2024年2月17日发(作者：支幼菱)
Protein A 、Protein G 与抗体的结合
1 Protein A Sepharose 、rProtein A Sepharose 亲和层析介质与抗体的结合
目前，约70-80%的抗体纯化使用 Protein A、Protein G 亲和层析。蛋白 A (Protein A)来源于金黄色葡萄 球菌的一个株系，它含有 5个可以和抗体IgG分子的Fc段特异性结合的结构域。蛋白
偶联到琼脂糖基质上，可以特异性的和样品中的抗体分子结合，
一步亲和层析就可达到超过
A作为亲和配基被
而使其他杂蛋白流穿，具有极高的选择性，
95%的纯度。1个蛋白A分子至少可以结合 2个IgG。蛋白A也可以结合另一
IgA、IgM的纯化。 些免疫球蛋白，如用于某些种属的
天然(Native Protein A) 和重组的蛋白 A (rProtein A) 对于IgG的Fc段有着相似的特异结合。重组的蛋
降低了空间位阻，增加了与 IgG 白A经改造后含有一个 C末端半胱氨酸，可以单一位点偶联于琼脂糖上，
的结合能力。蛋白 A与IgG的结合强度很大成度上依赖于该抗体的种属和亚型，而其动态结合能力则决 定于结合强度(解离常数)及传质阻力等多种因素(例如上样时样品在柱内的停留时间
2 Protein G Sepharose 亲和层析介质与抗体的结合
)。
蛋白G是一种源自链球菌 G族的细胞表面蛋白，为三型 Fc受体。其通过类似于蛋白
抗体的Fc段结合。像蛋白 A 一样，蛋白G可以与IgG的Fc区域特异性结合，不同的是，
Sepharose 可以广泛、更强地结合更多类型的
纯度更高，配基脱落也相对更低。此外，蛋白
A的非免疫机制与
Protein G
IgG,多克隆IgG及人IgG，同时血清蛋白结合水平更低，
G还可以和某些抗体的 Fab和F (ab ' )2段结合。
Protein G 是从G类Streptococci 细菌中分离出来的胞壁蛋白，与多数哺乳动物的 IgG Fc段结合(包括：
人、山羊、绵羊、兔、豚鼠、马、猪、猴、小鼠等)，分子量：25kDa。Protein G可用于纯化不能与 Protein A很好结合的哺乳动物单抗和多抗 IgG的纯化。相对于 Protein A ，Protein G 对于大多数哺乳动物的IgG
有着更高的亲和力， 尤其是对于IgG的亚基，如人IgG3，小鼠lgG1和鼠IgG2a。与Protein A不同，Protein G不与狗IgG结合、不结合人IgM，IgD，或IgA。
重组蛋白G(Recomb Protein G)已经除去了与白蛋白及细胞表面结合位点，减少了交叉反应和非特异性结
合。因此，它比天然蛋白 G和蛋白A有更大的亲和力。可以代替二抗，广泛应用于免疫化学等领域。在
亲和力、稳定性等方面好。
本产品将我公司自主设计和生产的新型重组蛋白 G偶联到环氧活化的琼脂糖凝胶 6B上，成为用于抗体分
离纯化的亲和层析介质 本产品稳定性好，基团脱落少，使用寿命长，使用方便，可从腹水或培养液中直接分离纯化抗体。
由于采用了环氧活化的方法，与溴化氰活化方法相比，可获得长短更适合的结合臂，使抗体纯化获得更好
的效果。并且这种方法活化的琼脂糖凝胶没有离子交换的作用，因而其死吸附少。
亲和介质特性
特点
基质
配基
配基密度
吸附载量
亲和介质的颗粒大小
最大流速
pH范围
使用温度
保存温度
保存液体
基团脱落少，结合特异性强
6%的交联琼脂糖凝胶
重组蛋白G
~6mg重组蛋白 G/ml
3-7mg 鼠 lgG2a/ml
50-160 卩 m
200cm/h
3-10，在位清洗时pH范围可到2-11
常温
+4~8°C
20%乙醇
三、适用范围
Protein A和Protein G的相对结合强度
物种物种
人
亚类亚类
IgA
igD
igD
igG1
protein A 结合
可变
-
-
++++
++++
-
++++
可变
-
++
protein G 结合
-
-
-
++++
++++
++++
++++
-
-
++++
+
++
++
++
++
++++
+
+
++++
++++
++++
+++
+++
-
igG2
igG3
igG4
igM
鸡蛋黄
牛
igY
狗
++
-
