2024年5月20日发(作者：速幼荷)
食品与发酵工业
FOODANDFERMENTATIONINDUSTRIES
DOI:10.13995/.11-1802/ts.025483
引用格式:楼志华,刘翔,张劲楠.嗜糖假单胞菌麦芽四糖酶基因在地衣芽孢杆菌中的异源表达[J].食品与发酵工业,2021,47
(1):hua,LIUXiang,logousexpressionofmaltotetraose-formingamylasefromPseud-
omonassaccharophilainBacilluslicheniformis[J].FoodandFermentationIndustries,2021,47(1):50-54.
嗜糖假单胞菌麦芽四糖酶基因在地衣芽孢杆菌中的异源表达
楼志华
1,2∗
,刘翔
1
,张劲楠
1
1(江苏省奥谷生物科技有限公司,江苏常州,213300)2(溧阳维信生物科技有限公司,江苏常州,213300)
摘 要 为了考察重组地衣芽孢杆菌的异源表达特性,进一步提高麦芽四糖酶的发酵水平,以适用于工业化生
产,研究构建了木糖诱导型的重组地衣芽孢表达系统,表达了来源于嗜糖假单胞菌的麦芽四糖酶基因,并进行了
初步发酵优化。结果显示,构建的表达系统经过核酸电泳以及十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰氨凝胶电泳(sodium
dodecylsulfate-polyacrylamidegelelectrophoresis,SDS-PAGE)鉴定均正确,该系统在发酵过程中经过木糖诱导,重
组酶能够成功地分泌至发酵液中,然后通过对诱导剂添加时间、诱导温度和发酵时间优化后,摇瓶水平的最大酶
活力可达(168.2±9.41)U/mL。最佳的发酵条件为,在24h添加诱导剂,诱导温度30℃,发酵至稳定期结束停
止发酵。该研究为重组地衣芽孢杆菌的异源表达研究以及麦芽四糖酶的工业化应用提供了参考。
关键词 麦芽四糖酶;地衣芽孢杆菌;嗜糖假单胞菌;发酵优化;异源表达;木糖诱导
lase),又名麦芽四糖淀粉水解酶,可以连续地催化淀
产物为麦芽四糖
[1]
。而麦芽四糖因其独特的理化特
性,一度被誉为最有希望的麦芽低聚糖
[2]
,在食品加
工行业有着广泛、重要的应用。
麦芽四糖酶基因主要来源于斯氏假单胞菌
麦芽四糖酶(glucan1,4-α-maltotetraohydro-
则以地衣芽孢杆菌为宿主进行重组表达
[8]
,并且在
地衣芽孢杆菌发酵产相关淀粉酶方面形成了技术封
锁,因此导致国内纯化的麦芽四糖价格极高。地衣芽
孢杆菌是优良的食品安全级表达宿主,被美国FDA
认定为食品安全级菌株(GenerallyRecognizedAs
Safe,GRAS)已有近40年的历史,而且该菌产酶能力
高,胞外蛋白分泌能力大约是枯草芽孢杆菌的2
杆菌表达麦芽四糖酶的研究。
倍
[9]
。然而,国内目前还未发现有关重组地衣芽孢
本研究拟构建地衣芽孢杆菌表达系统,对来源于嗜
糖假单胞菌的麦芽四糖酶基因进行木糖诱导表达,通过
果聚糖合酶信号肽使麦芽四糖酶分泌至胞外,并对构建
的重组菌进行初步发酵条件优化,以期为地衣芽孢杆菌
的异源表达以及麦芽四糖酶的工业化应用提供参考。
粉状多糖中非还原型末端麦芽四糖残基的水解,主要
(Pseudomonasstutzeri)和嗜糖假单胞菌(Pseudomonas
相比而言,嗜糖假单胞菌来源的麦芽四糖酶的热稳定
性和pH稳定性均较好,在40℃以下和pH5.5~11
均能长时间保持稳定;在最适温度(55℃)、最适pH
saccharophila),二者来源的麦芽四糖酶均为α构型。
(6.7)以及在其他宿主内表达后酶活力也均较高
[3]
。
这些因素表明嗜糖假单胞菌来源的麦芽四糖酶更适
合于工业化应用,也因而备受学者的关注。国内,
ZHOU、赵云等
[4-5]
在大肠杆菌中克隆表达了嗜糖假
单胞菌来源的麦芽四糖酶,但获得的重组酶大部分是
楠等
[6-7]
在Bacillussubtilis中构建了表达系统胞外表
达了嗜糖假单胞菌来源的麦芽四糖酶,发现其比活力
为980.49U/mg,通过发酵优化后,在摇瓶水平重组
酶活力可高达147U/mL。这些报道中,重组酶酶学
性质基本一致,在芽孢杆菌中表达可获得更高的活
力。国外,美国杰能科公司上市的麦芽四糖酶SAS3
第一作者:硕士,工程师(通讯作者,E-mail:muxinhua23@)
收稿日期:2020-08-26,改回日期:2020-09-21
1 材料与方法
1.1 菌株和质粒
本研究所用敲除了α-淀粉酶基因amyL和碱性蛋
白酶基因aprE的地衣芽孢杆菌Bacilluslicheniformis
CICIMB1391(BLΔAE)、109以及大肠杆菌-
芽孢杆菌穿梭质粒pHY300-PLK,均购于江南大学,由
江苏省奥谷生物科技有限公司保藏。重组质粒pBL-
SY2由江南大学石贵阳教授惠赠,该重组质粒携带了
来源于iformisCICIMB1391自身的木糖异构
包涵体,重组酶活力并不高。2019年,张梓芊、杨亚
50
2021Vol.47No.1(Total421)
酶启动子及其调控蛋白基因、枯草芽孢杆菌果聚糖合
酶信号肽基因sacBss、iformisATCC14580的麦
芽糖淀粉酶基因以及木糖异构酶基因的终止子ter。
嗜糖假单胞菌麦芽四糖酶基因序列由NCBI数据库查
寻获得,序列号为:X16732.1,将该序列和终止子ter一
并委托上海生物工程有限公司合成,合成后的片段插入
至质粒pET28a中,即pET28a-G4-ter。重组质粒pBLxys、
1.
