2024年2月17日发(作者：充博文)

农业生物技术学报

JournalofAgriculturalBiotechnology2007,15(2):192~197 ·

·研究论文表达伪狂犬病毒 糖蛋白基因重组腺病毒的构建及其免疫效果

* 陈振海, 杨汉春 **, 郭 鑫, 陈艳红

北京100094） （中国农业大学农业部预防兽医学重点实验室，

摘要:通过双酶切将伪狂犬病毒( ,PRV)Fa

株 囊膜糖蛋白基因片段亚克隆到5

型腺病毒AdMax系统

病毒液。间接免疫荧光实验证明此重组病毒能表达

穿梭质粒

pDC316中， 得到

pDC316­

。用此质粒与腺病毒

DNA辅助质粒

pBHGloxΔ E1,3Cre

共转染

293细胞， 包装出重组

腺病毒Adv­

。通过

PCR鉴定和病毒空斑纯化， 得到纯的高效价

Adv­

100%的免疫保护。

攻毒试验表明， 此重组病毒能提供

该病毒经肌注免疫

Balb/c

小鼠， 能诱导小鼠产生特异的体液和细胞免疫反应。

PRVgC蛋白。

免疫

关键词:伪狂犬病毒； 重组腺病毒；

gC糖蛋白；

中图分类号：S188 文献标识码：A 文章编号：1006­1304(2007)02­0192­06 ConstructionoftheRecombinant Expressingthe GeneforDevelopingVaccineagainst Glycoprotein CHENZhen­hai,YANGHan­chun**,GUOXin,CHENYan­hong The into293cells,therecombinant (PRV)Fastrain genewassubclonedinto and shuttlevectorpDC316throughdouble DNAhelperplasmidpBHGloxΔ E1,3Cre o­transfectionoftheshuttlevectorpDC316­ ards,hightitersofrecombinant rotein uscularimmunizationofAdv experiment,thegroupimmunizedbyAdv­ expressinggCproteinwasobtainedthroughhomologousrecombinationandobservationof designatedasAdv­ werepreparedafterPCRiden­ geneexpressionwasconfirmedinMarc145cellsbyimmunofluorescentstain­ hallenge presented100%protectionefficiencyascontrastto0%obtainedinthecontrolgroup. ;immunization

Totally,thepresentresultswillprovideagoodfoundationfordevelopinganovelPRVlivevectorvaccine. gCglycoprotein;recombinant 伪狂犬病是由伪狂犬病毒（

, 大的不稳定性。例如某些对小鼠免疫效果良好的核

酸疫苗， 当免疫经济动物如猪、 牛等时效果明显减弱

甚至无效 （茆达干等， 。 动物本身遗传背景的不

2004）同固然是导致这种差异出现的原因之一，然而，

PRV)引起的动物传染病。现有伪狂犬病疫苗中,

基

因缺失苗存在一定的安全隐患，灭活苗免疫效果不

已成为控制和

理想， 不能有效地克服母源抗体干扰，

消灭伪狂犬病的重要制约因素。以主要保护性抗原

DNA

疫苗在注射入动物体后的稳定性及转染效率

等问题也很大程度地影响了最终结果。如何解决这

些问题， 一直是该类疫苗研究的难点和热点。

重组复制缺陷型腺病毒作为活病毒载体疫苗的

一种,

在基因转移效率和诱导保护性免疫等方面都

具有明显的优势。与

DNA疫苗激发免疫应答的途

径相似，病毒

DNA进入细胞后， 在体内大量表达天gB、

gC

和

gD

囊膜糖蛋白为基础的新型疫苗一直是

伪狂犬病研究的重要领域，活病毒载体疫苗和核酸

疫苗均是有良好前景的新型疫苗（Vinciane 2003;Mengeling ,1997;Laurent , 。核

,2003）酸疫苗尽管诱导的免疫应答全面，在安全性方面更

具优势，然而其应答强度并不高且免疫效果存在较

（863）

（No.2002AA24134）

*基金项目： 国家高技术研究与发展 计划课题 资助。

**通讯作者。Authorforcorrespondence。教授， 博士生导师， 主要从事动物分子病毒学与免疫学研究。

Tel:86­10­62731296;E­mail:.

