2024年2月21日发(作者：恽高超)

口腔颌面外科杂志2021年4月第31卷第2期Journal of Oral and Maxillofacial Surgery Vol.31 No.2 April,2021•

8卜NLRP3和Caspase-1在颞下颌关节骨关节炎滑膜中的表达李艳艳，冯亚平，柯金，龙星(武汉大学口腔医院口腔颌面外科，湖北武汉430079#[摘要]目的：探究 &LRP3

炎症小体（&ACHT, and PYD dom/ins-cont/ining protein 3 infl/mm/some)和腕天蛋白酶-1 (cysteinyl aspartate specific proteinase，Caspase-1)在颗下颌关节骨关节炎（temporomandibular joint osteoarthritis，

TMJOA)患者滑膜细胞中的表达。方法：分离人颞下颌关节滑膜组织并进行滑膜细胞培养，另取3例髁突肥大患者的

滑膜组织作为对照组。实时定量聚合酶链式反应(real-time quantitative polymerase chain reaction，（T-PC()法检测滑膜

细胞中&L(P3和C/sp/se-1的基因表达，Westernblot检测滑膜细胞中&L(P3和C/sp/se-1的表达。结果：TMJOA患

者滑膜细胞中的&L(P3和C/sp/se-1的表达显著高于对照组(！<0.05)。结论:&L(P3和C/sp/se-1在TMJOA滑膜细

胞中高表达，说明它们与TMJOA发生发展密切相关，这将有助于进

[关键词]明其分子机制。颞下颌关节骨关节炎'滑膜；&L(P3炎性小体'半胱氨酸蛋白酶-1

[中图分类号](782 [文献标志码]A DOI： 10.3969/.1005-4979.2021.02.003Expression of NLRP3 and Caspase-1 in synovium of temporomandibular joint osteoarthritisLI

Yanyan，FENG

Yoping，KE

Jin，LONG

Xing

(Department

of

Oral

and

Maxillofacial

Surgery，Hospital

of

Stomatology，Wuhan

University，Wuhan 430079，Hubei

Province，China)[Abstract] Objective:

To investigate the expression of NLRP3 (NACHT, LRR and PYD domains-containing protein 3 in-

fl/mm/some) and C/sp/se-1 in the synovium of temporomandibular joint osteoarthritis (TMJOA).

Methods：

Synovial tis­sues were collected from TMJ of patients and synovial cells were cultured. Synovial tissues of three patients with condy­lar hypertrophy were taken as control group. Real-time PCR was used to examine the gene expression of NLRP3 and C/s-

p/se-1 in synovial cells. The protein expressions of NLRP3 and C/sp/se-1 in synovial cells were detected by Western blot.

Results：

The expressions of NLRP3 and Caspase-1 in the synovial cells of TMJOA were significantly increased than the

control group (P<0.05).

Conclusion：

NLRP3 and C/sp/se-1 were increased in the synovial cells of TMJOA and closely re­lated to the occurrence and development of TMJOA, which will help to further clarify its molecular mechanism.[Keywords]

temporomandibular joint osteoarthritis; synovium; NLRP3 infl/mm/some; C/sp/se-1颞下颌关节骨关节炎（temporomandibular joint

osteoarthritis，TMJOA)是一种以关节软骨破坏、软骨

下骨退行性

性 ，

和滑膜炎症为

关节区疼痛、口 ， 面的：相关_。因此，研究TMJOA患者滑膜炎性分子表达

的 为 &NLRP3 炎症小体(NACHT，LRR and PYD do-

m/ins-cont/ining protein 3 infl/mm/some)是 NOD 样

受体（nucleotide-binding oligomerization dom/in-like

receptors，NLRs)家族的

NLRP3炎症小体 NLRP3、

，存在于细胞质中。关 蛋白形， 患者的 的研究表明，滑膜炎与关节软骨 软骨下骨的 行性收稿日期：2020-05-14

修回日期：2020-06-18基金项目： 科学基（81870789)作者简介： （1995—)，， 人，硕士研究生.E-m/il:*********************.cn通信作者： ， 医师.E-m/il:*************.cn;龙星，主任医师.E-m/il: ****************.cn(apoptosis-associated speck-like protein，ASC)和胱天

蛋白 -1( cysteinyl aspartate specific proteinase，Cas-

p/se-1)体3种蛋白组成。NLRP3

，与ASC 蛋白

，构象，

•

82 !口腔颌面外科杂志2021年4月第31卷第2期Journal of Oral and Maxillofacial Surgery Vol.31 No.2 April,2021招募pro-Caspase-l通过胱天蛋白募集域连接ASC