igG1
igG2
山羊
豚鼠
+++
+++
+
仓鼠
马
++
-
考拉
骆驼
-
++++
igG1
igG2a
+
++++
+++
++
可变
猴（恒河）
小鼠
igG2b
igG3
lgM
猪
兔
大鼠
+++
+++
+++
+
++++
++
++
++
++++
lgG1
lgG2a
-
-
-
-
+/-
lgG2b
lgG3
绵羊
++++ =强结合，++ =中等结合，-=弱或不结
四、缓冲液配制
建议采用磷酸缓冲液，洗脱后不影响下游的标记。
A 缓冲液 1mol/L Na2HPO4.12H2O(MW358.14) ............................... 358.14g
1500 mM NaCI l(MW68.08g/mol)
溶于1升水，滤膜过滤
B 缓冲液 1mol/L NaH2P04 (MW156.01)
1500 mM NaCl l(MW68.08g/mol)
溶于1升水，滤膜过滤
C吸附和洗涤缓冲液
根据所需PH值，按下表3配制。按照所列比例量取后混合，
如果洗脱下的抗体有些杂带，可加吐温 -20至终浓度0.05%
然后再加9倍体积的水，稀释成应用溶液。
............................... 156.01g
........................ 87.7g
...................... 87.7g
D中和缓冲液:A液77.4ml、B液22.6ml;两液混合成 PH7.4的中和缓冲液
E 洗脱液 0.1mol/L NaH2P04 (M W156.01)
150 mM NaCl l(MW68.08g/mol)
............................... 15.601g
............................... 8.77g
溶于1升水，滤膜过滤，HCI调整PH至3.0
五、应用举例
A实验名称：从小鼠腹水中分离纯化 lgG2a
1ml，流尽20%乙醇溶液； 1、 重组蛋白G琼脂糖凝胶装柱，柱床体积为
2、 以缓冲液C平衡5-10个床体积，流速为1ml/min ;(缓冲液C配制方法：取A液35.2ml、B液64.8ml, 再加900ml水，混合后PH6.5).
3、 将0.2ml小鼠腹水用缓冲液 C稀释到2ml, 0.45卩n滤膜过滤，上样。流速为
4、 用缓冲液C再洗5-10个床体积，流速为1ml/min ;
5、 用洗脱液E,洗脱3体积。
6、 在洗脱液加入0.2体积中和缓冲液，以 PH试纸确认溶液为中性。溶液太酸，会损伤抗体活性(中和缓
冲液配制方法：A液77.4ml、B液22.6ml;两液混合成 PH7.4的中和缓冲液
1ml/min ;
7、 将分离纯化的lgG2a与对照品同时进行 SDS-PAGE电泳分析。
8、 用纯水流洗10个柱床体积，再用 20%的乙醇流洗10个柱床体积，流速为 2ml/min ,
柱子置于+4~8
C环境中保存
表三，25C下0.1mol/L磷酸钠缓冲液的配制
A液
pH
5.8
6.0
6.2
6.4
6.6
6.8
7.0
7.2
7.4
7.6
7.8
8.0
1mol/L Na
2HPO(ml)
7.9
12.0
17.8
25.5
35.2
46.3
57.7
68.4
77.4
84.5
89.6
93.2
B液
1mol/L NaH2PQ(ml)
92.1
88.0
82.2
74.5
64.8
53.7
42.3
31.6
22.6
15.5
10.4
6.8
根据比例量取混合，然后在加 9倍体积的水，稀释成应用溶液。
B 免疫沉淀(Immunoprecipitation, IP):
(1) 蛋白样品的准备：
1)
培养液，
细胞裂解液裂解细胞。
3)
4)
裂解方法进行裂解。
注：详细的裂解方法参考不同裂解液的详细使用方法。对于不同的培养器材，参考 10厘米培养皿的裂解
对于组织样品参考贴壁细胞使用裂解液的比例进行裂解。
对于悬浮细胞，离心收集细胞后， PBS洗涤一次，然后参考贴壁细胞的对于10厘米细胞培养皿中的贴壁细胞，吸除细胞PBS洗涤一次，然后加入 500微升至2毫升
