2024年3月10日发(作者：阿会雯)
基于核酸适配体和阳离子聚合物PAH高效聚集纳米金比色法
检测牛奶中四环素
罗艳芳;贺兰;詹深山;刘乐;支月娥;周培
【摘 要】为满足乳制品中四环素快速检测要求,开发了基于核酸适配体(aptamer)
和阳离子聚合物PAH高效聚集纳米金比色检测牛奶中四环素(TET)的新方法.本文
优化了PAH和适配体的浓度.最优实验条件下,四环素浓度在一定范围内与
A520/A650呈现良好的线性关系,最低检测限(LOD)为95 nmol/L,对四环素具有良
好的选择性.该方法已成功用于牛奶中四环素的检测,回收率为108％～117％,相对
标准偏差为2.9％～3.6％.
【期刊名称】《上海交通大学学报（农业科学版）》
【年(卷),期】2014(032)006
【总页数】6页(P66-70,91)
【关键词】四环素;核酸适配体;PAH;纳米金;比色
【作 者】罗艳芳;贺兰;詹深山;刘乐;支月娥;周培
【作者单位】上海交通大学农业与生物学院,上海200240;上海交通大学农业与生
物学院,上海200240;上海交通大学农业与生物学院,上海200240;上海交通大学农
业与生物学院,上海200240;上海交通大学农业与生物学院,上海200240;上海交通
大学农业与生物学院,上海200240
【正文语种】中 文
【中图分类】X83
四环素是一种常见的广谱抗生素类药物,被广泛运用于人类细菌感染治疗及添加于
畜禽饲料中[1]。据报道,每年有5 000 t四环素被人类和动物消耗[2]。随着四环素
使用量的增加,其在食品和环境中的残留带来了一系列的问题,如:微生物抗药性增强、
超级细菌的产生,食用具有抗生素残留肉制品后导致的过敏现象及某些器官的病变
等等[3-4]。为了保障消费者食品安全,欧盟规定牛奶中四环素最大残留为225
nmol/L[5],美国食品药品监督管理局规定牛奶中四环素最大残留为900 nmol/L[6]。
2002年,我国农业部修订的《动物性食品中兽药最高残留限量》中规定,牛羊奶以
及所有动物性食品中四环素类药物残留的最高残留量为225 nmol/L。
目前,四环素的检测方法很多,最常见的有高效液相色谱法(HPLC)[7-8]、毛细管电泳
法(CE)[9]、液质联用(LC-MS)[10]、酶联免疫(ELISA)[11]及微生物抑制法[12]等等。
近年来,核酸适配体已被广泛运用于重金属离子[13]、生物分子[14]及细胞[15]等的
检测。此外,核酸适配体合成简单,价格低廉。纳米金是一种非常理想的信号传导材
料,具有很好的光学特征。利用其开发的比色生物传感器对环境监测、生物医药的
探索具有非常重大的意义[16]。
聚烯丙胺盐酸盐(PAH)是一种高效阳离子聚合物,不仅具有聚集纳米金的作用而且还
能通过静电作用和DNA片段结合。Weejeong等[17]已经利用PAH这一性质成
功开发出疟疾的诊断方法。本实验选取PAH作为一种有效的纳米金聚集剂,通过其
控制纳米金的聚集和分散状态使纳米金溶液产生颜色变化检测四环素的含量。
1.1 主要仪器与试剂
M200 pro微型板块分光光度计为瑞士Tecan集团产品;圆二色谱仪为日本JASCO
公司产品;分析电子显微镜JEM-2010HT为日本日立集团产品;恒温孵育器为
Eppendorf公司产品;四环素适配体[18]:5'-
CGTACGGAATTCGCTAGCCCCCCGG-
CAGGCCACGGCTTGGGTTGGTCCCACTGCG-CGTGGATCCGAGCTCCACGTG-
3'由中国上海英潍捷基贸易有限公司合成;四环素,氯金酸,柠檬酸三钠,PAH,庆大霉
素、卡那霉素、氯霉素、妥布霉素、柔红霉素、甲砜霉素、土霉素和金霉素购自西
格玛奥德里奇(上海)贸易有限公司;牛奶样品购自于当地超市;所用试剂均为市售分