和 pro-Caspase-1,产生活化的 Caspase-1 plO 和

Caspase-1 p20,随后将 pro-IL-1!和 pro-IL-18 C 切

为活化和分泌形式的IL-1!和IL-18,细胞因子启动

或者扩增不同的下游信号通路，导致炎症的级联放

大[4]。NLRP3炎症小体的活化在许多疾病，如IgA肾

病和类风湿关节炎（rheumatoid arthritis，RS)等的病

理发展中发挥着重要的作用[5-6]。然而，目 不

楚在TMJ0A滑膜炎中是否涉及NLRP3/Caspase-1/

IL-1!轴的活化。因， 将对颞下颌关节滑膜细胞中的NLRP3和Caspase-1的表达进行研究，

以期进一步阐明TMJ0A的分子 。1材料和方法1.1材料1.1.1取材在患者知情同意情况下采集 【样本，研究 大腔 。8例根表 & 腔检查和 为TMJ0A， 要进行关节 者的 ，中 ，3 ，女性，5例， 3 大患者的作为 ，者年龄均在20~55岁。1.1.2主要试剂憐酸盐缓冲t佼（phosphate buffer

saline，PBS )&局糖培养基（Dulb ecco's modified eagle

medium，DMEM)&胎牛血清（Hyclone公司，美国）；

RIPA(radio immunoprecipitation assay)裂解液、十一-

- (sodium dodecylsulfate polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE)

蛋 ( Biosharp ， 中 )；盒、Trizol试剂(TaKaRa公司，日本）;兔抗NLRP3单

克隆抗体、 Caspase-1单克隆体和羊抗兔二抗(Abcam ， );鼠抗肌球蛋白（！-actin)多克隆体和羊抗鼠 （ 三鹰生物技术在限司，中国）；增强发光法（enhanced chemilumi-

nescenece，ECL)显影t佼(上海碧3天公司，中国）。1.2方法1.2.1滑膜细胞的培养根据蔡恒星等[7]的经验方

法进行 细胞分离和 ，注无菌操作。具体步骤：用含100 U/mL链霉素和100 mg/L青霉素的

无菌PBS冲洗取材组织，直至溶液澄。将剪成

1 mmx2 mm大小的 块，置于25 mL培养瓶的

瓶底，使其分散匀。用含有20% 的DMEM培养基润湿组织块，于37 $、95%〇2和5[C0-培养箱中培养。定期观察换液，待细胞生长融

合至密度达80[左右进行传代。1.2.2 实时定量聚合酶链式反应（real-time quanti­tative polymerase chain reaction，RT-PCR) 法测定滑膜

组织中NLRP3和Caspase-1 mRNA的表达取培养

3代以内的滑膜细胞，PBS冲洗3遍后加人Trizol

，置于摇 5 min，将提的总RNA转移到

无酶微型离心管中 测纯度，按上的说明合成模板cDNA，使用SYBR Premix Ex Taq

进行RT-PCR。引物以！-actin为内参，引物序列见

表1。反应条件:①95 $ 30 s;②PCR反应，G0T0:39

(40 Cycles )，60 $ 30 s;③ ，每置3 行 ， 2-^法 细胞的NLRP3和Caspase-1基因表达量。表1 RT-PC!基因引物序列表Table 1 Primer sequences used for RT-PCR因引物序列NLRP3上游引物

5'-GAGTTCTTCGCTGCTATGT-3'下游引物

5'-ACCTTCACGTCTCGGTTC-3'Caspase-1上游引物

5'-CAGGAGGGAATATGTGGG-3"下游引物5'-CACCTTGGGCTTGTCTTT-31.2.3 Western blot 检测滑膜细胞中 NLRP3、Cas-

pase-1蛋白表达 3代以内的 细，PBS洗涤3次，吸干，加人RIPA裂解液反应，迅速

刮下细 移到冷离心管中，以操作在 ：进行。在4$下14 000x#离心10 min收集蛋白，检

测蛋 度。 加人 SDS-PAGE 蛋 ，匀，在95$加热装置上变性蛋。洗净

干 板后 直 ， 放置 ， 待 后，加入20 %g的蛋 ，然后 分离蛋白。将蛋 中 移 到 (poly-vinylidenefluoride，PVDF)膜上。根据 NLRP3、Caspase-1 和

!-actin的蛋白分子量将PVDF膜切成条，置于洗

的 子 ， TBST 洗 5 min。 加人

摇动 60 min， TBST 洗 3 次， 次 5 min。加人 的 ， 分 NLRP3单克隆抗体（1:1 000)、兔抗Caspase-1单克隆抗体

(1:100)及鼠！-actin 多克隆体（1:500)，4$中

摇动过夜后，TBST漂洗3次，每次5 min。加人

的 ， 摇动 60 min， TBST 洗 3 次，次 5 min。 加人增强发光显 ECL 后在

中成像，用Image J软件分析条带上的NLRP3和

Caspase-1蛋白的 表达量。

口腔颌面外科杂志2021年4月第31卷第2期Journal of Oral and Maxillofacial Surgery Vol.31 No.2 April,2021•