2006­06­19接受日期：

2006­08­28

收稿日期：

第

2

期 陈振海等：表达伪狂犬病毒 糖蛋白基因重组腺病毒的构建及其免疫效果

193然的抗原蛋白。因此常能诱导高效的特异性体液免

疫应答和细胞免疫应答

（张立国等，

2000； 何金生等，

2002； 冯 霞等，

2004）。 正是由于腺病毒颗粒自身的

结构蛋白在保护和传递携带外源基因的病毒

DNA

上强于裸

DNA

疫苗，所以腺病毒疫苗的免疫效果

相对均一稳定。从实践的角度来说，其操作更加简

便， 成本也较低。在安全性方面， 由于使用的是复制

缺陷型腺病毒系统，

病毒基因组缺失了

E1

和

E3

两

个功能蛋白， 大大降低了重组病毒返祖的可能， 安全

性较高。本实验正是基于这些原因，构建了预防

PRV

的重组腺病毒疫苗

Adv­

，并对其免疫效果

进行了初步研究。

1 材料和方法

1.1 材料

伪狂犬病毒（

，

PRV）

Fa

株及

携带报告基因 的重组腺病毒

Adv­

由本室

保存。293、

Marc145

和

BHK21

细胞由本室传代保

存。穿梭质粒

pDC316

和辅助质粒

pBHGloxΔ E1, 3Cre

为加拿大

MicrobixBiosystems

公司（多伦多）

产品，pAC­

为含伪狂犬病毒

Fa

株 基因的重

组真核表达质粒，

本室保存。MBP­gC­NC

蛋白为原

核表达并切胶纯化制备的重组蛋白。Balb/c

健康小

鼠(6~8

周龄)购自军事医学科学院实验动物中心。

转

染试剂

Transfectin

购自北京天为时代公司 （北京），

T4 DNALigase

和低熔点琼脂糖为

Promega

公司

Madison,美国） 产品， 限制性内切酶

RI、

d芋

和

DNA聚合酶为

TakaRa

公司 （大连）

产品，

PCR

产

物回收试剂盒为博大泰克公司 （北京） 产品。鼠抗伪

狂犬病毒

gC

蛋白抗血清由本室制备保存。辣根过

氧化物酶 （HRP） 和异硫氰酸荧光素 （FITC） 标记的

羊抗鼠

IgG二抗为北京鼎国公司产品。质粒中提试

剂盒购自北京威格拉斯公司，

DMEM

培养基购自

Gibco

公司（Carlsbad,

美国），标准胎牛血清购自

Hyclone公司 （Logan,美国）。

1.2 方法

1.2.1 重组穿梭质粒的构建 用

RI和

d芋

双酶切

pAC­

， 回收 基因片段插入腺病毒穿梭

载体

pDC316

的

RI/ d芋位点。

PCR

方法鉴定

重组克隆菌株， 并提取质粒做双酶切分析。

鉴定重组

克隆后,

将重组穿梭质粒命名为

pDC316­

。

1.2.2 重组腺病毒的获得与

PCR

鉴定 将

pDC316­

和

pBHGloxΔ E1,3Cre

用质粒中提试剂

盒提纯后， 通过脂质体共转染

293

细胞,初步获得重

组腺病毒。 收获细胞培养液反复冻融裂解后离心， 取

上清液接种新的

293

细胞。37℃感作

1h后， 弃去病

毒液， 并用新的细胞培养液洗

2

遍， 加入新鲜完全培

养基， 至细胞

80%~90%病变时收集病毒悬液，

加入

蛋白酶

K消化后煮沸

5min

分别提取病毒

DNA， 做

PCR

扩增鉴定。重组腺病毒基因组中 基因

PCR

扩增的反应体系为：

10伊buffer5

滋L, 2.5mmol/L dNTP1

滋L ，上下游引物（10

滋mol/L ）各

1

滋L, DMSO5

滋L ， 模板(病毒冻存液)1

滋L ，

DNA

聚

合酶

1U， 补水至

50

滋L 。反应条件为：

94 ℃预变性

5min；

94 ℃1min，

59 ℃1min，

72 ℃1.5min，

31

个循

环；

72 ℃延伸

10min。2

条引物：

gC­F1：

5'­ATAGAATTCGCCACCATGGCCTCGCTCGCGC­ GTGCGATG­3'；

gC­R1：

5'­AGCTCTAGATTACAGCACGGGCCGGCGATA­ GTAGACG­3'。

1.2.3 空斑纯化 将

PBS

溶解的

2％琼脂糖沸水

融化后冷却至

40~50 ℃ ,

与

37 ℃

预热的

2伊DMEM/20％FBS（ fetalbovineserum)等体积混合备

用。将初步得到的重组病毒液做梯度稀释后感染接

种于

6

孔板

90％覆盖率的

293

细胞。 作用

2h

后， 将

病毒液吸出并用无血清培养液漂洗

1

次，沿壁加入

前述混合液。室温冷凝后， 放入

37 ℃ 5％CO 2

培养

箱中培养。待出现明显可见斑后挑出，

扩增培养， 做

PCR

鉴定和毒价测定。

1.2.4 重组腺病毒滴度测定 用

96

孔板做

实验,

按照

Reed­Muench

方法计算病毒滴度，具体

操作参照殷 震等

（1997）。

1.2.5 重组腺病毒表达

gC

蛋白的免疫荧光鉴定

重组腺病毒感染

Marc145

细胞

48h

后弃生长液,

用

无水乙醇固定细胞，以鼠抗伪狂犬病毒

gC

蛋白阳

性血清

（1颐20

稀释)作一抗， 以羊抗鼠

IgG­FITC

作二

抗进行免疫荧光检测 。 同时设置阴性对照

Adv­

。

1.2.6 免疫动物 免疫

6~8

周龄健康

Balb/c

小鼠,

分

2

组， 每组

12

只。

Adv­

免疫组每只小鼠肌肉注

射

2伊10 8

的重组腺病毒

Adv­

，免疫

2

次，

间隔期为

2

周， 阴性对照重组腺病毒

Adv­

以同

样的方案免疫

2

次。

1.2.7 抗

gC

抗体水平的检测 采用间接

ELISA法,

包被抗原为 表达的重组

MBP­gC­NC

蛋白

(200ng/100

滋L),

以

1%BSA (bovineserumalbumin)

封闭后依次加入倍比稀释的免疫小鼠血清(孵育、 洗

板)及

HRP

标记的羊抗鼠二抗

(孵育、

洗板)。最后加

底物显色,于波长

450nm

测定各孔的 值。当实

验组与对照组 值之比大于

2.1

的最大稀释度判

为抗体的效价。

1.2.8 中和抗体水平的检测 分离被检血清，

56℃ （

194农 业 生 物 技 术 学 报

2007

年

灭活

30min，倍比稀释血清后分别加入

96

孔细胞

每孔

50

滋L培养板中， 每个稀释度作

3

个重复，

。然

后在加有血清的培养孔中加入用

DMEM

稀释为

的

PRV50

滋L,200 5%CO2

培养箱中

37 ℃，

作用

20~24h， 然后于每孔中滴加

2~5伊10 5

个

/mL的

放回培养箱

轻轻摇匀后，

BHK21

细胞悬液

100

滋L ，

中继续培养

4~6d， 观察细胞病变情况， 计算被检血

清中抗

PRV的特异性中和抗体的滴度。

1.2.9 迟发型超敏反应(delayed­typehyper­sensitivi­ 2

周进行病毒攻毒试验。用

20

的

PRVFa株病

剂量

毒培养液经脚掌和腹部皮下接种

Balb/c

小鼠，

为

100

滋L每组攻毒小鼠数

8

只。攻毒后逐日观察

，

死亡情况。

动物的临床症状、

1.2.11 数据分析 将所有数据用

SPSS12.0

的单因

素方差分析并进行

Student’

s

检验。以

<0.05

作

为差异显著性评判标准。

2 结果

2.1 重组腺病毒的获得和鉴定

用

ty，

DTH)

末次免疫后

2

周,

每组任选

4

只小鼠于

左、 右足垫分别注射

50

滋L（病

PRV

灭活病毒抗原

8 毒滴度约为

10 RI和

d芋双酶切

pAC­

，回收得到

和细胞培养基作为阴性

/mL）

对照。分别于

0、 右足

24和

48h用微型卡尺测量左、

50 基因片段，将其插入腺病毒穿梭载体

pDC316

中。PCR

方法和双酶切分析鉴定表明得到重组质

粒， 命名为

pDC316­

。以此腺病毒转移质粒和病

毒载体质粒共转染

293

细胞（图

1），

7~10d

后细胞

出现肿胀、 圆缩等典型的细胞病变(图

2)。收获细胞

垫厚度，单位用

mm

表示,

以左足垫肿胀厚度减去

右足垫肿胀厚度计算水肿反应。

1.2.10 攻毒试验 所有实验动物均于末次免疫后

TM

图 方法产生重组腺病毒示意图

eofrecombinant TM generationbytheAdMax methodin293cells 图2.