析纯试剂。
1.2 纳米金制备[19]
纳米金制备过程中所需的玻璃器皿均先用酸液[HNO3∶HCl=3∶1(V/V)]浸泡过夜,
用超纯水清洗后烘干。将100 mL 0.01%的氯金酸加入烧杯中置于磁力加热搅拌器
上加热,充分沸腾后迅速加入3.5 mL 1.0%的柠檬酸三钠溶液。继续加热搅拌30
min后,溶液颜色逐渐变为亮红色。停止加热,继续搅拌15 min后让其自然冷却,最
后用0.2 μm超滤膜(PVDF)过滤。滤液装于棕色试剂瓶中,置于4 ℃冰箱保存备用。
1.3 牛奶样品预处理
准确称取适量奶粉溶解于5 mL离心管中,随后加入2%的三氯乙酸溶液[20],混合均
匀后超声处理30 min。将超声处理后的混合液离心(10 000 r/min,8 min ),将上清
液过0.2 μm超滤膜(PVDF)以去除被沉淀的蛋白质、脂肪等物质。滤液置于4 ℃
冰箱保存备用。
1.4 PAH高效聚集纳米金检测原理
研究表明,阳离子聚合物PAH对纳米金具有很好的聚集效果[17]。本实验发现,当
PAH、aptamer和四环素形成复合物后,PAH的聚合能力下降。其检测原理(图1)
为:当体系中存在四环素时,PAH、aptamer和四环素形成大分子复合物,PAH聚合
能力显著下降,体系中纳米金聚集程度较低,体系溶液呈浅红色;当体系中不存在四环
素时,PAH仍具有较好的聚合能力,体系中纳米金聚集程度较高,体系溶液呈浅蓝色。
根据本课题组已有研究成果[21-22],亮红色纳米金的紫外-可见吸收光谱在520 nm
处具有最强吸收峰,在650 nm处具有最弱吸收峰,而聚集后呈蓝色的纳米金在520
nm处的吸收峰逐渐减弱,在650 nm处的吸收峰逐渐增强。因此,分别用酶标仪测
定这两处的吸收峰值A520和A650,计算吸收峰比值A520/A650。
1.5 检测方法
取30 μL 50 nmol/L四环素适配体和10 μL待测样品于离心管中混合均匀,置于恒
温孵育器中90 ℃孵育5 min后冷却到常温。向离心管中加入340 μL MOPS缓冲
液(pH 7.0),混合均匀后加入20 μL 200 nmol/L的PAH,在25 ℃恒温孵育器孵育
30 min。取出后向离心管中加入100 μL纳米金溶液,混合均匀。静置5 min后用
移液枪移取200 μL加入到96孔板中,置于M200 pro微型板块分光光度计测定
650 nm及520 nm 处的吸光值A650和A520,并计算A520/ A650。
2.1 圆二色谱图(CD)表征
据文献报道,四环素适配体CD峰谱在240～260 nm有1个负峰,270～290 nm有
1个正峰[23]。从图2可看出,加入四环素后,aptamer 的CD的正负峰值增大并伴
随明显蓝移,表明TET与适配体结合后,适配体的构象发生了很大变化[24]。当加入
PAH后,出峰位置没有发生变化,但是负峰值有所降低,说明PAH并没有改变适配体
的构象,只是吸附在其磷酸骨架上,形成了aptamer-TET-PAH大分子复合物。因此,
四环素和PAH都能与aptamer发生明显的相互作用。
2.2 电子透射电镜(TEM)表征
TEM可以非常清晰的观察纳米金的形态。如图3,单纯的纳米金分布均匀,粒径很小
(图3左);加入适配体和PAH后纳米金开始聚集(图3中),且聚集程度很高;加入四环
素后,纳米金呈较分散态(图3右),聚集程度较不加四环素低,说明加入四环素形成的
aptamer-TET-PAH大分子复合物后,降低了PAH对纳米金的聚合能力。这与圆二
色谱得出的结论一致,进一步验证了实验原理的可行性。
2.3 PAH浓度优化
阳离子聚合物PAH通过破坏纳米金表面电荷,引起纳米金的聚集。体系PAH浓度
