2024年10月26日发(作者：圭丹亦)
子体铅诱导T30695构象改变N-甲基卟啉二丙酸Ⅸ(NMM)
荧光探针检测氡
刘红文;刘士蒙;李诗雅;杨桂英;刘然;吕昌银
【摘 要】氡衰变形成稳定的子体铅只需约3.82 d,且衰变产生的210pb非常稳定,
其半衰期为21年.基于氡辐射衰变最终形成稳定的子体铅的特点,探讨了子体铅诱
导富鸟嘌呤核苷酸序列形成G-四链体的特性,建立了一种基于子体铅诱导T30695
构象改变的荧光传感器.氡的子体铅诱导T30695形成的G-四链体结构能与N-甲
基卟啉二丙酸Ⅸ(NMM)荧光染料结合发出较强荧光,在一定范围内,荧光强度与
Pb2+的浓度和氡累积辐射剂量浓度成正相关.Pb2+离子浓度在5.13×10-9～
1.25×10-7mol/L范围内与体系的△IF值呈现良好的线性关系,回归方程为
△IF=77.30+ 5.05c,r=0.995 0,对铅的检出限为1.54×10-9 mol/L,对氡的检出限为
1.07×104Bq·h/m3.
【期刊名称】《分析测试学报》
【年(卷),期】2019(038)006
【总页数】6页(P643-648)
【关键词】氡;子体铅;核酸适配体;G-四链体;构象转变;荧光传感
【作 者】刘红文;刘士蒙;李诗雅;杨桂英;刘然;吕昌银
【作者单位】南华大学公共卫生学院,湖南衡阳421000;南华大学公共卫生学院,湖
南衡阳421000;南华大学公共卫生学院,湖南衡阳421000;南华大学公共卫生学院,
湖南衡阳421000;南华大学公共卫生学院,湖南衡阳421000;南华大学公共卫生学
院,湖南衡阳421000
【正文语种】中 文
【中图分类】O657.3
氡是238U、235U和232Th等放射性核素的衰变产物，无色无味，易溶于水，半
衰期为3.82天，其衰变产生的子体210Pb的半衰期长达21年[1-3]。氡是室内放
射性气体污染物的主要存在形式，人类所遭受的自然辐射剂量中有一半来自氡的辐
射。氡及其衰变子体形成的气溶胶被人体吸入后，可蓄积在人体肺细胞组织和骨骼
中，衰变过程产生的α粒子将会破坏细胞核中的 DNA分子，造成人体呼吸系统、
血液系统疾病和细胞遗传学损伤[4-5]。氡及其子体已经成为引发肺癌、白血病、
皮肤病以及其他呼吸道疾病的重要元凶[6]。现代人约有80%的时间在室内度过，
氡污染引起的人体健康问题受到越来越多的关注。因此监测环境中氡的浓度对保障
人类健康具有重要意义。
传统的放射性气体氡的检测方法，多是基于核科学和物理学领域中针对氡辐射产生
的α射线等来测定氡累积浓度的物理检测方法。近年来，核酸适配体因其高效特
异的结合能力，无毒性、易合成、稳定性好等优点，已成为重金属检测领域的研究
热点[7]。Wang等[8]筛选出可与Cd2+作用并产生二级结构构象变化的核酸适配
体，并基于此构建了一种可检测低浓度Cd2+的生物传感器。Zhu等[9]设计了一
种银特异性的核酸适配体，可与低浓度的Ag+形成G-四链体结构，并产生荧光猝
灭作用，实现对低浓度Ag+的定量检测。Chen等[10]经过18次的阳性和阴性选
择，获得了两种具有高度结合性和特异性的核酸适配体，并据此设计了荧光生物传
感器用于Pb2+检测。
1998年Arthanari等报道了一种不对称的阴离子活性卟啉荧光染料—N-甲基卟啉
二丙酸Ⅸ(N-methyl mesoporphyrin Ⅸ，NMM)，其最大吸收波长约为399 nm，
最强发射峰波长在610 nm左右。NMM自身的荧光强度很弱，很难与单链DNA、
双螺旋结构的DNA结合，但可与G-四链体结构产生特异性结合，结合后体系荧
光强度明显增强[11]。作为G-四链体的荧光染料，NMM已经在生物分析技术领
域得到了广泛地应用。本文根据氡辐射衰变的特点，结合铅离子的现代分析新技术，
以NMM作为荧光探针，探讨了Pb2+诱导富G序列形成G-四链体的特性，建立
了一种基于Pb2+诱导富含鸟嘌呤的寡核苷酸链T30695构象改变的荧光传感器对
铅和氡进行检测。
1 实验部分
1.1 仪器与试剂
F-4500荧光分光光度计(日本Hitachi公司)；J-815圆二色谱光谱仪(日本Jasco