pBLG4,
2 工具酶
重组地衣芽孢杆菌
、引物和试剂
BLG4由本研究构建。
含DNA聚合酶的Taq和Pfu预混液、T4DNA连
接酶,ThermoFisher公司;各种限制性内切酶、PCR产
物纯化试剂盒、质粒提取试剂盒,TAKARA有限公
司;引物由上海生物工程有限公司合成,引物序列见
表1;酵母粉和蛋白胨,安琪酵母有限公司;其他试剂
为国产分析纯或生化试剂。
表1 本研究所使用的引物
Table1 Primersusedinthisstudy
引物名称
CC
引物序列(5’-3’)
a
酶切位点
HindⅢ
PxylsR
PxylF
KpnⅠ
PxylsF
GG
AAGCTTTTAAAATCTCTCATTCATAAACCGTTCC
KpnⅠ
PterR
GG
GGTACCATGATGATGATGATGATGCG
GGTACCATGAGCCACATCCTGC
注:
a
GCTCTAGAGGGTAAAAAACCATTCACTCXbaⅠ
下划线序列为酶切位点
1.3 DNA操作技术
质粒提取、DNA片段纯化、回收等均参照TAKARA
试剂盒说明书。PCR扩增反应、DNA琼脂糖凝胶电泳、酶
切、连接以及转化子筛选等均参照分子克隆实验指南
[10]
1.4 木糖诱导分泌表达载体的构建
。
首先以重组质粒pBLSY2为模板,以PxylF、Pxy-
lsR
基因和信号肽的基因片段
为引物,扩增含木糖异构酶启动子及其调控蛋白
Blxyl-sacBss,反应条件:95
℃
环,72
10min,95
℃10min。
℃30
然后分别同
s,54℃30s,72
pHY300-PLK
℃2min,30
经
个循
Hind
Ⅲ
获得木糖诱导分泌表达的重组质粒
和KpnⅠ酶切后通过胶回收克隆至
pBLxys
pHY300-PLK,
后转化至
G4-ter
为模板
JM109,
,
即
以引物
PxylsF、PterR
JM109/pBLxys。
扩增麦芽四糖酶结
再以pET28a-
构基因,反应条件与上述一致,再分别同pHY300-PLK
经KpnⅠ和XbaⅠ酶切后通过胶回收克隆至pBLxys,即
为木糖诱导分泌表达麦芽四糖酶的重组质粒pBLG4,
经过转化子筛选后,送去测序,测序正确后即获得携带
1.
pBLG4
5 重组地衣芽孢杆菌的构建
重组质粒的109/pBLG4。
培养109/pBLxys、109/pBLG4,
提取重组质粒pBLxys、pBLG4后,按文献[13]所述电
转方法分别将其转入BLΔAE,从而获得重组地衣芽孢
杆菌BLXYLS和BLG4。
1.6 麦芽四糖酶酶活定义及测定
麦芽四糖酶酶活力单位(U)定义为:在pH7.0
和50℃的反应条件下,每分钟分解可溶性淀粉生成
相当于1μmoL葡萄糖所需的酶量。
麦芽四糖酶酶活测定方法参照文献[5]。
1.7 发酵优化实验
10.0,
LBG
酵母粉
培养基
FM408
(g/L)
5.0,NaCl
:葡萄糖
10.
10.
0。
0,蛋白胨FP321
发酵培养基(g/L):麦芽糊精90,蛋白胨FP321
20,
10,K
酵母粉FM40810,玉米浆干粉5,
36,CaCl
(NH
4
)
2
HPO
4
MgSO
2
HPO
4
·3H
2
O9.12,KH
2
PO
4
1.
2
0.50,
4
在进行发酵优化实验时
·7H
2
O0.50。
,均使用挡板摇瓶进行发
酵,发酵前均加入终质量浓度为20mg/L的四环素。
每组实验做3个平行。
2
2.1
结果与分析
重组表达载体的构建
根据NCBI显示,嗜糖假单胞菌麦芽四糖酶基因
序列(G4-ter)总长约1.7kbp,编码551个氨基酸,理
论上蛋白大小为59.9kDa,而终止子序列总长为0.1
kbp,
和6.
