2024年3月12日发(作者：函香露)
大豆耐盐相关基因GmNcl1功能标记的开发及验证
宁丽华;何晓兰;张大勇
【摘 要】土壤盐渍化严重影响大豆生产,因而鉴定大豆耐盐种质的分子标记对大豆
耐盐新品种的培育具有重要意义.本研究分析了大豆耐盐相关基因GmNcl1等位变
异位点的限制性酶切位点,通过酶切PCR产物,琼脂糖凝胶电泳和酶切片段分析,开
发建立了分子标记CAPS/Xba I.利用该标记对10份不同耐盐大豆种质进行酶切分
型鉴定,然后通过测序试验进行验证.结果表明,用所开发的共显性标记CAPS/Xba I
对10份大豆种质进行耐盐性鉴定,鉴定结果与依据表型进行鉴定的结果一致.由此
可见,CAPS/Xba I可用于大豆品种的耐盐性鉴定.%Soil salinization will lead to
serious reduction of yield and affect the quality of soybean. Therefore,
identif-ying molecular markers linked to the function gene of salt tolerance
will be helpful to soybean breeding. On the basis of the allelic variations of
GmNcl1, which was a salt tolerance gene, a pair of primers was designed,
and the method of restriction analysis was used to develop function
marker. Finally, a cleaved amplified polymorphic sequences( CAPS) marker
named CAPS/Xba I was developed. Ten different salt tolerance
characteristic soybean cultivars have been screened by this marker. The
result of salt tolerance soybean identified by the codominant marker was
consisted with the result of that identified ac-cording to phenotype. So,
CAPS/Xba I could be used in the identification of soybean salt tolerance.
【期刊名称】《江苏农业学报》
【年(卷),期】2017(033)006
【总页数】8页(P1227-1234)
【关键词】大豆;耐盐性;GmNcl1;酶切扩增多态性序列(CAPS)标记
【作 者】宁丽华;何晓兰;张大勇
【作者单位】江苏省农业科学院种质资源与生物技术研究所/江苏省农业生物学重
点实验室,江苏 南京 210014;江苏省农业科学院种质资源与生物技术研究所/江苏
省农业生物学重点实验室,江苏 南京 210014;江苏省农业科学院种质资源与生物技
术研究所/江苏省农业生物学重点实验室,江苏 南京 210014
【正文语种】中 文
【中图分类】S565.1
土壤盐渍化和次生盐渍化是一个全球性的问题，严重影响农业生产并造成生态问题。
由于环境恶化和不合理耕作等原因，盐渍化土壤面积不断增加。目前，全球约有
7.6%的土壤发生盐渍化，而中国盐渍化土壤面积高达 2.7×108 hm2，约占耕地面
积的10.0%[1-2]。大豆是重要的粮食作物和油料作物，在中国食品工业和农业生
产中占重要地位。大豆属于中度耐盐作物，其土壤盐度阈值为5 dS/m，将盐浓度
从2 dS/m提高到7 dS/m，大豆产量降低40.0%[3]。不同大豆品种的耐盐特性
显著不同，利用含有优异等位变异基因的种质资源[4]来选育耐盐品种，对于促进
盐渍土地的有效利用和实现大豆高产稳产具有重要的理论意义和实践价值。
传统耐盐大豆选育工作主要是通过在盐渍条件下对大豆不同生育期的耐盐特征表型
鉴定进行判断[5]，而表型鉴定结果易受环境及人为因素的影响，从而降低耐盐品