共转染后产生细胞病变 （A） 与正常细胞对

照 （B）

thiceffectsobservedafter cotransfection

A）andnormal293cellsasnegative （control

B） （A.293cellscotransfectedwithshuttlevectorpDC316­ and DNAhelperplasmidpBHGloxE1,3Cre; 293cells.

第

2

期 陈振海等：表达伪狂犬病毒 糖蛋白基因重组腺病毒的构建及其免疫效果

195培养液反复冻融后离心，取上清液接种新的

293

细

胞，至细胞

80%病变时收集病毒悬液,

提取病毒

DNA， 经

PCR

扩增得到

1

条约

1.5kb

的片段， 与预

期大小一致，

而以腺病毒

Adv­

为模板则不能扩

增出相应片段 （图

3）， 表明已获得含有 基因的重

组腺病毒，

命名为

Adv­

。进一步做空斑纯化，

7~8 d左右出现明显病毒空斑 （图

4）。挑出后扩增， 获得

纯的

Adv­

病毒种子液。用

96

孔板做 实

验,

结果表明病毒滴度为

3.1× 10 9 /mL。

图3.

重组腺病毒的PCR鉴定结果

ficationofrecombinant Adv­ byPCR M,100bpDNAladder;1,PCRproductofAdv­ ;2,PCRproductof Adv­ ;Arrowshowsthebandof genefragment.

图4.

病毒空斑形成

ionofvirusplaqueArrowshowstheplaque.. 2.2 基因在重组腺病毒中的表达

分别用

Adv­

和

Adv

感染

Marc145

细

胞， 间接免疫荧光检测表明，

48h

后在

Adv­

感染

的细胞胞浆内可见到强烈的特异性荧光灶， 在

Adv­

感染的细胞中未检测到特异性免疫荧光

5）， 表明

Adv­

感染哺乳动物细胞后能够表达

gC

蛋白。

图5.

用Adv

和

Adv

感染后48h的

Marc145细胞荧光检测

ionofMarc145cellsinfectedwithAdv­ and Adv­ for48hbyimmunofluorescenceassay 145cellsinfectedwithrecombinant Adv­ ; 145cellsinfectedwithrecombinant Adv 2.3 免疫小鼠血清抗体效价测定 12

只小鼠在接受重组腺病毒免疫后， 其循环抗

体的效价上升很快，一免后

2

周的

gC

蛋白

ELISA效价为

3200~12800，平均值

7680依2862 ，阳转率

100％。二免后

2

周效价为

51200~204800，平均值

112640± 56086，而对照组小鼠的

ELISA

效价均为

阴性， 组间抗体效价差别极显著( <0.01)。用微量

中和实验检测抗

PRV的中和抗体水平， 一免后

2

周

为

14依4 ， 二免后

2

周效价为

48依18 ， 而对照组小鼠

的中和抗体均为阴性。

2.4DTH 反应

注射

PRV

抗原后分别于

24

和

48h

测量左右

足垫的厚度，结果显示疫苗

Adv­

免疫组小鼠足

垫呈现不同程度红肿， 表明有大量单核细胞浸润， 而

阴性对照组

Adv­

未见有红肿现象，

表明出现的

足垫肿胀是抗原特异性

DTH

反应增强的结果， 疫

苗组与对照组足垫肿胀值差异极显著( <0.01)（图

6）。

（图

196农 业 生 物 技 术 学 报

2007

年

图6.注射

PRV抗原后

24和

48h小鼠左右足垫厚度

essofbothleftandrightfootpadofmice injected byPRVantigenfor24and48h 2.5 小鼠对 PRVFa株攻击的保护性试验 20 PRV强毒攻击后,