因此
3kbp
Kpn
大小的
Ⅰ和
2
Xba
条核
Ⅰ
酸
酶切后应获得约
条带。Blxyl-sacBss
1.8
基
kbp
因
片段长度约为1.4kbp,经HindⅢ和KpnⅠ酶切后应
获得约6.7kbp和1.4kbp大小的2条核酸条带。对
获得的克隆宿主109/pBLG4提取重组质粒
pBLG4,
图1。然后分别用
质粒大小约
Hind
8.1
Ⅲ、
kbp,
Hind
构建重组表达载体图见
Ⅲ和KpnⅠ、KpnⅠ
和XbaⅠ酶切,电泳鉴定结果如图2,结合测序结果,
可以充分说明重组表达载体构建正确。
2.2 重组麦芽四糖酶的表达
将对照菌BLXYLS和重组菌BLG4分别进行摇
瓶发酵,接种后8h均加入10g/L木糖进行诱导,然
后继续培养30h,离心后收集发酵液上清,分别检测
二者胞外麦芽四糖酶活力。结果显示,只有重组菌
BLG4
将二者发酵液上清进行十二烷基硫酸钠
检测到活力,而对照菌BLXYLS未检测到活力
-聚丙烯酰氨
。
凝胶电泳(sodiumdodecylsulfate-polyacrylamidegel
electrophoresis,SDS-PAGE)分析,结果见图3。可以
2021年第47卷第1期(总第421期)
51
食品与发酵工业
FOODANDFERMENTATIONINDUSTRIES
Blxyl-木糖异构酶启动子及其调控蛋白基因;sacBss-枯草
芽孢杆菌果聚糖合酶信号肽基因;G4-嗜糖假单胞菌
麦芽四糖酶基因;ter-木糖异构酶基因的终止子
图1 重组表达载体pBLG4
Fig.1 DiagramofrecombinantexpressionvectorpBLG4
M-Maker;1-pBLG4/HindⅢ;2-pBLG4/
图2 重组表达载体
3-pBLG4/KpnⅠ
pBLG4
+Xba
Hind
验证电泳图
Ⅰ
Ⅲ+KpnⅠ;
Fig.2 ElectropherogramofrecombinantexpressionvectorpBLG4
发现在约60kDa处出现一明显的表达条带,这与理
论推测的蛋白大小基本一致,表明重组菌成功地将麦
芽四糖酶分泌到了发酵液中。
图3 发酵液上清液
M-Maker;1-BLXYLS;2-BLG4
SDS-PAGE电泳图
Fig.3 SDS-PAGE
broth
electropherogram
supernatant
offermentation
52
2021Vol.47No.1(Total421)
2.3 发酵条件优化
2.3.1
重组菌接种后
诱导剂添加时间对发酵的影响
,在37℃、250r/min下进行培养,
分别在接种后的8、12、16、20、24、28、32h取样检测
OD
600
补加30
,并添加
g/L麦芽糊精
10g/L木糖
,发酵至
进行
48
诱导
h时添加
,发酵至
10
24
g/
h
L
时
的
木糖,然后继续发酵至72h结束。发酵结束后,取样
检测OD
2、图4所示
600
和发酵液中的麦芽四糖酶活力,结果如表
长影响较小,
。
但对发酵结束时胞外麦芽四糖酶酶活有
结果显示,诱导剂添加时间对重组菌生
显著影响。随着诱导剂添加时间的延迟(8~24h),
发酵结束时检测到的胞外酶活呈递增趋势,当发酵
24h添加诱导
2)
剂
U
时
/mL;
,发
而当
酵结
28、32
束时胞
h添加诱导剂时
外酶活力高达
发酵结束时酶活有所降低
(138.2±11.
。
,
事实上,这与木糖操纵子在地衣芽孢杆菌中的转
录特性有关,据文献
[12-13]
报道,在对数生长期到稳定
期的转换期间木糖操纵子转录活性显著增加,并且这
种较高的转录活性会维持近12h。根据检测到的菌
体量来看,发酵至24h后,重组菌的生长速率明显降
低,该时间点对应文献中对数生长期到稳定期的转换
期间,因此,在发酵24h时诱导能够检测到较高的麦
芽四糖酶酶活。
2.3.2
重组菌接种后
诱导温度对发酵的影响
,在37℃、250r/min下进行培养,
当培养至24h时,添加10g/L木糖进行诱导,并添加
30
至48
g/L
h
麦芽糊精
时添加10
,分别转移至
g/L的木糖和
25、30、37、42
30g/L,然后继续发
℃,发酵
酵至72h结束。发酵结束后,取样检测OD
600
和发酵
液中的麦芽四糖酶活力,结果如图5所示。可以发
现,诱导温度对重组菌生长和产酶均有显著的影响。
在25~37℃,随着温度升高,发酵结束后的菌体量也
越来越高,而42℃时,菌体量又有所降低,这说明重
组菌最适生长温度为37℃。当诱导温度为30℃时,
胞外酶活力最高可达(161.4±10.4)U/mL,37℃次
之,42℃时胞外酶活力最低。
重组菌在温度胁迫下的产酶特性是可以预见的。
温度低时,菌体整体代谢速率较慢,酶的合成速率也
会降低
[14]
但地衣芽孢杆
。而温度较高时
菌分泌的其
,
他
尽管菌体代谢速率增加
蛋白酶也会增加
[15]
,
重组酶的水解速率也会增加,另外重组酶自身的稳定
,对
性也可能有所下降。所以,诱导温度变化对重组菌生
长和重组酶酶活力均有较大的影响。
表2 不同时间添加诱导剂发酵结束时的菌体量
Table2 Biomassattheendoffermentationunderdifferentinductiontime
诱导剂添加时间/h
发酵结束时OD
600
值
8
50.2±2.08
12
49.6±3.70
16
50.6±3.21
20
50.8±2.88
24
51.8±3.04
28
53.3±3.63
32
52.1±3.41
图4 诱导剂不同添加时间对重组菌表达麦芽四糖酶的影响
Fig.