种的选育效率。分子生物学的发展和分子标记技术的广泛应用，为大豆耐盐遗传育
种提供了有效的辅助工具。为了更好地开展耐盐大豆育种工作，提高大豆耐盐育种
效率，育种工作者开发了一批与大豆耐盐基因紧密连锁的分子标记。使用改进的随
机多肽扩增DNA(RAPD)方法在耐盐品种Morgan和文丰7中鉴定到3个特异的
多态性位点[6]。郭蓓等[7]开发的共显性RAPD分子标记，可以鉴定耐盐大豆个体
(700 bp)和盐敏感大豆个体(600 bp)，该标记在锦豆33×Hark以及铁峰8号×早
熟6号这2个F2群体中均得到了验证[8]。田蕾[9]将前期开发的RAPD标记转化
为特定序列扩增DNA(SCAR)标记，SCAR标记的使用增强了RAPD标记的特异性
并简化了PCR分析。但是大豆耐盐性状是一个复杂的数量性状，由多个基因甚至
基因网络控制[10-11]，仅靠现有的耐盐分子标记来鉴定大豆种质的耐盐性是远远
不够的，急需开发和补充新的可用于育种实践的有效分子标记。
单价阳离子/H+逆向转运蛋白在植物对盐胁迫的抵抗中发挥重要作用。大豆
GmCAX1基因编码1种阳离子/H+逆向转运蛋白，该基因在拟南芥中过表达可显
著提高拟南芥植株的耐盐性[12]。大豆钾离子转运蛋白基因GmHKT1;4在烟草中
过表达后，会在盐胁迫的耐受中发挥作用[13]。在拟南芥中，若编码质膜上
Na+/H+转运蛋白的GmSOS1过表达，则可显著提高盐胁迫条件下种子的萌发率
[14]。GmSALT3属于定位在内质网上的阳离子/H+转运蛋白，在控制Na+向地
上部的运输中发挥重要作用[15]。AtCHX21转运蛋白能够将Na+从内皮层细胞运
输到根系的中柱中，最终将Na+加载到木质部[16]。大豆GmNcl1蛋白与拟南芥
CHXs转运蛋白家族成员亲缘关系较近。GmNcl1基因受盐胁迫诱导而表达上调，
为耐盐的相关基因[17-18]。赫卫等[17]对不同耐盐性大豆品种的GmNcl1基因进
行测序，发现耐盐品种和盐敏感品种之间存在特定的单倍型
GAGATATTC(耐)/TTT----CT(敏)序列。本研究拟根据已公布的GmNcl1基因
(Glyma.03g171500)的全基因序列，寻找该基因在不同耐盐特性材料中特异的单
核苷酸多态性(SNP)，并将其转化为基于PCR技术检测的基因特异性分子标记，
以期提高耐盐基因的筛选效率。
本试验所用大豆材料如表1显示，试验在江苏省农业科学院的温室中进行，大豆
的耐盐性采用本实验室前期建立的大豆苗期耐盐性鉴定方法[17]进行鉴定。
根据已公布的大豆基因组序列，利用Primer 5.0在线软件设计引物(表2)，用于基
因启动子的扩增以及分子标记开发。
以Lee68和Jackson的DNA为模板，用高保真聚合酶扩增启动子序列。PCR反
应体系：2×Phanta Max buffer 25 μl，dNTP Mix(10 mmol/L)1 μl，上游引物
(10 μmol/L)和下游引物(10 μmol/L)各4 μl，高保真聚合酶(1 U/μl)1 μl，模板
DNA(20 ng/μl)4 μl，ddH2O补足到50 μl。PCR扩增程序为：95 ℃预变性3
min；95 ℃变性15 s，56 ℃退火45 s，72 ℃延伸30 s，35个循环,最后72 ℃
延伸10 min，4 ℃保温。对PCR产物进行凝胶电泳检测，条带大小与目的片段大
小一致，用PCR回收试剂盒回收纯化PCR产物，回收后的产物与T载体重组，将
重组质粒转化到大肠杆菌DH5α中。对菌液PCR鉴定为阳性的样品进行测序验证。
测序正确的启动子序列用植物顺式元件数据库PLACE[21]和Plant-CARE数据库
[22]进行在线预测，分析启动子可能存在的顺式作用元件。本研究中所涉及的引物
合成和测序试验均由南京金斯瑞有限公司完成。
用限制性内切酶Xba I单酶切PCR扩增产物。酶切体系：10×FastDigest Green
buffer 5 μl，DNA 1 μg，限制性内切酶Xba I 1 μl，ddH2O补足到50 μl。确保
酶切体系中Xba I酶的用量充足。酶切条件为：37 ℃温浴15 min,反应结束后，
65 ℃温浴20 min终止酶切反应。对酶切产物进行2.5%琼脂糖凝胶电泳检测。
以盐敏感大豆材料Jackson和耐盐大豆材料Lee68的DNA为模板，以Ncl-
