2024年5月4日发(作者：繁骏英)
酶切、片段回收与连接
酶切、片段回收与连接
黄华如
（生命科学学院，生技091，29号）
摘要：实验用bt2质粒和pet质粒做酶切材料，回收目的片段，经连接后，转入以氯化钙罚制备的大肠
杆菌感受态细胞中，并让转化大肠杆菌在含有抗生素培养基上生长，最后用长出来的大肠杆菌做验证PCR。
本次试验中，质粒经过双酶切后，可以清晰的看到目的条带，转化后的大肠杆菌也可以在含有抗生素培养
基中长出来，但是最后的验证PCR验证在培养基上生长的是假阳性大肠杆菌。说明了实验中目的基因没有
成功转入大肠杆菌。
关键词：重组；酶切；连接；转化；片段回收
基因文库的建立为重组DNA研究工作提供了方便的、有意义的基因。构建基因文库的
意义不只是使生物的遗传信息以稳定的重组体形式贮存起来，更重要的是它是分离克隆目的
基因的主要途径。对于复杂的染色体DNA分子来说，单个基因所占比例十分微小，要想从
庞大的基因组中将其分离出来，一般需要先进行扩增，所以需要构建基因文库。
基因工程(gene engineering)是20世纪70年代以后兴起的一门新技术，即用人工的方法，
把遗传物质DNA分离出来，在体外进行基因切割、连接、重组，然后再转移到生物体内并
进行表达的技术。基因工程中的关键一步是将目的基因与DNA载体连接成重组DNA，获
得重组子，并把重组子筛选出来。近年来，建立了许多方法来筛选重组子，其中较为常用的
是利用a互补原理，根据菌落的蓝白颜色进行筛选1oL一互补是指E．coli B一半乳糖苷酶
的两个无活性片段(N端片段和c端片段)组合而成为功能完整的酶的过程。现在使用的许多
质粒载体都带有一个E．coli DNA的短片段，其中含有B．半乳糖苷酶N端146个氨基酸
的编码信息及调控序列。在这个编码区中插入了一个多克隆位点，可在此处插入外源DNA
片段。这种类型的载体适用于可编码B．半乳糖苷酶c端部分的宿主细胞。尽管宿主和载体
编码的两个片段都没有活性，但他们能够融合为具有酶活性的蛋白质，在含有底物X-gal的
培养基中形成蓝色菌落。当外源DNA片段插入到质粒的多克隆位点后，导致N端片段丧失
仪．互补能力，因此，带有重组质粒的宿主细胞将形成白色菌落
[1]
。
1 材料与设备
1.1 试供材料
大肠杆菌、质粒DNA
1.2 试剂准备
质粒DNA回收试剂盒、灭菌水、琼脂糖、BamHI、HindIII、T
4
连接酶、T
4
Buffer、LB
固体培养基、等
1.3 实验设备及用具
高速冷冻离心机、液氮罐、恒温水浴锅、紫外分光光度计、制冰机、冰箱、移液枪、PH
计、冰盒、恒温培养箱、恒温振荡摇床、高压灭菌锅、恒温水浴锅等。
2 实验步骤
2.1 提取质粒DNA
这个步骤由老师完成
2.2 酶切
第 1 页
酶切、片段回收与连接
表一：质粒（bt
2
）双酶切体系 表二：质粒（pet）双酶切体系
试剂
Buffer
质粒（bt
2
）
Bam
1
HI
HindIII
Water
总体系
酶切2h以上，酶切结束后，用1.2%琼脂糖检查双酶切效果。
2.3 片段回收
1) 使用TAE缓冲液或TBE缓冲液制作琼脂糖凝胶，然对目的DNA进行琼脂糖凝胶电泳。
2) 在紫外灯下切出含有目的DNA的琼脂糖凝胶，用纸巾吸尽凝胶表面的液体。此时应注
意尽量切除不含目的DNA部分的凝胶，尽量减小凝胶体积，提高DNA回收率。胶块
超过300mg时，请使用多个Column 进行回收，否则严重影响收率。注）切胶时请注
意不要将DNA长时间暴露于紫外灯下，以防止DNA损伤。
3) 切碎胶块。胶块切碎后可以加快操作步骤6的胶块融化时间，提高DNA的回收率。
4) 称量胶块重量，计算胶块体积。计算胶块体积时，以1mg=1ul进行计算。
5) 向凝胶中加入胶块融化液Buffer GM，Buffer GM的加量如下表：
凝胶浓度
1.0%
1.0%-1.5%
1.5%-2.0%
Buffer GM使用量
3个凝胶体积量
4个凝胶体积量
5个凝胶体积量
用量
2ul
4ul
1ul
1ul
12ul
20ul
试剂
Buffer
质粒（pet）
Bam
1
HI
HindIII
Water
总体系
用量
2ul