83 •1.3统计学分析采用SPSS 20.0软件进行统计学分析。数据采

用均数±标准差（！±")表示，用独立样本#检验比较

两组的差异，$<0.05为差异有统计学意义。2结果2.1 RT-PCR检测结果RT-PCR的结果见图1。按照21#法分析，NL-

RP3和Caspase-1 mRNA在TMJOA滑膜细胞中的表达升高，差异有统计学意义($<0.05 )。AVB

N.:YHM日

泠爷tf4曰

3炤H1CO撇l

N.i

2

努:

D

1-,

o杰®A:NLR3mRNA 表达水平；B:Caspase-l mRNA 表达水平。[表A $<

0.05,与对照组比较。图1

RT-PCR显示NLRP3和Caspase-1基因在颞下颌关节滑膜细

胞中的表达量Figure 1 The gene expression level of NLRP3 and Caspase-1 in

TMJ synovial cells by RT-PCR2.2 Western blot 检测结果Western blot结果表明，TMJOA滑膜细胞中

NLRP3和Caspase-l的蛋白表达水平显著e于对照

组，且差异有统计学意义($<0.05，图2)。A B对照组TMJOA组A:用 Westem blot 检测 NLRP3 和 Caspase-l 蛋白表达水平；B&NLRP3

蛋白表达水平；C:Caspase-l蛋白表达水平。[表示$<0.05,与对照

组比较。图2

Western

blot检测颞下颌关节滑膜细胞中NLRP3和

Caspase-1的蛋白表达情况Figure 2 The protein expression of NLRP3 and Caspase-1 in

TMJ synovial cells by Western blot3讨论多项研究认为滑膜炎出现在TMJOA的各个时

期，并且是导致 和下颌 的.原B8D。滑膜炎 列促炎细胞子，其中IL-1!和TNF-a是研究最为广泛的因子，在 炎(os­teoarthritis ，OA) 的滑膜 、滑液、 软和软 '骨中均有升高，导致软骨分 气NLRP3/Caspase-1炎症复合体通路在固有免疫

防御反应中 的作用， 研究主要集中于细胞。 验分 和蛋白2个 明在 TMJOA 的滑膜细胞中 在 NLRP3 炎

和Caspase-1，且两者的表达 照组相比显著升高。为进 研究TMJOA滑膜细胞中的NLRP3/

Caspase-1炎 的激活和 。NLRP3 炎 的 和 2 个连续步骤：第一'步是 Toll样 （Toll-like re­ceptors ，TLRs) 细胞子 分子式(pathogen-associated molecular patterns ,PAMPs)

和宿主源性的危险fg 号(danger-associated molecular

patterns，DAMPs )，激活NF- #B信号通路，启动

NLRP3炎 和IL-1!等前体蛋白的 ；第二步是NLRP3的 NLRP3并活化Caspase-1，导致IL-1!和IL-18的加工和释

。 时，IL-1! 用于NF-#B ，促进NLRP3炎 的活化， 导致[10]。于NLRP3炎性小体的激活，普遍认同

的 的 、钾离子外排流出、溶酶体膜的破坏导致组织蛋白酶 和细胞器的空间定位[11]。研究认为，巨噬细胞的胞外腺嘌呤核

苷三憐酸（adenosine triphosphate，ATP)激活细胞膜

上的ATP-门控离子通道P2X7嘌呤能 ，迅速打开K+通道外排K+，招募pannewin-1半道蛋白形成

膜孔，使细胞外的NLRP3 进人细胞质内，直接 NLRP3[12-13]，进而活化Caspase-1，释放成熟的促炎因子IL-1!， IL-1!可以刺激滑膜细胞释放前列腺素E2(prostaglandin E2，PGE2)快速促炎，同

时抑制软骨细胞增殖，降低蛋白多糖和胶原的

成，导致滑膜炎症和软的破坏[1Z]。以往研究得知颞

下颌 滑膜细胞 A型细胞和B型细胞，A型细胞为巨噬细胞样细胞，B型细胞为成纤维样细

•

84 !口腔颌面外科杂志2021年4月第31卷第2期Journal of Oral and Maxillofacial Surgery Vol.31 No.2 April,2021胞[15$。因此我们猜测，这种NLRP3激活方式可能存