优化如图4所示,体系中适配体的浓度为10 nmol/L,当PAH浓度从0升高至8
nmol/L,A520和A650比值逐渐减少,当浓度超过8 nmol/L时,比值基本保持稳定,
说明体系中纳米金的聚集已经达到饱和,PAH对纳米金的聚集效果最好。因此选用
8 nmol/L为检测体系中PAH的最佳浓度。
2.4 Aptamer浓度优化
Aptamer对纳米金的聚集有保护作用。如图5所示,PAH浓度为8 nmol/L,分别向
体系中加入和不加入四环素进行吸光值测定,并计算差值△A520/A650 =
A520/A650 -(A520/A650)0,从图中可以看出,当体系中适配体终浓度由1 nmol/L
上升到3 nmol/L时,△A520/A650值逐渐增大,但当适配体浓度继续增加
时,△A520/A650值由开始下降。表明aptamer浓度为3 nmol/L时,体系信号响应
差值最大,检测灵敏度最高,选用3 nmol/L为最适aptamer浓度。
2.5 工作曲线
最优实验条件下,分别测定不同四环素浓度下的A520/A650值,其测定结果如图6
所示。四环素浓度c (μmol/L)为横坐标,A520/A650作为纵坐标,绘制体系的工作
曲线图,图中A520/A650的值随四环素浓度的增加而升高,当四环素浓度超过1
μmol/L时,A520/A650趋于稳定。在四环素浓度为100 nmol/L～1 μmol/L,拟合
曲线,回归方程为Y=2.23X+1.029 6,相关系数为0.9924。通过公式3σ/s[22,25]计
算出最低检测限(LOD)为95 nmol/L,式中σ代表空白样的标准偏差,s代表拟合直
线的斜率。该方法最低检测限低于国家标准225 nmol/L。
2.6 方法特异性实验
为考察体系对四环素的特异性,分别加入600 nmol/L庆大霉素、卡那霉素、氯霉
素、妥布霉素、甲砜霉素、土霉素、金霉素和TET于检测体系中,记录响应值。如
图7中插入图所示,空白对照为浅蓝色,加入四环素后,溶液为浅红色,具有较大的
A520/A650响应值;加入其他抗生素类物质后,体系均显示浅蓝色,具有较小的
A520/A650响应值。这说明该体系只对四环素具有较好的响应值,说明该法对四环
素具有较好的选择性。
2.7 牛奶样品检测
最佳实验条件下,将3个不同浓度的四环素标品加入牛奶样品中,按照前述方法处理,
取上清液进行试验,重复5次。结果如表1,样品回收率为108%～117%,相对标准
偏差为2.90%～3.60%,表明本方法具有较好的准确度和重复性。
本文根据阳离子聚合物PAH高效聚集纳米金的原理,开发了一种快速比色法检测乳
制品中四环素的方法。所建立方法在四环素浓度为100 nmol/L～1 μmol/L间,具
有良好的线性关系,其最低检测限为95 nmol/L。该操作简单、快速、特异性强,有
望在乳制品四环素检测中推广运用。
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2024年3月10日发(作者：阿会雯)
基于核酸适配体和阳离子聚合物PAH高效聚集纳米金比色法
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罗艳芳;贺兰;詹深山;刘乐;支月娥;周培
【摘 要】为满足乳制品中四环素快速检测要求,开发了基于核酸适配体(aptamer)
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A520/A650呈现良好的线性关系,最低检测限(LOD)为95 nmol/L,对四环素具有良
好的选择性.该方法已成功用于牛奶中四环素的检测,回收率为108％～117％,相对
标准偏差为2.9％～3.6％.