液的用量进行裂解。如果裂解获得的蛋白样品浓度过高， 可以用裂解液或PBS适当稀释，如果蛋白样品浓 度过低，在以后的裂解过程中宜适当减少裂解液的用量。
(2) .去除非特异性结合(可选做):
1).取200微升至1毫升蛋白样品，蛋白量约为200微克至1毫克，加入约1微克和免疫沉淀时使用的
种属相同的普通IgG和20微升充分重悬的 Protein A+G Agarose，4
C缓慢摇动30分钟至2小时。
IgG
2） . 2500rpm（约1000g）离心5分钟，取上清用于后续的免疫沉淀。
注： 所谓种属相同的 IgG 是指，例如后续免疫沉淀时用的是小鼠
IgG，如无normal IgG可以加入其它不影响后续检测的其它
IgG ，则在本步骤中可以加入 normal mouse
mouse IgG类型的抗体。通过和 normal IgG和
Protein A+GAgarose 的孵育，可以充分降低非特异性的结合，降低背景。
（3） . 免疫沉淀：
1） .加入0.2-2微克用于免疫沉淀的一抗， 4
C缓慢摇动过夜。
2） .再加入20微升充分重悬的 Protein A+G Agarose , 4C缓慢摇动1-3个小时。（为方便后续的洗涤操作可
以把加入充分重悬的 Protein A+G Agarose 的量调整为 40 微升。 ）
3） . 2500rpm（约1000g）离心5分钟，或瞬时高速离心，小心吸除上清，注意宁可留下少量上清也不能吸掉
Protein A+GAgarose 。
4） .用准备蛋白样品时的裂解液或 PBS洗涤沉淀5次，裂解液或PBS的用量每次为0.5-1毫升。洗涤时离 心条件和吸除上清的要求同上面的步骤 C3。
5） . 完成最后一次洗涤后，去除上清，加入 20-40 微升 1XSDS-PAGE 电泳上样缓冲液 Vortex 重悬沉淀， 瞬时高速离心把样品离心至管底。
6） . 100
C或沸水浴处理 3-5分钟，取部分或全部样品用于
存。
SDS-PAGE电泳，暂时不用的样品可以 -20
C保
2024年2月17日发(作者：支幼菱)
Protein A 、Protein G 与抗体的结合
1 Protein A Sepharose 、rProtein A Sepharose 亲和层析介质与抗体的结合
目前，约70-80%的抗体纯化使用 Protein A、Protein G 亲和层析。蛋白 A (Protein A)来源于金黄色葡萄 球菌的一个株系，它含有 5个可以和抗体IgG分子的Fc段特异性结合的结构域。蛋白
偶联到琼脂糖基质上，可以特异性的和样品中的抗体分子结合，
一步亲和层析就可达到超过
A作为亲和配基被
而使其他杂蛋白流穿，具有极高的选择性，
95%的纯度。1个蛋白A分子至少可以结合 2个IgG。蛋白A也可以结合另一
IgA、IgM的纯化。 些免疫球蛋白，如用于某些种属的
天然(Native Protein A) 和重组的蛋白 A (rProtein A) 对于IgG的Fc段有着相似的特异结合。重组的蛋
降低了空间位阻，增加了与 IgG 白A经改造后含有一个 C末端半胱氨酸，可以单一位点偶联于琼脂糖上，
的结合能力。蛋白 A与IgG的结合强度很大成度上依赖于该抗体的种属和亚型，而其动态结合能力则决 定于结合强度(解离常数)及传质阻力等多种因素(例如上样时样品在柱内的停留时间
2 Protein G Sepharose 亲和层析介质与抗体的结合
)。
蛋白G是一种源自链球菌 G族的细胞表面蛋白，为三型 Fc受体。其通过类似于蛋白
抗体的Fc段结合。像蛋白 A 一样，蛋白G可以与IgG的Fc区域特异性结合，不同的是，
Sepharose 可以广泛、更强地结合更多类型的
纯度更高，配基脱落也相对更低。此外，蛋白
A的非免疫机制与
Protein G
IgG,多克隆IgG及人IgG，同时血清蛋白结合水平更低，
G还可以和某些抗体的 Fab和F (ab ' )2段结合。
Protein G 是从G类Streptococci 细菌中分离出来的胞壁蛋白，与多数哺乳动物的 IgG Fc段结合(包括：
人、山羊、绵羊、兔、豚鼠、马、猪、猴、小鼠等)，分子量：25kDa。Protein G可用于纯化不能与 Protein A很好结合的哺乳动物单抗和多抗 IgG的纯化。相对于 Protein A ，Protein G 对于大多数哺乳动物的IgG