在于TMJ0A的滑膜中并导致滑膜炎症。另外，研究者们发现NLRP3/Caspase-1介导炎

症反应的同时介导一种新型细胞程序性坏死一细

胞焦亡(pyroptosis)[16]。胞质内激活的NLRP3炎症体

可以活化Caspase-1、活性形式的Caspase-1切割其

底物gasdermin D(GSDMD)的N端蛋白，释放的N

端蛋白结合细胞膜并寡聚形成孔道状结构，使细胞

内容物释放，引起细胞离子浓 细胞渗，发细胞焦亡!17$。细胞焦亡一方面对先

至关重要，帮助机体应对病原体 ，另一

方面炎性体 活化 关。近研究 细胞焦亡 、 滑膜化相关，形成焦亡-性炎性反应-

纤维化 程。研究发现膝骨关节炎(knee osteoarthritis，K0A)的滑膜成纤维细胞和滑膜

细胞均可在K0A中发细胞焦亡， 炎性

因子， 滑膜成 细胞 GSDMD ，可 成 志物的 ， 成 滑膜细胞焦亡介导滑膜炎症反应并 化[18$。本实验发现TMJ0A患者的滑膜细胞中，NLRP3 Cas-pase-1的表达水平显者升局，而NLRP3和Caspase-1

在细胞焦亡相关 中发重要的作用，这；提示细胞焦亡很可能 TMJ0A的发、发展，这一的研究 。参考文献：[1] Wang XD, Zhang JN, Gan YH, et al. Current understand­ing of pathogenesis and treatment of TMJ osteoarthritis[J].

J Dent Res, 2015, 94(5)： 666-673.[2] , , ,.

颌关节骨关节炎滑膜成纤维细胞中血管生成及润滑相关因子的表达[J].

口腔

医学研究，2018,34(3):270-273.[3] Gonzalez-Garcia R, Rodriguez-Campo FJ, Monje F, et al.

Influence of the upper joint surface and synovial lining in

the outcome of chronic closed lock of the temporo­mandibular joint treated with arthroscopy[J]. J 0ral Max-

illofac Surg, 2010, 68(1)： 35-42.[4] Place DE, Kanneganti TD. Recent advances in inflamma-

some biology[J]. Curr 0pin Immunol, 2018, 50: 32-38.[5] Tsai YL, Hua KF, Chen A, et al. NLRP3 inflammasome:Pathogenic role and potential therapeutic target for IgA

nephropathy[J]. Sci Rep, 2017, 7: 41123.[6] Shen HH, Yang YX, Meng X, et al. NLRP3: A promising

therapeutic target for autoimmune diseases[J]. AutoimmunRev, 2018, 17(7): 694-702.[7] ,

颖杰，龙星.透明质酸对体外培养颞下颌关滑膜成

细胞粘附与增殖性能的影响[J]. 口腔 ：研究, 2012, 28(6): 513-515,518.[8] Wenham CYJ, McDermott M, Conaghan PG. Biological

therapies in osteoarthritis[J]. Curr Pharm Des, 2015, 21(17):

2206-2215.[9] Mathiessen A, Conaghan PG. Synovitis in osteoarthritis:

Current understanding with therapeutic implications [J].

Arthritis Res Ther, 2017, 19(1): 18.[10] Afonina IS, Zhong ZY, Karin M, et al. Limiting inflamma-

tion-the negative regulation of NF-kB and the NLRP3 in-

flammasome[J]. Nat Immunol, 2017, 18(8): 861-869.[11] Jo EK, Kim JK, Shin DM, et al. Molecular mechanisms

regulating NLRP3 inflammasome activation[J]. Cell Mol

Immunol, 2016, 13(2): 148-159.[12] Kanneganti TD, Lamkanfi M, Kim YG, et al. Pannexin-1-

mediated recognition of bacterial molecules activates the

cryopyrin inflammasome independent of Toll-like receptor

signaling[J]. Immunity, 2007, 26(4): 433-443.[13] Gicquel T, Robert S, Loyer P, et al. ILr1" production is

dependent on the activation of purinergic receptors and

NLRP3 pathway in human macrophages [J]. FASEB J,

2015, 29(10): 4162-4173.[14] Yamaguchi A, Tojyo I, Yoshida H, et al. Role of hypoxia

and interleukin-1beta in gene expressions of matrix metal-

loproteinases in temporomandibular joint disc cells [J].

Arch 0ral Biol, 2005, 50(1): 81-87.[15] Dijkgraaf LC, de Bont LG, Boering G, et al. Structure of

the normal synovial membrane of the temporomandibular

joint: A review of the literature[J]. J 0ral Maxillofac Surg,

1996, 54(3): 332-338.[16] Lim Y, Kumar S. A single cut to pyroptosis[J]. 0ncotarget,

2015, 6(35): 36926-36927.[17] Shi J, Zhao Y, Wang K, et al. Cleavage of GSDMD by in­flammatory caspases determines pyroptotic cell death [J].Nature, 2015, 526(7575): 660-665.[18]

李晓辰.基于NLRP3/Caspase-1炎症小体对“易层”贴敷

疗法外治膝骨关节炎中滑膜炎症的机制研究[D].南京:

南京中医药大学，2018.