4ul
1ul
1ul
12ul
20ul
6) 均匀混合后室温15-25℃融化凝胶。此时应间断震荡混合，是胶块融化（约5-10分钟）。
7) 当凝胶完全融化后，观察融胶液的颜色，如果融胶液颜色有黄色变为橙色或粉色，向上
述胶块融化液中加入10ul 3 M醋酸钠溶液（pH5.2），均匀混合至溶液恢复黄色。当分
离小于400bp的DNA片段时，应在此溶液中再加入终浓度为20%的异丙醇。
8) 将试剂盒中的Spin Column安置于Collection Tube上。
9) 将上述操作步骤7的溶液转移至Spin Column中，12,000rpm离心1分钟，弃滤液。
10) 将700ul 的Buffer WB 加入Spin Column中，室温12,000rpm离心30秒钟，弃滤液。
11) 重复操作步骤10。
12) 将Spin Column安置于Collection Tube上，室温12,000rpm离心1分钟。
13) 将Spin Column安置于新的1.5ml的离心管上，在Spin Column膜的中央处加入30ul的
灭菌蒸馏水或Elintion Buffer，室温静置1分钟。
14) 室温12,000rpm离心1分钟洗脱DNA。
2.4 T
4
连接酶连接
表三：T
4
连接酶连接体系
试剂
回收pet质粒
回收bt
2
质粒
T
4
连接酶
T
4
Buffer
总
放置4°C连接过夜
第 2 页
用量
4ul
4ul
1ul
1ul
10ul
酶切、片段回收与连接
2.5 转化大肠杆菌
质粒DNA转化大肠杆菌方法：
1) 把感受态细胞置于冰中；
2) 把50ul的感受态细胞转至连接的DNA中（10ng一下，昏匀）；
3) 冰中放置30分钟；
4) 42°C放置45--60秒；
5) 冰中放置2--3分钟；
6) 加入37°C预热更好的soc培养基，使终体积1ml；
7) 37°C振荡培养1小时（160--225r）
8) 取适量的菌液涂布琼脂糖培养基
9) 37°C过夜培养
2.6 验证（PCR）
表四：验证PCR体系
试剂
10xBuffer
dNTP
引物1
引物2
Taq酶
加蒸馏水至
用量
2ul
2.5ul
0.5
0.5ul
0.5ul
25ul
PCR条件：94℃4min，94℃45s，51℃45s，72℃1m30s，30个循环，72℃10min。
3 结果分析
3.1 酶切结果
（M：Maker2000；B：bt
2
质粒；P：pet质粒；1，2，3···：每组实验）
图1 两种质粒的双酶切结果
在图1中可以清晰的看到，bt
2
质粒被酶Bam
1
HI和酶HindIII切成两条带，而pet质粒
则被切成一条带，在bt2质粒中，第一条较粗的带为目的基因，第二条是双酶切切除目的基
因后剩下的基因；在pet质粒中，可以看到的只有一条带，其实在双酶切下，pet质粒也会
有两条带的，只不过是切完后的两段片段的质量差不多，在电泳的时候没能跑开来。由于
bt2和pet质粒都是用相同的两种酶剪切，所以在在bt2质粒和pet质粒剪切下来的目的片段
和载体片段都形成了相同的粘性末端。我们每组的结果都很清晰很成功，只要成功的地方很
有可能是bt2质粒和pet质粒的质量都非常高。
3.2 转化大肠杆菌结果
第 3 页
酶切、片段回收与连接
图2 质粒DNA转化大肠杆菌
图2中可以清晰的看到白色的斑点，转化的大肠杆菌。由于目的基因中含有一些抗性基
因，如，Amp、潮霉素等，而在培养基中也加有这如Amp、等的抗生素，能在培养基生长
的细菌，它们的基因组里面应该是含有抗性基因的。从图中可以看到很多白色的斑点，能够
正常生长的大肠杆菌，这些大肠杆菌中成功的转入了含有bt2质粒的目的基因。但是，这些
白色的斑也有可能是假阳性，为了确定目的基因是否真正的转入大肠杆菌，还需要做PCR
验证。
3.3 验证的PCR结果
（M：maker2000；1-6：本组大肠杆菌结果；7-8：老师提供大肠杆菌结果）
图3 验证转化大肠杆菌PCR电泳图谱
图3中，白色方框内的为1班6组的结果，左边的六个孔是点用自己转化大肠杆菌PCR
的结果产物，右边两个点是老师提供转化大肠杆菌PCR的产物，可以看到，我们自己转化
