2024年3月10日发(作者：俎梅)
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谷氨酸脱羧酶和谷氨酸脱氢酶基因的串联表
达及其对GABA产量影响
作者：罗秀针 林燕燕 陈雅静 张文华 谢伟容
来源：《福建农业学报》2018年第07期
摘 要：为构建一株无外源L谷氨酸（LGlu）条件下可直接转化葡萄糖生产γ氨基丁酸
（GABA）的安全基因工程菌，将植物乳杆菌GABA合成途径的关键酶——谷氨酸脱羧酶基因
gadB与LGlu合成途径中的关键酶谷氨酸脱氢酶基因gdh进行串联表达，导入产谷氨酸菌株谷
氨酸棒杆菌SF016中，检测其对LGlu及GABA产量的影响。经摇瓶发酵40 h重组菌
SF016pgg谷氨酸脱羧酶的酶活达0.63 mol·min-1·g-1，而谷氨酸脱氢酶的酶活达0.131 mol·min-
1·g-1，比原始菌株提高了约2.0倍。重组菌SF016pgg以葡萄糖为碳源，通过40 h发酵罐发酵
可积累产生23.12 g·L-1的GABA，说明串联表达gadB和gdh基因有效实现重组菌在以葡萄糖
为单一碳源、无外源LGlu存在的培养基中直接发酵生产GABA。该生产方式的成本明显降
低，且产品的安全性高，可用于食品、饲料或医药等行业。
关键词：谷氨酸脱羧酶；谷氨酸脱氢酶；谷氨酸生产菌SF016；基因串联表达
中图分类号：Q 784文献标识码：A文章编号：1008-0384（2018）07-744-06
Abstract： This study aimed to create a genetically engineered bacterium that could produce
γaminobutyric acid （GABA） directly from glucose without exogenous Lglutamic acid
（LGlu）.The gadB and gdh genes responsible for the generation of two critical enzymes，glutamic
acid decarboxylase （GAD） and glutamate dehydrogenase （GDH）， respectively，in the
synthesis of plant lactobacillus GABA were coexpressed in a Gluproducing strain of Corynebacterium
glutamicum， resulting effects on GABA production by the recombinational strain，
SF016pgg， were analyzed. The activities of GAD and GDH in SF016pggnearly doubled after
incubation in a shaking flask for 40 h reaching 0.63 mol·min-1·g-1 and 0.131 mol·min-1·g-1，
respectively. Furthermore， the SF016pgg production of GABA from glucose as a single carbon
source totaled 23.12 g·L-1 in a 40 h fermentation in a tank. The results seemed to clearly demonstrate
the effectiveness of the gadB and gdh coexpressed recombinant strain on producing GABA by
converting glucose without exogenous addition of LGlu. As a result， the GABA production cost was
significantly reduced making the industrialization of food， feed and/or pharmaceutical applications
exceedingly promising.
Key words： glutamate decarboxylase； glutamate dehydrogenase； glutamic acid producing
strain； coexpression
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γ氨基丁酸（GABA）是一種天然的非蛋白质氨基酸[1]，重要的中枢神经系统抑制性神经
递质[2]，广泛应用于食品、饲料、医药等领域，能有效抗焦虑、降血压、提高记忆能力、调
节激素分泌水平、促进生殖、镇痛等，其市场需求量逐年增加[3]。
目前，GABA的制备主要通过化学合成法、生物转化法和微生物直接发酵法[4-7]。化学合
