2024年8月26日发(作者：无鸿云)
ＨＥＩＬＯＮＧＪＩＡＮＧ ＭＥＤＩＣＩＮＥ ＡＮＤ ＰＨＡＲＭＡＣＹ Ｆｅｂ．２０１５，Ｖｏ１．３８ Ｎｏ．１ ・１５７・
Ｎｏｇｇｉｎ基因修饰对Ａｔ３致伤神经干细胞凋亡及突触素表达的影响①
王增冕，张晓梅，盛宝英
（佳木斯大学附属第一医院神经内科，黑龙江佳木斯１５４００３）
关键词：ｎｏｇｇｉｎ基因；Ｐ３８表达；神经干细胞
中图分类号：Ｑ４２１文献标识码：Ａ文章编号：１００８—０１０４（２０１５）０１—０１５７—０２
阿尔茨海默病（Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ ｄｉｓｅａｓｅ，ＡＤ）Ｒ病人
群大多数为中老年人。此病患者经常记不清发生的
事情，认不出熟悉的人，而且在行为神态上呈现出呆
浓度，ＤＭＥＭ／Ｆ１２二倍液５０ｍＬ—ＥＧＦ（２ ｇ／ｍＬ）
ｌｍＬ ２０ｎｇ／ｍＬ；ｂＦＧＦ（２１ｘｇ／ｍＬ）ｌｍＬ ２０ｎｇ／ｍＬ；Ｂ２７
２ｍＬ ２％；青霉素（１万单￣／ｍＬ）１ｍＬ １００单位／ｍＬ；
傻状态。这主要是因为病人的中枢神经受到此病的
侵害，中枢神经不能正常工作。年龄越大的人患病
的可能性越大。因此，由该病引起的死亡排在临床
死亡原因的第四位。此类疾病的病理是：病患的神
经细胞遭到破坏，影响病患的部分身体机能的工作。
治疗该病的关键在于病变神经元的恢复和替换。婴
儿和成年人的大脑内都有神经干细胞。利用神经干
链霉素（１万单位／ｍＬ）ｌｍＬ １００单￣＿／ｍＬ；用１０％
ＮａＨＣＯ 或ＨＣＬ调节ｐＨ值为７．２～７．３。三蒸水滴
定容至１００ｍＬ，密闭，４￣Ｃ冰箱保存备用。
⑤多聚赖氨酸的配制：将多聚赖氨酸以１：１０的
比例稀释于无菌三蒸水中，针式滤器过滤，盛装于塑
料瓶内备用。应用时将多聚赖氨酸均匀涂布于盖玻
片上，无菌培养箱孵育过夜，灭菌三蒸水清洗２次，
细胞移植人受损的神经组织，更换和修复受损的神
经元，以恢复大脑的正常功能，是用于ＡＤ的治疗未
将盖玻片置人无菌培养板孔中，晾干后使用。
（￣）ＡＩ３１—４２聚集态的制备：用二甲基亚砜溶解
来的一个重要方向。神经系统的神经干细胞不仅在
发展中国家，也继续存在于成人中枢神经系统中的
多个脑区域。利用神经干细胞移植入受损的神经组
织，更换和修复受损的神经元，以恢复大脑的正常功
能，是用于ＡＤ的治疗未来的一个重要方向。
１材料与方法
１．１ 实验材料
新生３ｄ内昆明小鼠由佳木斯大学实验动物中
心提供。
１．２主要试剂配制
①２ ｇ／ｍＬ ｂＦＧＦ液配制：ｂＦＧＦ１００ｕｇ加５ｍＬ三
蒸水配制成２０１ｘｇ／ｍＬ ｂＦＧＦ溶液（一２０℃冰冻）。
ｌｍＬ的２０／ｚｇ／ｍＬ ｂＦＧＦ溶液加９ｍＬ三蒸水配制成
２１ｘｇ／ｍＬ ｂＦＧＦ溶液。
②２ ｇ／ｍＬ ＥＧＦ液配制：ＥＧＦ１００Ｉｘｇ加５ｍＬ三
蒸水配制成２０１￣ｇ，／ｍＬ ＥＧＦ溶液（一２０￣Ｃ冰冻）。
１ｍＬ的２０￣ｇ／ｍＬ ＥＧＦ溶液加９ｍＬ三蒸水配制成
２Ｉ￣ｇ／ｍＬ ＥＧＦ溶液。
③ＤＭＥＮ／Ｆ１２（１：１）培养基二倍液配制：取
ＤＭＥＭ／Ｆ１２干粉１４．７９ｇ，三蒸水４００ｍＬ溶解，Ｎａ一
ＣＨＯ 调整ｐＨ值７．２～７．４，定容至５００ｍＬ。
０．２２ｉｘｍ微孔滤膜滤器过滤，每瓶５０ｍＬ／瓶分装。一
２０℃保存。用时３７ｃＩ＝温箱孵育。
④神经干细胞培养基配制：试剂液体量加入后
ＡＢ１—４２后加０．０１ＭＰＢＳ使其终浓度１２．５Ｉｘｍｏｌ／Ｌ，
３７℃培养箱中孵育一周（二甲基亚砜浓度小于
５％）。
１．３ 实验方法Ｈ
１．３．１小鼠海马神经干细胞分离、培养
７５％酒精的棉球擦洗新生小鼠，在超净工作台
无菌条件下断头并分离海马，无菌眼科剪将组织块
剪成１ｍｍ 以下的小块，用尖头已抛光的长颈吸管
机械吹打成单细胞悬液，用血球计数板计数，以５×