有着更高的亲和力， 尤其是对于IgG的亚基，如人IgG3，小鼠lgG1和鼠IgG2a。与Protein A不同，Protein G不与狗IgG结合、不结合人IgM，IgD，或IgA。
重组蛋白G(Recomb Protein G)已经除去了与白蛋白及细胞表面结合位点，减少了交叉反应和非特异性结
合。因此，它比天然蛋白 G和蛋白A有更大的亲和力。可以代替二抗，广泛应用于免疫化学等领域。在
亲和力、稳定性等方面好。
本产品将我公司自主设计和生产的新型重组蛋白 G偶联到环氧活化的琼脂糖凝胶 6B上，成为用于抗体分
离纯化的亲和层析介质 本产品稳定性好，基团脱落少，使用寿命长，使用方便，可从腹水或培养液中直接分离纯化抗体。
由于采用了环氧活化的方法，与溴化氰活化方法相比，可获得长短更适合的结合臂，使抗体纯化获得更好
的效果。并且这种方法活化的琼脂糖凝胶没有离子交换的作用，因而其死吸附少。
亲和介质特性
特点
基质
配基
配基密度
吸附载量
亲和介质的颗粒大小
最大流速
pH范围
使用温度
保存温度
保存液体
基团脱落少，结合特异性强
6%的交联琼脂糖凝胶
重组蛋白G
~6mg重组蛋白 G/ml
3-7mg 鼠 lgG2a/ml
50-160 卩 m
200cm/h
3-10，在位清洗时pH范围可到2-11
常温
+4~8°C
20%乙醇
三、适用范围
Protein A和Protein G的相对结合强度
物种物种
人
亚类亚类
IgA
igD
igD
igG1
protein A 结合
可变
-
-
++++
++++
-
++++
可变
-
++
protein G 结合
-
-
-
++++
++++
++++
++++
-
-
++++
+
++
++
++
++
++++
+
+
++++
++++
++++
+++
+++
-
igG2
igG3
igG4
igM
鸡蛋黄
牛
igY
狗
++
-
igG1
igG2
山羊
豚鼠
+++
+++
+
仓鼠
马
++
-
考拉
骆驼
-
++++
igG1
igG2a
+
++++
+++
++
可变
猴（恒河）
小鼠
igG2b
igG3
lgM
猪
兔
大鼠
+++
+++
+++
+
++++
++
++
++
++++
lgG1
lgG2a
-
-
-
-
+/-
lgG2b
lgG3
绵羊
++++ =强结合，++ =中等结合，-=弱或不结
四、缓冲液配制
建议采用磷酸缓冲液，洗脱后不影响下游的标记。
A 缓冲液 1mol/L Na2HPO4.12H2O(MW358.14) ............................... 358.14g
1500 mM NaCI l(MW68.08g/mol)
溶于1升水，滤膜过滤
B 缓冲液 1mol/L NaH2P04 (MW156.01)
1500 mM NaCl l(MW68.08g/mol)
溶于1升水，滤膜过滤
C吸附和洗涤缓冲液
根据所需PH值，按下表3配制。按照所列比例量取后混合，
如果洗脱下的抗体有些杂带，可加吐温 -20至终浓度0.05%
然后再加9倍体积的水，稀释成应用溶液。
............................... 156.01g
........................ 87.7g
...................... 87.7g
D中和缓冲液:A液77.4ml、B液22.6ml;两液混合成 PH7.4的中和缓冲液
E 洗脱液 0.1mol/L NaH2P04 (M W156.01)
150 mM NaCl l(MW68.08g/mol)
............................... 15.601g
............................... 8.77g
溶于1升水，滤膜过滤，HCI调整PH至3.0
五、应用举例
A实验名称：从小鼠腹水中分离纯化 lgG2a
1ml，流尽20%乙醇溶液； 1、 重组蛋白G琼脂糖凝胶装柱，柱床体积为
2、 以缓冲液C平衡5-10个床体积，流速为1ml/min ;(缓冲液C配制方法：取A液35.2ml、B液64.8ml, 再加900ml水，混合后PH6.5).