成制备GABA的反应条件要求高，对环境造成比较大的污染，而且收率较低，产品的安全性
较差，获得的产品仅能在化工与医药领域应用，不能应用于食品与饲料行业；而通过植物生长
富集GABA则周期长，含量很低；生物转化法通过利用超表达微生物中的谷氨酸脱羧酶催化
LGlu脱羧生产GABA，需在反应体系中添加外源的LGlu，虽然环境污染较少但其生产成本较
高。田灵芝等[8]将植物乳杆菌中谷氨酸脱羧酶基因在大肠杆菌进行GABA 高效率生产，通过
补加LGlu底物GABA 转化质量浓度达204. 5 g·L-1，虽然产率较高但由于大肠杆菌为非安全
性微生物，仅能应用于化工领域；Huang J等[9]经筛选诱变得到一株安全乳酸菌，在3.7 L发
酵罐中GABA 积累量达到76. 36 g·L-1，其产率较低，无法进行规模化生产。孙红梅等[10]利
用产精氨酸钝齿棒杆菌为宿主菌进行谷氨酸脱羧酶基因整合及精氨酸代谢流的改造实现了单菌
发酵生产，但产量较低，仅为8.28 g·L-1。如何利用安全微生物直接发酵高产GABA是解决
GABA高效生产的关键。
谷氨酸棒杆菌Corynebacterium glutamicum是工业生产上应用广泛的一种氨基酸生产菌，
属好氧的革兰氏阳性菌，在糖蜜玉米浆等廉价培养基中即可生长，大规模应用于食品、医药、
饲料等领域，无安全问题。现阶段工业化生产LGlu、L赖氨酸、L缬氨酸等氨基酸生产菌大都
为谷氨酸棒杆菌[11-12]。目前国内外在谷氨酸棒状杆菌代谢工程的研究中并没有报道在该菌株
中含有谷氨酸脱羧酶编码基因[13]。
本实验室前期筛选到的植物乳杆菌具有高产GABA能力。谷氨酸棒杆菌SF016是本研究
室通过筛选及多次诱变获得的一株高产LGlu的谷氨酸棒杆菌温敏突变株，可利用葡萄糖、糖
蜜等廉价原料发酵获得LGlu，其发酵48 h LGlu可以达到56.4 g·L-1的水平。在谷氨酸棒杆菌
中，谷氨酸脱氢酶（Glutamate dehydrogenase，由gdh 编码，简称GDH）是谷氨酸代谢合成途
径的关键酶之一[14]，该酶可以催化α酮戊二酸还原生成LGlu，因此过表达该酶基因有望达到
提高LGlu产量的目的。本研究的创新点在于在筛选获得的高产谷氨酸的谷氨酸棒杆菌SF016
基础上，利用其合成的谷氨酸作为前体，通过转入谷氨酸脱羧酶（Glutamate decarboxylase，由
gadB编码，简称GAD）基因提高其LGlu合成代谢路径上的关键酶基因的表达量，进一步提
高其合成LGlu能力，同时串联表达来源于植物乳杆菌的谷氨酸脱羧酶编码基因，将菌种的代
谢产物谷氨酸直接在细胞内转变成GABA，完成 GABA在单个微生物细胞内的从头生物合
成，相对于需要外源添加 LGlu或 LGlu·Na为前体物质的生物转化法，这种生产方式的成本明
显降低，且产品的安全性高，可用于食品、饲料或医药等行业。
1 材料和方法
1.1 材料
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1.1.1 菌株和质粒
温敏谷氨酸棒杆菌SF016（Corynebacterium glutamicum SF016）、植物乳杆菌谷氨酸脱羧
酶基因表达载体pET28agadB、 Escherichia coli JM109为本实验室保藏； pMD18T Simple T克
隆载体购自TAKARA；谷氨酸棒杆菌表达质粒pZ81由福建师范大学施碧红教授惠赠。
1.1.2 主要试剂和仪器
限制性内切酶、DNA聚合酶、T4連接酶等均购自TAKARA；基因组提取试剂盒、质粒提
取试剂盒、PCR产物回收试剂盒、胶回收试剂盒等均购自上海生工生物工程有限公司；其他药
品均为国产分析纯；5 L发酵罐购于上海保兴生物设备工程有限公司，SBA40B 生物传感分析
仪购于山东省科学院生物研究所。
1.1.3 引物和基因序列
根据Genbank上的谷氨酸棒杆菌模式菌株的gdh基因序列设计PCR引物P1gdh和
P2gdh；根据植物乳杆菌gadB基因序列设计PCR引物P1gadB和P2gadB；根据表达载体pZ81
的ptac基因序列设计引物P1 tacgdh （表1）。
1.1.4 培养基
LB培养基：蛋白胨1%，酵母膏0.5%，NaCl 1%，琼脂2%；
LBG培养基：蛋白胨1%，酵母膏0.5%，NaCl 1%，葡萄糖5%，琼脂2%；
重组菌的斜面培养基：蛋白胨1%，酵母膏0.5%，NaCl 1%，葡萄糖5%，琼脂2%；
重组菌摇瓶发酵培养基：葡萄糖0.5%，黄豆提取物1.8%，进口酵母粉1.0%，KH2PO4
0.1%，尿素0.3%，丁二酸0.05%，琼脂2.0%，生物素0.000 01%；
重组菌的种子培养基：葡萄糖2.2%，酵母粉1.0%，黄豆提取物2.0%，FeSO4 0.001%，
MgSO4·7H2O 0.001%，尿素0.04%，丁二酸1.0%，生物素0.000 04%，VB10.000 02%，蛋氨
酸0.000 05%，消泡剂0.000 5 mL·dL-1；
