小分子水凝胶对骨髓间充质干细胞增殖、凋亡及向心肌细胞分化的影响

2024年3月7日发(作者：佛艳卉)

陈国钦;黎锦亮;宋明才;区彩文

【摘要】背景:前期研究研制的一种短肽小分子水凝胶,在改善局部微环境、携带生物活性物质及干预干细胞信号转导途径等方面较其他水凝胶有着更明显的优势.目的:探讨小分子水凝胶对骨髓间充质干细胞增殖、凋亡、向心肌细胞分化等的影响.方法:①取第9代SD大鼠骨髓间充质干细胞,分2组培养,实验组加入小分子水凝胶溶液,对照组常规培养,检测培养7 d内的细胞增殖与凋亡;将两组细胞分别置于缺氧环境中孵育12 h,检测细胞凋亡及凋亡蛋白Bcl-2、Bax、Caspase-3的表达;②取第9代骨髓间充质干细胞,分4组干预:5-氮杂胞苷组加入5-氮杂胞苷,凝胶组加入小分子水凝胶,实验组加入小分子水凝胶与5-氮杂胞苷,正常对照组加入L-DMEM基本培养基,诱导4周后,检测cTnT、desmin及Cx-43蛋白的表达,以及心肌早期转录因子NKX2.5、GATA-4的表达.结果与结论:①与对照组相比,实验组骨髓间充质干细胞有更好的增殖能力及更低的凋亡数量;在缺氧环境中,实验组和对照组存活的细胞均有减少,实验组的凋亡或坏死细胞数目明显少于对照组(P<0.05);实验组细胞Bcl-2蛋白表达高于对照组(P<0.01),Bax、Caspase-3蛋白表达低于对照组(P<0.01);②5-氮杂胞苷组和实验组各样本中均出现明确的心肌早期分化基因,实验组NKx2.5和GATA-4 mRNA表达高于5-氮杂胞苷组(P<0.05).正常对照组cTnT表达阴性,desmin及Cx-43蛋白表达很弱;实验组cTnT、desmin及Cx-43蛋白表达强于5-氮杂胞苷组、凝胶组,凝胶组cTnT、desmin及Cx-43蛋白表达与5-氮杂胞苷组相似;③结果表明,小分子水凝胶作为培养基质,更有利于骨髓间充质干细胞的增殖,减少其凋亡并促进其向心肌细胞分化.%BACKGROUND:A short-peptide small molecule hydrogel (SMH) developed in the previous study

has more obvious advantages than other hydrogels to improve local

microenvironment, carry bioactive substances and interfere with stem cell

signal transduction pathways. OBJECTIVE:To explore the effect of SMHs on

bone marrow mesenchymal stem cells (BMSCs) proliferation, apoptosis

and differentiation into myocardial cells. METHODS: (1) Passage 9 rat

BMSCs in vitro were divided into control group and experimental group,

followed by routine culture and culture in SMHs, respectively. At 7 days of

culture, cell proliferation and apoptosis were detected. Cells in the two

groups were exposed to anaerobic environment for 12 hours, and

expression levels of Bcl-2, Bax and Caspase-3 in BMSCs were detected. (2)

Passage 9 BMSCs were divided into four groups and then cultured in 5-azacytidine, SMHs, SMHs+5-azacytidine, and L-DMEM (normal control),

respectively. After 4 weeks of induction, expression of CTnT, desmin and

Cx-43 proteins was detected and expression levels of early cardiac

transcription factors, NKX2.5 and GATA-4, were also measured. RESULTS

AND CONCLUSION: (1) Compared with the control group, better

proliferation and lower apoptosis of BMSCs were found in the

experimental group. Under anaerobic conditions, the number of survival

cells was reduced in both groups, but less apoptosis or necrosis was found

in the experimental group than the control group (P < 0.05). Moreover, the

level of Bcl-2 was higher in the experimental group than the control group

(P < 0.01), while the levels of Bax and Caspases-3 protiens were lower in

the experimental group than the control group (P < 0.01). (2) NKx2.5 and

GATA-4 mRNA expression was found in both 5-azacytidine and SMHs+5-

azacytidine groups, and moreover, the mRNA levels of early cardiac

transcription factors were significantly higher in the SMHs+5-azacytidine

group than in the 5-azacytidine group (P < 0.05). In the normal control

group, cTnT expressed negatively, and desmin and Cx-43 expressed weakly.