公司)；RAD7 Electronic radon detector(美国Durridgce公司)；氡室(南华大学
核工业第六研究所)；混合纤维素膜(Merck Milipore公司)。
冰醋酸(HAc，天津市福晨化学试剂厂)；三羟甲基氨基甲烷(Tris，上海阿拉丁生化
科技股份有限公司)；铅标准溶液(100.0 μg/mL，中国计量科学院)；富含鸟嘌呤
的寡核苷酸链T30695(5’-GGGTGGGTGGGTGGGT-3’)与互补链C-
T30695(5’-ACCCACCCACCCACCC-3’)(上海生工生物工程股份有限公司)；荧
光染料N-甲基卟啉二丙酸Ⅸ(NMM,百灵威公司)；实验用水为灭菌超纯水(电阻率
为18.25 MΩ·cm)。
1.2 氡样本的采样方法
以10 mL 0.2%(体积分数)醋酸为吸收液，以直径70 mm，高17 mm的一次性塑
料培养皿为收集器，在平皿口加封混合纤维素膜(孔径为0.8 μm)；设定采样时间，
将采样器放入氡室，被动式采集含铅样本。采样后密封,室温放置4 d，用0.2%的
醋酸定容至10 mL，混匀，4 ℃冰箱保存，待测[12-14]。
1.3 Pb2+标准溶液的紫外光谱测定
将T30695及C-T30695分别配制成1 μmol/L的工作溶液，于95 ℃的金属恒温
仪中加热5 min，置于空气中迅速冷却至室温，备用。在反应管中，依次加入100
mmol/L Tris-HAC缓冲溶液(pH 7.25)50 μL，1 μmol/L T30695溶液20 μL，以
及一定量的铅标准溶液，混匀，于室温孵育80 min。
加入1 μmol/L的C-T30695溶液20 μL，于室温下孵育15 min后，加入NMM
染料(1.72×10-5 mol/L) 50 μL，加超纯水至200 μL，混匀，室温下避光孵育10
min后待测。设置仪器的激发波长为399 nm，发射波长为610 nm，测定各管的
荧光强度值(IF)，以超纯水作空白测定荧光值(IF0)，计算ΔIF= IF0-IF，建立荧光
强度差(ΔIF)对铅离子浓度(c)的线性回归方程。
2 结果与讨论
2.1 荧光传感原理
氡衰变形成稳定的子体铅只需约3.82 d，且衰变产生的子体铅210Pb非常稳定。
本实验以子体铅作为目标检测物，建立了氡的免标记荧光DNA传感器生物分析新
方法。用含0.2%醋酸吸收液的采样皿进行被动式采样，氡进入采样皿后，衰变产
生子体铅，随后在稀醋酸中转变形成铅离子。
实验原理如图1所示。NMM单独存在时荧光很弱，在没有Pb2+存在的条件下，
富鸟嘌呤DNA单链T30695与互补链C-T30695结合形成双链结构，不能与
NMM结合，NMM游离在溶液中，体系产生弱荧光；当体系中导入Pb2+时，
Pb2+诱导富G单链T30695发生构型转变，形成G-四链体结构，荧光染料
NMM嵌入G-四链体结构中，产生强的荧光。在一定浓度范围内，两体系荧光信
号差值ΔIF与Pb2+浓度呈线性关系。据此，建立了基于铅诱导T30695构象改变
的荧光法检测铅和氡。
图1 基于Pb2+诱导特异性核酸适配体构象转变的非标记荧光法测氡原理图Fig.1
Schematic diagram of radon label-free fluorescent detection based on
structure exchange of aptamer
2.2 实验机制可行性分析
文献[15]报道，NMM与双链DNA的结合能力较低，但能很好地与阳离子诱导形
成的稳定G-四链体结合，发出较强的荧光。为验证荧光传感原理的正确性，进行
了机制验证实验。结果如图2所示，当体系中只存在NMM时，设定激发波长为
399 nm，测定NMM在560～700 nm处的荧光强度，结果发现体系的荧光强度
IF≤400(曲线a)，说明NMM本身的荧光较弱。
图2 不同实验体系NMM染料的荧光发射光谱图Fig.2 Fluorescence emission
spectra of NMM in different systems cNMM=4.30 mmol/L,cT30695=cC-
T30695=cPb2+=100 nmol/L