重组菌的发酵培养基：葡萄糖5%，KH2PO4 0.3%，MgSO4·7H2O 0.1%，苏氨酸
0.025%，赖氨酸0.025%，黄豆提取物0.8%，豆浓0.08%～0.10%，FeSO4 0.002 6%，消泡剂
0.016%，对氨基苯甲酸（PABA）0.000 9%，VCNa 0.000 9%，生物素0.000 1%。
1.2 方法
1.2.1 gadB、gdh和tacgdh基因的克隆
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通过PCR方法以表达载体pET28agadB为模板，采用P1gadB、P2gadB引物扩增gadB基
因片段，以谷氨酸棒杆菌SF016基因组DNA为模板，采用P1gdh和P2gdh引物扩增gdh基
因，并分别连接到穿梭质粒pz81上，构建pZ8gadB和pZ8gdh质粒，再以P1tacgdh和P2gdh
为引物，以pz8gdh为模板扩增携带tac启动子的gdh基因，连接pMD18T Simple T克隆载体构
建Ttacgdh载体并测序。
1.2.2 串联表达载体pZ8gadtacgdh的构建
将pZ8gad与Ttacgdh的阳性克隆质粒分别用限制性内切酶SalⅠ进行单酶切，酶切体系50
μL：ddH2O 20 μL，pZ8gad/Ttacgdh质粒20 μL（约1 μg），10×H buffer 5 μL，SalⅠ5 μL，
37℃水浴过夜酶切。分别切胶回收酶切质粒pZ8gad和酶切基因片段tacgdh进行磷酸化处理，
再用于连接反应构建重组载体pZ8gadtacgdh，连接反应体系20 μL：ddH2O 4 μL， SalⅠ酶切
质粒pZ8gad 1 μL， SalⅠ酶切片段tacgdh 10 μL，10×ligase buffer 2 μL，T4 DNA ligase 3 μL，
16℃过夜连接。连接反应结束后转化大肠杆菌JM109感受态细胞，37℃，120 r·min-1复苏1
h，取100 μL涂布于含卡那霉素终质量浓度50 μg·mL-1的LB平板上，置于37℃恒温培养箱中
倒置培养约16 h。挑单菌落接种至含终质量浓度50 μg·mL-1卡那霉素的LB液体培养基中，
37℃，250 r·min-1培养过夜，提质粒利用限制性内切酶EcoRI酶切质粒筛选正向连接的阳性克
隆载体，将酶切验证正确的重组质粒送于北京华大基因有限公司进行测序。
1.2.3 gdaB和gdh基因过表达菌株的构建
采用电转化法[15]将酶切验证正确的重组质粒pZ8gadtacgdh导入实验室保藏的谷氨酸生产
菌SF016感受态细胞中，在含有25 μg·mL-1 的Km LBG平板上筛选阳性菌株。经提取质粒
PCR和酶切验证，最终筛选得到重组基因工程菌株SF016pgg。
1.2.4 重组谷氨酸棒杆菌酶活的检测
（1）粗酶液制备[16]：
将重组基因工程菌株SF016pgg以及原始菌株SF016在摇瓶发酵培养基培养72 h，发酵液
离心收集的菌体根据菌体浓度重悬于pH 8.0 的TrisHCl缓冲液，超声波破碎细胞，离心破碎
液，取上清即为粗酶液。
（2）GAD 酶活检测：
采用Berthlot 比色法[17]，一个酶活力单位（U） 定义为在测定条件下每分钟产生1 μmol
GABA所需的酶量。
（3）GDH酶活检测：
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参考文献[18]的方法。酶活力定义为：在标准酶活性测定条件下，每分钟还原1 μmol
NADP+或氧化1 μmol NADPH 所需酶量。
1.2.5 串联表达gadB和gdh基因对谷氨酸棒杆菌SF016产GABA的影响
（1）摇瓶发酵检测GABA及LGlu含量：
挑取重组菌单菌落接种至LBG培养基斜面，以15%接种量转接至摇瓶发酵培养基，220
r·min-1发酵40 h，检测GABA及LGlu的含量，在32℃摇瓶培养12 h后将温度提高到37℃进
行培养。
（2）5 L发酵罐培养检测GABA及LGlu含量：
重组菌SF016pgg发酵罐条件为5.0 L发酵罐发酵初体积2.5 L，种子液转接量15%，发酵
过程中溶氧控制在20%～40%（0.5 vvm， 300 r·min-1），发酵前12 h培養温度32℃，后面发
酵培养温度37℃，发酵前25 h通过流加25%的氨水和2 mol·L-1稀盐酸控制pH在6.8～7.0，
25 h以后通过添加25%的氨水和2 mol·L-1稀盐酸控制pH在5.0～6.0，发酵过程中进行葡萄糖
（65%）流加补料，控制其残糖含量在0.5%～1.5%，起始的葡萄糖含量为3%，在发酵30 h后
补加 0.1 mol 磷酸吡哆醛（PLP）。对照菌SF016在发酵过程中pH控制在6.8～7.0，不添加
PLP。
发酵液中葡萄糖的测定：采用SBA40B 生物传感分析仪测定。
1.2.6 菌体生长的测定
菌液浓度测定： 吸取样品菌液，用蒸馏水稀释一定倍数，以蒸馏水作为空白对照，采用
分光光度计于1 cm光程测定OD562nm。
2 结果与分析