The expression of cTnT, desmin and Cx-43 proteins was higher in the

SMHs+5-azacytidine group than in the 5-azacytidine and SMHs groups,

while there was no significant difference between the latter two groups. To

conclude, SMHs as a culture medium is conducive to the proliferation of

BMSCs, reduces cell apoptosis, and promotes myocardial differentiation of

BMSCs.

【期刊名称】《中国组织工程研究》

【年(卷),期】2017(021)021

【总页数】7页(P3299-3305)

【关键词】干细胞;骨髓干细胞;小分子水凝胶;骨髓间充质干细胞;增殖;凋亡;诱导分化;国家自然科学基金

【作者】陈国钦;黎锦亮;宋明才;区彩文

【作者单位】广州市番禺区中心医院心内科,番禺区心血管病研究所,广东省广州市

511400;广州市番禺区中心医院心内科,番禺区心血管病研究所,广东省广州市

511400;南方医科大学,广东省广州市 510515

【正文语种】中文

【中图分类】R394.2

0 引言 Introduction

心肌干细胞移植治疗心肌梗死一直是心肌梗死治疗领域的前沿研究[1-2]，具有很大的应用前景，然而移植后干细胞滞留率、存活率和分化率低是制约其发展的瓶颈[3]。本课题组与合作课题组研制的一种短肽小分子水凝胶，具备独特的生物可调控降解性，而且在改善局部微环境、携带生物活性物质及干预干细胞的信号转导途径等方面较其他水凝胶有着更明显的优势[4-6]。实验探讨小分子水凝胶能否模拟心肌内环境作为干细胞三维载体支架，利于心肌干细胞增殖、成活及分化等。

1 材料和方法 Materials and methods

1.1 设计体外细胞学观察实验。

1.2 时间及地点实验于2015年1月至2016年1月在南方医科大学珠江医院心脏中心实验室完成。

1.3 材料小分子水凝胶，成胶前体化合物的名称为DFEFKDFEFKYRGD，由南开大学生命科学院杨志谋课题组设计并提供。

实验动物：4周龄清洁级雄性SD大鼠，体质量(180±20)g，购自南方医科大学实验动物中心，动物许可证号：SCXK-(粤)2011-0015。实验中对动物处置符合科技部颁布的《关于善待实验动物的指导性意见》的规定。

主要仪器和试剂：Nikon相差倒置显微镜(Nikon)；olymPus荧光显微镜(olymPus)；LeieaQwinV3图像分析软件(Leiea)；652酶联免疫检测仪(BIO-RAD)；胰蛋白酶(1∶250)、胎牛血清、DMEM培养液(Hyclone公司)；乙二胺四乙酸(天象人生物技术研究所)；D-Hank’s液(NaCl、KCl、Na2HPO4、KH2PO4、NaOH、NaHCO3、苯酚红，南京化学试剂厂)；CD44兔多克隆抗体(RabbitAnti-CD44)、CD34兔多克隆抗体(Rabbit Anti-CD34)(HCAM)；即用型

SABC免疫组织化学染色试剂盒、DAB显色试剂盒AR1025(武汉博士德生物工程有限公司)；AnnexinV/PI凋亡检测试剂盒(凯基生物公司)；LDH试剂盒(Diagnostic Chemieals)；ABI7300实时定量PCR仪(美国HYBAID)；SYBR

Green PCRMasterMix reagent kits试剂盒(Applied Biosystems)；Trizol总RNA提取试剂(invitrogen)；5-氮杂胞苷(Sigma)；小鼠抗大鼠cThT(Neomarkers)；兔单克隆抗Bcl-2、Bax、Caspase-3抗体(eellsignal)；HRP标记抗羊IgG(santa)。