阴性对照组小鼠出现

了全身奇痒,

啃咬等伪狂犬病典型症状， 在

7d

内全

部死亡， 免疫保护率为

0%（ 0/8）。Adv­

免疫组观

察

15d

内无死亡现象， 免疫保护率为

100%（ 8/8）。

3 讨论

腺病毒载体具有滴度高、

感染范围广、

DNA不整

合到宿主染色体、可插入

7～8kb的外源

DNA片段

等优点， 目前已成为基因治疗、

基因功能研究、 反义治

疗、疫苗开发等领域最为常用的载体之一

(Niaand Hildegund，

2004)。 在重组腺病毒的构建上常采用两种

方法,即细胞内同源重组法和细菌内同源重组法两种

(何金生等，

2001； 赵峰和周清华，

2001)。传统的细胞

内同源重组法是将目的基因亚克隆至穿梭质粒中,再

与腺病毒基因组质粒共转染

293细胞， 两质粒借所带

的部分同源序列在

293细胞内发生同源重组而形成

重组体， 并进一步包装成重组腺病毒，

该方法的主要

问题是发生重组的概率很低， 这直接关系到出毒的成

功率，

如pAC/pJM17腺病毒系统。 我们也曾试图利用

此系统构建表达

PRV

基因的重组腺病毒， 数次失

败。采用细菌内同源重组法快速制备重组腺病毒的

AdEasy系统，则是将线性化的转移质粒和腺病毒基

因组质粒混合后经电穿孔法导入

BJ5183细菌,

继而

用经筛选鉴定的重组腺病毒质粒转染

293

细胞， 包

装出重组腺病毒。

此方法相对简便,成功率明显提高，

但只有14%。后改进为两步法细菌内同源重组， 即首

先构建

BJ5183pAdEasy细菌,

然后将转移质粒导入

细菌中进行同源重组。这使得构建重组腺病毒的成

功率提高到

94%。但仍延用电穿孔技术将转移质粒

导入细菌,需要特殊的电穿孔设备,操作要求较高。于

是，有报道改用氯化钙制作感受态细菌转化转移质

粒， 获得了成功 （汤福祥等，

2003）。综合来说， 真核细

胞内重组产生的重组病毒， 由于病毒DNA面临的生

存环境是终端宿主哺乳动物细胞， 对腺病毒生存压力

的保持有助于重组腺病毒基因组的完整性。

相比较而

言， 在原核细胞 （BJ5183） 中完成病毒基因组重组， 由

于失去了生存压力的腺病毒基因组更容易发生突变，

使得产生的重组病毒遗传背景及活性将可能受到影

响。所以在AdEasy系统中有电泳酶切鉴定重组病毒

基因组质粒的步骤， 以确认基因组

DNA的完整性。

本研究使用的

AdMax

腺病毒系统是利用细胞

内同源重组法， 在

Cre­

重组酶介导下， 使转染

进

293

细胞的穿梭质粒和辅助大质粒发生定点重

组， 产生

E1/E3

缺失的复制缺限型腺病毒。AdMax

系统的特点是通过重组酶在真核细胞内完成重组出

毒， 高效而稳定， 是目前最方便快捷的腺病毒载体系

统。正是该系统的如上优点使得我们能快速得到数

十株重组腺病毒， 成功率为

100％， 其中有本研究使

用的

Adv­

重组病毒。

对于上述提及的两种腺病毒系统，在腺病毒

DNA质粒提取方面也可能会碰到一些问题。

由于该

质粒

DNA

很大 （约

30~40kb）， 拷贝数不高， 给提取

纯化并最终得到较高浓度、纯度和超螺旋构像比例

的病毒

DNA质粒带来不便。以硅胶介质等为代表

的柱离心式纯化柱常用于制备转染用的质粒

DNA，

然而本研究的经验表明，此类形式的纯化方法在制

备如腺病毒

DNA质粒这样的大质粒时，效果常不

好， 产量以致浓度不理想。 而选择使用非离心柱式纯

化

DNA的方法，能保证顺利得到符合转染要求的

大质粒，如本研究使用的试剂盒方法就是较好的选

择， 以兹参考。

重组腺病毒载体可有效地将外源

DNA

导入宿

主细胞内，并使之高效表达以及正确的翻译后修饰,

从而可诱导很好的保护性体液和细胞免疫应答。因

此,已用于多种病毒抗原的疫苗研究中。尤其需要提

及的是，由于腺病毒能通过消化道和呼吸道途径感

染,在诱导产生粘膜免疫方面也具有优势，所以腺病

毒滴鼻免疫和口服给药在有关研究中都取得了不错

的效果

(JohnandCarol,2003;Sally .,2002; Kampen ,2005)。 本研究在成功构建得到Adv­

重组病毒后， 通过肌肉途径免疫小鼠，

结果表明产生

了很好的保护性体液免疫反应 （中和抗体） 和细胞免

疫反应

（DTH，

CD4 + T细胞特异性应答）。ELISA抗体

效价上升明显， 一免后

2周和二免后

2周效价均值分

别达到7680和

112640， 阳转率为

100％， 表明重组腺

病毒疫苗效果良好。与

ELISA抗体效价相对应的平

均中和抗体效价分别为

14

和

48， 表明一免后即产生

了一定水平的中和抗体。在二免后， 随着总抗体的进

一步大幅上升， 中和抗体水平也明显升高，

ELISA抗

第

2

期 陈振海等：表达伪狂犬病毒 糖蛋白基因重组腺病毒的构建及其免疫效果

197体效价与中和抗体效价水平呈正相关。 疫苗免疫后的

抗体水平一般能相当程度地折射出细胞免疫和攻毒

保护水平。 初步的攻毒试验也表明该腺病毒疫苗能提

供完全的免疫保护。 然而此疫苗在不同传递途径上的

免疫效果究竟如何， 与表达其它病毒抗原的重组腺病

毒疫苗联合免疫时单个疫苗免疫效果是否受到影响，

参 考 文 献 FengX(冯霞),YuSQ(余双庆),ChenGM(陈国敏),ZuoJM (左建民),Zhouling(周玲)andZengY(曾毅).Construction andimmunepotencyofrecombinant adenoviruscontaining codonmodifiedHIV­1gp120(J). (中华实验和临床病毒学杂志), 2004,18(2):113~118(inChinese) HeJS(何金生),WangJW(王健伟)andHongT(洪涛).The principleandmethodsofconstructingtherecombinant (J). (中华实验和临床病毒学杂志),2001,15(4):399~401 (inChinese) HeJS(何金生),WangJW(王健伟),JiangXL(姜秀丽),Wang DY(王大燕),WenLY(温乐英)andHongT(洪涛).Expres­ sionofthemainstructuralantigenVP6ofhumanrotavirusby recombinant andimmuneresponsesinduced (J). (中华实验和临床病毒学杂志),2002,16(2):109~113(in Chinese) limmunizationwithareplica­ tion­deficient vectorexpressingmurinecy­ tomegalovirusglycoproteinBinducesmucosalandsystemic immunity(J). ,2003,21:2632~2642 KampenKRV,ShiZ,GaoP,ZhangJF,FosterKW,ChenDT andimmunogenicityofaden­ ovirus­vectorednasalandepicutaneousinfluenzavaccinesin humans(J). ,2005,23:1029~1036 LaurentF,SimonaB,ChristineA,NathalieB,AndreBandJean cinationofneonatepigletsinthefaceofma­ ternalimmunityinduceshumoralmemoryandprotectiona­ gainstavirulent challenge(J). 2003,21:1732~1741 MaoDG(茆达干),YangLG(杨利国)andChaoSX(曹少先). 在抵抗PRV母源抗体和已存在对腺病毒结构蛋白的

免疫等诸多条件下的免疫效果究竟怎样，

分别针对性

地采用什么改进策略， 是本研究后续工作所要探讨的

问题。 这些工作的开展将进一步地丰富免疫策略和疫

苗设计的研究。

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2024年2月17日发(作者：充博文)