2.1 重组SF016pgg的构建与鉴定
将构建好的pZ8gadBtacgdh重组质粒转化Escherichia coli JM109中，经Km平板筛选得到
转化子，挑取单克隆进行活化后抽提质粒进行酶切验证并委托北京华大基因有限公司测定阳性
克隆所插入目的片段基因序列，EcoRⅠ单酶切结果如图1所示。
由图1可知仅正向连接的gadBtacgdh基因序列在EcoRⅠ酶作用下产生gadB的酶切片
段，而反向连接或者无连接的质粒检测不到gadB基因的酶切片段，与预期结果一致；阳性克
隆测序结果显示，来自于SF106的gdh基因与GenBank中的icum ATCC13032的gdh
基因序列同源性达100%，基因长度为1 344 bp，其前端的ptac启动子序列与pZ81的ptac启动
子序列一致。
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将正向连接的阳性克隆载体pZ8gadBtacgdh电转化至谷氨酸生产菌SF016感受态细胞中，
经Km平板筛选和酶切简单获得的基因工程菌株命名为SF016pgg。
2.2 摇瓶发酵重组菌GAD、GDH的酶活及GABA、LGlu含量检测
取发酵摇瓶的培养基，离心收集细胞并超声破碎，取适量的粗酶液进行酶活性检测。重组
基因工程菌SF016pgg与原始菌SF016菌株胞内GAD、GDH的比酶活如表2所示。重组菌粗
酶液GDH比酶活明显高于原始菌，提高了2.05倍，而原始菌SF016未检测到GAD酶活性，
重组菌SF016pgg的GAD酶活达0.63 mol·min-1·g-1，表明2个基因在重组谷氨酸棒杆菌
SF016中实现表达。
2.3 串联表达gadB和gdh基因对谷氨酸棒杆菌SF016产GABA的影响
重组菌发酵产GABA，以SF016作为对照，对发酵过程中的生物量、发酵液中GABA产
量以及LGlu的产量进行跟踪测定，如图2所示，最终发酵参数见表3。从表3中可以看出基
因工程菌SF016pgg对比原始菌具备了产GABA的能力，能将菌种生产的LGlu部分转化为
GABA，其产量可达23.12 g·L-1。
从图2的菌体发酵生长曲线可知，重组菌SF016pgg比原始菌晚6 h进入平稳期，其最高
OD也比原始菌少27.8%，可能由于额外引入了重组表达载体pZ8gadBtacgdh，增加了GAD和
GDH的表达，从而导致菌株需要消耗更多的ATP用于菌体代谢，延迟其生长周期，且其发酵
过程中pH的调整及PLP的添加也对菌体的生长产生影响。
从图2可知重组菌SF016pgg与原始菌在发酵过程中GABA、LGlu的变化情况。原始菌
SF016是一株高产LGlu的温敏突变株，在发酵40 h后其LGlu的积累量为53.82 g·L-1，但是
重组菌SF016在发酵前12 h的LGlu产量比原始菌高，分析是由于在重组菌中引入了gdh基
因，导致其LGlu的积累较快。在12 h后其LGlu含量逐渐下降，分析是由于导入的gadB基因
的成功表达将LGlu转化为GABA。从重组菌SF016pgg的GABA曲线可以看出，在发酵前12
h主要是LGlu积累期，生产的GABA含量较低，在调整pH及添加辅酶PLP以后GABA的含
量开始逐渐上升，发酵40 h可积累产生23.12 g·L-1的GABA。
3 讨 论
微生物无外源添加LGlu直接发酵法制备GABA 是通过生物细胞表达的GAD，将游离的
LGlu转化为GABA的生产方法，其发酵条件要求温和，安全，污水处理成本较低，原料成本
低廉等[7]。而常用的生物转化法合成GABA的工艺均需要添加外源谷氨酸或谷氨酸钠盐作为
底物，在一定程度上增加了GABA的生产成本。因此，构建以单菌直接发酵生产GABA的工
程菌具有广阔的运用前景。国内已实现单菌直接发酵生产GABA的代谢改造，但是仅在产谷
氨酸的宿主菌中引入gadB基因，其发酵72 h最高可达26 g·L-1 [19]，与本研究相比存在产酸
较低、生长周期较长等问题。
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本研究将植物乳杆菌 GABA合成途径的关键酶基因gadB与LGlu合成途径中的关键酶基
因gdh进行串联表达，导入产谷氨酸菌株谷氨酸棒杆菌SF016中，构建重组菌SF016pgg。结
果表明重组菌成功表达了GAD和GDH，由于受到其表达体系的限制，重组菌GAD的表达量
较低，通过40 h发酵重组菌GABA积累量为23.12 g·L-1。本研究实现了葡萄糖转化GABA的
直接发酵，在目前报道的棒杆菌直接合成GABA的产量中处于较高水平，且发酵周期较短。
虽然该研究中GABA产量还未达到工业化应用的水平，但这种经济环保的生产模式具有很大
的经济价值，为后期定向改造重组菌的GAD酶和LGlu代谢途径提供基础，也为进一步研究
重组菌在发酵过程pH的调整及其他发酵工艺的控制提供参考。
参考文献：
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（责任编辑：张 梅）