1.4 实验方法

1.4.1 骨髓间充质干细胞的分离、培养、纯化及鉴定所有动物手术以腹腔注射3%戊巴比妥钠(2mL/kg)麻醉下进行，并尽努力最大限度地减少SD大鼠的疼痛、痛苦和死亡。SD大鼠麻醉成功后，将身体放在体积分数5%乙醇中浸泡10min，头部露出液面，无菌操作分离大鼠胫骨、股骨，用5mL注射器抽取DMEM反复冲洗骨髓腔，经200目滤网过滤并收集冲洗液于15mL离心管中，室温1 500

r/min离心5min，弃上清。用10mL含体积分数15%FBS的新鲜培养基DMEM重悬细胞。按照1012L-1的细胞浓度接种在50 cm2培养瓶中，置于37℃、体积分数5%CO2、湿度饱和的细胞培养箱里进行培养。当贴壁细胞融合接近80%左右时，按1∶2的比例进行传代培养。原代骨髓间充质干细胞培养1 d后，进行首次换液并去除未贴壁细胞，以后每二三天换液1次。培养七八天，以2.0×108L-1的细胞浓度接种传代。

选用生长状况良好的第9代骨髓间充质干细胞，采用SABC法检测细胞表面抗原CD44+、CD34-的细胞即为所需细胞。取第9代的骨髓间充质干细胞进行实验。

1.4.2 MTT检测细胞生长增殖取第9代骨髓间充质干细胞，用10%无菌蔗糖浸洗后，37℃下用0.25%胰蛋白酶和0.02%EDTA混合消化液消化1min，收集细胞，1 000 r/min离心8min。用血细胞计数板计算细胞数目，调整细胞浓度为

5×108L-1，每孔加入200 μL细胞悬液，实验组加入1%小分子水凝胶溶液，以单独培养的细胞为对照组，每组设定6个复孔，每天每组细胞各取6孔。最后比色以空白对照组进行调零。在各时间点，向每孔加入PBS，溶解新鲜配制的MTT溶液(0.5 g/L)20 μL，继续孵育4 h。小心吸尽孔内培养上清液，每孔加入150 μL

DMSO，低速振荡使结晶物溶解。选择570 nm波长，在酶联免疫检测仪(BIO-RAD)上测定各孔波长吸光度(A)值的差值，绘制生长曲线。

1.4.3 吖啶橙/溴化乙锭双荧光染色(AO/EB)测定细胞凋亡分组同1.4.2，两组在培养后第1，3，5，7天，取各组细胞，加入AO/EB染色液。在olympus荧光显微镜下观察细胞形态和着色。实验重复3次。每孔随机选取5个视野，分别计数存活、凋亡和坏死细胞，计算受检细胞群体中凋亡细胞百分率时计数100个细胞。凋亡细胞%=凋亡细胞/总细胞计数×100%。

1.4.4 小分子水凝胶对缺氧环境下骨髓间充质干细胞凋亡的影响待1.4.2中两组细胞生长至80%-90%融合后，将所有细胞在无胎牛血清DMEM中培养24 h，然后将实验组与对照组细胞分别置于含体积分数94%N2、体积分数1%O2和体积分数5%CO2的两气培养箱中37℃孵育12 h；同时设立常氧(体积分数95%空气和体积分数5%CO2)环境中的骨髓间充质干细胞作为正常对照。缺氧12 h后提取各组细胞总蛋白，AO/EB染色观察细胞，Annexin V/PI双标流式细胞仪检测细胞凋亡，按Western-Blot步骤操作分别检测各组细胞缺氧后凋亡蛋白Bcl-2、Bax、Caspase-3的表达。

1.4.5 小分子水凝胶对骨髓间充质干细胞向心肌分化的作用

骨髓间充质干细胞的诱导分化：取第9代骨髓间充质干细胞，接种于预置盖玻片的6孔板中培养2 d，将完全培养液换为无血清培养液，24 h后分4组干预：5-氮杂胞苷组加入终浓度为10 μmol/L的5-氮杂胞苷，凝胶组加入浓度为1%的小分子水凝胶，实验组加入浓度为1%的小分子水凝胶与终浓度为10 μmol/L的5-