Promoter为引物，克隆GmNcl1基因的启动子，长度为1 320 bp(图1)，其测
序比对结果如图2显示，不同耐盐特性大豆材料GmNcl1启动子的碱基序列存在
差异。为了进一步分析这些碱基差异是否会引起不同材料中顺式作用元件的差异，
对这2种不同耐盐特性大豆材料GmNcl1基因的启动子区域序列进行在线分析。
表3显示，GmNcl1启动子区含有真核生物RNA聚合酶II识别位点TATA-盒子
和CAAT-盒子，还发现MYB转录因子结合位点、TC-重复序列和热激应答元件
(HSE)等与干旱、高温等胁迫响应相关的顺式作用元件，说明GmNcl1基因可能被
盐胁迫相关的转录因子调控。该基因启动子区域含有与激素代谢相关的调控元件，
例如参与脱落酸响应的ABA应答元件(ABRE)，参与乙烯代谢的乙烯应答元件。另
外，该基因存在一些光响应的顺式作用元件(G-盒子和盒子 I)，还存在一些其他的
调控元件，如调节胚乳发育的顺式作用元件(Skn-1_基序)。对Lee68和Jackson
的GmNcl1启动子顺式作用元件进行比较，发现不同耐盐性大豆材料的该基因启
动子区所包含顺式作用元件的类型和数目并没有差异。
利用DNAMAN软件对启动子区域突变位点前后的限制性酶切位点进行分析，结
果(表4)显示，-403(G→C)和-670(T→G)处没有酶切位点，而在2种材料
(Jackson和Lee68)的-897(T→A)处均存在Tsp509 I 酶切位点，不适合开发标记。
-385(C→T)处形成特异的Xba I酶切位点，-393(----→ATAT)处可以形成特异的
Ssp I酶切位点，-948(T→G)处可以形成特异的Tail酶切位点，这3个位点适合建
立酶切扩增多态性序列(CAPS)标记。从经济学角度考虑，-385(C→T)处形成的
Xba I酶切位点更经济实惠，所以本研究重点对这个位点进行酶切分析。
提取Lee68和Jackson的DNA，用GmNcl1基因的特异引物(CAPS-Xba I)进行
PCR扩增，反应结束后，将所得PCR产物在2.5%琼脂糖凝胶上进行电泳。采用
限制性内切酶Xba I对PCR产物进行酶切，得到-385位点的酶切分型结果。
Lee68对应的酶切产物仅有1条324 bp的DNA片段，而Jackson包含280 bp
和40 bp的2个DNA片段。将这个具有多态性的酶切扩增序列命名为
CAPS/Xba I标记。利用CAPS/Xba I标记对另外8个供试材料进行分子标记鉴定。
结果(图3)显示，耐盐大豆材料中酶切后条带为324 bp，而盐敏感大豆材料的酶
切后条带为280 bp和40 bp 2个条带。
图4显示，酶切后仅有324 bp 1条片段的PCR产物的第30～33位核苷酸为
ATAT，并且第45位核苷酸为T。酶切后有280 bp和40 bp 2条片段的PCR产
物的第45位核苷酸为C。
GmNcl1基因和GmSALT3基因均位于Do等[23]定位的一个主效耐盐QTL区段
内，该QTL位于SSR03_1335与SSR_1359之间。生物信息学分析结果表明，这
2个基因均编码Na+/H+转运蛋白家族。Guan等[15]发现，GmSALT3基因与大
豆耐盐性相关，该基因主要在耐盐大豆品种铁峰8号的根系中表达，NaCl处理后，
该基因在耐盐大豆材料中大量表达，在盐敏感大豆材料中不表达。GmSALT3基因
可能在Na+向地上部的运输中发挥作用，但是并不直接控制盐分向地上部的运输。
赫卫等[17]发现，盐胁迫下GmNcl1基因诱导表达上调，表明该基因也与大豆的
耐盐性相关。盐胁迫处理4种不同耐盐特性的大豆后，GmNcl1表达量均显著上
调，而且盐敏感品种上调倍数高于耐盐品种[18]。基因的表达受上游相关转录因子
的调控，而转录因子对基因的调控是通过与启动子区的顺式作用元件共同作用完成
的[24]。因此，分析启动子区的顺式作用元件有助于了解基因的表达调控机制。本
研究发现，具有不同耐盐特性的大豆GmNcl1基因启动子区域内顺式作用元件的
类型和数目并无差别，说明不同材料GmNcl1基因表达模式的差异并不是由于启
动子区域差异所造成的。
传统耐盐性鉴定必须严格控制处理条件，并经过反复的表型鉴定才能获得准确的耐
盐种质，需要投入大量的人力物力，而且鉴定结果的准确性低。采用分子标记技术