2024年3月10日发(作者：俎梅)
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谷氨酸脱羧酶和谷氨酸脱氢酶基因的串联表
达及其对GABA产量影响
作者：罗秀针 林燕燕 陈雅静 张文华 谢伟容
来源：《福建农业学报》2018年第07期
摘 要：为构建一株无外源L谷氨酸（LGlu）条件下可直接转化葡萄糖生产γ氨基丁酸
（GABA）的安全基因工程菌，将植物乳杆菌GABA合成途径的关键酶——谷氨酸脱羧酶基因
gadB与LGlu合成途径中的关键酶谷氨酸脱氢酶基因gdh进行串联表达，导入产谷氨酸菌株谷
氨酸棒杆菌SF016中，检测其对LGlu及GABA产量的影响。经摇瓶发酵40 h重组菌
SF016pgg谷氨酸脱羧酶的酶活达0.63 mol·min-1·g-1，而谷氨酸脱氢酶的酶活达0.131 mol·min-
1·g-1，比原始菌株提高了约2.0倍。重组菌SF016pgg以葡萄糖为碳源，通过40 h发酵罐发酵
可积累产生23.12 g·L-1的GABA，说明串联表达gadB和gdh基因有效实现重组菌在以葡萄糖
为单一碳源、无外源LGlu存在的培养基中直接发酵生产GABA。该生产方式的成本明显降
低，且产品的安全性高，可用于食品、饲料或医药等行业。
关键词：谷氨酸脱羧酶；谷氨酸脱氢酶；谷氨酸生产菌SF016；基因串联表达
中图分类号：Q 784文献标识码：A文章编号：1008-0384（2018）07-744-06
Abstract： This study aimed to create a genetically engineered bacterium that could produce
γaminobutyric acid （GABA） directly from glucose without exogenous Lglutamic acid
（LGlu）.The gadB and gdh genes responsible for the generation of two critical enzymes，glutamic
acid decarboxylase （GAD） and glutamate dehydrogenase （GDH）， respectively，in the
synthesis of plant lactobacillus GABA were coexpressed in a Gluproducing strain of Corynebacterium
glutamicum， resulting effects on GABA production by the recombinational strain，
SF016pgg， were analyzed. The activities of GAD and GDH in SF016pggnearly doubled after
incubation in a shaking flask for 40 h reaching 0.63 mol·min-1·g-1 and 0.131 mol·min-1·g-1，
respectively. Furthermore， the SF016pgg production of GABA from glucose as a single carbon
source totaled 23.12 g·L-1 in a 40 h fermentation in a tank. The results seemed to clearly demonstrate
the effectiveness of the gadB and gdh coexpressed recombinant strain on producing GABA by
converting glucose without exogenous addition of LGlu. As a result， the GABA production cost was
significantly reduced making the industrialization of food， feed and/or pharmaceutical applications
exceedingly promising.
Key words： glutamate decarboxylase； glutamate dehydrogenase； glutamic acid producing
strain； coexpression
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γ氨基丁酸（GABA）是一種天然的非蛋白质氨基酸[1]，重要的中枢神经系统抑制性神经
递质[2]，广泛应用于食品、饲料、医药等领域，能有效抗焦虑、降血压、提高记忆能力、调
节激素分泌水平、促进生殖、镇痛等，其市场需求量逐年增加[3]。
目前，GABA的制备主要通过化学合成法、生物转化法和微生物直接发酵法[4-7]。化学合