氮杂胞苷，正常对照组加入L-DMEM基本培养基。诱导剂作用24 h后，更换完全培养基继续培养，每3 d换液1次，观察细胞形态变化，每周用AdobePhotoshop7.0软件拍照记录，连续4周。4周后收集细胞，以用体积分数95%乙醇(加少量冰醋酸)固定15min，PBS彻底清洗。

实时荧光定量RT-PCR检测心肌早期转录因子NKX2.5、GATA-4的表达：取诱导后4周的细胞，进行嵌合荧光检测，试剂盒中的SYBRGreenⅠ与双链DNA结合后发出荧光，通过荧光强弱检测产物量的变化以实现对起始模板的定量分析。

Nkx2.5 上游：5'-GAG CCTACG GTG ACC CTG ACC CAG-3'下游；5'-TGA CCT

GCG TGG ACG TGA GCT TCA-3'GATA-4 上游：5'-CAT GCT TGC AGT TGT

GCT AG-3'下游；5'-ATT CTC TGC TAC GGC CAG TA-3'GAPDH 上游：5'-CCC

CCAATG TAT CCG TTG TG-3'下游；5'-TAG CCC AGG ATG CCC TTT AGT-3'

Western印迹法检测：取诱导后4周的细胞，采用Western印迹法检测cTnT蛋白的表达。

免疫细胞化学染色检测cTnT、desmin及Cx-43蛋白的表达：取诱导后4周的细胞，用0.01 mol/LPBS清洗3次，在室温条件下用冷丙酮固定10min，0.01

mol/L PBS浸洗3次，再用体积分数10%山羊血清在37℃条件下封闭30min。倾去封闭液，分别各自加入小鼠抗大鼠cTnT(1∶100)、Cx-43、a-actin、desmin一抗，置4℃冰箱内过夜，在37℃条件下反应2 h。用PBS浸洗3次，加入CY5标记的羊抗鼠IgG(1∶100)，在37℃条件下孵育1 h。然后，加入DAPI在室温下染色10min，磷酸甘油封固。在荧光显微镜下观察和照相记录。以PBS代替一抗作为阴性对照。

1.5 主要观察指标小分子水凝胶对骨髓间充质干细胞增殖、凋亡、向心肌细胞分化等的影响。

1.6 统计学分析采用SPSS 13.0统计软件分析数据,数据用±s表示，多组间均值比

较采用单因素方差分析，两组间比较用t检验，P<0.05认为差异有显著性意义。

2 结果 Results

2.1 小分子水凝胶对骨髓间充质干细胞存活和生长增殖的影响 AO/EB染色显示，实验组骨髓间充质干细胞在小分子水凝胶中生长第5-7天后仍能保持较好的活力，而对照组第5-7天可见数少量凋亡及坏死的细胞；实验组中细胞培养7 d后绿色荧光着色较深，呈亮绿色，表明活力明显较对照组好，存活细胞数目较高，见图1。

MTT检测结果显示，实验组骨髓间充质干细胞在小分子水凝胶中能够保持良好的增殖能力，与对照组相比，5 d前细胞生长曲线较低，但5 d后明显增高(P<0.05)，见图2。

2.2 小分子水凝胶对缺氧环境下骨髓间充质干细胞凋亡的影响

2.2.1 AnnexinV/PI流式细胞分析细胞凋亡 AnnexinV/Pl双标流式细胞仪检测显示，在缺氧环境中实验组和对照组存活的细胞均有减少，实验组的凋亡或坏死细胞数目明显少于对照组(P<0.05)，见图3。AO/EB染色显示，绿色染色为存活细胞，黄色为凋亡或坏死细胞，结果显示，实验组存活细胞数量明显多于对照组，而凋亡或坏死的细胞数量明显少于对照组，见图4。