当向富含鸟嘌呤的DNA单链T30695溶液中加入富含胞嘧啶的DNA互补链C-
T30695后，通过碱基互补配对，T30695与其互补链结合成为双链，形成双螺旋
结构。由于NMM不能与DNA双螺旋结构结合，使得“NMM+T30695+C-
T30695”体系测定的荧光强度比较微弱(曲线b)，与“NMM”体系荧光强度相差
不大。该实验结果证明NMM与双链DNA的结合能力弱，产生的荧光也很弱。
当体系中同时存在Pb2+与核酸适配体T30695，进行一段时间孵育后，T30695
被Pb2+诱导形成G-四链体结构。此时，加入荧光染料NMM可与G-四链体结构
的核苷酸链结合，体系的荧光强度显著增强，如图2曲线d所示，
“NMM+Pb2++T30695”体系的荧光强度IF≈1 100，且Pb2+离子浓度越大，
体系荧光强度增强越多。该实验结果说明NMM与G-四链体结构有较好的结合能
力，从而产生较强荧光。
当核酸适配体T30695被Pb2+诱导形成G-四链体结构后，再加入互补链 C-
T30695，二者很难再形成DNA双螺旋结构。NMM仍可与G-四链体结构结合发
出较强荧光，如图2中曲线c所示，“NMM+Pb2++T30695+C-T30695”体系
的荧光强度IF≈800，仍然比“NMM+T30695+C-T30695”体系的荧光强度强，
且两者间荧光强度的变化随着Pb2+离子浓度的增大而增大。该实验结果说明
Pb2+诱导T30695形成了G-四链体结构，与NMM结合产生了较强荧光。
图3 圆二色光谱图Fig.3 Circular dichroism spectracT30695=cC-
T30695=cPb2+=100 nmol/L
与“NMM+Pb2++T30695”体系相比，“NMM+Pb2++T30695+C-T30695”
体系的荧光强度并没有达到与之相同的水平。这可能因为体系中存在C-T30695
和Pb2+竞争结合T30695，导致仍有少量DNA双螺旋结构形成，该双螺旋结构
未与NMM结合产生荧光。因此，荧光强度略低于NMM与G-四链体结合时的水
平[16-17]。
2.3 圆二色谱实验
为进一步探究荧光强度变化与核酸适配体T30695构象改变间的关系，从分子结
构的角度，更好地说明Pb2+诱导T30695发生的构象变化，进行了圆二色谱验证
实验，结果如图3所示。核酸适配体T30695单链状态下在265 nm处有一个正
峰(曲线a)，加入Pb2+诱导T30695形成G-四链体结构后，在265 nm处的正峰
显著升高，并于245 nm处出现了一个负峰(曲线b)，这一结果符合顺式平行结构
G-四链体的特征[18]。单独将T30695与互补链C-T30695孵育一段时间后，在
260～285 nm处扫描出正峰，在240 nm左右处扫描出一个明显的负峰(曲线d)，
这一结果符合较典型的多聚鸟嘌呤与胞嘧啶寡核苷酸链形成B型双螺旋结构的圆
二色光谱图特征[16,19]，证明T30695与C-T30695结合形成了B型双螺旋结构。
核酸适配体T30695与Pb2+孵育一段时间后，再加入互补链C-T30695，扫描得
到一个不是很典型的圆二色光谱图，245 nm处有一个负峰，265～285 nm处出
现了一个较大的正峰(曲线c)，可能是因为这一体系中同时存在G-四链体结构和B
型双螺旋结构，因此在245 nm处有负峰，265 nm和285 nm均有正峰[16]。
2.4 实验条件优化
在pH 6.5～8.0的酸度范围内对pH值的影响进行了研究。结果显示，酸度对ΔIF
值影响较大。pH 6.75～7.25时，ΔIF值逐渐上升；pH 7.25～8.00时，ΔIF值逐
渐下降，所以，实验选择pH 7.25的Tris-HAc缓冲液维持体系的酸碱性。同时考
察了Tris-HAc用量对检测性能的影响，随着Tris-HAc用量的增加，荧光差值ΔIF
逐渐增高，在45 μL左右达到平台，45～70 μL体积范围内，荧光差值ΔIF趋于
稳定。因此，实验选择加入50 μL的Tris-HAc缓冲溶液进行后续研究。
对反应体系中Pb2+与T30695的孵育时间进行研究，结果显示，75 min之前
ΔIF值逐渐增大，说明随着反应时间的增加，形成G-四链体的量增加，其与