成制备GABA的反应条件要求高，对环境造成比较大的污染，而且收率较低，产品的安全性
较差，获得的产品仅能在化工与医药领域应用，不能应用于食品与饲料行业；而通过植物生长
富集GABA则周期长，含量很低；生物转化法通过利用超表达微生物中的谷氨酸脱羧酶催化
LGlu脱羧生产GABA，需在反应体系中添加外源的LGlu，虽然环境污染较少但其生产成本较
高。田灵芝等[8]将植物乳杆菌中谷氨酸脱羧酶基因在大肠杆菌进行GABA 高效率生产，通过
补加LGlu底物GABA 转化质量浓度达204. 5 g·L-1，虽然产率较高但由于大肠杆菌为非安全
性微生物，仅能应用于化工领域；Huang J等[9]经筛选诱变得到一株安全乳酸菌，在3.7 L发
酵罐中GABA 积累量达到76. 36 g·L-1，其产率较低，无法进行规模化生产。孙红梅等[10]利
用产精氨酸钝齿棒杆菌为宿主菌进行谷氨酸脱羧酶基因整合及精氨酸代谢流的改造实现了单菌
发酵生产，但产量较低，仅为8.28 g·L-1。如何利用安全微生物直接发酵高产GABA是解决
GABA高效生产的关键。
谷氨酸棒杆菌Corynebacterium glutamicum是工业生产上应用广泛的一种氨基酸生产菌，
属好氧的革兰氏阳性菌，在糖蜜玉米浆等廉价培养基中即可生长，大规模应用于食品、医药、
饲料等领域，无安全问题。现阶段工业化生产LGlu、L赖氨酸、L缬氨酸等氨基酸生产菌大都
为谷氨酸棒杆菌[11-12]。目前国内外在谷氨酸棒状杆菌代谢工程的研究中并没有报道在该菌株
中含有谷氨酸脱羧酶编码基因[13]。
本实验室前期筛选到的植物乳杆菌具有高产GABA能力。谷氨酸棒杆菌SF016是本研究
室通过筛选及多次诱变获得的一株高产LGlu的谷氨酸棒杆菌温敏突变株，可利用葡萄糖、糖
蜜等廉价原料发酵获得LGlu，其发酵48 h LGlu可以达到56.4 g·L-1的水平。在谷氨酸棒杆菌
中，谷氨酸脱氢酶（Glutamate dehydrogenase，由gdh 编码，简称GDH）是谷氨酸代谢合成途
径的关键酶之一[14]，该酶可以催化α酮戊二酸还原生成LGlu，因此过表达该酶基因有望达到
提高LGlu产量的目的。本研究的创新点在于在筛选获得的高产谷氨酸的谷氨酸棒杆菌SF016
基础上，利用其合成的谷氨酸作为前体，通过转入谷氨酸脱羧酶（Glutamate decarboxylase，由
gadB编码，简称GAD）基因提高其LGlu合成代谢路径上的关键酶基因的表达量，进一步提
高其合成LGlu能力，同时串联表达来源于植物乳杆菌的谷氨酸脱羧酶编码基因，将菌种的代
谢产物谷氨酸直接在细胞内转变成GABA，完成 GABA在单个微生物细胞内的从头生物合
成，相对于需要外源添加 LGlu或 LGlu·Na为前体物质的生物转化法，这种生产方式的成本明
显降低，且产品的安全性高，可用于食品、饲料或医药等行业。
1 材料和方法
1.1 材料
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1.1.1 菌株和质粒
温敏谷氨酸棒杆菌SF016（Corynebacterium glutamicum SF016）、植物乳杆菌谷氨酸脱羧
酶基因表达载体pET28agadB、 Escherichia coli JM109为本实验室保藏； pMD18T Simple T克
隆载体购自TAKARA；谷氨酸棒杆菌表达质粒pZ81由福建师范大学施碧红教授惠赠。
1.1.2 主要试剂和仪器
限制性内切酶、DNA聚合酶、T4連接酶等均购自TAKARA；基因组提取试剂盒、质粒提
取试剂盒、PCR产物回收试剂盒、胶回收试剂盒等均购自上海生工生物工程有限公司；其他药
品均为国产分析纯；5 L发酵罐购于上海保兴生物设备工程有限公司，SBA40B 生物传感分析
仪购于山东省科学院生物研究所。
1.1.3 引物和基因序列
根据Genbank上的谷氨酸棒杆菌模式菌株的gdh基因序列设计PCR引物P1gdh和
P2gdh；根据植物乳杆菌gadB基因序列设计PCR引物P1gadB和P2gadB；根据表达载体pZ81
的ptac基因序列设计引物P1 tacgdh （表1）。
1.1.4 培养基
LB培养基：蛋白胨1%，酵母膏0.5%，NaCl 1%，琼脂2%；
LBG培养基：蛋白胨1%，酵母膏0.5%，NaCl 1%，葡萄糖5%，琼脂2%；
重组菌的斜面培养基：蛋白胨1%，酵母膏0.5%，NaCl 1%，葡萄糖5%，琼脂2%；
重组菌摇瓶发酵培养基：葡萄糖0.5%，黄豆提取物1.8%，进口酵母粉1.0%，KH2PO4
0.1%，尿素0.3%，丁二酸0.05%，琼脂2.0%，生物素0.000 01%；
重组菌的种子培养基：葡萄糖2.2%，酵母粉1.0%，黄豆提取物2.0%，FeSO4 0.001%，
MgSO4·7H2O 0.001%，尿素0.04%，丁二酸1.0%，生物素0.000 04%，VB10.000 02%，蛋氨
酸0.000 05%，消泡剂0.000 5 mL·dL-1；