expression
4 Effect
of
of
maltotetraose
differentadding
inrecombinant
timeofinducer
bacteria
onthe
图5 诱导温度对重组菌表达麦芽四糖酶的影响
Fig.5 Effect
maltotetraose
ofinduction
in
temperature
recombinant
on
bacteria
theexpressionof
2.3.3
根据
发酵时间对发酵的影响
2.3.1和2.3.2的结果,在37℃、250r/min
下对重组菌进行培养,当培养至24h时,添加2%木
糖进行诱导,并转移至30℃继续发酵。诱导后每隔
12h检测菌体量OD
600
和麦芽四糖酶酶活。结果如图
6
大酶活力为
所示。可以看到
(168.2
,发酵至
±9.41)
84
U
h
/mL,
时,胞外检测到的最
之后酶活力明显
开始下降。显然,重组地衣芽孢杆菌胞外酶活力开始
下降的时间要略晚于稳定期,这与2.3.1小节所记录
的特性相符,表明木糖诱导型重组地衣芽孢杆菌发酵
至稳定期结束时停止发酵最为合适。
在后续应用过程中,对重组酶的酶学性质进行了
简单研究。以淀粉液为化液底物反应时,其最适pH
为7.0,最适反应温度为50℃,并且在反应48h后,
相对酶活力仍能达50%以上,结合异淀粉酶进行转
化,麦芽四糖转化率可达72.4%,其特性与文献报
道
[5-7]
基本一致,表明重组酶的酶学性质未发生明显
图6 重组地衣芽孢杆菌发酵过程曲线
Fig.6 Growth
recombinant
andmaltotetraose
Bacilluslicheniformis
productioncurvesof
改变,有良好的应用前景。目前,国内对麦芽四糖酶
的发酵还处于基础研究阶段,多见于在大肠杆菌、枯
草芽孢杆菌中的表达,在地衣芽孢杆菌中的表达未见
报道。杨亚楠等
[7]
在以枯草芽孢杆菌表达来源于嗜
糖假单胞麦芽四糖酶的表达时,摇瓶水平酶活力可力
达147U/mL,本研究摇瓶水平酶活力可达(168.2±
9.
显示
41)
,地衣芽孢杆菌胞外蛋白分泌量可达枯草芽孢杆
U/mL,较之有所提高,但提高有限。多项研究
菌的2倍
[9]
开发,其优势尚未完全发挥
,这表明地衣芽孢的表达性能仍未被完全
,可提升的空间仍然很大。
据报道
[1]
杆菌分批补
,美
料
国
发
杰
酵
能
,
科
表
公
达
司
嗜
也
糖
是
假
通
单
过
胞
重
菌
组
的
地
麦
衣
芽
芽
四
孢
糖
酶,根据该酶的比酶活
[7]
及地衣芽孢杆菌的产酶特
性,保守估计其发酵水平应在10000U/mL左右。就
本研究结果来看,尽管继续通过发酵优化能够继续提
升发酵水平,但提升效果可能有限,还需要充分挖掘
地衣芽孢杆菌的表达潜力,提升其表达能力,诸如在
密码子偏好性
[16]
敲除
[18]
,高效启动子开发
,酶蛋白
[19
修
-
饰
[17]
20]
等方面均可继续进行
,蛋白酶基因继续
深入研究。
3 结论
本研究利用地衣芽孢杆菌木糖诱导分泌表达载
体,对来源于嗜糖假单胞菌麦芽四糖基因进行了表
达,重组酶成功地分泌至胞外,能够在发酵液上清液
中检测到酶活力,而且目标蛋白大小符合理论大小。
对重组菌进行了发酵条件优化:在24h添加诱导剂,
诱导温度30℃,发酵至稳定期结束停止发酵,摇瓶水
2021年第47卷第1期(总第421期)
53
食品与发酵工业
FOODANDFERMENTATIONINDUSTRIES
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zymaticproperties[D].Wuxi:JiangnanUniversity,2019.
fromPseudomonassaccharophilaandanalysisofitsstructureanden-
technology,2013,33(5):100-106.
andthecharacterizationofaα-4-amylaseenzyme[J].ChinaBio-
Heterologousexpressionofmaltotetraose-formingamylasefromPseudomonas
saccharophilainBacilluslicheniformis
1(JiangsuOGOBiotechnologyCo.,Ltd.,Changzhou213300,China)2(LiyangVisionBioTechnologyCo.,Ltd.,Changzhou213300,China)
ABSTRACT ToinvestigatetheheterologousexpressioninBacilluslicheniformisandimprovethefermentationlevelofmaltotetraose-
ingamylasefromPseudomonassaccharophila,bservedthatmaltote-
andfermentationtime,themaximumenzymeactivityreachedto(168.2±9.41)U/imalfermenta-
Keywords maltotetraose-formingamylase;Pseudomonassaccharophila;recombinantexpression;fermentationoptimization
formingamylase,iformisCICIMB1391toexpressthemaltotetraose-form-
LOUZhihua
1,2∗
,LIUXiang
1
,ZHANGJingnan
1
traose-formingamylasptimizedinductiontime,temperature
tionconditionswereaddingtheinducerat24h,theinductiontemperatureof30℃,andendingfermentationattheendofstableperiod.