１０。／Ｌ密度接种于培养瓶中，神经干细胞条件培养
基，３７￣Ｃ、ｃ０ 体积分数５％的条件下培养，每３天
换一半完全培养液。
１．３．２神经干细胞的传代培养及分化
在培养的第７～１０天，用１５ｍＬ离心管收集培
养瓶中的多克隆球，１０００ｒｐｍ离心３ｍｉｎ，弃上清。用
尖头已抛光的长颈吸管吹打成单细胞悬液，传代次
数共计不超过４次。以１×１０。／Ｌ密度接种于多个
２５ｅｍ 的培养瓶中，加入神经干细胞完全培养液，以
后每３—４日半量换液，６～７ｄ传代一次。传三代后
神经干细胞在培养液内加入１０％胎牛血清，孵育
７２ｈ后行ＭＡＰ一２、ＧＦＡＰ鉴定。
１．３．３ ＳＡＢＣ免疫化学法Ｎｅｓｔｉｎ、ＭＡＰ一２，ＧＦＡＰ鉴定
取悬浮培养第三代神经干细胞，接种于预先涂
布０．１ｇ／Ｌ多聚赖氨酸的盖玻片中，并加入分化培养
① 基金项目：黑龙江省教育厅科研项目，编号：１２５２１５４３。
作者简介：王增冕（１９８５～）女，黑龙江佳木斯人，硕士，医师。
通讯作者：盛宝英（１９５６～）女，黑龙江佳木斯人，硕士，主任医师，硕士研究生导师。Ｅ—ｍａｉｌ：ｄｒ．ｗｔｓ＠１６３．ｔｏｍ。
・
１５８・ 黑龙江医药科学２０１５年２月第３８卷第１期
基，３７℃培养箱培养２４ｈ后行Ｎｅｓｔｉｎ免疫荧光鉴定。
１．３．４重组ＰＥＧＦＰ—Ｎ１一ＮＯＧ真核表达载体的构建
①ｎｏｇｇｉｎ基因的提取
根据大鼠Ｎｏｇｇｉｎ基因ｃＤＮＡ的全部序列，设计
一
淀粉样蛋白培养；空质粒组：Ｂ一淀粉样蛋白与转
染ＰＥＧＦＰ一１一ＧＦＰ修饰神经干细胞共培养；Ｎｏｇ—
ｇｉｎ＋Ａ１３组：Ｂ一淀粉样蛋白与体外培养的ＰＥＧＦＰ—
一
对引物，ｎｏｇｇｉｎ上游：５’ＧＣＣＡＡＣＡ１ＴｒＡＴＣＴＧＣＡ—
ｌ—ｎｏｇｇｉｎ神经干细胞共培养。
１．４ 统计学方法
采用ＳＰＳＳ１０．０行方差检验分析，Ｐ＜０．０５为
差异有统计学意义。
２ 结果
ＣＡＴＣＡＧＡＣ３’，下游：５’ＴＡＣＴＧＡＡＴＧＧＴｒＡＴＣＣＡＣＧ—
ＣＡＣＡＣ３’，提取胎鼠脑细胞总ＲＮＡ，合成ｃＤＮＡ的
第一条链，取５ ＲＴ产物进行ＰＣＲ反应，总反应体
系为５０ｔｚＬ，反应条件为９４℃５ｍｉｎ后，９４℃４５ｓ、６０℃
４５ｓ、７２￣Ｃ ２ｍｉｎ循环３５次，末次延伸７２℃１０ｍｉｎ。
②ｐＥＧＦＰ—Ｎ１和ｎｏｇｇｉｎ质料的准备
将含ＤＨ５ｃ￣的菌株以１：１００体积比接种于ＬＢ
培养基中，同时把Ｎｏｇｇｉｎ质粒的ＤＨ５ｃｔ菌株以同比
例种于１００１￣ｇ／ｍＬ氨苄青霉素的ＬＢ培养基内，３７￣Ｃ
摇床培养１２—１６ ｈ。
（￣）ｐＥＧＦＰ—Ｎ１和ｎｏｇｇｉｎ的产物回收
对ｐＥＧＦＰ—Ｎ１和Ｎｏｇｇｉｎ质粒酶切产物电泳目
的进行回收。
④ＤＮＡ的片段连接
将回收纯化基因片段Ｎｏｇｇｉｎ和ｐＥＧＦＰ—Ｎ１进
行定向连接。
⑤ｐＥＧＦＰ—Ｎ１一ＮＯＧ重组质粒的双酶切鉴
定。
大肠杆菌ＤＨ５ｃ￣的制备扩连接产物的转化均在
无菌条件下操作。从含ｋａｎ的平板上随机挑取３—
４个菌落分别接种于５ｍＬ含有３０１ｘｇ／ｍＬ Ｋａｎ的ＬＢ
液培养基中，３７℃，１８０ｒ／ｍｉｎ振荡培养１０～１２ｈ后，
提取质粒。所提取的质粒用限制性内切酶ＥｃｏＲ Ｉ
和Ｓａｌ Ｉ双酶切鉴定。重组质粒的ＰＣＲ扩增鉴定：
采用２０１ｘＬ体系进行ＰＣＲ，产物经１％琼脂糖凝胶电
泳，ｐＥＧＦＰ—Ｎ１一ＮＯＧ引物序列对应目的片段长
７５９９ｂｐ，用Ｍａｒｋｅｒ ＤＬ １５０００作为参照。
ｐＥＧＦＰ—Ｎ１一ＮＯＧ的ＤＨ５ｅｔ阳性克隆菌液中
加入１５％甘油，一７Ｏ℃保存备用。
１．３．５重组ＰＥＧＦＰ—Ｎ１一ＮＯＧ基因转染大鼠神经
干细胞及Ｎｏｇｇｉｎ蛋白表达
瞬时转染２４ｈ后，按１／１０比例传代，第二天改
用含Ｇ４１８（８００ＵＧ／ＭＬ）及１０％胎牛血清的ＭＥＭ
培养液筛选，维持培养，３～５ｄ换液一次，约７ｄ左右