重组菌的发酵培养基：葡萄糖5%，KH2PO4 0.3%，MgSO4·7H2O 0.1%，苏氨酸
0.025%，赖氨酸0.025%，黄豆提取物0.8%，豆浓0.08%～0.10%，FeSO4 0.002 6%，消泡剂
0.016%，对氨基苯甲酸（PABA）0.000 9%，VCNa 0.000 9%，生物素0.000 1%。
1.2 方法
1.2.1 gadB、gdh和tacgdh基因的克隆
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通过PCR方法以表达载体pET28agadB为模板，采用P1gadB、P2gadB引物扩增gadB基
因片段，以谷氨酸棒杆菌SF016基因组DNA为模板，采用P1gdh和P2gdh引物扩增gdh基
因，并分别连接到穿梭质粒pz81上，构建pZ8gadB和pZ8gdh质粒，再以P1tacgdh和P2gdh
为引物，以pz8gdh为模板扩增携带tac启动子的gdh基因，连接pMD18T Simple T克隆载体构
建Ttacgdh载体并测序。
1.2.2 串联表达载体pZ8gadtacgdh的构建
将pZ8gad与Ttacgdh的阳性克隆质粒分别用限制性内切酶SalⅠ进行单酶切，酶切体系50
μL：ddH2O 20 μL，pZ8gad/Ttacgdh质粒20 μL（约1 μg），10×H buffer 5 μL，SalⅠ5 μL，
37℃水浴过夜酶切。分别切胶回收酶切质粒pZ8gad和酶切基因片段tacgdh进行磷酸化处理，
再用于连接反应构建重组载体pZ8gadtacgdh，连接反应体系20 μL：ddH2O 4 μL， SalⅠ酶切
质粒pZ8gad 1 μL， SalⅠ酶切片段tacgdh 10 μL，10×ligase buffer 2 μL，T4 DNA ligase 3 μL，
16℃过夜连接。连接反应结束后转化大肠杆菌JM109感受态细胞，37℃，120 r·min-1复苏1
h，取100 μL涂布于含卡那霉素终质量浓度50 μg·mL-1的LB平板上，置于37℃恒温培养箱中
倒置培养约16 h。挑单菌落接种至含终质量浓度50 μg·mL-1卡那霉素的LB液体培养基中，
37℃，250 r·min-1培养过夜，提质粒利用限制性内切酶EcoRI酶切质粒筛选正向连接的阳性克
隆载体，将酶切验证正确的重组质粒送于北京华大基因有限公司进行测序。
1.2.3 gdaB和gdh基因过表达菌株的构建
采用电转化法[15]将酶切验证正确的重组质粒pZ8gadtacgdh导入实验室保藏的谷氨酸生产
菌SF016感受态细胞中，在含有25 μg·mL-1 的Km LBG平板上筛选阳性菌株。经提取质粒
PCR和酶切验证，最终筛选得到重组基因工程菌株SF016pgg。
1.2.4 重组谷氨酸棒杆菌酶活的检测
（1）粗酶液制备[16]：
将重组基因工程菌株SF016pgg以及原始菌株SF016在摇瓶发酵培养基培养72 h，发酵液
离心收集的菌体根据菌体浓度重悬于pH 8.0 的TrisHCl缓冲液，超声波破碎细胞，离心破碎
液，取上清即为粗酶液。
（2）GAD 酶活检测：
采用Berthlot 比色法[17]，一个酶活力单位（U） 定义为在测定条件下每分钟产生1 μmol
GABA所需的酶量。
（3）GDH酶活检测：
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参考文献[18]的方法。酶活力定义为：在标准酶活性测定条件下，每分钟还原1 μmol
NADP+或氧化1 μmol NADPH 所需酶量。
1.2.5 串联表达gadB和gdh基因对谷氨酸棒杆菌SF016产GABA的影响
（1）摇瓶发酵检测GABA及LGlu含量：
挑取重组菌单菌落接种至LBG培养基斜面，以15%接种量转接至摇瓶发酵培养基，220
r·min-1发酵40 h，检测GABA及LGlu的含量，在32℃摇瓶培养12 h后将温度提高到37℃进
行培养。
（2）5 L发酵罐培养检测GABA及LGlu含量：
重组菌SF016pgg发酵罐条件为5.0 L发酵罐发酵初体积2.5 L，种子液转接量15%，发酵
过程中溶氧控制在20%～40%（0.5 vvm， 300 r·min-1），发酵前12 h培養温度32℃，后面发
酵培养温度37℃，发酵前25 h通过流加25%的氨水和2 mol·L-1稀盐酸控制pH在6.8～7.0，
25 h以后通过添加25%的氨水和2 mol·L-1稀盐酸控制pH在5.0～6.0，发酵过程中进行葡萄糖
（65%）流加补料，控制其残糖含量在0.5%～1.5%，起始的葡萄糖含量为3%，在发酵30 h后
补加 0.1 mol 磷酸吡哆醛（PLP）。对照菌SF016在发酵过程中pH控制在6.8～7.0，不添加
PLP。
发酵液中葡萄糖的测定：采用SBA40B 生物传感分析仪测定。
1.2.6 菌体生长的测定
菌液浓度测定： 吸取样品菌液，用蒸馏水稀释一定倍数，以蒸馏水作为空白对照，采用
分光光度计于1 cm光程测定OD562nm。