54
2021Vol.47No.1(Total421)
2024年5月20日发(作者：速幼荷)
食品与发酵工业
FOODANDFERMENTATIONINDUSTRIES
DOI:10.13995/.11-1802/ts.025483
引用格式:楼志华,刘翔,张劲楠.嗜糖假单胞菌麦芽四糖酶基因在地衣芽孢杆菌中的异源表达[J].食品与发酵工业,2021,47
(1):hua,LIUXiang,logousexpressionofmaltotetraose-formingamylasefromPseud-
omonassaccharophilainBacilluslicheniformis[J].FoodandFermentationIndustries,2021,47(1):50-54.
嗜糖假单胞菌麦芽四糖酶基因在地衣芽孢杆菌中的异源表达
楼志华
1,2∗
,刘翔
1
,张劲楠
1
1(江苏省奥谷生物科技有限公司,江苏常州,213300)2(溧阳维信生物科技有限公司,江苏常州,213300)
摘 要 为了考察重组地衣芽孢杆菌的异源表达特性,进一步提高麦芽四糖酶的发酵水平,以适用于工业化生
产,研究构建了木糖诱导型的重组地衣芽孢表达系统,表达了来源于嗜糖假单胞菌的麦芽四糖酶基因,并进行了
初步发酵优化。结果显示,构建的表达系统经过核酸电泳以及十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰氨凝胶电泳(sodium
dodecylsulfate-polyacrylamidegelelectrophoresis,SDS-PAGE)鉴定均正确,该系统在发酵过程中经过木糖诱导,重
组酶能够成功地分泌至发酵液中,然后通过对诱导剂添加时间、诱导温度和发酵时间优化后,摇瓶水平的最大酶
活力可达(168.2±9.41)U/mL。最佳的发酵条件为,在24h添加诱导剂,诱导温度30℃,发酵至稳定期结束停
止发酵。该研究为重组地衣芽孢杆菌的异源表达研究以及麦芽四糖酶的工业化应用提供了参考。
关键词 麦芽四糖酶;地衣芽孢杆菌;嗜糖假单胞菌;发酵优化;异源表达;木糖诱导
lase),又名麦芽四糖淀粉水解酶,可以连续地催化淀
产物为麦芽四糖
[1]
。而麦芽四糖因其独特的理化特
性,一度被誉为最有希望的麦芽低聚糖
[2]
,在食品加
工行业有着广泛、重要的应用。
麦芽四糖酶基因主要来源于斯氏假单胞菌
麦芽四糖酶(glucan1,4-α-maltotetraohydro-
则以地衣芽孢杆菌为宿主进行重组表达
[8]
,并且在
地衣芽孢杆菌发酵产相关淀粉酶方面形成了技术封
锁,因此导致国内纯化的麦芽四糖价格极高。地衣芽
孢杆菌是优良的食品安全级表达宿主,被美国FDA
认定为食品安全级菌株(GenerallyRecognizedAs
Safe,GRAS)已有近40年的历史,而且该菌产酶能力
高,胞外蛋白分泌能力大约是枯草芽孢杆菌的2
杆菌表达麦芽四糖酶的研究。
倍
[9]
。然而,国内目前还未发现有关重组地衣芽孢
本研究拟构建地衣芽孢杆菌表达系统,对来源于嗜
糖假单胞菌的麦芽四糖酶基因进行木糖诱导表达,通过
果聚糖合酶信号肽使麦芽四糖酶分泌至胞外,并对构建
的重组菌进行初步发酵条件优化,以期为地衣芽孢杆菌
的异源表达以及麦芽四糖酶的工业化应用提供参考。
粉状多糖中非还原型末端麦芽四糖残基的水解,主要
(Pseudomonasstutzeri)和嗜糖假单胞菌(Pseudomonas
相比而言,嗜糖假单胞菌来源的麦芽四糖酶的热稳定
性和pH稳定性均较好,在40℃以下和pH5.5~11
均能长时间保持稳定;在最适温度(55℃)、最适pH
saccharophila),二者来源的麦芽四糖酶均为α构型。
(6.7)以及在其他宿主内表达后酶活力也均较高
[3]
。
这些因素表明嗜糖假单胞菌来源的麦芽四糖酶更适
合于工业化应用,也因而备受学者的关注。国内,
ZHOU、赵云等
[4-5]
在大肠杆菌中克隆表达了嗜糖假
单胞菌来源的麦芽四糖酶,但获得的重组酶大部分是
楠等
[6-7]
在Bacillussubtilis中构建了表达系统胞外表
达了嗜糖假单胞菌来源的麦芽四糖酶,发现其比活力
为980.49U/mg,通过发酵优化后,在摇瓶水平重组
酶活力可高达147U/mL。这些报道中,重组酶酶学
性质基本一致,在芽孢杆菌中表达可获得更高的活
力。国外,美国杰能科公司上市的麦芽四糖酶SAS3
第一作者:硕士,工程师(通讯作者,E-mail:muxinhua23@)
收稿日期:2020-08-26,改回日期:2020-09-21
1 材料与方法
1.1 菌株和质粒
本研究所用敲除了α-淀粉酶基因amyL和碱性蛋
白酶基因aprE的地衣芽孢杆菌Bacilluslicheniformis
CICIMB1391(BLΔAE)、109以及大肠杆菌-
芽孢杆菌穿梭质粒pHY300-PLK,均购于江南大学,由
江苏省奥谷生物科技有限公司保藏。重组质粒pBL-
SY2由江南大学石贵阳教授惠赠,该重组质粒携带了
来源于iformisCICIMB1391自身的木糖异构
包涵体,重组酶活力并不高。2019年,张梓芊、杨亚
50
2021Vol.47No.1(Total421)
酶启动子及其调控蛋白基因、枯草芽孢杆菌果聚糖合
酶信号肽基因sacBss、iformisATCC14580的麦
芽糖淀粉酶基因以及木糖异构酶基因的终止子ter。
嗜糖假单胞菌麦芽四糖酶基因序列由NCBI数据库查
寻获得,序列号为:X16732.1,将该序列和终止子ter一
并委托上海生物工程有限公司合成,合成后的片段插入
至质粒pET28a中,即pET28a-G4-ter。重组质粒pBLxys、
1.