阴性对照细胞全部死亡，将Ｇ４１８浓度降为２００ｐ￣ｇ／
ｍＬ的维持浓度，约１４ｄ后出现细胞克隆。挑取阳性
克隆扩大培养，命名为ＮＳＣ／ＮＯＧＧＩＮ载体组和
ＮＳＣ／空载体组，分别扩大培养，传代建系。激光共
聚焦显微镜检测重组ＰＥＧＦＰ—Ｎ１一ＮＯ。
１．３．６实验分组
正常组：神经干细胞不加Ｂ一淀粉样蛋白培养；
Ａ１３组：１３一淀粉样蛋白与体外培养的未转染神经干
细胞；ｎｏｇｇｉｎ组：ＰＥＧＦＰ一１一ｎｏｇｇｉｎ神经干细胞Ｂ
免疫组化检测结果显示：正常组Ｃａｓｐａｓｅ一３阳
性细胞比率最低，多散在分布；Ａ１３组与空质粒
Ｃａｓｐａｓｅ一３阳性细胞比率较高，达３４．８３％、
３３．９６％，行 检验ＡＩ３组与空质粒比较Ｐ＞０．０５，
Ａ１３组及空质粒与其他组比较Ｐ＜０．０１。ｎｏｇｇｉｎ＋
ＡＩ３组Ｃａｓｐａｓｅ一３阳性细胞比率较小，达２４．７２％，
与正常组、Ａ１３组与空质粒比较Ｐ＜０．０１，结果具有
统计学意义。
３ 讨论
神经干细胞的生物学特性是自我更新、多分化
潜能，还有良好的迁移能力和与宿主细胞融合能力
以及低免疫源性，使其为移植治疗神经系统疾病成
为可能。我们可以利用神经干细胞的生物学特性。
通过移植使损伤神经的结构和功能达到重建立，也
可将目的基因转染至神经干细胞，使其做为基因载
体，达到基因治疗及结构修复的协同作用，所以，神
经干细胞的体外培养、基因转染与细胞移植，成为近
年研究的热点 －９］。有研究表明在转基因小鼠建立
的ＡＤ模型中发现其额叶的前皮质内缺乏突触素和
神经元，而ＡＤ患者的神经元突触损伤的关键原因
是ＡＢ的神经毒性作用，所以近年来，突触素常常做
为ＡＤ研究的一个指标。本实验结果显示：与未转
染ＮＳＣｓ比较，ｎｏｇｇｉｎ基因转染神经干细胞突触素表
达增高，转染组细胞在Ａ１３致伤条件下仍可有一定
的突触素表达。ｎｏｇｇｉｎ基因在常规体外培养条件
下，可提高ＮＳＣｓ的突触素表达，有利于细胞间的信
号传递，在Ａ１３致伤后ｎｏｇｇｉｎ基因仍可促进突触素
的表达，提示在轴突的生长和突触的成熟中，ｎｏｇｇｉｎ
基因可能起到重要作用。利用神经干细胞移植与原
位诱导治疗中枢神经系统退行性疾病一直是人们不
断探索的一种手段，希望找寻补偿各种原因引起的
神经元丢失的方法，以促进脑缺血后神经功能的恢
复。ｎｏｇｇｉｎ基因转染在一定程度上能抑制体外培养
的神经干细胞在Ａ１３致伤后的凋亡，提高体外培养
及Ａ１３致伤条件下突起生长、突触素表达，但其作用
机制还需进一步探讨，ｎｏｇｇｉｎ基因修饰神经干细胞
移植治疗ＡＤ，对促进原位细胞的生长发育、神经再
生以及退行性病变的神经系统中的突触重建所能起
的作用还需进一步观察。
（下转第１６０页）
・
１６０－ 黑龙江医药科学２０１５年２月第３８卷第１期
１０～１６个月，平均拆除时间为（１２．１－４－３．２）个月。
其余４例骨折不愈合患者经外固定支架治疗无效，
拆除外固定支架１个月时，行内固定加植骨术后骨
散，造成严重感染 Ｊ。
折愈合。
治疗中出现创面和软组织小面积感染的患者有
６例，针道感染者有４例，经静脉滴注抗生素后治
愈，无无严重感染并发症发生。
经过１～２年对患者的随访统计，患者的恢复和
支架固定情况良好，有３例患者钢针出现松动，及时
到医院重新固定后对骨折恢复不产生影响。疗效为
优的患者２９例（３６．２％），疗效为良的患者４０例
（５０．０％），疗效一般的７例（８．８％），无效４例
（５．０％）。治疗的优良率为８６．２％。见表１。
表１ 患者的疗效评分水平
堕旦
例数
运用外固定支架治疗严重胫腓骨开放性骨折，
则能有效避免以上两种方法的缺点。它尽可能采用
微创原则对骨折部位进行复位，不会造成软组织的
二次损伤，避免内固定法中对骨膜的剥离，能够加快