农业生物技术学报

JournalofAgriculturalBiotechnology2007,15(2):192~197 ·

·研究论文表达伪狂犬病毒 糖蛋白基因重组腺病毒的构建及其免疫效果

* 陈振海, 杨汉春 **, 郭 鑫, 陈艳红

北京100094） （中国农业大学农业部预防兽医学重点实验室，

摘要:通过双酶切将伪狂犬病毒( ,PRV)Fa

株 囊膜糖蛋白基因片段亚克隆到5

型腺病毒AdMax系统

病毒液。间接免疫荧光实验证明此重组病毒能表达

穿梭质粒

pDC316中， 得到

pDC316­

。用此质粒与腺病毒

DNA辅助质粒

pBHGloxΔ E1,3Cre

共转染

293细胞， 包装出重组

腺病毒Adv­

。通过

PCR鉴定和病毒空斑纯化， 得到纯的高效价

Adv­

100%的免疫保护。

攻毒试验表明， 此重组病毒能提供

该病毒经肌注免疫

Balb/c

小鼠， 能诱导小鼠产生特异的体液和细胞免疫反应。

PRVgC蛋白。

免疫

关键词:伪狂犬病毒； 重组腺病毒；

gC糖蛋白；

中图分类号：S188 文献标识码：A 文章编号：1006­1304(2007)02­0192­06 ConstructionoftheRecombinant Expressingthe GeneforDevelopingVaccineagainst Glycoprotein CHENZhen­hai,YANGHan­chun**,GUOXin,CHENYan­hong The into293cells,therecombinant (PRV)Fastrain genewassubclonedinto and shuttlevectorpDC316throughdouble DNAhelperplasmidpBHGloxΔ E1,3Cre o­transfectionoftheshuttlevectorpDC316­ ards,hightitersofrecombinant rotein uscularimmunizationofAdv experiment,thegroupimmunizedbyAdv­ expressinggCproteinwasobtainedthroughhomologousrecombinationandobservationof designatedasAdv­ werepreparedafterPCRiden­ geneexpressionwasconfirmedinMarc145cellsbyimmunofluorescentstain­ hallenge presented100%protectionefficiencyascontrastto0%obtainedinthecontrolgroup. ;immunization

Totally,thepresentresultswillprovideagoodfoundationfordevelopinganovelPRVlivevectorvaccine. gCglycoprotein;recombinant 伪狂犬病是由伪狂犬病毒（

, 大的不稳定性。例如某些对小鼠免疫效果良好的核

酸疫苗， 当免疫经济动物如猪、 牛等时效果明显减弱

甚至无效 （茆达干等， 。 动物本身遗传背景的不

2004）同固然是导致这种差异出现的原因之一，然而，

PRV)引起的动物传染病。现有伪狂犬病疫苗中,

基

因缺失苗存在一定的安全隐患，灭活苗免疫效果不

已成为控制和

理想， 不能有效地克服母源抗体干扰，

消灭伪狂犬病的重要制约因素。以主要保护性抗原

DNA

疫苗在注射入动物体后的稳定性及转染效率

等问题也很大程度地影响了最终结果。如何解决这

些问题， 一直是该类疫苗研究的难点和热点。

重组复制缺陷型腺病毒作为活病毒载体疫苗的

一种,

在基因转移效率和诱导保护性免疫等方面都

具有明显的优势。与

DNA疫苗激发免疫应答的途

径相似，病毒

DNA进入细胞后， 在体内大量表达天gB、

gC

和

gD

囊膜糖蛋白为基础的新型疫苗一直是

伪狂犬病研究的重要领域，活病毒载体疫苗和核酸

疫苗均是有良好前景的新型疫苗（Vinciane 2003;Mengeling ,1997;Laurent , 。核

,2003）酸疫苗尽管诱导的免疫应答全面，在安全性方面更

具优势，然而其应答强度并不高且免疫效果存在较

（863）

（No.2002AA24134）

*基金项目： 国家高技术研究与发展 计划课题 资助。

**通讯作者。Authorforcorrespondence。教授， 博士生导师， 主要从事动物分子病毒学与免疫学研究。

Tel:86­10­62731296;E­mail:.