分析大豆耐盐特性，不易受外界环境和生长时期等因素的限制，能直接准确地鉴定
出耐盐特性[25]。大豆耐盐分子育种工作已经开展了一段时间，但是利用分子标记
辅助选择育种的研究进展缓慢。这主要是因为标记与目的基因间的距离较远，在标
记辅助育种过程中易发生分离，影响分子标记辅助选择的效率。在候选基因区段内
进行序列多样性分析，开发基于候选基因的功能标记，可以对遗传多样性和遗传距
离进行相对准确地估计，提高分子标记辅助选择和分子设计育种的效率。耐盐相关
基因GmNcl1在不同耐盐特性的大豆材料中存在不同的单倍型
GAGATATTC(耐)/TTT----CT(敏)序列[17]。
为了更加高效地筛选和鉴定耐盐大豆品种，本研究将GmNcl1基因的多态位点开
发成CAPS标记。CAPS标记是特异引物PCR扩增产物与限制性内切酶相结合而
产生的一种DNA分子标记，是针对目标基因本身开发的标记，它揭示了特异PCR
产物DNA序列上限制性酶切位点的变异信息。CAPS标记技术具有多态性高，共
显性，所需DNA量少，操作简便，结果稳定可靠等优点[26]。本研究所开发的
CAPS/Xba I分子标记能有效鉴定大豆的耐盐特性。值得注意的是，本研究只对有
限的大豆材料进行鉴定，而耐盐性是一个复杂的数量性状，由多个基因甚至基因网
络控制，该基因或许并不能完全解释表型变异，所以下一步还需要选取更具代表性
的材料对本研究中所开发的分子标记进行验证。
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2024年3月12日发(作者：函香露)
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宁丽华;何晓兰;张大勇
【摘 要】土壤盐渍化严重影响大豆生产,因而鉴定大豆耐盐种质的分子标记对大豆
耐盐新品种的培育具有重要意义.本研究分析了大豆耐盐相关基因GmNcl1等位变
异位点的限制性酶切位点,通过酶切PCR产物,琼脂糖凝胶电泳和酶切片段分析,开
发建立了分子标记CAPS/Xba I.利用该标记对10份不同耐盐大豆种质进行酶切分
型鉴定,然后通过测序试验进行验证.结果表明,用所开发的共显性标记CAPS/Xba I
对10份大豆种质进行耐盐性鉴定,鉴定结果与依据表型进行鉴定的结果一致.由此
可见,CAPS/Xba I可用于大豆品种的耐盐性鉴定.%Soil salinization will lead to
serious reduction of yield and affect the quality of soybean. Therefore,
identif-ying molecular markers linked to the function gene of salt tolerance
will be helpful to soybean breeding. On the basis of the allelic variations of
GmNcl1, which was a salt tolerance gene, a pair of primers was designed,
and the method of restriction analysis was used to develop function
marker. Finally, a cleaved amplified polymorphic sequences( CAPS) marker
named CAPS/Xba I was developed. Ten different salt tolerance
characteristic soybean cultivars have been screened by this marker. The
result of salt tolerance soybean identified by the codominant marker was
consisted with the result of that identified ac-cording to phenotype. So,
CAPS/Xba I could be used in the identification of soybean salt tolerance.