NMM染料结合后，荧光强度(IF)增强，导致荧光差值(ΔIF)也逐渐增加。75 min
以后，Pb2+离子已经与之完全结合，ΔIF值的变化趋于平缓。据此，选择孵育时
间为80 min。同时考察了C-T30695孵育时间对实验体系的影响，根据实验结果，
选择15 min作为互补链C-T30695的孵育时间。
图4 共存物质对测定体系的影响Fig.4 Responses of the Pb2+ sensors over
other competing metal ions concentration：50 nmol/L for Pb2+,5 μmol/L
for Bi3+, 2.5 μmol/L for Mn2+,Cr3+,Zn2+
荧光染料NMM的反应时间与浓度对测定结果有一定影响。实验发现，加入
NMM染料前5 min，体系的荧光差值(ΔIF)变化非常大，5 min后，ΔIF的变化趋
于平缓，说明此时NMM与G-四链体结合已基本完成并发出较强荧光。10 min
后体系荧光差值有稍许下降，但变化趋于平缓，可能的原因是，体系中的C-
T30695与部分T30695结合，导致荧光差值些许下降，但随着时间的增长，体系
达到稳定状态，荧光差值变化趋于平缓。因此，实验选择10 min作为NMM染
料的反应时间。通过考察荧光染料NMM浓度的影响，选择NMM的反应浓度为
4.30×10-6 mol/L。
2.5 共存干扰物的影响
对常见的一些重金属干扰物质Bi3+、Cu2+、Mn2+、Mg2+、Ce3+、NH4+、
Ca2+、Cr3+、Zn2+等进行了干扰测定。结果如图4所示，相对误差不大于±5%
时，100倍的Bi3+、Mg2+、Ce3+，90倍的倍的Mn2+、Cr3+、Zn2+ 对
Pb2+的测定均不产生干扰。此外，本方法根据氡最终衰变成为子体铅的核放射特
点来进行氡的检测，通过氡辐射采样方法可知，由于采用0.80 μm的微孔混和纤
维素膜加封采样器进气口，空气中的颗粒干扰物难以进入样品溶液，所以空气中其
他可能存在的干扰物质在样品采集时即可排除。
图5 氡累积浓度与荧光强度的关系Fig.5 Correlation curve of fluorescence
intensity and radon concentration
2.6 标准曲线与检出限
按实验方法操作，测定Pb2+离子标准系列溶液的荧光值IF和未加Pb2+离子的试
剂空白溶液的荧光值IF0,计算ΔIF值，绘制标准曲线。 Pb2+浓度在5.13×10-9～
1.25×10-7mol/L范围内与体系的ΔIF值呈现良好的线性关系，回归方程为
ΔIF=77.30+5.05cPb(10-9 mol/L)，相关系数r=0.995 0。对空白溶液平行测定
11次，计算空白溶液的标准偏差为sb=2.59，按照CL=3sb/k计算得到铅离子的
检出限为1.54×10-9 mol/L。
2.7 氡累积浓度的测定与模型建立
按照采样方法，在南华大学核六所氡实验室采集累积浓度分别为0.96、1.95、
5.86、11.66、17.42、20.31、23.19(×104 Bq·h/m3)的氡辐射样品溶液，如表1
所示，随着氡累积浓度的增加，铅含量和样品的荧光差值ΔIF值(图5)也逐渐增加。
进一步分析图5发现，在0.96～23.19×104Bq·h/m3的氡浓度范围内，荧光差值
ΔIF与氡累积浓度之间呈对数增长的关系，符合放射性物质指数衰变的特性;但在
3.58×104～16.92×104 Bq·h/m3氡浓度范围内，两者之间存在良好的线性关系：
ΔIF=3.60cRn+140.27，r=0.994 9。本方法氡的检测范围为3.58×104～
16.92×104 Bq·h/m3，检出限为1.07×104 Bq·h/m3。对样品溶液平行测定6次，
相对标准偏差(RSD)为1.7%～3.3%，加标回收率为96.0%～104%，表明方法测
定干扰小，结果准确可靠，适用于铅离子和氡积累浓度的检测。
表1 样品中Pb2+离子的检测结果(n=6)Table 1 Determination results of Pb2+