的大肠柑橘在电泳图中没有跑出来，而老师提供的大肠杆菌就可以跑出来。说明了我们自己
转化的大肠杆菌虽然在抗生素培养基生存，但那是假阳性的大肠杆菌，而老师提供的大肠杆
菌是成功转入了目的基因的阳性大肠杆菌。
4 讨论与分析
4.1 讨论
本实验所涉及的内容和步骤都非常多，有很多环节都是要注意的，这关系到整个实验的
成功与失败，例如下面的这些：
1) 感受态细胞非常脆弱，要轻拿轻放，不能过分的摇晃，更不能激烈震荡；
2) 在做酶切和PCR过程中，尽量在冰上操作，保持低温环境；
3) 在进行加样的时候要有耐心，因为进行双酶切时加入的物品的量都是比较少的，所以要
特别留意。特别是在把取出的样品加入到PCR管的时候更要注意，因为量太少，所以
要粘着PCR的管壁来放样；
4) 转化实验中所使用的玻璃仪器，微量吸管，离心管等应该彻底清洗干净，并进行高温高
压消毒灭菌，表面去污剂、化学试剂的污染残留会大大减低转化率。微量吸管应该剪去
尖端扩大口径。
第 4 页
酶切、片段回收与连接
4.2 分析
质粒的重组和转化是基因工程的关键所在，所谓的基因的工程就是将真核细胞的基因能
在原核细胞中成功地表达，这个实验通过质粒的重组和转化，这对基因工程的研究很有帮助
的。在基因工程中，目的基因获取的途径有很多：从基因文库或cDNA文库中获取所需的
目的基因；更具目的基因的序列来合成所需的目的片段；通过PCR扩增技术来获得所需的
目的片段。而本实验就是通过PCR扩增技术来获取质粒DNA的，在进行电泳检测目的基
因，可能会出现无扩增产物、非特异性扩增、拖尾、假阳性、假阴性的现象。
参考文献：
[1] 梁红，梁雪莲. 生物技术综合实验教程[M]. 北京：化学工业出版社，2010.
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2024年5月4日发(作者：繁骏英)
酶切、片段回收与连接
酶切、片段回收与连接
黄华如
（生命科学学院，生技091，29号）
摘要：实验用bt2质粒和pet质粒做酶切材料，回收目的片段，经连接后，转入以氯化钙罚制备的大肠
杆菌感受态细胞中，并让转化大肠杆菌在含有抗生素培养基上生长，最后用长出来的大肠杆菌做验证PCR。
本次试验中，质粒经过双酶切后，可以清晰的看到目的条带，转化后的大肠杆菌也可以在含有抗生素培养
基中长出来，但是最后的验证PCR验证在培养基上生长的是假阳性大肠杆菌。说明了实验中目的基因没有
成功转入大肠杆菌。
关键词：重组；酶切；连接；转化；片段回收
基因文库的建立为重组DNA研究工作提供了方便的、有意义的基因。构建基因文库的
意义不只是使生物的遗传信息以稳定的重组体形式贮存起来，更重要的是它是分离克隆目的
基因的主要途径。对于复杂的染色体DNA分子来说，单个基因所占比例十分微小，要想从
庞大的基因组中将其分离出来，一般需要先进行扩增，所以需要构建基因文库。
基因工程(gene engineering)是20世纪70年代以后兴起的一门新技术，即用人工的方法，
把遗传物质DNA分离出来，在体外进行基因切割、连接、重组，然后再转移到生物体内并
进行表达的技术。基因工程中的关键一步是将目的基因与DNA载体连接成重组DNA，获
得重组子，并把重组子筛选出来。近年来，建立了许多方法来筛选重组子，其中较为常用的
是利用a互补原理，根据菌落的蓝白颜色进行筛选1oL一互补是指E．coli B一半乳糖苷酶
的两个无活性片段(N端片段和c端片段)组合而成为功能完整的酶的过程。现在使用的许多
质粒载体都带有一个E．coli DNA的短片段，其中含有B．半乳糖苷酶N端146个氨基酸
的编码信息及调控序列。在这个编码区中插入了一个多克隆位点，可在此处插入外源DNA
片段。这种类型的载体适用于可编码B．半乳糖苷酶c端部分的宿主细胞。尽管宿主和载体
编码的两个片段都没有活性，但他们能够融合为具有酶活性的蛋白质，在含有底物X-gal的
培养基中形成蓝色菌落。当外源DNA片段插入到质粒的多克隆位点后，导致N端片段丧失
仪．互补能力，因此，带有重组质粒的宿主细胞将形成白色菌落
[1]
。
1 材料与设备
1.1 试供材料
大肠杆菌、质粒DNA