【期刊名称】《江苏农业学报》
【年(卷),期】2017(033)006
【总页数】8页(P1227-1234)
【关键词】大豆;耐盐性;GmNcl1;酶切扩增多态性序列(CAPS)标记
【作 者】宁丽华;何晓兰;张大勇
【作者单位】江苏省农业科学院种质资源与生物技术研究所/江苏省农业生物学重
点实验室,江苏 南京 210014;江苏省农业科学院种质资源与生物技术研究所/江苏
省农业生物学重点实验室,江苏 南京 210014;江苏省农业科学院种质资源与生物技
术研究所/江苏省农业生物学重点实验室,江苏 南京 210014
【正文语种】中 文
【中图分类】S565.1
土壤盐渍化和次生盐渍化是一个全球性的问题，严重影响农业生产并造成生态问题。
由于环境恶化和不合理耕作等原因，盐渍化土壤面积不断增加。目前，全球约有
7.6%的土壤发生盐渍化，而中国盐渍化土壤面积高达 2.7×108 hm2，约占耕地面
积的10.0%[1-2]。大豆是重要的粮食作物和油料作物，在中国食品工业和农业生
产中占重要地位。大豆属于中度耐盐作物，其土壤盐度阈值为5 dS/m，将盐浓度
从2 dS/m提高到7 dS/m，大豆产量降低40.0%[3]。不同大豆品种的耐盐特性
显著不同，利用含有优异等位变异基因的种质资源[4]来选育耐盐品种，对于促进
盐渍土地的有效利用和实现大豆高产稳产具有重要的理论意义和实践价值。
传统耐盐大豆选育工作主要是通过在盐渍条件下对大豆不同生育期的耐盐特征表型
鉴定进行判断[5]，而表型鉴定结果易受环境及人为因素的影响，从而降低耐盐品
种的选育效率。分子生物学的发展和分子标记技术的广泛应用，为大豆耐盐遗传育
种提供了有效的辅助工具。为了更好地开展耐盐大豆育种工作，提高大豆耐盐育种
效率，育种工作者开发了一批与大豆耐盐基因紧密连锁的分子标记。使用改进的随
机多肽扩增DNA(RAPD)方法在耐盐品种Morgan和文丰7中鉴定到3个特异的
多态性位点[6]。郭蓓等[7]开发的共显性RAPD分子标记，可以鉴定耐盐大豆个体
(700 bp)和盐敏感大豆个体(600 bp)，该标记在锦豆33×Hark以及铁峰8号×早
熟6号这2个F2群体中均得到了验证[8]。田蕾[9]将前期开发的RAPD标记转化
为特定序列扩增DNA(SCAR)标记，SCAR标记的使用增强了RAPD标记的特异性
并简化了PCR分析。但是大豆耐盐性状是一个复杂的数量性状，由多个基因甚至
基因网络控制[10-11]，仅靠现有的耐盐分子标记来鉴定大豆种质的耐盐性是远远
不够的，急需开发和补充新的可用于育种实践的有效分子标记。
单价阳离子/H+逆向转运蛋白在植物对盐胁迫的抵抗中发挥重要作用。大豆
GmCAX1基因编码1种阳离子/H+逆向转运蛋白，该基因在拟南芥中过表达可显
著提高拟南芥植株的耐盐性[12]。大豆钾离子转运蛋白基因GmHKT1;4在烟草中
过表达后，会在盐胁迫的耐受中发挥作用[13]。在拟南芥中，若编码质膜上
Na+/H+转运蛋白的GmSOS1过表达，则可显著提高盐胁迫条件下种子的萌发率
[14]。GmSALT3属于定位在内质网上的阳离子/H+转运蛋白，在控制Na+向地
上部的运输中发挥重要作用[15]。AtCHX21转运蛋白能够将Na+从内皮层细胞运
输到根系的中柱中，最终将Na+加载到木质部[16]。大豆GmNcl1蛋白与拟南芥
CHXs转运蛋白家族成员亲缘关系较近。GmNcl1基因受盐胁迫诱导而表达上调，
为耐盐的相关基因[17-18]。赫卫等[17]对不同耐盐性大豆品种的GmNcl1基因进
行测序，发现耐盐品种和盐敏感品种之间存在特定的单倍型
GAGATATTC(耐)/TTT----CT(敏)序列。本研究拟根据已公布的GmNcl1基因
(Glyma.03g171500)的全基因序列，寻找该基因在不同耐盐特性材料中特异的单
核苷酸多态性(SNP)，并将其转化为基于PCR技术检测的基因特异性分子标记，
以期提高耐盐基因的筛选效率。