骨折愈合ｌ＿４．５ｊ。在对伤口进行缝合时此法能够减轻
创面张力，有利于创面缝合和愈合。外固定支架对
骨折部位的纵向加压和纵向延伸优势能够加快骨痂
形成，刺激骨骼生长，防止骨骼重叠移位，加快骨组
织的生长。外固定支架不会对伤口的换药产生影
垡
２９
垦
４ｏ
二墼
７
墼
４
响。另外，其特有的稳定性使患者在手术早期即能
进行关节功能性活动，防止关节和肌肉黏连，萎
缩 。在应用外固定支架时，要特别注意保持针道
的清洁干燥，不要清除针道内产生的保护性硬痂。
对支架各关节和螺钉要密切关注，防止松动造成固
定不稳。
从研究结果以及外固定支架的优势分析可知，
将外固定支架应用于严重胫腓骨骨折，能够提高骨
！丝２ ： Ｑ： ： ：
３ 讨论
胫腓部开放性骨折时往往合并皮肤及骨部软组
织的严重损伤，因此，如何选择有效的骨折复位固定
方法，减少进一步的软组织伤害，且不影响到骨折断
折固定的稳定性，减轻手术损伤，加快骨折愈合，防
止感染并发症。
参考文献：
［１］李永军，王广超，吕志刚．应用外固定支架治疗严重胫腓骨开放
性骨折［Ｊ］．中国实用医药，２０１３，０５：７ｌ一７２
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例临床分析［Ｊ］．广西医学，２０１３，０８：１１０２—１１０３
面的血运是避免骨折部位髓腔感染，加快骨折愈合
的关键。
胫腓部骨折不同的治疗方法都遵循“复位，固
定，功能锻炼”三大原则 】。传统骨折复位法采用
手法对骨折部位进行复位牵引，外用石膏或夹板进
行固定，此法简单易行，而且不会对骨折的软组织造
成伤害，但是外固定物容易松动，固定不牢固，易造
成骨折移位，另外，对于皮肤及软组织损伤的开放性
骨折，不利于伤口换药，容易造成伤口的感染。采用
内固定法治疗胫腓部骨折时，虽然对骨折部位固定
牢靠，但是内固定时需要剥离大量的软组织和骨膜，
会对软组织造成进一步损伤，影响骨折部位血运，不
利于骨折的愈合生长。特别是对于创面严重的Ⅲ型
骨折，内固定法可能会使软组织缺损严重，污染扩
［３］刘海，徐明君．开放性胫腓骨骨折８４例治疗体会［Ｊ］．黑龙江医
药科学，２０００，２３（５）：８５—８６
［４］李伟东，李长德，王建业．ＶＳＤ＋外固定架治疗Ｇｕｓｔｉｌｏ １１１Ｂ型胫
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［５］李玉满，赵洪斌，侯旭东．单臂外固定支架在Ｂ超引导定位下治
疗肢体骨骨折中的ｌ临床应用［Ｊ］．黑龙江医药科学，２００２，２５（４）：
１９
［６］王福成，解云川，魏巍．ＡＯ外固定架治疗重度开放性胫腓骨多段
骨折的ｌ临床体会［Ｊ］．黑龙江医药科学，２００５，２８（４）：３２
（收稿日期：２０１４—０６—１０）
（上接第１５８页）
参考文献：
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［２］Ｎａｒｕｌａ Ｊ，Ｈａｉｄｅｒ Ｎ，Ａｒｂｕｓｔｉｎｉ Ｅ，ｅｔ ａ１．Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ ｏｆ ｄｉｓｅａｓｅ： ｐ－
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［６］金玉玲，张晓梅，朱晓峰．移植神经干细胞在脑缺血大鼠损伤
脑区的定向分化及其对运动功能的影响［Ｊ］．黑龙江医药科学，
２００５，２８（１）：１—３
［７］张晓梅，徐忠烨，朱晓峰．ｂＦＧＦ、ＥＧＦ联合应用对新生大鼠海马
神经干细胞分化的影响［Ｊ］．黑龙江医药科学，２００２，２５（５）：４—
