需要新鲜配制，但如果用量大，现场配也很方便。
此步关键是在树脂与DNA的结合上，这就再次强调第二部分调亚硫酸钠PH值得重要性。
因为树脂与DNA结合需要有一个适当的PH，如前一步没做好，此步树脂不能与DNA很好
结合，将会带来灾难性后果，即DNA随着液体被挤出了，洗脱时实际已没有任何DNA了。
第四部分 修饰后DNA用于PCR
这一步也没有悬念。我主要谈一下这里面的几个比较棘手的问题：
1：引物问题：我感觉自己设计引物有相当的难度，我曾设计过几对引物，并且试验了一下，
但以失败告终。如果时间充裕、作的又是比较新的基因文献不多，自己设计引物没有问题。
如果不是这样，还是参考文献更好些。首先查阅SCI分值高的文献，然后是著名实验室的
文献，如果国内有做的，更好了，可以直接联系咨询。查到序列后，一定要和Genbank中
的序列进行比对，防止有印刷错误造成的个别碱基的差别。然后再到google上搜一下，看
用的人多否，体系条件是否一样。用的人多、体系条件一样，表明可重复性比较强。我也是
按此行事，算比较顺利。
2：Taq酶问题：有文献用高保真的金牌 Taq（Platinum），但我感觉只要体系正确、变性退
火等条件合适，一般的热启动酶是可以的。我开始使用的是Takara的LA Taq，很好用，配
有10x含mg++的LA缓冲液。有时候用没了，暂时以Takara 的普通Taq酶也可以。如何选
择，可以根据自己的情况。初作者还是用好一点的酶。
3：PCR的条件：变性一般都选择95度，3min。其余我感觉还是根据文献，退火可以根据
你的引物的退火温度在小范围内尝试。一般和文献报道差别不大。只是扩增片断特异性的问
题。建议根据文献。
4：做PCR的EP管最好选择进口的，壁薄且厚度均匀，这可以保证温度的迅速变化可以及
时传递给管内的反应液，使体系真正在所设定的温度下运行。
5：PCR仪：如果在某一个仪器上作出来了，最好一直用此仪器继续。不同的仪器“脾气”
也不一样，但EP管必要和仪器内的插孔紧密结合方好，留有空隙，我认为会影响温度的传
递。
这一部分有些啰嗦，只是个人一些不成熟经验。有疑问处，请大家指出，交流。今天先到这
里，现写一些内容，比较费劲，总是不能一挥而就。望见谅。歇息一会准备写最后蓝白斑筛
选克隆这一部分。
第五部分 PCR产物的凝胶回收
这一步比较简单，可以购买一个凝胶PCR产物回收试剂盒，国产的就很好、价格也合理，
比如TIANGEN的产品（用过）。把切下来的胶按说明书操作即可。
几个细节：
1：PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，要使用新配的电泳液。凝胶浓度1%-2%均可。
2：凝胶DNA回收时在300nm紫外灯下观察条带位置，切取目的片断所在位置的凝胶，尽
量小，保证特异性。
3：紫外照射时间不能过长，否则对DNA有损伤。
4：回收后的DNA如不马上用就储存于-20度，在数月内是很稳定的。
第六部分 PCR产物与T载体的连接和转化、蓝白斑筛选
1：连接T载体（本实验使用的是Promega的试剂盒）
15ul体系
T-easy 1ul
Ligase 1ul
2xbuffer 7.5ul
DNA 5.5ul
4度，过夜。
2：连接产物的转化
1）-70度冰箱内取出感受态细菌，融化后置于冰上；
2）连接产物15ul 全部加入，至于冰上30分钟；
3）42度， 90秒钟；
4）冰上2分钟；
5）800ul LB培养基；
6）280rpm，37度，摇床45分钟（将管放水平了摇，保证菌液摇匀）；
7）8000rpm，1分钟；在超净台内去上清，留100-150ul；
8）涂板：37度孵箱过夜；（板为含有氨苄青霉素的固体LB培养基）
先涂：X-gar 35ul
IPTG 25ul
后涂：混悬液
过夜后可见板上长出很多蓝色或白色斑点，取白色斑点，尤其是蓝色斑点周围的白色斑点，
此处自联率较低。
3：取白斑，划种于新板上
新板：先涂：X-gar 35ul
IPTG 25ul
然后于板底划出分区，进行标记。根据需要，一般一板作50个克隆没有问题。
针头挑白斑划2道于板上相应区域内。
37度，孵箱过夜。
4：联系测序公司送测序。一般一个克隆在35-45元。
这一部分的细节：
1：涂板要均匀，保证Xgar和IPTG均匀分布在板面上；
2：不要让蓝白斑长得太满，否则选取克隆时容易一下挑2个。