本试验所用大豆材料如表1显示，试验在江苏省农业科学院的温室中进行，大豆
的耐盐性采用本实验室前期建立的大豆苗期耐盐性鉴定方法[17]进行鉴定。
根据已公布的大豆基因组序列，利用Primer 5.0在线软件设计引物(表2)，用于基
因启动子的扩增以及分子标记开发。
以Lee68和Jackson的DNA为模板，用高保真聚合酶扩增启动子序列。PCR反
应体系：2×Phanta Max buffer 25 μl，dNTP Mix(10 mmol/L)1 μl，上游引物
(10 μmol/L)和下游引物(10 μmol/L)各4 μl，高保真聚合酶(1 U/μl)1 μl，模板
DNA(20 ng/μl)4 μl，ddH2O补足到50 μl。PCR扩增程序为：95 ℃预变性3
min；95 ℃变性15 s，56 ℃退火45 s，72 ℃延伸30 s，35个循环,最后72 ℃
延伸10 min，4 ℃保温。对PCR产物进行凝胶电泳检测，条带大小与目的片段大
小一致，用PCR回收试剂盒回收纯化PCR产物，回收后的产物与T载体重组，将
重组质粒转化到大肠杆菌DH5α中。对菌液PCR鉴定为阳性的样品进行测序验证。
测序正确的启动子序列用植物顺式元件数据库PLACE[21]和Plant-CARE数据库
[22]进行在线预测，分析启动子可能存在的顺式作用元件。本研究中所涉及的引物
合成和测序试验均由南京金斯瑞有限公司完成。
用限制性内切酶Xba I单酶切PCR扩增产物。酶切体系：10×FastDigest Green
buffer 5 μl，DNA 1 μg，限制性内切酶Xba I 1 μl，ddH2O补足到50 μl。确保
酶切体系中Xba I酶的用量充足。酶切条件为：37 ℃温浴15 min,反应结束后，
65 ℃温浴20 min终止酶切反应。对酶切产物进行2.5%琼脂糖凝胶电泳检测。
以盐敏感大豆材料Jackson和耐盐大豆材料Lee68的DNA为模板，以Ncl-
Promoter为引物，克隆GmNcl1基因的启动子，长度为1 320 bp(图1)，其测
序比对结果如图2显示，不同耐盐特性大豆材料GmNcl1启动子的碱基序列存在
差异。为了进一步分析这些碱基差异是否会引起不同材料中顺式作用元件的差异，
对这2种不同耐盐特性大豆材料GmNcl1基因的启动子区域序列进行在线分析。
表3显示，GmNcl1启动子区含有真核生物RNA聚合酶II识别位点TATA-盒子
和CAAT-盒子，还发现MYB转录因子结合位点、TC-重复序列和热激应答元件
(HSE)等与干旱、高温等胁迫响应相关的顺式作用元件，说明GmNcl1基因可能被
盐胁迫相关的转录因子调控。该基因启动子区域含有与激素代谢相关的调控元件，
例如参与脱落酸响应的ABA应答元件(ABRE)，参与乙烯代谢的乙烯应答元件。另
外，该基因存在一些光响应的顺式作用元件(G-盒子和盒子 I)，还存在一些其他的
调控元件，如调节胚乳发育的顺式作用元件(Skn-1_基序)。对Lee68和Jackson
的GmNcl1启动子顺式作用元件进行比较，发现不同耐盐性大豆材料的该基因启
动子区所包含顺式作用元件的类型和数目并没有差异。
利用DNAMAN软件对启动子区域突变位点前后的限制性酶切位点进行分析，结
果(表4)显示，-403(G→C)和-670(T→G)处没有酶切位点，而在2种材料
(Jackson和Lee68)的-897(T→A)处均存在Tsp509 I 酶切位点，不适合开发标记。
-385(C→T)处形成特异的Xba I酶切位点，-393(----→ATAT)处可以形成特异的
Ssp I酶切位点，-948(T→G)处可以形成特异的Tail酶切位点，这3个位点适合建
立酶切扩增多态性序列(CAPS)标记。从经济学角度考虑，-385(C→T)处形成的
Xba I酶切位点更经济实惠，所以本研究重点对这个位点进行酶切分析。