pBLG4,
2 工具酶
重组地衣芽孢杆菌
、引物和试剂
BLG4由本研究构建。
含DNA聚合酶的Taq和Pfu预混液、T4DNA连
接酶,ThermoFisher公司;各种限制性内切酶、PCR产
物纯化试剂盒、质粒提取试剂盒,TAKARA有限公
司;引物由上海生物工程有限公司合成,引物序列见
表1;酵母粉和蛋白胨,安琪酵母有限公司;其他试剂
为国产分析纯或生化试剂。
表1 本研究所使用的引物
Table1 Primersusedinthisstudy
引物名称
CC
引物序列(5’-3’)
a
酶切位点
HindⅢ
PxylsR
PxylF
KpnⅠ
PxylsF
GG
AAGCTTTTAAAATCTCTCATTCATAAACCGTTCC
KpnⅠ
PterR
GG
GGTACCATGATGATGATGATGATGCG
GGTACCATGAGCCACATCCTGC
注:
a
GCTCTAGAGGGTAAAAAACCATTCACTCXbaⅠ
下划线序列为酶切位点
1.3 DNA操作技术
质粒提取、DNA片段纯化、回收等均参照TAKARA
试剂盒说明书。PCR扩增反应、DNA琼脂糖凝胶电泳、酶
切、连接以及转化子筛选等均参照分子克隆实验指南
[10]
1.4 木糖诱导分泌表达载体的构建
。
首先以重组质粒pBLSY2为模板,以PxylF、Pxy-
lsR
基因和信号肽的基因片段
为引物,扩增含木糖异构酶启动子及其调控蛋白
Blxyl-sacBss,反应条件:95
℃
环,72
10min,95
℃10min。
℃30
然后分别同
s,54℃30s,72
pHY300-PLK
℃2min,30
经
个循
Hind
Ⅲ
获得木糖诱导分泌表达的重组质粒
和KpnⅠ酶切后通过胶回收克隆至
pBLxys
pHY300-PLK,
后转化至
G4-ter
为模板
JM109,
,
即
以引物
PxylsF、PterR
JM109/pBLxys。
扩增麦芽四糖酶结
再以pET28a-
构基因,反应条件与上述一致,再分别同pHY300-PLK
经KpnⅠ和XbaⅠ酶切后通过胶回收克隆至pBLxys,即
为木糖诱导分泌表达麦芽四糖酶的重组质粒pBLG4,
经过转化子筛选后,送去测序,测序正确后即获得携带
1.
pBLG4
5 重组地衣芽孢杆菌的构建
重组质粒的109/pBLG4。
培养109/pBLxys、109/pBLG4,
提取重组质粒pBLxys、pBLG4后,按文献[13]所述电
转方法分别将其转入BLΔAE,从而获得重组地衣芽孢
杆菌BLXYLS和BLG4。
1.6 麦芽四糖酶酶活定义及测定
麦芽四糖酶酶活力单位(U)定义为:在pH7.0
和50℃的反应条件下,每分钟分解可溶性淀粉生成
相当于1μmoL葡萄糖所需的酶量。
麦芽四糖酶酶活测定方法参照文献[5]。
1.7 发酵优化实验
10.0,
LBG
酵母粉
培养基
FM408
(g/L)
5.0,NaCl
:葡萄糖
10.
10.
0。
0,蛋白胨FP321
发酵培养基(g/L):麦芽糊精90,蛋白胨FP321
20,
10,K
酵母粉FM40810,玉米浆干粉5,
36,CaCl
(NH
4
)
2
HPO
4
MgSO
2
HPO
4
·3H
2
O9.12,KH
2
PO
4
1.
2
0.50,
4
在进行发酵优化实验时
·7H
2
O0.50。
,均使用挡板摇瓶进行发
酵,发酵前均加入终质量浓度为20mg/L的四环素。
每组实验做3个平行。
2
2.1
结果与分析
重组表达载体的构建
根据NCBI显示,嗜糖假单胞菌麦芽四糖酶基因
序列(G4-ter)总长约1.7kbp,编码551个氨基酸,理
论上蛋白大小为59.9kDa,而终止子序列总长为0.1
kbp,
和6.