2 结果与分析
2.1 重组SF016pgg的构建与鉴定
将构建好的pZ8gadBtacgdh重组质粒转化Escherichia coli JM109中，经Km平板筛选得到
转化子，挑取单克隆进行活化后抽提质粒进行酶切验证并委托北京华大基因有限公司测定阳性
克隆所插入目的片段基因序列，EcoRⅠ单酶切结果如图1所示。
由图1可知仅正向连接的gadBtacgdh基因序列在EcoRⅠ酶作用下产生gadB的酶切片
段，而反向连接或者无连接的质粒检测不到gadB基因的酶切片段，与预期结果一致；阳性克
隆测序结果显示，来自于SF106的gdh基因与GenBank中的icum ATCC13032的gdh
基因序列同源性达100%，基因长度为1 344 bp，其前端的ptac启动子序列与pZ81的ptac启动
子序列一致。
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将正向连接的阳性克隆载体pZ8gadBtacgdh电转化至谷氨酸生产菌SF016感受态细胞中，
经Km平板筛选和酶切简单获得的基因工程菌株命名为SF016pgg。
2.2 摇瓶发酵重组菌GAD、GDH的酶活及GABA、LGlu含量检测
取发酵摇瓶的培养基，离心收集细胞并超声破碎，取适量的粗酶液进行酶活性检测。重组
基因工程菌SF016pgg与原始菌SF016菌株胞内GAD、GDH的比酶活如表2所示。重组菌粗
酶液GDH比酶活明显高于原始菌，提高了2.05倍，而原始菌SF016未检测到GAD酶活性，
重组菌SF016pgg的GAD酶活达0.63 mol·min-1·g-1，表明2个基因在重组谷氨酸棒杆菌
SF016中实现表达。
2.3 串联表达gadB和gdh基因对谷氨酸棒杆菌SF016产GABA的影响
重组菌发酵产GABA，以SF016作为对照，对发酵过程中的生物量、发酵液中GABA产
量以及LGlu的产量进行跟踪测定，如图2所示，最终发酵参数见表3。从表3中可以看出基
因工程菌SF016pgg对比原始菌具备了产GABA的能力，能将菌种生产的LGlu部分转化为
GABA，其产量可达23.12 g·L-1。
从图2的菌体发酵生长曲线可知，重组菌SF016pgg比原始菌晚6 h进入平稳期，其最高
OD也比原始菌少27.8%，可能由于额外引入了重组表达载体pZ8gadBtacgdh，增加了GAD和
GDH的表达，从而导致菌株需要消耗更多的ATP用于菌体代谢，延迟其生长周期，且其发酵
过程中pH的调整及PLP的添加也对菌体的生长产生影响。
从图2可知重组菌SF016pgg与原始菌在发酵过程中GABA、LGlu的变化情况。原始菌
SF016是一株高产LGlu的温敏突变株，在发酵40 h后其LGlu的积累量为53.82 g·L-1，但是
重组菌SF016在发酵前12 h的LGlu产量比原始菌高，分析是由于在重组菌中引入了gdh基
因，导致其LGlu的积累较快。在12 h后其LGlu含量逐渐下降，分析是由于导入的gadB基因
的成功表达将LGlu转化为GABA。从重组菌SF016pgg的GABA曲线可以看出，在发酵前12
h主要是LGlu积累期，生产的GABA含量较低，在调整pH及添加辅酶PLP以后GABA的含
量开始逐渐上升，发酵40 h可积累产生23.12 g·L-1的GABA。
3 讨 论
微生物无外源添加LGlu直接发酵法制备GABA 是通过生物细胞表达的GAD，将游离的
LGlu转化为GABA的生产方法，其发酵条件要求温和，安全，污水处理成本较低，原料成本
低廉等[7]。而常用的生物转化法合成GABA的工艺均需要添加外源谷氨酸或谷氨酸钠盐作为
底物，在一定程度上增加了GABA的生产成本。因此，构建以单菌直接发酵生产GABA的工
程菌具有广阔的运用前景。国内已实现单菌直接发酵生产GABA的代谢改造，但是仅在产谷
氨酸的宿主菌中引入gadB基因，其发酵72 h最高可达26 g·L-1 [19]，与本研究相比存在产酸
较低、生长周期较长等问题。
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本研究将植物乳杆菌 GABA合成途径的关键酶基因gadB与LGlu合成途径中的关键酶基
因gdh进行串联表达，导入产谷氨酸菌株谷氨酸棒杆菌SF016中，构建重组菌SF016pgg。结
果表明重组菌成功表达了GAD和GDH，由于受到其表达体系的限制，重组菌GAD的表达量
较低，通过40 h发酵重组菌GABA积累量为23.12 g·L-1。本研究实现了葡萄糖转化GABA的
直接发酵，在目前报道的棒杆菌直接合成GABA的产量中处于较高水平，且发酵周期较短。
虽然该研究中GABA产量还未达到工业化应用的水平，但这种经济环保的生产模式具有很大
的经济价值，为后期定向改造重组菌的GAD酶和LGlu代谢途径提供基础，也为进一步研究
重组菌在发酵过程pH的调整及其他发酵工艺的控制提供参考。
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（责任编辑：张 梅）