2006­06­19接受日期：

2006­08­28

收稿日期：

第

2

期 陈振海等：表达伪狂犬病毒 糖蛋白基因重组腺病毒的构建及其免疫效果

193然的抗原蛋白。因此常能诱导高效的特异性体液免

疫应答和细胞免疫应答

（张立国等，

2000； 何金生等，

2002； 冯 霞等，

2004）。 正是由于腺病毒颗粒自身的

结构蛋白在保护和传递携带外源基因的病毒

DNA

上强于裸

DNA

疫苗，所以腺病毒疫苗的免疫效果

相对均一稳定。从实践的角度来说，其操作更加简

便， 成本也较低。在安全性方面， 由于使用的是复制

缺陷型腺病毒系统，

病毒基因组缺失了

E1

和

E3

两

个功能蛋白， 大大降低了重组病毒返祖的可能， 安全

性较高。本实验正是基于这些原因，构建了预防

PRV

的重组腺病毒疫苗

Adv­

，并对其免疫效果

进行了初步研究。

1 材料和方法

1.1 材料

伪狂犬病毒（

，

PRV）

Fa

株及

携带报告基因 的重组腺病毒

Adv­

由本室

保存。293、

Marc145

和

BHK21

细胞由本室传代保

存。穿梭质粒

pDC316

和辅助质粒

pBHGloxΔ E1, 3Cre

为加拿大

MicrobixBiosystems

公司（多伦多）

产品，pAC­

为含伪狂犬病毒

Fa

株 基因的重

组真核表达质粒，

本室保存。MBP­gC­NC

蛋白为原

核表达并切胶纯化制备的重组蛋白。Balb/c

健康小

鼠(6~8

周龄)购自军事医学科学院实验动物中心。

转

染试剂

Transfectin

购自北京天为时代公司 （北京），

T4 DNALigase

和低熔点琼脂糖为

Promega

公司

Madison,美国） 产品， 限制性内切酶

RI、

d芋

和

DNA聚合酶为

TakaRa

公司 （大连）

产品，

PCR

产

物回收试剂盒为博大泰克公司 （北京） 产品。鼠抗伪

狂犬病毒

gC

蛋白抗血清由本室制备保存。辣根过

氧化物酶 （HRP） 和异硫氰酸荧光素 （FITC） 标记的

羊抗鼠

IgG二抗为北京鼎国公司产品。质粒中提试

剂盒购自北京威格拉斯公司，

DMEM

培养基购自

Gibco

公司（Carlsbad,

美国），标准胎牛血清购自

Hyclone公司 （Logan,美国）。

1.2 方法

1.2.1 重组穿梭质粒的构建 用

RI和

d芋

双酶切

pAC­

， 回收 基因片段插入腺病毒穿梭

载体

pDC316

的

RI/ d芋位点。

PCR

方法鉴定

重组克隆菌株， 并提取质粒做双酶切分析。

鉴定重组

克隆后,

将重组穿梭质粒命名为

pDC316­

。

1.2.2 重组腺病毒的获得与

PCR

鉴定 将

pDC316­

和

pBHGloxΔ E1,3Cre

用质粒中提试剂

盒提纯后， 通过脂质体共转染

293

细胞,初步获得重

组腺病毒。 收获细胞培养液反复冻融裂解后离心， 取

上清液接种新的

293

细胞。37℃感作

1h后， 弃去病

毒液， 并用新的细胞培养液洗

2

遍， 加入新鲜完全培

养基， 至细胞

80%~90%病变时收集病毒悬液，

加入

蛋白酶

K消化后煮沸

5min

分别提取病毒

DNA， 做

PCR

扩增鉴定。重组腺病毒基因组中 基因

PCR

扩增的反应体系为：

10伊buffer5

滋L, 2.5mmol/L dNTP1

滋L ，上下游引物（10

滋mol/L ）各

1

滋L, DMSO5

滋L ， 模板(病毒冻存液)1

滋L ，

DNA

聚

合酶

1U， 补水至

50

滋L 。反应条件为：

94 ℃预变性

5min；

94 ℃1min，

59 ℃1min，

72 ℃1.5min，

31

个循

环；

72 ℃延伸

10min。2

条引物：

gC­F1：

5'­ATAGAATTCGCCACCATGGCCTCGCTCGCGC­ GTGCGATG­3'；

gC­R1：

5'­AGCTCTAGATTACAGCACGGGCCGGCGATA­ GTAGACG­3'。

1.2.3 空斑纯化 将

PBS

溶解的

2％琼脂糖沸水

融化后冷却至

40~50 ℃ ,

与

37 ℃

预热的

2伊DMEM/20％FBS（ fetalbovineserum)等体积混合备

用。将初步得到的重组病毒液做梯度稀释后感染接

种于

6

孔板

90％覆盖率的

293

细胞。 作用

2h

后， 将

病毒液吸出并用无血清培养液漂洗

1

次，沿壁加入

前述混合液。室温冷凝后， 放入

37 ℃ 5％CO 2

培养

箱中培养。待出现明显可见斑后挑出，

扩增培养， 做

PCR

鉴定和毒价测定。

1.2.4 重组腺病毒滴度测定 用

96

孔板做

实验,

按照

Reed­Muench

方法计算病毒滴度，具体

操作参照殷 震等

（1997）。

1.2.5 重组腺病毒表达

gC

蛋白的免疫荧光鉴定

重组腺病毒感染

Marc145

细胞

48h

后弃生长液,

用

无水乙醇固定细胞，以鼠抗伪狂犬病毒

gC

蛋白阳

性血清

（1颐20

稀释)作一抗， 以羊抗鼠

IgG­FITC

作二

抗进行免疫荧光检测 。 同时设置阴性对照

Adv­

。

1.2.6 免疫动物 免疫

6~8

周龄健康

Balb/c

小鼠,

分

2

组， 每组

12

只。

Adv­

免疫组每只小鼠肌肉注

射

2伊10 8

的重组腺病毒

Adv­

，免疫

2

次，

间隔期为

2

周， 阴性对照重组腺病毒

Adv­

以同

样的方案免疫

2

次。

1.2.7 抗

gC

抗体水平的检测 采用间接

ELISA法,

包被抗原为 表达的重组

MBP­gC­NC

蛋白

(200ng/100

滋L),

以

1%BSA (bovineserumalbumin)

封闭后依次加入倍比稀释的免疫小鼠血清(孵育、 洗

板)及

HRP

标记的羊抗鼠二抗

(孵育、

洗板)。最后加

底物显色,于波长

450nm

测定各孔的 值。当实

验组与对照组 值之比大于

2.1

的最大稀释度判

为抗体的效价。

1.2.8 中和抗体水平的检测 分离被检血清，

56℃ （

194农 业 生 物 技 术 学 报

2007

年

灭活

30min，倍比稀释血清后分别加入

96

孔细胞

每孔

50

滋L培养板中， 每个稀释度作

3

个重复，

。然

后在加有血清的培养孔中加入用

DMEM

稀释为

的

PRV50

滋L,200 5%CO2

培养箱中

37 ℃，

作用

20~24h， 然后于每孔中滴加

2~5伊10 5

个

/mL的

放回培养箱

轻轻摇匀后，

BHK21

细胞悬液

100

滋L ，

中继续培养

4~6d， 观察细胞病变情况， 计算被检血

清中抗

PRV的特异性中和抗体的滴度。

1.2.9 迟发型超敏反应(delayed­typehyper­sensitivi­ 2

周进行病毒攻毒试验。用

20

的

PRVFa株病

剂量

毒培养液经脚掌和腹部皮下接种

Balb/c

小鼠，

为

100

滋L每组攻毒小鼠数

8

只。攻毒后逐日观察

，

死亡情况。

动物的临床症状、

1.2.11 数据分析 将所有数据用

SPSS12.0

的单因

素方差分析并进行

Student’

s

检验。以

<0.05

作

为差异显著性评判标准。

2 结果

2.1 重组腺病毒的获得和鉴定

用

ty，

DTH)

末次免疫后

2

周,

每组任选

4

只小鼠于

左、 右足垫分别注射

50

滋L（病

PRV

灭活病毒抗原

8 毒滴度约为

10 RI和

d芋双酶切

pAC­

，回收得到

和细胞培养基作为阴性

/mL）

对照。分别于

0、 右足

24和

48h用微型卡尺测量左、

50 基因片段，将其插入腺病毒穿梭载体

pDC316

中。PCR

方法和双酶切分析鉴定表明得到重组质

粒， 命名为

pDC316­

。以此腺病毒转移质粒和病

毒载体质粒共转染

293

细胞（图

1），

7~10d

后细胞

出现肿胀、 圆缩等典型的细胞病变(图

2)。收获细胞

垫厚度，单位用

mm

表示,

以左足垫肿胀厚度减去

右足垫肿胀厚度计算水肿反应。

1.2.10 攻毒试验 所有实验动物均于末次免疫后

TM

图 方法产生重组腺病毒示意图

eofrecombinant TM generationbytheAdMax methodin293cells 图2.