2.2.2 Western-Blot分析细胞凋亡相关蛋白表达从图5A可观察到，经缺氧处理后，实验组及对照组细胞Bcl-2蛋白表达明显高于正常对照组(P<0.01)，且实验组细胞Bcl-2蛋白表达高于对照组(P<0.01)。从图5B，C可观察到，经缺氧处理后，对照组细胞Bax、Caspase-3蛋白表达高于正常对照组(P<0.01)，实验组细胞Bax、Caspase-3蛋白表达低于对照组(P<0.01)。

结果表明实验组在小分子水凝胶培养的骨髓间充质干细胞，在缺氧环境下能通过增加Bcl-2蛋白表达，同时降低Bax、Caspase-3蛋白表达来减少凋亡，提示小分子水凝胶可减少缺氧环境下骨髓间充质质干细胞的凋亡。

2.3 小分子水凝胶对骨髓间充质干细胞向心肌分化的作用

2.3.1 实时荧光定量RT-PCR检测心肌早期转录因子NKx2.5、GATA-4的表达诱导4周后，从扩增图及溶解曲线图中分析5-氮杂胞苷组和实验组各样本中均出现明确的心肌早期分化基因，实验组NKx2.5和GATA-4 mRNA表达高于5-氮杂胞苷组(P<0.05)，见表1。

图2 实验组与对照组骨髓间充质干细胞的MTT生长曲线Figure 2 Growth

curves of bone marrow mesenchymal stem cells in experimental and

control groups detected by MTT assay图注：实验组5 d后的细胞增殖高于对照组(P<0.05)。

图5 Western-Blot分析缺氧环境中实验组与对照组骨髓间充质干细胞凋亡相关蛋白的表达Figure 5 Apoptosis-related protein expressions in bone marrow

mesenchymal stem cells analyzed by western blot method图注：图中A-C分别为Bcl-2蛋白表达、Bax蛋白表达、Caspase-3蛋白表达。图中1为正常对照组，2为对照组，3为实验组。与正常对照组比较，aP<0.01；与对照组比较，bP<0.01。

图6 诱导后4周各组骨髓间充质干细胞cTnT蛋白表达Figure 6 cTnT protein

expression in bone marrow mesenchymal stem cells at 4 weeks after

induction detected by western blot assay图注：图中A-D分别为5-氮杂胞苷组、实验组、凝胶组及正常对照组。与正常对照组比较，aP<0.01；与5-氮杂胞苷组、凝胶组比较，bP<0.05。

表1 诱导后各组骨髓间充质干细胞NKx2.5、GATA-4mRNA相对表达量的比较

(±s，n=8)Table 1 mRNA expression of NKx2.5 and GATA-4 in bone

marrow mesenchymal stem cells after induction表注：与5-氮杂胞苷组比较，aP<0.05。5-氮杂胞苷组 3.240±0.712 5.351±0.841实验组 4.901±0.607a

7.727±0.593a凝胶组 1.984±0.412 2.734±0.534正常对照组 1.023±0.304

1.087±0.221

2.3.2 Western印迹法检测cTnT蛋白表达诱导4周后，未诱导的在正常对照组中几乎未发现cTnT蛋白表达，5-氮杂胞苷组、凝胶组及实验组中cTnT蛋白均可见阳性表达，实验组cTnT蛋白表达高于5-氮杂胞苷组、凝胶组(P<0.05)，5-氮杂胞苷组与凝胶组比较差异无显著性意义，见图6。

2.3.3 免疫细胞化学染色检测结果诱导后4周相差显微镜下可见，实验组细胞形态和排列方式均发生明显改变，细胞平行排列，呈簇团状且相邻细胞间出现细胞连接。免疫细胞化学染色结果显示，正常对照组cTnT蛋白表达阴性，desmin及Cx-43蛋白表达很弱；实验组cTnT、desmin及Cx-43蛋白表达较5-氮杂胞苷组、凝胶组明显增强，凝胶组cTnT、desmin及Cx-43蛋白表达与5-氮杂胞苷组相似(图7)。