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［３］Ｅｖｅｓ ＥＭ，Ｓｋｏｅｚｙｌａｓ Ｃ，Ｙｏｓｈｉｄａ Ｋ，ｅｔ ａ１．ＦＧＦ ｉｎｄｕｃｅｓ ａ ｓｗｉｔｅｔｌ ｉｎ
ｄｅａｔｈ ｒｅｃｅｐｔｏｒｐａｔｈｗａｙｓ ｉｎ ｎｅｕｒｏｎａｌ ｃｅｌｌｓ［Ｊ］．Ｊ Ｎｅｕｒｏｓｅｉ，２００１，２１
（１４）：４９９６—５００６
［８］徐忠烨，朱晓峰．新生大鼠海马神经干细胞的分离培养及鉴定
［ｊ］．黑龙江医药科学，２００５，２８（１）：２—４
［９］胡旭慧，黄昕艳，朱晓峰 ＡＢ２５—３５寡聚体对原代培养海马神
经元突触的损伤作用［Ｊ］．黑龙江医药科学，２０１０，３３（３）：ｌ１３
［４］Ｅｌｉｎｏｓ—Ｂａｅｚ ＣＭ，Ｍａｌｄｏｎａｄｏ Ｖ，Ｍｅｌｅｎｄｅｚ—ｚａ＝ｊ ｇｌａ Ｊ．ＣａｓＰａｓｅｓ：
ａｐｏｐｔｏｓｉｓ ｉｎｄｕｃｉｎｇ ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ［Ｊ］ Ｇａｅ Ｍｅｄ Ｍｅｘ，２００３，１３９（５）：
４９３４９９
（收稿日期：２０ｌ４一Ｏ５一ｏ３）
［５］张晓梅，金玉玲，朱晓峰．体外培养海马神经干细胞分化前后
2024年8月26日发(作者：无鸿云)
ＨＥＩＬＯＮＧＪＩＡＮＧ ＭＥＤＩＣＩＮＥ ＡＮＤ ＰＨＡＲＭＡＣＹ Ｆｅｂ．２０１５，Ｖｏ１．３８ Ｎｏ．１ ・１５７・
Ｎｏｇｇｉｎ基因修饰对Ａｔ３致伤神经干细胞凋亡及突触素表达的影响①
王增冕，张晓梅，盛宝英
（佳木斯大学附属第一医院神经内科，黑龙江佳木斯１５４００３）
关键词：ｎｏｇｇｉｎ基因；Ｐ３８表达；神经干细胞
中图分类号：Ｑ４２１文献标识码：Ａ文章编号：１００８—０１０４（２０１５）０１—０１５７—０２
阿尔茨海默病（Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ ｄｉｓｅａｓｅ，ＡＤ）Ｒ病人
群大多数为中老年人。此病患者经常记不清发生的
事情，认不出熟悉的人，而且在行为神态上呈现出呆
浓度，ＤＭＥＭ／Ｆ１２二倍液５０ｍＬ—ＥＧＦ（２ ｇ／ｍＬ）
ｌｍＬ ２０ｎｇ／ｍＬ；ｂＦＧＦ（２１ｘｇ／ｍＬ）ｌｍＬ ２０ｎｇ／ｍＬ；Ｂ２７
２ｍＬ ２％；青霉素（１万单￣／ｍＬ）１ｍＬ １００单位／ｍＬ；
傻状态。这主要是因为病人的中枢神经受到此病的
侵害，中枢神经不能正常工作。年龄越大的人患病
的可能性越大。因此，由该病引起的死亡排在临床
死亡原因的第四位。此类疾病的病理是：病患的神
经细胞遭到破坏，影响病患的部分身体机能的工作。
治疗该病的关键在于病变神经元的恢复和替换。婴
儿和成年人的大脑内都有神经干细胞。利用神经干
链霉素（１万单位／ｍＬ）ｌｍＬ １００单￣＿／ｍＬ；用１０％
ＮａＨＣＯ 或ＨＣＬ调节ｐＨ值为７．２～７．３。三蒸水滴
定容至１００ｍＬ，密闭，４￣Ｃ冰箱保存备用。
⑤多聚赖氨酸的配制：将多聚赖氨酸以１：１０的
比例稀释于无菌三蒸水中，针式滤器过滤，盛装于塑
料瓶内备用。应用时将多聚赖氨酸均匀涂布于盖玻
片上，无菌培养箱孵育过夜，灭菌三蒸水清洗２次，
细胞移植人受损的神经组织，更换和修复受损的神
经元，以恢复大脑的正常功能，是用于ＡＤ的治疗未
将盖玻片置人无菌培养板孔中，晾干后使用。
（￣）ＡＩ３１—４２聚集态的制备：用二甲基亚砜溶解
来的一个重要方向。神经系统的神经干细胞不仅在
发展中国家，也继续存在于成人中枢神经系统中的
多个脑区域。利用神经干细胞移植入受损的神经组
织，更换和修复受损的神经元，以恢复大脑的正常功
能，是用于ＡＤ的治疗未来的一个重要方向。
１材料与方法
１．１ 实验材料
新生３ｄ内昆明小鼠由佳木斯大学实验动物中
心提供。
１．２主要试剂配制
①２ ｇ／ｍＬ ｂＦＧＦ液配制：ｂＦＧＦ１００ｕｇ加５ｍＬ三
蒸水配制成２０１ｘｇ／ｍＬ ｂＦＧＦ溶液（一２０℃冰冻）。