2024年2月21日发(作者：恽高超)

口腔颌面外科杂志2021年4月第31卷第2期Journal of Oral and Maxillofacial Surgery Vol.31 No.2 April,2021•

8卜NLRP3和Caspase-1在颞下颌关节骨关节炎滑膜中的表达李艳艳，冯亚平，柯金，龙星(武汉大学口腔医院口腔颌面外科，湖北武汉430079#[摘要]目的：探究 &LRP3

炎症小体（&ACHT, and PYD dom/ins-cont/ining protein 3 infl/mm/some)和腕天蛋白酶-1 (cysteinyl aspartate specific proteinase，Caspase-1)在颗下颌关节骨关节炎（temporomandibular joint osteoarthritis，

TMJOA)患者滑膜细胞中的表达。方法：分离人颞下颌关节滑膜组织并进行滑膜细胞培养，另取3例髁突肥大患者的

滑膜组织作为对照组。实时定量聚合酶链式反应(real-time quantitative polymerase chain reaction，（T-PC()法检测滑膜

细胞中&L(P3和C/sp/se-1的基因表达，Westernblot检测滑膜细胞中&L(P3和C/sp/se-1的表达。结果：TMJOA患

者滑膜细胞中的&L(P3和C/sp/se-1的表达显著高于对照组(！<0.05)。结论:&L(P3和C/sp/se-1在TMJOA滑膜细

胞中高表达，说明它们与TMJOA发生发展密切相关，这将有助于进

[关键词]明其分子机制。颞下颌关节骨关节炎'滑膜；&L(P3炎性小体'半胱氨酸蛋白酶-1

[中图分类号](782 [文献标志码]A DOI： 10.3969/.1005-4979.2021.02.003Expression of NLRP3 and Caspase-1 in synovium of temporomandibular joint osteoarthritisLI

Yanyan，FENG

Yoping，KE

Jin，LONG

Xing

(Department

of

Oral

and

Maxillofacial

Surgery，Hospital

of

Stomatology，Wuhan

University，Wuhan 430079，Hubei

Province，China)[Abstract] Objective:

To investigate the expression of NLRP3 (NACHT, LRR and PYD domains-containing protein 3 in-

fl/mm/some) and C/sp/se-1 in the synovium of temporomandibular joint osteoarthritis (TMJOA).

Methods：

Synovial tis­sues were collected from TMJ of patients and synovial cells were cultured. Synovial tissues of three patients with condy­lar hypertrophy were taken as control group. Real-time PCR was used to examine the gene expression of NLRP3 and C/s-

p/se-1 in synovial cells. The protein expressions of NLRP3 and C/sp/se-1 in synovial cells were detected by Western blot.

Results：

The expressions of NLRP3 and Caspase-1 in the synovial cells of TMJOA were significantly increased than the

control group (P<0.05).

Conclusion：

NLRP3 and C/sp/se-1 were increased in the synovial cells of TMJOA and closely re­lated to the occurrence and development of TMJOA, which will help to further clarify its molecular mechanism.[Keywords]

temporomandibular joint osteoarthritis; synovium; NLRP3 infl/mm/some; C/sp/se-1颞下颌关节骨关节炎（temporomandibular joint

osteoarthritis，TMJOA)是一种以关节软骨破坏、软骨

下骨退行性

性 ，

和滑膜炎症为

关节区疼痛、口 ， 面的：相关_。因此，研究TMJOA患者滑膜炎性分子表达

的 为 &NLRP3 炎症小体(NACHT，LRR and PYD do-

m/ins-cont/ining protein 3 infl/mm/some)是 NOD 样

受体（nucleotide-binding oligomerization dom/in-like

receptors，NLRs)家族的

NLRP3炎症小体 NLRP3、

，存在于细胞质中。关 蛋白形， 患者的 的研究表明，滑膜炎与关节软骨 软骨下骨的 行性收稿日期：2020-05-14

修回日期：2020-06-18基金项目： 科学基（81870789)作者简介： （1995—)，， 人，硕士研究生.E-m/il:*********************.cn通信作者： ， 医师.E-m/il:*************.cn;龙星，主任医师.E-m/il: ****************.cn(apoptosis-associated speck-like protein，ASC)和胱天

蛋白 -1( cysteinyl aspartate specific proteinase，Cas-

p/se-1)体3种蛋白组成。NLRP3

，与ASC 蛋白

，构象，

•

82 !口腔颌面外科杂志2021年4月第31卷第2期Journal of Oral and Maxillofacial Surgery Vol.31 No.2 April,2021招募pro-Caspase-l通过胱天蛋白募集域连接ASC