因此
3kbp
Kpn
大小的
Ⅰ和
2
Xba
条核
Ⅰ
酸
酶切后应获得约
条带。Blxyl-sacBss
1.8
基
kbp
因
片段长度约为1.4kbp,经HindⅢ和KpnⅠ酶切后应
获得约6.7kbp和1.4kbp大小的2条核酸条带。对
获得的克隆宿主109/pBLG4提取重组质粒
pBLG4,
图1。然后分别用
质粒大小约
Hind
8.1
Ⅲ、
kbp,
Hind
构建重组表达载体图见
Ⅲ和KpnⅠ、KpnⅠ
和XbaⅠ酶切,电泳鉴定结果如图2,结合测序结果,
可以充分说明重组表达载体构建正确。
2.2 重组麦芽四糖酶的表达
将对照菌BLXYLS和重组菌BLG4分别进行摇
瓶发酵,接种后8h均加入10g/L木糖进行诱导,然
后继续培养30h,离心后收集发酵液上清,分别检测
二者胞外麦芽四糖酶活力。结果显示,只有重组菌
BLG4
将二者发酵液上清进行十二烷基硫酸钠
检测到活力,而对照菌BLXYLS未检测到活力
-聚丙烯酰氨
。
凝胶电泳(sodiumdodecylsulfate-polyacrylamidegel
electrophoresis,SDS-PAGE)分析,结果见图3。可以
2021年第47卷第1期(总第421期)
51
食品与发酵工业
FOODANDFERMENTATIONINDUSTRIES
Blxyl-木糖异构酶启动子及其调控蛋白基因;sacBss-枯草
芽孢杆菌果聚糖合酶信号肽基因;G4-嗜糖假单胞菌
麦芽四糖酶基因;ter-木糖异构酶基因的终止子
图1 重组表达载体pBLG4
Fig.1 DiagramofrecombinantexpressionvectorpBLG4
M-Maker;1-pBLG4/HindⅢ;2-pBLG4/
图2 重组表达载体
3-pBLG4/KpnⅠ
pBLG4
+Xba
Hind
验证电泳图
Ⅰ
Ⅲ+KpnⅠ;
Fig.2 ElectropherogramofrecombinantexpressionvectorpBLG4
发现在约60kDa处出现一明显的表达条带,这与理
论推测的蛋白大小基本一致,表明重组菌成功地将麦
芽四糖酶分泌到了发酵液中。
图3 发酵液上清液
M-Maker;1-BLXYLS;2-BLG4
SDS-PAGE电泳图
Fig.3 SDS-PAGE
broth
electropherogram
supernatant
offermentation
52
2021Vol.47No.1(Total421)
2.3 发酵条件优化
2.3.1
重组菌接种后
诱导剂添加时间对发酵的影响
,在37℃、250r/min下进行培养,
分别在接种后的8、12、16、20、24、28、32h取样检测
OD
600
补加30
,并添加
g/L麦芽糊精
10g/L木糖
,发酵至
进行
48
诱导
h时添加
,发酵至
10
24
g/
h
L
时
的
木糖,然后继续发酵至72h结束。发酵结束后,取样
检测OD
2、图4所示
600
和发酵液中的麦芽四糖酶活力,结果如表
长影响较小,
。
但对发酵结束时胞外麦芽四糖酶酶活有
结果显示,诱导剂添加时间对重组菌生
显著影响。随着诱导剂添加时间的延迟(8~24h),
发酵结束时检测到的胞外酶活呈递增趋势,当发酵
24h添加诱导
2)
剂
U
时
/mL;
,发
而当
酵结
28、32
束时胞
h添加诱导剂时
外酶活力高达
发酵结束时酶活有所降低
(138.2±11.
。
,
事实上,这与木糖操纵子在地衣芽孢杆菌中的转
录特性有关,据文献
[12-13]
报道,在对数生长期到稳定
期的转换期间木糖操纵子转录活性显著增加,并且这
种较高的转录活性会维持近12h。根据检测到的菌
体量来看,发酵至24h后,重组菌的生长速率明显降
低,该时间点对应文献中对数生长期到稳定期的转换
期间,因此,在发酵24h时诱导能够检测到较高的麦
芽四糖酶酶活。
2.3.2
重组菌接种后
诱导温度对发酵的影响
,在37℃、250r/min下进行培养,
当培养至24h时,添加10g/L木糖进行诱导,并添加
30
至48
g/L
h
麦芽糊精
时添加10
,分别转移至
g/L的木糖和
25、30、37、42
30g/L,然后继续发
℃,发酵
酵至72h结束。发酵结束后,取样检测OD
600
和发酵
液中的麦芽四糖酶活力,结果如图5所示。可以发
现,诱导温度对重组菌生长和产酶均有显著的影响。
在25~37℃,随着温度升高,发酵结束后的菌体量也
越来越高,而42℃时,菌体量又有所降低,这说明重
组菌最适生长温度为37℃。当诱导温度为30℃时,
胞外酶活力最高可达(161.4±10.4)U/mL,37℃次
之,42℃时胞外酶活力最低。
重组菌在温度胁迫下的产酶特性是可以预见的。
温度低时,菌体整体代谢速率较慢,酶的合成速率也
会降低
[14]
但地衣芽孢杆
。而温度较高时
菌分泌的其
,
他
尽管菌体代谢速率增加
蛋白酶也会增加
[15]
,
重组酶的水解速率也会增加,另外重组酶自身的稳定
,对
性也可能有所下降。所以,诱导温度变化对重组菌生
长和重组酶酶活力均有较大的影响。
表2 不同时间添加诱导剂发酵结束时的菌体量
Table2 Biomassattheendoffermentationunderdifferentinductiontime
诱导剂添加时间/h
发酵结束时OD
600
值
8
50.2±2.08
12
49.6±3.70
16
50.6±3.21
20
50.8±2.88
24
51.8±3.04
28
53.3±3.63
32
52.1±3.41
图4 诱导剂不同添加时间对重组菌表达麦芽四糖酶的影响
Fig.