ｌｍＬ的２０／ｚｇ／ｍＬ ｂＦＧＦ溶液加９ｍＬ三蒸水配制成
２１ｘｇ／ｍＬ ｂＦＧＦ溶液。
②２ ｇ／ｍＬ ＥＧＦ液配制：ＥＧＦ１００Ｉｘｇ加５ｍＬ三
蒸水配制成２０１￣ｇ，／ｍＬ ＥＧＦ溶液（一２０￣Ｃ冰冻）。
１ｍＬ的２０￣ｇ／ｍＬ ＥＧＦ溶液加９ｍＬ三蒸水配制成
２Ｉ￣ｇ／ｍＬ ＥＧＦ溶液。
③ＤＭＥＮ／Ｆ１２（１：１）培养基二倍液配制：取
ＤＭＥＭ／Ｆ１２干粉１４．７９ｇ，三蒸水４００ｍＬ溶解，Ｎａ一
ＣＨＯ 调整ｐＨ值７．２～７．４，定容至５００ｍＬ。
０．２２ｉｘｍ微孔滤膜滤器过滤，每瓶５０ｍＬ／瓶分装。一
２０℃保存。用时３７ｃＩ＝温箱孵育。
④神经干细胞培养基配制：试剂液体量加入后
ＡＢ１—４２后加０．０１ＭＰＢＳ使其终浓度１２．５Ｉｘｍｏｌ／Ｌ，
３７℃培养箱中孵育一周（二甲基亚砜浓度小于
５％）。
１．３ 实验方法Ｈ
１．３．１小鼠海马神经干细胞分离、培养
７５％酒精的棉球擦洗新生小鼠，在超净工作台
无菌条件下断头并分离海马，无菌眼科剪将组织块
剪成１ｍｍ 以下的小块，用尖头已抛光的长颈吸管
机械吹打成单细胞悬液，用血球计数板计数，以５×
１０。／Ｌ密度接种于培养瓶中，神经干细胞条件培养
基，３７￣Ｃ、ｃ０ 体积分数５％的条件下培养，每３天
换一半完全培养液。
１．３．２神经干细胞的传代培养及分化
在培养的第７～１０天，用１５ｍＬ离心管收集培
养瓶中的多克隆球，１０００ｒｐｍ离心３ｍｉｎ，弃上清。用
尖头已抛光的长颈吸管吹打成单细胞悬液，传代次
数共计不超过４次。以１×１０。／Ｌ密度接种于多个
２５ｅｍ 的培养瓶中，加入神经干细胞完全培养液，以
后每３—４日半量换液，６～７ｄ传代一次。传三代后
神经干细胞在培养液内加入１０％胎牛血清，孵育
７２ｈ后行ＭＡＰ一２、ＧＦＡＰ鉴定。
１．３．３ ＳＡＢＣ免疫化学法Ｎｅｓｔｉｎ、ＭＡＰ一２，ＧＦＡＰ鉴定
取悬浮培养第三代神经干细胞，接种于预先涂
布０．１ｇ／Ｌ多聚赖氨酸的盖玻片中，并加入分化培养
① 基金项目：黑龙江省教育厅科研项目，编号：１２５２１５４３。
作者简介：王增冕（１９８５～）女，黑龙江佳木斯人，硕士，医师。
通讯作者：盛宝英（１９５６～）女，黑龙江佳木斯人，硕士，主任医师，硕士研究生导师。Ｅ—ｍａｉｌ：ｄｒ．ｗｔｓ＠１６３．ｔｏｍ。
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１５８・ 黑龙江医药科学２０１５年２月第３８卷第１期
基，３７℃培养箱培养２４ｈ后行Ｎｅｓｔｉｎ免疫荧光鉴定。
１．３．４重组ＰＥＧＦＰ—Ｎ１一ＮＯＧ真核表达载体的构建
①ｎｏｇｇｉｎ基因的提取
根据大鼠Ｎｏｇｇｉｎ基因ｃＤＮＡ的全部序列，设计
一
淀粉样蛋白培养；空质粒组：Ｂ一淀粉样蛋白与转
染ＰＥＧＦＰ一１一ＧＦＰ修饰神经干细胞共培养；Ｎｏｇ—
ｇｉｎ＋Ａ１３组：Ｂ一淀粉样蛋白与体外培养的ＰＥＧＦＰ—
一
对引物，ｎｏｇｇｉｎ上游：５’ＧＣＣＡＡＣＡ１ＴｒＡＴＣＴＧＣＡ—
ｌ—ｎｏｇｇｉｎ神经干细胞共培养。
１．４ 统计学方法
采用ＳＰＳＳ１０．０行方差检验分析，Ｐ＜０．０５为
差异有统计学意义。
２ 结果
ＣＡＴＣＡＧＡＣ３’，下游：５’ＴＡＣＴＧＡＡＴＧＧＴｒＡＴＣＣＡＣＧ—
ＣＡＣＡＣ３’，提取胎鼠脑细胞总ＲＮＡ，合成ｃＤＮＡ的
第一条链，取５ ＲＴ产物进行ＰＣＲ反应，总反应体
系为５０ｔｚＬ，反应条件为９４℃５ｍｉｎ后，９４℃４５ｓ、６０℃
４５ｓ、７２￣Ｃ ２ｍｉｎ循环３５次，末次延伸７２℃１０ｍｉｎ。
②ｐＥＧＦＰ—Ｎ１和ｎｏｇｇｉｎ质料的准备
将含ＤＨ５ｃ￣的菌株以１：１００体积比接种于ＬＢ
培养基中，同时把Ｎｏｇｇｉｎ质粒的ＤＨ５ｃｔ菌株以同比
例种于１００１￣ｇ／ｍＬ氨苄青霉素的ＬＢ培养基内，３７￣Ｃ