和 pro-Caspase-1,产生活化的 Caspase-1 plO 和

Caspase-1 p20,随后将 pro-IL-1!和 pro-IL-18 C 切

为活化和分泌形式的IL-1!和IL-18,细胞因子启动

或者扩增不同的下游信号通路，导致炎症的级联放

大[4]。NLRP3炎症小体的活化在许多疾病，如IgA肾

病和类风湿关节炎（rheumatoid arthritis，RS)等的病

理发展中发挥着重要的作用[5-6]。然而，目 不

楚在TMJ0A滑膜炎中是否涉及NLRP3/Caspase-1/

IL-1!轴的活化。因， 将对颞下颌关节滑膜细胞中的NLRP3和Caspase-1的表达进行研究，

以期进一步阐明TMJ0A的分子 。1材料和方法1.1材料1.1.1取材在患者知情同意情况下采集 【样本，研究 大腔 。8例根表 & 腔检查和 为TMJ0A， 要进行关节 者的 ，中 ，3 ，女性，5例， 3 大患者的作为 ，者年龄均在20~55岁。1.1.2主要试剂憐酸盐缓冲t佼（phosphate buffer

saline，PBS )&局糖培养基（Dulb ecco's modified eagle

medium，DMEM)&胎牛血清（Hyclone公司，美国）；

RIPA(radio immunoprecipitation assay)裂解液、十一-

- (sodium dodecylsulfate polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE)

蛋 ( Biosharp ， 中 )；盒、Trizol试剂(TaKaRa公司，日本）;兔抗NLRP3单

克隆抗体、 Caspase-1单克隆体和羊抗兔二抗(Abcam ， );鼠抗肌球蛋白（！-actin)多克隆体和羊抗鼠 （ 三鹰生物技术在限司，中国）；增强发光法（enhanced chemilumi-

nescenece，ECL)显影t佼(上海碧3天公司，中国）。1.2方法1.2.1滑膜细胞的培养根据蔡恒星等[7]的经验方

法进行 细胞分离和 ，注无菌操作。具体步骤：用含100 U/mL链霉素和100 mg/L青霉素的

无菌PBS冲洗取材组织，直至溶液澄。将剪成

1 mmx2 mm大小的 块，置于25 mL培养瓶的

瓶底，使其分散匀。用含有20% 的DMEM培养基润湿组织块，于37 $、95%〇2和5[C0-培养箱中培养。定期观察换液，待细胞生长融

合至密度达80[左右进行传代。1.2.2 实时定量聚合酶链式反应（real-time quanti­tative polymerase chain reaction，RT-PCR) 法测定滑膜

组织中NLRP3和Caspase-1 mRNA的表达取培养

3代以内的滑膜细胞，PBS冲洗3遍后加人Trizol

，置于摇 5 min，将提的总RNA转移到

无酶微型离心管中 测纯度，按上的说明合成模板cDNA，使用SYBR Premix Ex Taq

进行RT-PCR。引物以！-actin为内参，引物序列见

表1。反应条件:①95 $ 30 s;②PCR反应，G0T0:39

(40 Cycles )，60 $ 30 s;③ ，每置3 行 ， 2-^法 细胞的NLRP3和Caspase-1基因表达量。表1 RT-PC!基因引物序列表Table 1 Primer sequences used for RT-PCR因引物序列NLRP3上游引物

5'-GAGTTCTTCGCTGCTATGT-3'下游引物

5'-ACCTTCACGTCTCGGTTC-3'Caspase-1上游引物

5'-CAGGAGGGAATATGTGGG-3"下游引物5'-CACCTTGGGCTTGTCTTT-31.2.3 Western blot 检测滑膜细胞中 NLRP3、Cas-

pase-1蛋白表达 3代以内的 细，PBS洗涤3次，吸干，加人RIPA裂解液反应，迅速

刮下细 移到冷离心管中，以操作在 ：进行。在4$下14 000x#离心10 min收集蛋白，检

测蛋 度。 加人 SDS-PAGE 蛋 ，匀，在95$加热装置上变性蛋。洗净

干 板后 直 ， 放置 ， 待 后，加入20 %g的蛋 ，然后 分离蛋白。将蛋 中 移 到 (poly-vinylidenefluoride，PVDF)膜上。根据 NLRP3、Caspase-1 和

!-actin的蛋白分子量将PVDF膜切成条，置于洗

的 子 ， TBST 洗 5 min。 加人

摇动 60 min， TBST 洗 3 次， 次 5 min。加人 的 ， 分 NLRP3单克隆抗体（1:1 000)、兔抗Caspase-1单克隆抗体

(1:100)及鼠！-actin 多克隆体（1:500)，4$中

摇动过夜后，TBST漂洗3次，每次5 min。加人

的 ， 摇动 60 min， TBST 洗 3 次，次 5 min。 加人增强发光显 ECL 后在

中成像，用Image J软件分析条带上的NLRP3和

Caspase-1蛋白的 表达量。

口腔颌面外科杂志2021年4月第31卷第2期Journal of Oral and Maxillofacial Surgery Vol.31 No.2 April,2021•