共转染后产生细胞病变 （A） 与正常细胞对

照 （B）

thiceffectsobservedafter cotransfection

A）andnormal293cellsasnegative （control

B） （A.293cellscotransfectedwithshuttlevectorpDC316­ and DNAhelperplasmidpBHGloxE1,3Cre; 293cells.

第

2

期 陈振海等：表达伪狂犬病毒 糖蛋白基因重组腺病毒的构建及其免疫效果

195培养液反复冻融后离心，取上清液接种新的

293

细

胞，至细胞

80%病变时收集病毒悬液,

提取病毒

DNA， 经

PCR

扩增得到

1

条约

1.5kb

的片段， 与预

期大小一致，

而以腺病毒

Adv­

为模板则不能扩

增出相应片段 （图

3）， 表明已获得含有 基因的重

组腺病毒，

命名为

Adv­

。进一步做空斑纯化，

7~8 d左右出现明显病毒空斑 （图

4）。挑出后扩增， 获得

纯的

Adv­

病毒种子液。用

96

孔板做 实

验,

结果表明病毒滴度为

3.1× 10 9 /mL。

图3.

重组腺病毒的PCR鉴定结果

ficationofrecombinant Adv­ byPCR M,100bpDNAladder;1,PCRproductofAdv­ ;2,PCRproductof Adv­ ;Arrowshowsthebandof genefragment.

图4.

病毒空斑形成

ionofvirusplaqueArrowshowstheplaque.. 2.2 基因在重组腺病毒中的表达

分别用

Adv­

和

Adv

感染

Marc145

细

胞， 间接免疫荧光检测表明，

48h

后在

Adv­

感染

的细胞胞浆内可见到强烈的特异性荧光灶， 在

Adv­

感染的细胞中未检测到特异性免疫荧光

5）， 表明

Adv­

感染哺乳动物细胞后能够表达

gC

蛋白。

图5.

用Adv

和

Adv

感染后48h的

Marc145细胞荧光检测

ionofMarc145cellsinfectedwithAdv­ and Adv­ for48hbyimmunofluorescenceassay 145cellsinfectedwithrecombinant Adv­ ; 145cellsinfectedwithrecombinant Adv 2.3 免疫小鼠血清抗体效价测定 12

只小鼠在接受重组腺病毒免疫后， 其循环抗

体的效价上升很快，一免后

2

周的

gC

蛋白

ELISA效价为

3200~12800，平均值

7680依2862 ，阳转率

100％。二免后

2

周效价为

51200~204800，平均值

112640± 56086，而对照组小鼠的

ELISA

效价均为

阴性， 组间抗体效价差别极显著( <0.01)。用微量

中和实验检测抗

PRV的中和抗体水平， 一免后

2

周

为

14依4 ， 二免后

2

周效价为

48依18 ， 而对照组小鼠

的中和抗体均为阴性。

2.4DTH 反应

注射

PRV

抗原后分别于

24

和

48h

测量左右

足垫的厚度，结果显示疫苗

Adv­

免疫组小鼠足

垫呈现不同程度红肿， 表明有大量单核细胞浸润， 而

阴性对照组

Adv­

未见有红肿现象，

表明出现的

足垫肿胀是抗原特异性

DTH

反应增强的结果， 疫

苗组与对照组足垫肿胀值差异极显著( <0.01)（图

6）。

（图

196农 业 生 物 技 术 学 报

2007

年

图6.注射

PRV抗原后

24和

48h小鼠左右足垫厚度

essofbothleftandrightfootpadofmice injected byPRVantigenfor24and48h 2.5 小鼠对 PRVFa株攻击的保护性试验 20 PRV强毒攻击后,