摇床培养１２—１６ ｈ。
（￣）ｐＥＧＦＰ—Ｎ１和ｎｏｇｇｉｎ的产物回收
对ｐＥＧＦＰ—Ｎ１和Ｎｏｇｇｉｎ质粒酶切产物电泳目
的进行回收。
④ＤＮＡ的片段连接
将回收纯化基因片段Ｎｏｇｇｉｎ和ｐＥＧＦＰ—Ｎ１进
行定向连接。
⑤ｐＥＧＦＰ—Ｎ１一ＮＯＧ重组质粒的双酶切鉴
定。
大肠杆菌ＤＨ５ｃ￣的制备扩连接产物的转化均在
无菌条件下操作。从含ｋａｎ的平板上随机挑取３—
４个菌落分别接种于５ｍＬ含有３０１ｘｇ／ｍＬ Ｋａｎ的ＬＢ
液培养基中，３７℃，１８０ｒ／ｍｉｎ振荡培养１０～１２ｈ后，
提取质粒。所提取的质粒用限制性内切酶ＥｃｏＲ Ｉ
和Ｓａｌ Ｉ双酶切鉴定。重组质粒的ＰＣＲ扩增鉴定：
采用２０１ｘＬ体系进行ＰＣＲ，产物经１％琼脂糖凝胶电
泳，ｐＥＧＦＰ—Ｎ１一ＮＯＧ引物序列对应目的片段长
７５９９ｂｐ，用Ｍａｒｋｅｒ ＤＬ １５０００作为参照。
ｐＥＧＦＰ—Ｎ１一ＮＯＧ的ＤＨ５ｅｔ阳性克隆菌液中
加入１５％甘油，一７Ｏ℃保存备用。
１．３．５重组ＰＥＧＦＰ—Ｎ１一ＮＯＧ基因转染大鼠神经
干细胞及Ｎｏｇｇｉｎ蛋白表达
瞬时转染２４ｈ后，按１／１０比例传代，第二天改
用含Ｇ４１８（８００ＵＧ／ＭＬ）及１０％胎牛血清的ＭＥＭ
培养液筛选，维持培养，３～５ｄ换液一次，约７ｄ左右
阴性对照细胞全部死亡，将Ｇ４１８浓度降为２００ｐ￣ｇ／
ｍＬ的维持浓度，约１４ｄ后出现细胞克隆。挑取阳性
克隆扩大培养，命名为ＮＳＣ／ＮＯＧＧＩＮ载体组和
ＮＳＣ／空载体组，分别扩大培养，传代建系。激光共
聚焦显微镜检测重组ＰＥＧＦＰ—Ｎ１一ＮＯ。
１．３．６实验分组
正常组：神经干细胞不加Ｂ一淀粉样蛋白培养；
Ａ１３组：１３一淀粉样蛋白与体外培养的未转染神经干
细胞；ｎｏｇｇｉｎ组：ＰＥＧＦＰ一１一ｎｏｇｇｉｎ神经干细胞Ｂ
免疫组化检测结果显示：正常组Ｃａｓｐａｓｅ一３阳
性细胞比率最低，多散在分布；Ａ１３组与空质粒
Ｃａｓｐａｓｅ一３阳性细胞比率较高，达３４．８３％、
３３．９６％，行 检验ＡＩ３组与空质粒比较Ｐ＞０．０５，
Ａ１３组及空质粒与其他组比较Ｐ＜０．０１。ｎｏｇｇｉｎ＋
ＡＩ３组Ｃａｓｐａｓｅ一３阳性细胞比率较小，达２４．７２％，
与正常组、Ａ１３组与空质粒比较Ｐ＜０．０１，结果具有
统计学意义。
３ 讨论
神经干细胞的生物学特性是自我更新、多分化
潜能，还有良好的迁移能力和与宿主细胞融合能力
以及低免疫源性，使其为移植治疗神经系统疾病成
为可能。我们可以利用神经干细胞的生物学特性。
通过移植使损伤神经的结构和功能达到重建立，也
可将目的基因转染至神经干细胞，使其做为基因载
体，达到基因治疗及结构修复的协同作用，所以，神
经干细胞的体外培养、基因转染与细胞移植，成为近
年研究的热点 －９］。有研究表明在转基因小鼠建立
的ＡＤ模型中发现其额叶的前皮质内缺乏突触素和
神经元，而ＡＤ患者的神经元突触损伤的关键原因
是ＡＢ的神经毒性作用，所以近年来，突触素常常做
为ＡＤ研究的一个指标。本实验结果显示：与未转
染ＮＳＣｓ比较，ｎｏｇｇｉｎ基因转染神经干细胞突触素表
达增高，转染组细胞在Ａ１３致伤条件下仍可有一定
的突触素表达。ｎｏｇｇｉｎ基因在常规体外培养条件
下，可提高ＮＳＣｓ的突触素表达，有利于细胞间的信
号传递，在Ａ１３致伤后ｎｏｇｇｉｎ基因仍可促进突触素
的表达，提示在轴突的生长和突触的成熟中，ｎｏｇｇｉｎ
基因可能起到重要作用。利用神经干细胞移植与原
位诱导治疗中枢神经系统退行性疾病一直是人们不
断探索的一种手段，希望找寻补偿各种原因引起的
神经元丢失的方法，以促进脑缺血后神经功能的恢
复。ｎｏｇｇｉｎ基因转染在一定程度上能抑制体外培养
的神经干细胞在Ａ１３致伤后的凋亡，提高体外培养
及Ａ１３致伤条件下突起生长、突触素表达，但其作用