83 •1.3统计学分析采用SPSS 20.0软件进行统计学分析。数据采

用均数±标准差（！±")表示，用独立样本#检验比较

两组的差异，$<0.05为差异有统计学意义。2结果2.1 RT-PCR检测结果RT-PCR的结果见图1。按照21#法分析，NL-

RP3和Caspase-1 mRNA在TMJOA滑膜细胞中的表达升高，差异有统计学意义($<0.05 )。AVB

N.:YHM日

泠爷tf4曰

3炤H1CO撇l

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2

努:

D

1-,

o杰®A:NLR3mRNA 表达水平；B:Caspase-l mRNA 表达水平。[表A $<

0.05,与对照组比较。图1

RT-PCR显示NLRP3和Caspase-1基因在颞下颌关节滑膜细

胞中的表达量Figure 1 The gene expression level of NLRP3 and Caspase-1 in

TMJ synovial cells by RT-PCR2.2 Western blot 检测结果Western blot结果表明，TMJOA滑膜细胞中

NLRP3和Caspase-l的蛋白表达水平显著e于对照

组，且差异有统计学意义($<0.05，图2)。A B对照组TMJOA组A:用 Westem blot 检测 NLRP3 和 Caspase-l 蛋白表达水平；B&NLRP3

蛋白表达水平；C:Caspase-l蛋白表达水平。[表示$<0.05,与对照

组比较。图2

Western

blot检测颞下颌关节滑膜细胞中NLRP3和

Caspase-1的蛋白表达情况Figure 2 The protein expression of NLRP3 and Caspase-1 in

TMJ synovial cells by Western blot3讨论多项研究认为滑膜炎出现在TMJOA的各个时

期，并且是导致 和下颌 的.原B8D。滑膜炎 列促炎细胞子，其中IL-1!和TNF-a是研究最为广泛的因子，在 炎(os­teoarthritis ，OA) 的滑膜 、滑液、 软和软 '骨中均有升高，导致软骨分 气NLRP3/Caspase-1炎症复合体通路在固有免疫

防御反应中 的作用， 研究主要集中于细胞。 验分 和蛋白2个 明在 TMJOA 的滑膜细胞中 在 NLRP3 炎

和Caspase-1，且两者的表达 照组相比显著升高。为进 研究TMJOA滑膜细胞中的NLRP3/

Caspase-1炎 的激活和 。NLRP3 炎 的 和 2 个连续步骤：第一'步是 Toll样 （Toll-like re­ceptors ，TLRs) 细胞子 分子式(pathogen-associated molecular patterns ,PAMPs)

和宿主源性的危险fg 号(danger-associated molecular

patterns，DAMPs )，激活NF- #B信号通路，启动

NLRP3炎 和IL-1!等前体蛋白的 ；第二步是NLRP3的 NLRP3并活化Caspase-1，导致IL-1!和IL-18的加工和释

。 时，IL-1! 用于NF-#B ，促进NLRP3炎 的活化， 导致[10]。于NLRP3炎性小体的激活，普遍认同

的 的 、钾离子外排流出、溶酶体膜的破坏导致组织蛋白酶 和细胞器的空间定位[11]。研究认为，巨噬细胞的胞外腺嘌呤核

苷三憐酸（adenosine triphosphate，ATP)激活细胞膜

上的ATP-门控离子通道P2X7嘌呤能 ，迅速打开K+通道外排K+，招募pannewin-1半道蛋白形成

膜孔，使细胞外的NLRP3 进人细胞质内，直接 NLRP3[12-13]，进而活化Caspase-1，释放成熟的促炎因子IL-1!， IL-1!可以刺激滑膜细胞释放前列腺素E2(prostaglandin E2，PGE2)快速促炎，同

时抑制软骨细胞增殖，降低蛋白多糖和胶原的

成，导致滑膜炎症和软的破坏[1Z]。以往研究得知颞

下颌 滑膜细胞 A型细胞和B型细胞，A型细胞为巨噬细胞样细胞，B型细胞为成纤维样细

•

84 !口腔颌面外科杂志2021年4月第31卷第2期Journal of Oral and Maxillofacial Surgery Vol.31 No.2 April,2021胞[15$。因此我们猜测，这种NLRP3激活方式可能存