in the samples(n=6)SamplecRn(Bq·h/m3)ΔIF(a.u.)Found(×10-
9mol/L)Added(×10-9mol/L)Totalfound(×10-
9mol/L)RSD(%)Recovery(%)10.96×104141.1312.6420.0032.412.898.821.95×
104148.1214.0220.0033.232.096.035.86×104163.2316.9220.0036.331.797.1
411.66×104184.6321.2520.0041.772.2103517.42×104201.0024.4920.0045.3
02.5104620.31×104205.4325.3720.0044.792.297.1723.19×104208.1725.882
0.0045.543.398.3
‘Found’ and ‘Added’ refer to the final concentration
3 结 论
本文以氡辐射的子体铅为目标检测物，应用核酸适体构建了一种免标记高灵敏的荧
光DNA传感器，并实现了铅浓度和氡辐射剂量的生物分析化学测定。方法仪器设
备简单，操作简单快速，样品几乎无干扰，具有较高的灵敏度，对铅的检出限为
1.54×10-9mol/L，对氡的检出限1.07×104Bq·h/m3。本法避免了现场进行氡辐
射剂量测量的放射性危害，开拓了核酸适配体对无机物、气体和放射性物质的生物
分析新领域。
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感器用于Pb2+检测。
1998年Arthanari等报道了一种不对称的阴离子活性卟啉荧光染料—N-甲基卟啉
二丙酸Ⅸ(N-methyl mesoporphyrin Ⅸ，NMM)，其最大吸收波长约为399 nm，
最强发射峰波长在610 nm左右。NMM自身的荧光强度很弱，很难与单链DNA、
双螺旋结构的DNA结合，但可与G-四链体结构产生特异性结合，结合后体系荧
光强度明显增强[11]。作为G-四链体的荧光染料，NMM已经在生物分析技术领
域得到了广泛地应用。本文根据氡辐射衰变的特点，结合铅离子的现代分析新技术，
以NMM作为荧光探针，探讨了Pb2+诱导富G序列形成G-四链体的特性，建立
了一种基于Pb2+诱导富含鸟嘌呤的寡核苷酸链T30695构象改变的荧光传感器对
铅和氡进行检测。
1 实验部分
1.1 仪器与试剂
F-4500荧光分光光度计(日本Hitachi公司)；J-815圆二色谱光谱仪(日本Jasco
公司)；RAD7 Electronic radon detector(美国Durridgce公司)；氡室(南华大学
核工业第六研究所)；混合纤维素膜(Merck Milipore公司)。
冰醋酸(HAc，天津市福晨化学试剂厂)；三羟甲基氨基甲烷(Tris，上海阿拉丁生化
科技股份有限公司)；铅标准溶液(100.0 μg/mL，中国计量科学院)；富含鸟嘌呤
的寡核苷酸链T30695(5’-GGGTGGGTGGGTGGGT-3’)与互补链C-
T30695(5’-ACCCACCCACCCACCC-3’)(上海生工生物工程股份有限公司)；荧
光染料N-甲基卟啉二丙酸Ⅸ(NMM,百灵威公司)；实验用水为灭菌超纯水(电阻率
为18.25 MΩ·cm)。
1.2 氡样本的采样方法
以10 mL 0.2%(体积分数)醋酸为吸收液，以直径70 mm，高17 mm的一次性塑
料培养皿为收集器，在平皿口加封混合纤维素膜(孔径为0.8 μm)；设定采样时间，
将采样器放入氡室，被动式采集含铅样本。采样后密封,室温放置4 d，用0.2%的
醋酸定容至10 mL，混匀，4 ℃冰箱保存，待测[12-14]。
1.3 Pb2+标准溶液的紫外光谱测定
将T30695及C-T30695分别配制成1 μmol/L的工作溶液，于95 ℃的金属恒温
仪中加热5 min，置于空气中迅速冷却至室温，备用。在反应管中，依次加入100
mmol/L Tris-HAC缓冲溶液(pH 7.25)50 μL，1 μmol/L T30695溶液20 μL，以
及一定量的铅标准溶液，混匀，于室温孵育80 min。