1.2 试剂准备
质粒DNA回收试剂盒、灭菌水、琼脂糖、BamHI、HindIII、T
4
连接酶、T
4
Buffer、LB
固体培养基、等
1.3 实验设备及用具
高速冷冻离心机、液氮罐、恒温水浴锅、紫外分光光度计、制冰机、冰箱、移液枪、PH
计、冰盒、恒温培养箱、恒温振荡摇床、高压灭菌锅、恒温水浴锅等。
2 实验步骤
2.1 提取质粒DNA
这个步骤由老师完成
2.2 酶切
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酶切、片段回收与连接
表一：质粒（bt
2
）双酶切体系 表二：质粒（pet）双酶切体系
试剂
Buffer
质粒（bt
2
）
Bam
1
HI
HindIII
Water
总体系
酶切2h以上，酶切结束后，用1.2%琼脂糖检查双酶切效果。
2.3 片段回收
1) 使用TAE缓冲液或TBE缓冲液制作琼脂糖凝胶，然对目的DNA进行琼脂糖凝胶电泳。
2) 在紫外灯下切出含有目的DNA的琼脂糖凝胶，用纸巾吸尽凝胶表面的液体。此时应注
意尽量切除不含目的DNA部分的凝胶，尽量减小凝胶体积，提高DNA回收率。胶块
超过300mg时，请使用多个Column 进行回收，否则严重影响收率。注）切胶时请注
意不要将DNA长时间暴露于紫外灯下，以防止DNA损伤。
3) 切碎胶块。胶块切碎后可以加快操作步骤6的胶块融化时间，提高DNA的回收率。
4) 称量胶块重量，计算胶块体积。计算胶块体积时，以1mg=1ul进行计算。
5) 向凝胶中加入胶块融化液Buffer GM，Buffer GM的加量如下表：
凝胶浓度
1.0%
1.0%-1.5%
1.5%-2.0%
Buffer GM使用量
3个凝胶体积量
4个凝胶体积量
5个凝胶体积量
用量
2ul
4ul
1ul
1ul
12ul
20ul
试剂
Buffer
质粒（pet）
Bam
1
HI
HindIII
Water
总体系
用量
2ul
4ul
1ul
1ul
12ul
20ul
6) 均匀混合后室温15-25℃融化凝胶。此时应间断震荡混合，是胶块融化（约5-10分钟）。
7) 当凝胶完全融化后，观察融胶液的颜色，如果融胶液颜色有黄色变为橙色或粉色，向上
述胶块融化液中加入10ul 3 M醋酸钠溶液（pH5.2），均匀混合至溶液恢复黄色。当分
离小于400bp的DNA片段时，应在此溶液中再加入终浓度为20%的异丙醇。
8) 将试剂盒中的Spin Column安置于Collection Tube上。
9) 将上述操作步骤7的溶液转移至Spin Column中，12,000rpm离心1分钟，弃滤液。
10) 将700ul 的Buffer WB 加入Spin Column中，室温12,000rpm离心30秒钟，弃滤液。
11) 重复操作步骤10。
12) 将Spin Column安置于Collection Tube上，室温12,000rpm离心1分钟。
13) 将Spin Column安置于新的1.5ml的离心管上，在Spin Column膜的中央处加入30ul的
灭菌蒸馏水或Elintion Buffer，室温静置1分钟。
14) 室温12,000rpm离心1分钟洗脱DNA。
2.4 T
4
连接酶连接
表三：T
4
连接酶连接体系
试剂
回收pet质粒
回收bt
2
质粒
T
4
连接酶
T
4
Buffer
总
放置4°C连接过夜
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用量
4ul
4ul
1ul
1ul
10ul
酶切、片段回收与连接
2.5 转化大肠杆菌
质粒DNA转化大肠杆菌方法：
1) 把感受态细胞置于冰中；
2) 把50ul的感受态细胞转至连接的DNA中（10ng一下，昏匀）；
3) 冰中放置30分钟；
4) 42°C放置45--60秒；
5) 冰中放置2--3分钟；
6) 加入37°C预热更好的soc培养基，使终体积1ml；
7) 37°C振荡培养1小时（160--225r）
8) 取适量的菌液涂布琼脂糖培养基
9) 37°C过夜培养
2.6 验证（PCR）
表四：验证PCR体系
试剂