在于TMJ0A的滑膜中并导致滑膜炎症。另外，研究者们发现NLRP3/Caspase-1介导炎

症反应的同时介导一种新型细胞程序性坏死一细

胞焦亡(pyroptosis)[16]。胞质内激活的NLRP3炎症体

可以活化Caspase-1、活性形式的Caspase-1切割其

底物gasdermin D(GSDMD)的N端蛋白，释放的N

端蛋白结合细胞膜并寡聚形成孔道状结构，使细胞

内容物释放，引起细胞离子浓 细胞渗，发细胞焦亡!17$。细胞焦亡一方面对先

至关重要，帮助机体应对病原体 ，另一

方面炎性体 活化 关。近研究 细胞焦亡 、 滑膜化相关，形成焦亡-性炎性反应-

纤维化 程。研究发现膝骨关节炎(knee osteoarthritis，K0A)的滑膜成纤维细胞和滑膜

细胞均可在K0A中发细胞焦亡， 炎性

因子， 滑膜成 细胞 GSDMD ，可 成 志物的 ， 成 滑膜细胞焦亡介导滑膜炎症反应并 化[18$。本实验发现TMJ0A患者的滑膜细胞中，NLRP3 Cas-pase-1的表达水平显者升局，而NLRP3和Caspase-1

在细胞焦亡相关 中发重要的作用，这；提示细胞焦亡很可能 TMJ0A的发、发展，这一的研究 。参考文献：[1] Wang XD, Zhang JN, Gan YH, et al. Current understand­ing of pathogenesis and treatment of TMJ osteoarthritis[J].

J Dent Res, 2015, 94(5)： 666-673.[2] , , ,.

颌关节骨关节炎滑膜成纤维细胞中血管生成及润滑相关因子的表达[J].

口腔

医学研究，2018,34(3):270-273.[3] Gonzalez-Garcia R, Rodriguez-Campo FJ, Monje F, et al.

Influence of the upper joint surface and synovial lining in

the outcome of chronic closed lock of the temporo­mandibular joint treated with arthroscopy[J]. J 0ral Max-

illofac Surg, 2010, 68(1)： 35-42.[4] Place DE, Kanneganti TD. Recent advances in inflamma-

some biology[J]. Curr 0pin Immunol, 2018, 50: 32-38.[5] Tsai YL, Hua KF, Chen A, et al. NLRP3 inflammasome:Pathogenic role and potential therapeutic target for IgA

nephropathy[J]. Sci Rep, 2017, 7: 41123.[6] Shen HH, Yang YX, Meng X, et al. NLRP3: A promising

therapeutic target for autoimmune diseases[J]. AutoimmunRev, 2018, 17(7): 694-702.[7] ,

颖杰，龙星.透明质酸对体外培养颞下颌关滑膜成

细胞粘附与增殖性能的影响[J]. 口腔 ：研究, 2012, 28(6): 513-515,518.[8] Wenham CYJ, McDermott M, Conaghan PG. Biological

therapies in osteoarthritis[J]. Curr Pharm Des, 2015, 21(17):

2206-2215.[9] Mathiessen A, Conaghan PG. Synovitis in osteoarthritis:

Current understanding with therapeutic implications [J].

Arthritis Res Ther, 2017, 19(1): 18.[10] Afonina IS, Zhong ZY, Karin M, et al. Limiting inflamma-

tion-the negative regulation of NF-kB and the NLRP3 in-

flammasome[J]. Nat Immunol, 2017, 18(8): 861-869.[11] Jo EK, Kim JK, Shin DM, et al. Molecular mechanisms

regulating NLRP3 inflammasome activation[J]. Cell Mol

Immunol, 2016, 13(2): 148-159.[12] Kanneganti TD, Lamkanfi M, Kim YG, et al. Pannexin-1-

mediated recognition of bacterial molecules activates the

cryopyrin inflammasome independent of Toll-like receptor

signaling[J]. Immunity, 2007, 26(4): 433-443.[13] Gicquel T, Robert S, Loyer P, et al. ILr1" production is

dependent on the activation of purinergic receptors and

NLRP3 pathway in human macrophages [J]. FASEB J,

2015, 29(10): 4162-4173.[14] Yamaguchi A, Tojyo I, Yoshida H, et al. Role of hypoxia

and interleukin-1beta in gene expressions of matrix metal-

loproteinases in temporomandibular joint disc cells [J].

Arch 0ral Biol, 2005, 50(1): 81-87.[15] Dijkgraaf LC, de Bont LG, Boering G, et al. Structure of

the normal synovial membrane of the temporomandibular

joint: A review of the literature[J]. J 0ral Maxillofac Surg,

1996, 54(3): 332-338.[16] Lim Y, Kumar S. A single cut to pyroptosis[J]. 0ncotarget,

2015, 6(35): 36926-36927.[17] Shi J, Zhao Y, Wang K, et al. Cleavage of GSDMD by in­flammatory caspases determines pyroptotic cell death [J].Nature, 2015, 526(7575): 660-665.[18]

李晓辰.基于NLRP3/Caspase-1炎症小体对“易层”贴敷

疗法外治膝骨关节炎中滑膜炎症的机制研究[D].南京:

南京中医药大学，2018.