加入1 μmol/L的C-T30695溶液20 μL，于室温下孵育15 min后，加入NMM
染料(1.72×10-5 mol/L) 50 μL，加超纯水至200 μL，混匀，室温下避光孵育10
min后待测。设置仪器的激发波长为399 nm，发射波长为610 nm，测定各管的
荧光强度值(IF)，以超纯水作空白测定荧光值(IF0)，计算ΔIF= IF0-IF，建立荧光
强度差(ΔIF)对铅离子浓度(c)的线性回归方程。
2 结果与讨论
2.1 荧光传感原理
氡衰变形成稳定的子体铅只需约3.82 d，且衰变产生的子体铅210Pb非常稳定。
本实验以子体铅作为目标检测物，建立了氡的免标记荧光DNA传感器生物分析新
方法。用含0.2%醋酸吸收液的采样皿进行被动式采样，氡进入采样皿后，衰变产
生子体铅，随后在稀醋酸中转变形成铅离子。
实验原理如图1所示。NMM单独存在时荧光很弱，在没有Pb2+存在的条件下，
富鸟嘌呤DNA单链T30695与互补链C-T30695结合形成双链结构，不能与
NMM结合，NMM游离在溶液中，体系产生弱荧光；当体系中导入Pb2+时，
Pb2+诱导富G单链T30695发生构型转变，形成G-四链体结构，荧光染料
NMM嵌入G-四链体结构中，产生强的荧光。在一定浓度范围内，两体系荧光信
号差值ΔIF与Pb2+浓度呈线性关系。据此，建立了基于铅诱导T30695构象改变
的荧光法检测铅和氡。
图1 基于Pb2+诱导特异性核酸适配体构象转变的非标记荧光法测氡原理图Fig.1
Schematic diagram of radon label-free fluorescent detection based on
structure exchange of aptamer
2.2 实验机制可行性分析
文献[15]报道，NMM与双链DNA的结合能力较低，但能很好地与阳离子诱导形
成的稳定G-四链体结合，发出较强的荧光。为验证荧光传感原理的正确性，进行
了机制验证实验。结果如图2所示，当体系中只存在NMM时，设定激发波长为
399 nm，测定NMM在560～700 nm处的荧光强度，结果发现体系的荧光强度
IF≤400(曲线a)，说明NMM本身的荧光较弱。
图2 不同实验体系NMM染料的荧光发射光谱图Fig.2 Fluorescence emission
spectra of NMM in different systems cNMM=4.30 mmol/L,cT30695=cC-
T30695=cPb2+=100 nmol/L
当向富含鸟嘌呤的DNA单链T30695溶液中加入富含胞嘧啶的DNA互补链C-
T30695后，通过碱基互补配对，T30695与其互补链结合成为双链，形成双螺旋
结构。由于NMM不能与DNA双螺旋结构结合，使得“NMM+T30695+C-
T30695”体系测定的荧光强度比较微弱(曲线b)，与“NMM”体系荧光强度相差
不大。该实验结果证明NMM与双链DNA的结合能力弱，产生的荧光也很弱。
当体系中同时存在Pb2+与核酸适配体T30695，进行一段时间孵育后，T30695
被Pb2+诱导形成G-四链体结构。此时，加入荧光染料NMM可与G-四链体结构
的核苷酸链结合，体系的荧光强度显著增强，如图2曲线d所示，
“NMM+Pb2++T30695”体系的荧光强度IF≈1 100，且Pb2+离子浓度越大，
体系荧光强度增强越多。该实验结果说明NMM与G-四链体结构有较好的结合能
力，从而产生较强荧光。
当核酸适配体T30695被Pb2+诱导形成G-四链体结构后，再加入互补链 C-
T30695，二者很难再形成DNA双螺旋结构。NMM仍可与G-四链体结构结合发
出较强荧光，如图2中曲线c所示，“NMM+Pb2++T30695+C-T30695”体系
的荧光强度IF≈800，仍然比“NMM+T30695+C-T30695”体系的荧光强度强，
且两者间荧光强度的变化随着Pb2+离子浓度的增大而增大。该实验结果说明
Pb2+诱导T30695形成了G-四链体结构，与NMM结合产生了较强荧光。
图3 圆二色光谱图Fig.3 Circular dichroism spectracT30695=cC-