10xBuffer
dNTP
引物1
引物2
Taq酶
加蒸馏水至
用量
2ul
2.5ul
0.5
0.5ul
0.5ul
25ul
PCR条件：94℃4min，94℃45s，51℃45s，72℃1m30s，30个循环，72℃10min。
3 结果分析
3.1 酶切结果
（M：Maker2000；B：bt
2
质粒；P：pet质粒；1，2，3···：每组实验）
图1 两种质粒的双酶切结果
在图1中可以清晰的看到，bt
2
质粒被酶Bam
1
HI和酶HindIII切成两条带，而pet质粒
则被切成一条带，在bt2质粒中，第一条较粗的带为目的基因，第二条是双酶切切除目的基
因后剩下的基因；在pet质粒中，可以看到的只有一条带，其实在双酶切下，pet质粒也会
有两条带的，只不过是切完后的两段片段的质量差不多，在电泳的时候没能跑开来。由于
bt2和pet质粒都是用相同的两种酶剪切，所以在在bt2质粒和pet质粒剪切下来的目的片段
和载体片段都形成了相同的粘性末端。我们每组的结果都很清晰很成功，只要成功的地方很
有可能是bt2质粒和pet质粒的质量都非常高。
3.2 转化大肠杆菌结果
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酶切、片段回收与连接
图2 质粒DNA转化大肠杆菌
图2中可以清晰的看到白色的斑点，转化的大肠杆菌。由于目的基因中含有一些抗性基
因，如，Amp、潮霉素等，而在培养基中也加有这如Amp、等的抗生素，能在培养基生长
的细菌，它们的基因组里面应该是含有抗性基因的。从图中可以看到很多白色的斑点，能够
正常生长的大肠杆菌，这些大肠杆菌中成功的转入了含有bt2质粒的目的基因。但是，这些
白色的斑也有可能是假阳性，为了确定目的基因是否真正的转入大肠杆菌，还需要做PCR
验证。
3.3 验证的PCR结果
（M：maker2000；1-6：本组大肠杆菌结果；7-8：老师提供大肠杆菌结果）
图3 验证转化大肠杆菌PCR电泳图谱
图3中，白色方框内的为1班6组的结果，左边的六个孔是点用自己转化大肠杆菌PCR
的结果产物，右边两个点是老师提供转化大肠杆菌PCR的产物，可以看到，我们自己转化
的大肠柑橘在电泳图中没有跑出来，而老师提供的大肠杆菌就可以跑出来。说明了我们自己
转化的大肠杆菌虽然在抗生素培养基生存，但那是假阳性的大肠杆菌，而老师提供的大肠杆
菌是成功转入了目的基因的阳性大肠杆菌。
4 讨论与分析
4.1 讨论
本实验所涉及的内容和步骤都非常多，有很多环节都是要注意的，这关系到整个实验的
成功与失败，例如下面的这些：
1) 感受态细胞非常脆弱，要轻拿轻放，不能过分的摇晃，更不能激烈震荡；
2) 在做酶切和PCR过程中，尽量在冰上操作，保持低温环境；
3) 在进行加样的时候要有耐心，因为进行双酶切时加入的物品的量都是比较少的，所以要
特别留意。特别是在把取出的样品加入到PCR管的时候更要注意，因为量太少，所以
要粘着PCR的管壁来放样；
4) 转化实验中所使用的玻璃仪器，微量吸管，离心管等应该彻底清洗干净，并进行高温高
压消毒灭菌，表面去污剂、化学试剂的污染残留会大大减低转化率。微量吸管应该剪去
尖端扩大口径。
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酶切、片段回收与连接
4.2 分析
质粒的重组和转化是基因工程的关键所在，所谓的基因的工程就是将真核细胞的基因能
在原核细胞中成功地表达，这个实验通过质粒的重组和转化，这对基因工程的研究很有帮助
的。在基因工程中，目的基因获取的途径有很多：从基因文库或cDNA文库中获取所需的
目的基因；更具目的基因的序列来合成所需的目的片段；通过PCR扩增技术来获得所需的
目的片段。而本实验就是通过PCR扩增技术来获取质粒DNA的，在进行电泳检测目的基
因，可能会出现无扩增产物、非特异性扩增、拖尾、假阳性、假阴性的现象。
参考文献：
[1] 梁红，梁雪莲. 生物技术综合实验教程[M]. 北京：化学工业出版社，2010.
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