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【总页数】6页(P66-70,91)
【关键词】四环素;核酸适配体;PAH;纳米金;比色
【作 者】罗艳芳;贺兰;詹深山;刘乐;支月娥;周培
【作者单位】上海交通大学农业与生物学院,上海200240;上海交通大学农业与生
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【正文语种】中 文
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超级细菌的产生,食用具有抗生素残留肉制品后导致的过敏现象及某些器官的病变
等等[3-4]。为了保障消费者食品安全,欧盟规定牛奶中四环素最大残留为225
nmol/L[5],美国食品药品监督管理局规定牛奶中四环素最大残留为900 nmol/L[6]。
2002年,我国农业部修订的《动物性食品中兽药最高残留限量》中规定,牛羊奶以
及所有动物性食品中四环素类药物残留的最高残留量为225 nmol/L。
目前,四环素的检测方法很多,最常见的有高效液相色谱法(HPLC)[7-8]、毛细管电泳
法(CE)[9]、液质联用(LC-MS)[10]、酶联免疫(ELISA)[11]及微生物抑制法[12]等等。
近年来,核酸适配体已被广泛运用于重金属离子[13]、生物分子[14]及细胞[15]等的
检测。此外,核酸适配体合成简单,价格低廉。纳米金是一种非常理想的信号传导材
料,具有很好的光学特征。利用其开发的比色生物传感器对环境监测、生物医药的
探索具有非常重大的意义[16]。
聚烯丙胺盐酸盐(PAH)是一种高效阳离子聚合物,不仅具有聚集纳米金的作用而且还
能通过静电作用和DNA片段结合。Weejeong等[17]已经利用PAH这一性质成
功开发出疟疾的诊断方法。本实验选取PAH作为一种有效的纳米金聚集剂,通过其
控制纳米金的聚集和分散状态使纳米金溶液产生颜色变化检测四环素的含量。
1.1 主要仪器与试剂
M200 pro微型板块分光光度计为瑞士Tecan集团产品;圆二色谱仪为日本JASCO
公司产品;分析电子显微镜JEM-2010HT为日本日立集团产品;恒温孵育器为
Eppendorf公司产品;四环素适配体[18]:5'-
CGTACGGAATTCGCTAGCCCCCCGG-
CAGGCCACGGCTTGGGTTGGTCCCACTGCG-CGTGGATCCGAGCTCCACGTG-
3'由中国上海英潍捷基贸易有限公司合成;四环素,氯金酸,柠檬酸三钠,PAH,庆大霉
素、卡那霉素、氯霉素、妥布霉素、柔红霉素、甲砜霉素、土霉素和金霉素购自西
格玛奥德里奇(上海)贸易有限公司;牛奶样品购自于当地超市;所用试剂均为市售分
析纯试剂。
1.2 纳米金制备[19]
纳米金制备过程中所需的玻璃器皿均先用酸液[HNO3∶HCl=3∶1(V/V)]浸泡过夜,
用超纯水清洗后烘干。将100 mL 0.01%的氯金酸加入烧杯中置于磁力加热搅拌器
上加热,充分沸腾后迅速加入3.5 mL 1.0%的柠檬酸三钠溶液。继续加热搅拌30
min后,溶液颜色逐渐变为亮红色。停止加热,继续搅拌15 min后让其自然冷却,最
后用0.2 μm超滤膜(PVDF)过滤。滤液装于棕色试剂瓶中,置于4 ℃冰箱保存备用。
1.3 牛奶样品预处理
准确称取适量奶粉溶解于5 mL离心管中,随后加入2%的三氯乙酸溶液[20],混合均
匀后超声处理30 min。将超声处理后的混合液离心(10 000 r/min,8 min ),将上清
液过0.2 μm超滤膜(PVDF)以去除被沉淀的蛋白质、脂肪等物质。滤液置于4 ℃
冰箱保存备用。
1.4 PAH高效聚集纳米金检测原理
研究表明,阳离子聚合物PAH对纳米金具有很好的聚集效果[17]。本实验发现,当
PAH、aptamer和四环素形成复合物后,PAH的聚合能力下降。其检测原理(图1)
为:当体系中存在四环素时,PAH、aptamer和四环素形成大分子复合物,PAH聚合
能力显著下降,体系中纳米金聚集程度较低,体系溶液呈浅红色;当体系中不存在四环
素时,PAH仍具有较好的聚合能力,体系中纳米金聚集程度较高,体系溶液呈浅蓝色。
根据本课题组已有研究成果[21-22],亮红色纳米金的紫外-可见吸收光谱在520 nm
处具有最强吸收峰,在650 nm处具有最弱吸收峰,而聚集后呈蓝色的纳米金在520
nm处的吸收峰逐渐减弱,在650 nm处的吸收峰逐渐增强。因此,分别用酶标仪测
定这两处的吸收峰值A520和A650,计算吸收峰比值A520/A650。
1.5 检测方法
取30 μL 50 nmol/L四环素适配体和10 μL待测样品于离心管中混合均匀,置于恒