阴性对照组小鼠出现

了全身奇痒,

啃咬等伪狂犬病典型症状， 在

7d

内全

部死亡， 免疫保护率为

0%（ 0/8）。Adv­

免疫组观

察

15d

内无死亡现象， 免疫保护率为

100%（ 8/8）。

3 讨论

腺病毒载体具有滴度高、

感染范围广、

DNA不整

合到宿主染色体、可插入

7～8kb的外源

DNA片段

等优点， 目前已成为基因治疗、

基因功能研究、 反义治

疗、疫苗开发等领域最为常用的载体之一

(Niaand Hildegund，

2004)。 在重组腺病毒的构建上常采用两种

方法,即细胞内同源重组法和细菌内同源重组法两种

(何金生等，

2001； 赵峰和周清华，

2001)。传统的细胞

内同源重组法是将目的基因亚克隆至穿梭质粒中,再

与腺病毒基因组质粒共转染

293细胞， 两质粒借所带

的部分同源序列在

293细胞内发生同源重组而形成

重组体， 并进一步包装成重组腺病毒，

该方法的主要

问题是发生重组的概率很低， 这直接关系到出毒的成

功率，

如pAC/pJM17腺病毒系统。 我们也曾试图利用

此系统构建表达

PRV

基因的重组腺病毒， 数次失

败。采用细菌内同源重组法快速制备重组腺病毒的

AdEasy系统，则是将线性化的转移质粒和腺病毒基

因组质粒混合后经电穿孔法导入

BJ5183细菌,

继而

用经筛选鉴定的重组腺病毒质粒转染

293

细胞， 包

装出重组腺病毒。

此方法相对简便,成功率明显提高，

但只有14%。后改进为两步法细菌内同源重组， 即首

先构建

BJ5183pAdEasy细菌,

然后将转移质粒导入

细菌中进行同源重组。这使得构建重组腺病毒的成

功率提高到

94%。但仍延用电穿孔技术将转移质粒

导入细菌,需要特殊的电穿孔设备,操作要求较高。于

是，有报道改用氯化钙制作感受态细菌转化转移质

粒， 获得了成功 （汤福祥等，

2003）。综合来说， 真核细

胞内重组产生的重组病毒， 由于病毒DNA面临的生

存环境是终端宿主哺乳动物细胞， 对腺病毒生存压力

的保持有助于重组腺病毒基因组的完整性。

相比较而

言， 在原核细胞 （BJ5183） 中完成病毒基因组重组， 由

于失去了生存压力的腺病毒基因组更容易发生突变，

使得产生的重组病毒遗传背景及活性将可能受到影

响。所以在AdEasy系统中有电泳酶切鉴定重组病毒

基因组质粒的步骤， 以确认基因组

DNA的完整性。

本研究使用的

AdMax

腺病毒系统是利用细胞

内同源重组法， 在

Cre­

重组酶介导下， 使转染

进

293

细胞的穿梭质粒和辅助大质粒发生定点重

组， 产生

E1/E3

缺失的复制缺限型腺病毒。AdMax

系统的特点是通过重组酶在真核细胞内完成重组出

毒， 高效而稳定， 是目前最方便快捷的腺病毒载体系

统。正是该系统的如上优点使得我们能快速得到数

十株重组腺病毒， 成功率为

100％， 其中有本研究使

用的

Adv­

重组病毒。

对于上述提及的两种腺病毒系统，在腺病毒

DNA质粒提取方面也可能会碰到一些问题。

由于该

质粒

DNA

很大 （约

30~40kb）， 拷贝数不高， 给提取

纯化并最终得到较高浓度、纯度和超螺旋构像比例

的病毒

DNA质粒带来不便。以硅胶介质等为代表

的柱离心式纯化柱常用于制备转染用的质粒

DNA，

然而本研究的经验表明，此类形式的纯化方法在制

备如腺病毒

DNA质粒这样的大质粒时，效果常不

好， 产量以致浓度不理想。 而选择使用非离心柱式纯

化

DNA的方法，能保证顺利得到符合转染要求的

大质粒，如本研究使用的试剂盒方法就是较好的选

择， 以兹参考。

重组腺病毒载体可有效地将外源

DNA

导入宿

主细胞内，并使之高效表达以及正确的翻译后修饰,

从而可诱导很好的保护性体液和细胞免疫应答。因

此,已用于多种病毒抗原的疫苗研究中。尤其需要提

及的是，由于腺病毒能通过消化道和呼吸道途径感

染,在诱导产生粘膜免疫方面也具有优势，所以腺病

毒滴鼻免疫和口服给药在有关研究中都取得了不错

的效果

(JohnandCarol,2003;Sally .,2002; Kampen ,2005)。 本研究在成功构建得到Adv­

重组病毒后， 通过肌肉途径免疫小鼠，

结果表明产生

了很好的保护性体液免疫反应 （中和抗体） 和细胞免

疫反应

（DTH，

CD4 + T细胞特异性应答）。ELISA抗体

效价上升明显， 一免后

2周和二免后

2周效价均值分

别达到7680和

112640， 阳转率为

100％， 表明重组腺

病毒疫苗效果良好。与

ELISA抗体效价相对应的平

均中和抗体效价分别为

14

和

48， 表明一免后即产生

了一定水平的中和抗体。在二免后， 随着总抗体的进

一步大幅上升， 中和抗体水平也明显升高，

ELISA抗

第

2

期 陈振海等：表达伪狂犬病毒 糖蛋白基因重组腺病毒的构建及其免疫效果

197体效价与中和抗体效价水平呈正相关。 疫苗免疫后的

抗体水平一般能相当程度地折射出细胞免疫和攻毒

保护水平。 初步的攻毒试验也表明该腺病毒疫苗能提

供完全的免疫保护。 然而此疫苗在不同传递途径上的

免疫效果究竟如何， 与表达其它病毒抗原的重组腺病

毒疫苗联合免疫时单个疫苗免疫效果是否受到影响，

参 考 文 献 FengX(冯霞),YuSQ(余双庆),ChenGM(陈国敏),ZuoJM (左建民),Zhouling(周玲)andZengY(曾毅).Construction andimmunepotencyofrecombinant adenoviruscontaining codonmodifiedHIV­1gp120(J). (中华实验和临床病毒学杂志), 2004,18(2):113~118(inChinese) HeJS(何金生),WangJW(王健伟)andHongT(洪涛).The principleandmethodsofconstructingtherecombinant (J). (中华实验和临床病毒学杂志),2001,15(4):399~401 (inChinese) HeJS(何金生),WangJW(王健伟),JiangXL(姜秀丽),Wang DY(王大燕),WenLY(温乐英)andHongT(洪涛).Expres­ sionofthemainstructuralantigenVP6ofhumanrotavirusby recombinant andimmuneresponsesinduced (J). (中华实验和临床病毒学杂志),2002,16(2):109~113(in Chinese) limmunizationwithareplica­ tion­deficient vectorexpressingmurinecy­ tomegalovirusglycoproteinBinducesmucosalandsystemic immunity(J). ,2003,21:2632~2642 KampenKRV,ShiZ,GaoP,ZhangJF,FosterKW,ChenDT andimmunogenicityofaden­ ovirus­vectorednasalandepicutaneousinfluenzavaccinesin humans(J). ,2005,23:1029~1036 LaurentF,SimonaB,ChristineA,NathalieB,AndreBandJean cinationofneonatepigletsinthefaceofma­ ternalimmunityinduceshumoralmemoryandprotectiona­ gainstavirulent challenge(J). 2003,21:1732~1741 MaoDG(茆达干),YangLG(杨利国)andChaoSX(曹少先). 在抵抗PRV母源抗体和已存在对腺病毒结构蛋白的

免疫等诸多条件下的免疫效果究竟怎样，

分别针对性

地采用什么改进策略， 是本研究后续工作所要探讨的

问题。 这些工作的开展将进一步地丰富免疫策略和疫

苗设计的研究。

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