T30695=cPb2+=100 nmol/L
与“NMM+Pb2++T30695”体系相比，“NMM+Pb2++T30695+C-T30695”
体系的荧光强度并没有达到与之相同的水平。这可能因为体系中存在C-T30695
和Pb2+竞争结合T30695，导致仍有少量DNA双螺旋结构形成，该双螺旋结构
未与NMM结合产生荧光。因此，荧光强度略低于NMM与G-四链体结合时的水
平[16-17]。
2.3 圆二色谱实验
为进一步探究荧光强度变化与核酸适配体T30695构象改变间的关系，从分子结
构的角度，更好地说明Pb2+诱导T30695发生的构象变化，进行了圆二色谱验证
实验，结果如图3所示。核酸适配体T30695单链状态下在265 nm处有一个正
峰(曲线a)，加入Pb2+诱导T30695形成G-四链体结构后，在265 nm处的正峰
显著升高，并于245 nm处出现了一个负峰(曲线b)，这一结果符合顺式平行结构
G-四链体的特征[18]。单独将T30695与互补链C-T30695孵育一段时间后，在
260～285 nm处扫描出正峰，在240 nm左右处扫描出一个明显的负峰(曲线d)，
这一结果符合较典型的多聚鸟嘌呤与胞嘧啶寡核苷酸链形成B型双螺旋结构的圆
二色光谱图特征[16,19]，证明T30695与C-T30695结合形成了B型双螺旋结构。
核酸适配体T30695与Pb2+孵育一段时间后，再加入互补链C-T30695，扫描得
到一个不是很典型的圆二色光谱图，245 nm处有一个负峰，265～285 nm处出
现了一个较大的正峰(曲线c)，可能是因为这一体系中同时存在G-四链体结构和B
型双螺旋结构，因此在245 nm处有负峰，265 nm和285 nm均有正峰[16]。
2.4 实验条件优化
在pH 6.5～8.0的酸度范围内对pH值的影响进行了研究。结果显示，酸度对ΔIF
值影响较大。pH 6.75～7.25时，ΔIF值逐渐上升；pH 7.25～8.00时，ΔIF值逐
渐下降，所以，实验选择pH 7.25的Tris-HAc缓冲液维持体系的酸碱性。同时考
察了Tris-HAc用量对检测性能的影响，随着Tris-HAc用量的增加，荧光差值ΔIF
逐渐增高，在45 μL左右达到平台，45～70 μL体积范围内，荧光差值ΔIF趋于
稳定。因此，实验选择加入50 μL的Tris-HAc缓冲溶液进行后续研究。
对反应体系中Pb2+与T30695的孵育时间进行研究，结果显示，75 min之前
ΔIF值逐渐增大，说明随着反应时间的增加，形成G-四链体的量增加，其与
NMM染料结合后，荧光强度(IF)增强，导致荧光差值(ΔIF)也逐渐增加。75 min
以后，Pb2+离子已经与之完全结合，ΔIF值的变化趋于平缓。据此，选择孵育时
间为80 min。同时考察了C-T30695孵育时间对实验体系的影响，根据实验结果，
选择15 min作为互补链C-T30695的孵育时间。
图4 共存物质对测定体系的影响Fig.4 Responses of the Pb2+ sensors over
other competing metal ions concentration：50 nmol/L for Pb2+,5 μmol/L
for Bi3+, 2.5 μmol/L for Mn2+,Cr3+,Zn2+
荧光染料NMM的反应时间与浓度对测定结果有一定影响。实验发现，加入
NMM染料前5 min，体系的荧光差值(ΔIF)变化非常大，5 min后，ΔIF的变化趋
于平缓，说明此时NMM与G-四链体结合已基本完成并发出较强荧光。10 min
后体系荧光差值有稍许下降，但变化趋于平缓，可能的原因是，体系中的C-
T30695与部分T30695结合，导致荧光差值些许下降，但随着时间的增长，体系
达到稳定状态，荧光差值变化趋于平缓。因此，实验选择10 min作为NMM染
料的反应时间。通过考察荧光染料NMM浓度的影响，选择NMM的反应浓度为
4.30×10-6 mol/L。
2.5 共存干扰物的影响
对常见的一些重金属干扰物质Bi3+、Cu2+、Mn2+、Mg2+、Ce3+、NH4+、