3 讨论 Discussion

实验MTT结果提示，骨髓间充质干细胞在小分子水凝胶中能够保持更好的增殖能力，同时减少凋亡细胞数，表明小分子水凝胶具有很好的生物相容性，骨髓间充质干细胞适合在小分子水凝胶提供的三维环境中生长。经缺氧处理12 h后，在小分子水凝胶中培养的骨髓间充质干细胞，大部分细胞仍保持较好的活力，凋亡或坏死的细胞数目较对照组明显较少,与相关报道一致[7-9]。

Bcl-2是抑制凋亡的基因，Bax是促凋亡基因，细胞凋亡的最终途径为激活Caspases-3蛋白，Caspase-3是凋亡发生的标志酶。对凋亡相关蛋白检测表明，实验组骨髓间充质干细胞的Bcl-2表达明显较对照组增加，而Bax、Caspases-3蛋白表达均明显下调，结果表明在小分子水凝胶培养的骨髓间充质干细胞，在缺氧环境下能通过增加表达Bcl-2蛋白，同时降低Bax、Caspase-3蛋白的表达来减少凋亡。小分子水凝胶有助于细胞抵抗缺氧微环境，提高其存活能力，原因可能是小分子水凝胶提供的三维微环境机械刺激活化骨髓间充质干细胞表面受体，激活细

胞内信号途径，直接促进骨髓间充质干细胞的存活[10-11]。有报道显示，小分子水凝胶也可间接通过某些特异性配体与骨髓间充质干细胞表面受体结合，激活下游信号传导通路，发挥保护细胞抵抗缺血缺氧的作用[12-13]。另外，小分子水凝胶还可能通过影响骨髓间充质干细胞的旁分泌，间接促进骨髓间充质干细胞的存活。

在影响细胞分化方面，实验应用5-氮杂胞苷在体外诱导大鼠骨髓间充质干细胞[14]。本研究还发现，在小分子水凝胶中培养的骨髓间充质干细胞经5-氮杂胞苷诱导4周后，细胞形态和排列方式均发生明显改变，排列具有方向性，融合成团状且相邻细胞间连接增多，个别胞浆中可见明显颗粒状物质及明显的肌管样结构。实时荧光定量PCR检测显示，实验组心肌早期转录因子NKx2.5和GATA-4mRNA表达明显增加。NKx2.5、GATA-4基因具有显著的心脏特异性表达的特点，是心脏前体细胞分化的最早期标志之一，两者通过参与调控心肌细胞结构基因和调控基因的表达来参与心肌细胞的分化。免疫细胞化学染色结果显示，实验组的骨髓间充质干细胞经5-氮杂胞苷诱导后，cTnT、desmin、及Cx-43表达较单独5-氮杂胞苷组明显增强。心肌特异性cTnT阳性结果表明，骨髓间充质干细胞转化的肌细胞包含心肌特异性肌性蛋白。Desmin和α-actin是比较公认和研究较多的心肌早期分化基因，最早表达于未分化的肌母细胞中的肌源性蛋白，因此表达阳性说明骨髓间充质干细胞发生了肌源性分化，Cx-43表达阳性说明细胞之间的沟通连接明显[15]。以上结果提示小分子水凝胶可能通过提供三维空间结果，有效促进骨髓间充质干细胞诱导分化成心肌样细胞[16-17]。

研究证实，小分子水凝胶等组织材料的组成、微结构、亲疏水性能、黏弹性等都能在一定程度上调控干细胞的分化方向[15]。实验通过设计及改变短肽小分子水凝胶内在属性(弹性、结晶性、交联密度、完整性及最小和最大孔径)来影响干细胞的分化能力，推测与机械刺激激活细胞表面受体和黏着斑位点，然后激活细胞内信号转导途径有关[18-19]。Arg-Gly-Asp(RGD)序列是一种细胞表面整合素特异性配体