提取Lee68和Jackson的DNA，用GmNcl1基因的特异引物(CAPS-Xba I)进行
PCR扩增，反应结束后，将所得PCR产物在2.5%琼脂糖凝胶上进行电泳。采用
限制性内切酶Xba I对PCR产物进行酶切，得到-385位点的酶切分型结果。
Lee68对应的酶切产物仅有1条324 bp的DNA片段，而Jackson包含280 bp
和40 bp的2个DNA片段。将这个具有多态性的酶切扩增序列命名为
CAPS/Xba I标记。利用CAPS/Xba I标记对另外8个供试材料进行分子标记鉴定。
结果(图3)显示，耐盐大豆材料中酶切后条带为324 bp，而盐敏感大豆材料的酶
切后条带为280 bp和40 bp 2个条带。
图4显示，酶切后仅有324 bp 1条片段的PCR产物的第30～33位核苷酸为
ATAT，并且第45位核苷酸为T。酶切后有280 bp和40 bp 2条片段的PCR产
物的第45位核苷酸为C。
GmNcl1基因和GmSALT3基因均位于Do等[23]定位的一个主效耐盐QTL区段
内，该QTL位于SSR03_1335与SSR_1359之间。生物信息学分析结果表明，这
2个基因均编码Na+/H+转运蛋白家族。Guan等[15]发现，GmSALT3基因与大
豆耐盐性相关，该基因主要在耐盐大豆品种铁峰8号的根系中表达，NaCl处理后，
该基因在耐盐大豆材料中大量表达，在盐敏感大豆材料中不表达。GmSALT3基因
可能在Na+向地上部的运输中发挥作用，但是并不直接控制盐分向地上部的运输。
赫卫等[17]发现，盐胁迫下GmNcl1基因诱导表达上调，表明该基因也与大豆的
耐盐性相关。盐胁迫处理4种不同耐盐特性的大豆后，GmNcl1表达量均显著上
调，而且盐敏感品种上调倍数高于耐盐品种[18]。基因的表达受上游相关转录因子
的调控，而转录因子对基因的调控是通过与启动子区的顺式作用元件共同作用完成
的[24]。因此，分析启动子区的顺式作用元件有助于了解基因的表达调控机制。本
研究发现，具有不同耐盐特性的大豆GmNcl1基因启动子区域内顺式作用元件的
类型和数目并无差别，说明不同材料GmNcl1基因表达模式的差异并不是由于启
动子区域差异所造成的。
传统耐盐性鉴定必须严格控制处理条件，并经过反复的表型鉴定才能获得准确的耐
盐种质，需要投入大量的人力物力，而且鉴定结果的准确性低。采用分子标记技术
分析大豆耐盐特性，不易受外界环境和生长时期等因素的限制，能直接准确地鉴定
出耐盐特性[25]。大豆耐盐分子育种工作已经开展了一段时间，但是利用分子标记
辅助选择育种的研究进展缓慢。这主要是因为标记与目的基因间的距离较远，在标
记辅助育种过程中易发生分离，影响分子标记辅助选择的效率。在候选基因区段内
进行序列多样性分析，开发基于候选基因的功能标记，可以对遗传多样性和遗传距
离进行相对准确地估计，提高分子标记辅助选择和分子设计育种的效率。耐盐相关
基因GmNcl1在不同耐盐特性的大豆材料中存在不同的单倍型
GAGATATTC(耐)/TTT----CT(敏)序列[17]。
为了更加高效地筛选和鉴定耐盐大豆品种，本研究将GmNcl1基因的多态位点开
发成CAPS标记。CAPS标记是特异引物PCR扩增产物与限制性内切酶相结合而
产生的一种DNA分子标记，是针对目标基因本身开发的标记，它揭示了特异PCR
产物DNA序列上限制性酶切位点的变异信息。CAPS标记技术具有多态性高，共
显性，所需DNA量少，操作简便，结果稳定可靠等优点[26]。本研究所开发的
CAPS/Xba I分子标记能有效鉴定大豆的耐盐特性。值得注意的是，本研究只对有
限的大豆材料进行鉴定，而耐盐性是一个复杂的数量性状，由多个基因甚至基因网
络控制，该基因或许并不能完全解释表型变异，所以下一步还需要选取更具代表性
的材料对本研究中所开发的分子标记进行验证。
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