expression
4 Effect
of
of
maltotetraose
differentadding
inrecombinant
timeofinducer
bacteria
onthe
图5 诱导温度对重组菌表达麦芽四糖酶的影响
Fig.5 Effect
maltotetraose
ofinduction
in
temperature
recombinant
on
bacteria
theexpressionof
2.3.3
根据
发酵时间对发酵的影响
2.3.1和2.3.2的结果,在37℃、250r/min
下对重组菌进行培养,当培养至24h时,添加2%木
糖进行诱导,并转移至30℃继续发酵。诱导后每隔
12h检测菌体量OD
600
和麦芽四糖酶酶活。结果如图
6
大酶活力为
所示。可以看到
(168.2
,发酵至
±9.41)
84
U
h
/mL,
时,胞外检测到的最
之后酶活力明显
开始下降。显然,重组地衣芽孢杆菌胞外酶活力开始
下降的时间要略晚于稳定期,这与2.3.1小节所记录
的特性相符,表明木糖诱导型重组地衣芽孢杆菌发酵
至稳定期结束时停止发酵最为合适。
在后续应用过程中,对重组酶的酶学性质进行了
简单研究。以淀粉液为化液底物反应时,其最适pH
为7.0,最适反应温度为50℃,并且在反应48h后,
相对酶活力仍能达50%以上,结合异淀粉酶进行转
化,麦芽四糖转化率可达72.4%,其特性与文献报
道
[5-7]
基本一致,表明重组酶的酶学性质未发生明显
图6 重组地衣芽孢杆菌发酵过程曲线
Fig.6 Growth
recombinant
andmaltotetraose
Bacilluslicheniformis
productioncurvesof
改变,有良好的应用前景。目前,国内对麦芽四糖酶
的发酵还处于基础研究阶段,多见于在大肠杆菌、枯
草芽孢杆菌中的表达,在地衣芽孢杆菌中的表达未见
报道。杨亚楠等
[7]
在以枯草芽孢杆菌表达来源于嗜
糖假单胞麦芽四糖酶的表达时,摇瓶水平酶活力可力
达147U/mL,本研究摇瓶水平酶活力可达(168.2±
9.
显示
41)
,地衣芽孢杆菌胞外蛋白分泌量可达枯草芽孢杆
U/mL,较之有所提高,但提高有限。多项研究
菌的2倍
[9]
开发,其优势尚未完全发挥
,这表明地衣芽孢的表达性能仍未被完全
,可提升的空间仍然很大。
据报道
[1]
杆菌分批补
,美
料
国
发
杰
酵
能
,
科
表
公
达
司
嗜
也
糖
是
假
通
单
过
胞
重
菌
组
的
地
麦
衣
芽
芽
四
孢
糖
酶,根据该酶的比酶活
[7]
及地衣芽孢杆菌的产酶特
性,保守估计其发酵水平应在10000U/mL左右。就
本研究结果来看,尽管继续通过发酵优化能够继续提
升发酵水平,但提升效果可能有限,还需要充分挖掘
地衣芽孢杆菌的表达潜力,提升其表达能力,诸如在
密码子偏好性
[16]
敲除
[18]
,高效启动子开发
,酶蛋白
[19
修
-
饰
[17]
20]
等方面均可继续进行
,蛋白酶基因继续
深入研究。
3 结论
本研究利用地衣芽孢杆菌木糖诱导分泌表达载
体,对来源于嗜糖假单胞菌麦芽四糖基因进行了表
达,重组酶成功地分泌至胞外,能够在发酵液上清液
中检测到酶活力,而且目标蛋白大小符合理论大小。
对重组菌进行了发酵条件优化:在24h添加诱导剂,
诱导温度30℃,发酵至稳定期结束停止发酵,摇瓶水
2021年第47卷第1期(总第421期)
53
食品与发酵工业
FOODANDFERMENTATIONINDUSTRIES
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saccharophilainBacilluslicheniformis
1(JiangsuOGOBiotechnologyCo.,Ltd.,Changzhou213300,China)2(LiyangVisionBioTechnologyCo.,Ltd.,Changzhou213300,China)
ABSTRACT ToinvestigatetheheterologousexpressioninBacilluslicheniformisandimprovethefermentationlevelofmaltotetraose-
ingamylasefromPseudomonassaccharophila,bservedthatmaltote-
andfermentationtime,themaximumenzymeactivityreachedto(168.2±9.41)U/imalfermenta-
Keywords maltotetraose-formingamylase;Pseudomonassaccharophila;recombinantexpression;fermentationoptimization
formingamylase,iformisCICIMB1391toexpressthemaltotetraose-form-
LOUZhihua
1,2∗
,LIUXiang
1
,ZHANGJingnan
1
traose-formingamylasptimizedinductiontime,temperature
tionconditionswereaddingtheinducerat24h,theinductiontemperatureof30℃,andendingfermentationattheendofstableperiod.
54
2021Vol.47No.1(Total421)