和最有效的促黏附多肽，多种细胞外基质成分中均含有高度保守的多肽RGD序列，所以经过多肽修饰后的细胞支架材料具备了促进细胞黏附和分化的优势，目前最有效且应用最广泛，将RGD序列结合在支架材料表面的技术已经开始应用于治疗炎症、心血管病、转移性肿瘤等领域[20-21]。研究应用的小分子水凝胶具有RGDSP结构序列[22-23]，研究结果证实，直接通过RGDSP结构域刺激早期心脏发育相关整合素aspl和avp3，对于提高骨髓间充质干细胞向心肌细胞分化具有重要作用，从本课题前期的实验研究可以得到初步证实[24]。另一方面，小分子水凝胶为骨髓间充质干细胞提供了一个类似心肌外基质的微环境，三维网状支架利于细胞向空间伸展[25]，化学微环境中和了5-氮杂胞苷的毒性作用，在与5-氮杂胞苷联合作用时，有助于上调5-氮杂胞苷对骨髓间充质干细胞所诱导分化的肌源性分化基因的表达，提高骨髓间充质干细胞向心肌细胞分化的能力[26]。研究初步证实了小分子水凝胶所提供的化学性和物理性因素可以起到促进细胞生长增殖、诱导分化的作用，这为小分子水凝胶与骨髓间充质干细胞移植治疗提供了可靠的实验基础。

图1 与小分子水凝胶共培养前后骨髓间充质干细胞的存活(AO/EB染色，×400，标尺=50 μm)Figure 1 Detection of cell viability by AO/EB staining after

culture with small molecule hydrogels(×400,scale bar=50 μm)图注：实验组骨髓间充质干细胞在小分子水凝胶中生长第5-7天后仍能保持较好的活力，而对照组第5-7天可见数少量凋亡及坏死的细胞。

图3 Annexin V/PI双标流式细胞仪检测缺氧环境中实验组与对照组细胞的存活Figure 3 Cell survival detected by flow cytometry with double Annexin V/PI

labeling图注：与正常对照组比较，aP<0.01；与对照组比较，bP<0.01。

图4 缺氧环境中实验组与对照组骨髓间充质干细胞的凋亡或坏死(AO/EB染色，×200)Figure 4 Detection of cell apoptosis and necrosis by AO/EB staining

under anaerobic conditions(×200)图注：图中A为实验组，B为对照组，C为

两组骨髓间充质干细胞的存活、凋亡和坏死数目。与对照组比较，aP<0.05。

图7 诱导后4后各组骨髓间充质干细胞免疫化学染色图片Figure 7

Immunocytochemical staining of bone marrow mesenchymal stem cells

after 4 weeks of induction图注：蓝色荧光为DIPI标记的细胞核，红色荧光为抗体表达阳性的细胞。正常对照组cTnT表达阴性，desmin及Cx-43表达很弱；实验组cTnT、desmin及Cx-43表达较5-氮杂胞苷组、凝胶组明显增强，凝胶组cTnT、desmin及Cx-43的表达与5-氮杂胞苷组相似。

致谢：感谢课题组的吴智业、邓菊、张建武、张稳柱、杨志谋在实验过程中给予的帮助。

作者贡献：区彩文进行实验设计，实验实施为陈国钦，实验评估为宋明才，资料收集为黎锦亮，陈国钦成文，区彩文审校。

利益冲突：所有作者共同认可文章无相关利益冲突。

伦理问题：实验方案经南方医科大学动物实验伦理委员会批准，批准号为SCXK-(粤)2011-0015。实验过程遵循了国际兽医学编辑协会《关于动物伦理与福利的作者指南共识》和本地及国家法规。实验动物在麻醉下进行所有的手术，并尽一切努力最大限度地减少其疼痛、痛苦和死亡。文章的撰写与编辑修改后文章遵守了《动物实验体内实验研究报告规范指南》(ARRIVE指南)。

文章查重：文章出版前已经过CNKI反剽窃文献检测系统进行3次查重。

文章外审：文章经国内小同行外审专家双盲外审，符合本刊发稿宗旨。

作者声明：第一作者对研究和撰写的论文中出现的不端行为承担责任。论文中涉及的原始图片、数据(包括计算机数据库)记录及样本已按照有关规定保存、分享和销毁，可接受核查。

文章版权：文章出版前杂志已与全体作者授权人签署了版权相关协议。

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