机制还需进一步探讨，ｎｏｇｇｉｎ基因修饰神经干细胞
移植治疗ＡＤ，对促进原位细胞的生长发育、神经再
生以及退行性病变的神经系统中的突触重建所能起
的作用还需进一步观察。
（下转第１６０页）
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１６０－ 黑龙江医药科学２０１５年２月第３８卷第１期
１０～１６个月，平均拆除时间为（１２．１－４－３．２）个月。
其余４例骨折不愈合患者经外固定支架治疗无效，
拆除外固定支架１个月时，行内固定加植骨术后骨
散，造成严重感染 Ｊ。
折愈合。
治疗中出现创面和软组织小面积感染的患者有
６例，针道感染者有４例，经静脉滴注抗生素后治
愈，无无严重感染并发症发生。
经过１～２年对患者的随访统计，患者的恢复和
支架固定情况良好，有３例患者钢针出现松动，及时
到医院重新固定后对骨折恢复不产生影响。疗效为
优的患者２９例（３６．２％），疗效为良的患者４０例
（５０．０％），疗效一般的７例（８．８％），无效４例
（５．０％）。治疗的优良率为８６．２％。见表１。
表１ 患者的疗效评分水平
堕旦
例数
运用外固定支架治疗严重胫腓骨开放性骨折，
则能有效避免以上两种方法的缺点。它尽可能采用
微创原则对骨折部位进行复位，不会造成软组织的
二次损伤，避免内固定法中对骨膜的剥离，能够加快
骨折愈合ｌ＿４．５ｊ。在对伤口进行缝合时此法能够减轻
创面张力，有利于创面缝合和愈合。外固定支架对
骨折部位的纵向加压和纵向延伸优势能够加快骨痂
形成，刺激骨骼生长，防止骨骼重叠移位，加快骨组
织的生长。外固定支架不会对伤口的换药产生影
垡
２９
垦
４ｏ
二墼
７
墼
４
响。另外，其特有的稳定性使患者在手术早期即能
进行关节功能性活动，防止关节和肌肉黏连，萎
缩 。在应用外固定支架时，要特别注意保持针道
的清洁干燥，不要清除针道内产生的保护性硬痂。
对支架各关节和螺钉要密切关注，防止松动造成固
定不稳。
从研究结果以及外固定支架的优势分析可知，
将外固定支架应用于严重胫腓骨骨折，能够提高骨
！丝２ ： Ｑ： ： ：
３ 讨论
胫腓部开放性骨折时往往合并皮肤及骨部软组
织的严重损伤，因此，如何选择有效的骨折复位固定
方法，减少进一步的软组织伤害，且不影响到骨折断
折固定的稳定性，减轻手术损伤，加快骨折愈合，防
止感染并发症。
参考文献：
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性骨折［Ｊ］．中国实用医药，２０１３，０５：７ｌ一７２
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例临床分析［Ｊ］．广西医学，２０１３，０８：１１０２—１１０３
面的血运是避免骨折部位髓腔感染，加快骨折愈合
的关键。
胫腓部骨折不同的治疗方法都遵循“复位，固
定，功能锻炼”三大原则 】。传统骨折复位法采用
手法对骨折部位进行复位牵引，外用石膏或夹板进
行固定，此法简单易行，而且不会对骨折的软组织造
成伤害，但是外固定物容易松动，固定不牢固，易造
成骨折移位，另外，对于皮肤及软组织损伤的开放性
骨折，不利于伤口换药，容易造成伤口的感染。采用
内固定法治疗胫腓部骨折时，虽然对骨折部位固定
牢靠，但是内固定时需要剥离大量的软组织和骨膜，
会对软组织造成进一步损伤，影响骨折部位血运，不
利于骨折的愈合生长。特别是对于创面严重的Ⅲ型
骨折，内固定法可能会使软组织缺损严重，污染扩
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（上接第１５８页）
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