3、 将0.2ml小鼠腹水用缓冲液 C稀释到2ml, 0.45卩n滤膜过滤，上样。流速为
4、 用缓冲液C再洗5-10个床体积，流速为1ml/min ;
5、 用洗脱液E,洗脱3体积。
6、 在洗脱液加入0.2体积中和缓冲液，以 PH试纸确认溶液为中性。溶液太酸，会损伤抗体活性(中和缓
冲液配制方法：A液77.4ml、B液22.6ml;两液混合成 PH7.4的中和缓冲液
1ml/min ;
7、 将分离纯化的lgG2a与对照品同时进行 SDS-PAGE电泳分析。
8、 用纯水流洗10个柱床体积，再用 20%的乙醇流洗10个柱床体积，流速为 2ml/min ,
柱子置于+4~8
C环境中保存
表三，25C下0.1mol/L磷酸钠缓冲液的配制
A液
pH
5.8
6.0
6.2
6.4
6.6
6.8
7.0
7.2
7.4
7.6
7.8
8.0
1mol/L Na
2HPO(ml)
7.9
12.0
17.8
25.5
35.2
46.3
57.7
68.4
77.4
84.5
89.6
93.2
B液
1mol/L NaH2PQ(ml)
92.1
88.0
82.2
74.5
64.8
53.7
42.3
31.6
22.6
15.5
10.4
6.8
根据比例量取混合，然后在加 9倍体积的水，稀释成应用溶液。
B 免疫沉淀(Immunoprecipitation, IP):
(1) 蛋白样品的准备：
1)
培养液，
细胞裂解液裂解细胞。
3)
4)
裂解方法进行裂解。
注：详细的裂解方法参考不同裂解液的详细使用方法。对于不同的培养器材，参考 10厘米培养皿的裂解
对于组织样品参考贴壁细胞使用裂解液的比例进行裂解。
对于悬浮细胞，离心收集细胞后， PBS洗涤一次，然后参考贴壁细胞的对于10厘米细胞培养皿中的贴壁细胞，吸除细胞PBS洗涤一次，然后加入 500微升至2毫升
液的用量进行裂解。如果裂解获得的蛋白样品浓度过高， 可以用裂解液或PBS适当稀释，如果蛋白样品浓 度过低，在以后的裂解过程中宜适当减少裂解液的用量。
(2) .去除非特异性结合(可选做):
1).取200微升至1毫升蛋白样品，蛋白量约为200微克至1毫克，加入约1微克和免疫沉淀时使用的
种属相同的普通IgG和20微升充分重悬的 Protein A+G Agarose，4
C缓慢摇动30分钟至2小时。
IgG
2） . 2500rpm（约1000g）离心5分钟，取上清用于后续的免疫沉淀。
注： 所谓种属相同的 IgG 是指，例如后续免疫沉淀时用的是小鼠
IgG，如无normal IgG可以加入其它不影响后续检测的其它
IgG ，则在本步骤中可以加入 normal mouse
mouse IgG类型的抗体。通过和 normal IgG和
Protein A+GAgarose 的孵育，可以充分降低非特异性的结合，降低背景。
（3） . 免疫沉淀：
1） .加入0.2-2微克用于免疫沉淀的一抗， 4
C缓慢摇动过夜。
2） .再加入20微升充分重悬的 Protein A+G Agarose , 4C缓慢摇动1-3个小时。（为方便后续的洗涤操作可
以把加入充分重悬的 Protein A+G Agarose 的量调整为 40 微升。 ）
3） . 2500rpm（约1000g）离心5分钟，或瞬时高速离心，小心吸除上清，注意宁可留下少量上清也不能吸掉
Protein A+GAgarose 。
4） .用准备蛋白样品时的裂解液或 PBS洗涤沉淀5次，裂解液或PBS的用量每次为0.5-1毫升。洗涤时离 心条件和吸除上清的要求同上面的步骤 C3。
5） . 完成最后一次洗涤后，去除上清，加入 20-40 微升 1XSDS-PAGE 电泳上样缓冲液 Vortex 重悬沉淀， 瞬时高速离心把样品离心至管底。
6） . 100
C或沸水浴处理 3-5分钟，取部分或全部样品用于
存。
SDS-PAGE电泳，暂时不用的样品可以 -20
C保