Ca2+、Cr3+、Zn2+等进行了干扰测定。结果如图4所示，相对误差不大于±5%
时，100倍的Bi3+、Mg2+、Ce3+，90倍的倍的Mn2+、Cr3+、Zn2+ 对
Pb2+的测定均不产生干扰。此外，本方法根据氡最终衰变成为子体铅的核放射特
点来进行氡的检测，通过氡辐射采样方法可知，由于采用0.80 μm的微孔混和纤
维素膜加封采样器进气口，空气中的颗粒干扰物难以进入样品溶液，所以空气中其
他可能存在的干扰物质在样品采集时即可排除。
图5 氡累积浓度与荧光强度的关系Fig.5 Correlation curve of fluorescence
intensity and radon concentration
2.6 标准曲线与检出限
按实验方法操作，测定Pb2+离子标准系列溶液的荧光值IF和未加Pb2+离子的试
剂空白溶液的荧光值IF0,计算ΔIF值，绘制标准曲线。 Pb2+浓度在5.13×10-9～
1.25×10-7mol/L范围内与体系的ΔIF值呈现良好的线性关系，回归方程为
ΔIF=77.30+5.05cPb(10-9 mol/L)，相关系数r=0.995 0。对空白溶液平行测定
11次，计算空白溶液的标准偏差为sb=2.59，按照CL=3sb/k计算得到铅离子的
检出限为1.54×10-9 mol/L。
2.7 氡累积浓度的测定与模型建立
按照采样方法，在南华大学核六所氡实验室采集累积浓度分别为0.96、1.95、
5.86、11.66、17.42、20.31、23.19(×104 Bq·h/m3)的氡辐射样品溶液，如表1
所示，随着氡累积浓度的增加，铅含量和样品的荧光差值ΔIF值(图5)也逐渐增加。
进一步分析图5发现，在0.96～23.19×104Bq·h/m3的氡浓度范围内，荧光差值
ΔIF与氡累积浓度之间呈对数增长的关系，符合放射性物质指数衰变的特性;但在
3.58×104～16.92×104 Bq·h/m3氡浓度范围内，两者之间存在良好的线性关系：
ΔIF=3.60cRn+140.27，r=0.994 9。本方法氡的检测范围为3.58×104～
16.92×104 Bq·h/m3，检出限为1.07×104 Bq·h/m3。对样品溶液平行测定6次，
相对标准偏差(RSD)为1.7%～3.3%，加标回收率为96.0%～104%，表明方法测
定干扰小，结果准确可靠，适用于铅离子和氡积累浓度的检测。
表1 样品中Pb2+离子的检测结果(n=6)Table 1 Determination results of Pb2+
in the samples(n=6)SamplecRn(Bq·h/m3)ΔIF(a.u.)Found(×10-
9mol/L)Added(×10-9mol/L)Totalfound(×10-
9mol/L)RSD(%)Recovery(%)10.96×104141.1312.6420.0032.412.898.821.95×
104148.1214.0220.0033.232.096.035.86×104163.2316.9220.0036.331.797.1
411.66×104184.6321.2520.0041.772.2103517.42×104201.0024.4920.0045.3
02.5104620.31×104205.4325.3720.0044.792.297.1723.19×104208.1725.882
0.0045.543.398.3
‘Found’ and ‘Added’ refer to the final concentration
3 结 论
本文以氡辐射的子体铅为目标检测物，应用核酸适体构建了一种免标记高灵敏的荧
光DNA传感器，并实现了铅浓度和氡辐射剂量的生物分析化学测定。方法仪器设
备简单，操作简单快速，样品几乎无干扰，具有较高的灵敏度，对铅的检出限为
1.54×10-9mol/L，对氡的检出限1.07×104Bq·h/m3。本法避免了现场进行氡辐
射剂量测量的放射性危害，开拓了核酸适配体对无机物、气体和放射性物质的生物
分析新领域。
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