温孵育器中90 ℃孵育5 min后冷却到常温。向离心管中加入340 μL MOPS缓冲
液(pH 7.0),混合均匀后加入20 μL 200 nmol/L的PAH,在25 ℃恒温孵育器孵育
30 min。取出后向离心管中加入100 μL纳米金溶液,混合均匀。静置5 min后用
移液枪移取200 μL加入到96孔板中,置于M200 pro微型板块分光光度计测定
650 nm及520 nm 处的吸光值A650和A520,并计算A520/ A650。
2.1 圆二色谱图(CD)表征
据文献报道,四环素适配体CD峰谱在240～260 nm有1个负峰,270～290 nm有
1个正峰[23]。从图2可看出,加入四环素后,aptamer 的CD的正负峰值增大并伴
随明显蓝移,表明TET与适配体结合后,适配体的构象发生了很大变化[24]。当加入
PAH后,出峰位置没有发生变化,但是负峰值有所降低,说明PAH并没有改变适配体
的构象,只是吸附在其磷酸骨架上,形成了aptamer-TET-PAH大分子复合物。因此,
四环素和PAH都能与aptamer发生明显的相互作用。
2.2 电子透射电镜(TEM)表征
TEM可以非常清晰的观察纳米金的形态。如图3,单纯的纳米金分布均匀,粒径很小
(图3左);加入适配体和PAH后纳米金开始聚集(图3中),且聚集程度很高;加入四环
素后,纳米金呈较分散态(图3右),聚集程度较不加四环素低,说明加入四环素形成的
aptamer-TET-PAH大分子复合物后,降低了PAH对纳米金的聚合能力。这与圆二
色谱得出的结论一致,进一步验证了实验原理的可行性。
2.3 PAH浓度优化
阳离子聚合物PAH通过破坏纳米金表面电荷,引起纳米金的聚集。体系PAH浓度
优化如图4所示,体系中适配体的浓度为10 nmol/L,当PAH浓度从0升高至8
nmol/L,A520和A650比值逐渐减少,当浓度超过8 nmol/L时,比值基本保持稳定,
说明体系中纳米金的聚集已经达到饱和,PAH对纳米金的聚集效果最好。因此选用
8 nmol/L为检测体系中PAH的最佳浓度。
2.4 Aptamer浓度优化
Aptamer对纳米金的聚集有保护作用。如图5所示,PAH浓度为8 nmol/L,分别向
体系中加入和不加入四环素进行吸光值测定,并计算差值△A520/A650 =
A520/A650 -(A520/A650)0,从图中可以看出,当体系中适配体终浓度由1 nmol/L
上升到3 nmol/L时,△A520/A650值逐渐增大,但当适配体浓度继续增加
时,△A520/A650值由开始下降。表明aptamer浓度为3 nmol/L时,体系信号响应
差值最大,检测灵敏度最高,选用3 nmol/L为最适aptamer浓度。
2.5 工作曲线
最优实验条件下,分别测定不同四环素浓度下的A520/A650值,其测定结果如图6
所示。四环素浓度c (μmol/L)为横坐标,A520/A650作为纵坐标,绘制体系的工作
曲线图,图中A520/A650的值随四环素浓度的增加而升高,当四环素浓度超过1
μmol/L时,A520/A650趋于稳定。在四环素浓度为100 nmol/L～1 μmol/L,拟合
曲线,回归方程为Y=2.23X+1.029 6,相关系数为0.9924。通过公式3σ/s[22,25]计
算出最低检测限(LOD)为95 nmol/L,式中σ代表空白样的标准偏差,s代表拟合直
线的斜率。该方法最低检测限低于国家标准225 nmol/L。
2.6 方法特异性实验
为考察体系对四环素的特异性,分别加入600 nmol/L庆大霉素、卡那霉素、氯霉
素、妥布霉素、甲砜霉素、土霉素、金霉素和TET于检测体系中,记录响应值。如
图7中插入图所示,空白对照为浅蓝色,加入四环素后,溶液为浅红色,具有较大的
A520/A650响应值;加入其他抗生素类物质后,体系均显示浅蓝色,具有较小的
A520/A650响应值。这说明该体系只对四环素具有较好的响应值,说明该法对四环
素具有较好的选择性。
2.7 牛奶样品检测
最佳实验条件下,将3个不同浓度的四环素标品加入牛奶样品中,按照前述方法处理,
取上清液进行试验,重复5次。结果如表1,样品回收率为108%～117%,相对标准
偏差为2.90%～3.60%,表明本方法具有较好的准确度和重复性。
本文根据阳离子聚合物PAH高效聚集纳米金的原理,开发了一种快速比色法检测乳
制品中四环素的方法。所建立方法在四环素浓度为100 nmol/L～1 μmol/L间,具
有良好的线性关系,其最低检测限为95 nmol/L。该操作简单、快速、特异性强,有
望在乳制品四环素检测中推广运用。
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