2024年3月18日发(作者:掌元绿)
第
42
卷第
10
期
2020
年
10
月
中国预防兽医学报
Chinese
Journal
of
Preventive
Veterinary
Medicine
Vbl.42No.10
Oct.
2020
doi
:
1
0.3969/j
.issn.
1008-0589.201910017
不同细胞唾液酸受体类型及唾液酸转移酶
与流感病毒敏感性的研究
常吉祥
"
,
杨春光蔦袁
兵駕杨子峰
,
,
张云辉心
(1
.昆明理工大学医学院
,
云南昆明
650504;
2
.云南省第一人民医院昆明理工大学附属医院
,
云南昆明
650032;
3
.呼吸疾病国家重点实验室呼吸疾病国家临床研究中心
/
广州医科大学附属第一医院
,
广东广州
510120)
摘
要
:
为研究人/禽流感病毒对细胞的敏感性差异,
本研究选取
9
种常用细胞
,
分别以
10
5
TCID
5
o
的人源甲型
流感病毒
(IAV
)
CA04
株与禽流感病毒
(AIV
)
Y280
株感染不同细胞
,
检测不同细胞中流感病毒的增殖水平
;
利用免疫
荧光试验检测细胞表面唾液酸
(
SA
)
受体类型及其与流感病毒的结合能力
;
采用流式细胞术定量检测每种细胞表面的
SA
类型及含量
;
通过
RT-PCR
方法检测唾液酸转移酶
(ST
)
(ST3GAL4
、
ST6GAL1)
基因
mRNA
的转录水平
。
结果显示
,
感染
CA04
株后
,
MDCK
、
16HBE
、
DF-1
和
A549
检测到了病毒滴度
,
但病毒低度较低为
:
3.2X10
2
TCID
50
/0.1
mL~
0.95X10
1
TCIDso/
感染
Y280
株后
,
病毒滴度从高到低依次为
MDCK
、
DF-1
、
Vero
、
293T
、
CHO-kl,
Hep-2
、
A549
、
16HBE
和
BHK,
病毒滴度为
6.3x10
’
TCIDMO.l
mL~9.9xl
(
y
TCID/;
免疫荧光试验结果显示
,
MDCK
、
16HBE
、
DF-1
和
A549
细胞表面存在大量
SAa
(
2-6)Gal
结构的糖链
,
BHK
细胞表面该糖链最少
,
MDCK
、
DF-1
和
16HBE
细胞表面比其它细胞含有更多的
SAa(2-3)Gal
结构的糖链
,因此
MDCK
、
DF-1
和
A549
细胞对人源流感病毒
CA04
株的结合能力最强
,
MDCK
、
DF-1
则对
AIVY280
株结合能力较强
;
流式细胞术定量分析结果显示,
9
种细胞中
MDCK
和
DF-1
细胞表面
SAa
(
2-6)Gal
糖链结构含量最高
,
其结合人流感病毒
CA04
株的能力较强
;
而不同细胞表面
SAa
(2-3)Gal
糖链结构含量差异不大
,
其结合
AIVY280
株的能力无显著差异
;
RT-PCR
检测结果显示
,
MDCK
、
DF-1
细胞
的
ST
相关基因
(
ST3GAL4
、
ST6GALl)mRNA
转录水平高于其它细胞
,
BHK
细胞的
ST3GAL4
、
ST6GAL1
mRNA
转录水平
则最低
。
因此
,
MDCK
、
DF-1
细胞与流感病毒的结合能力较强
,
而
BHK
细胞与流感病毒的结合能力较低
。
上述结果表
明
,
SA
含量
、
ST
转录水平较高的细胞
,
其结合流感病毒量也较多
,
对流感病毒的敏感性也高
;
反之
,则对流感病毒
敏感性较低
。
以上结果表明
,
细胞表面
SA
含量
、
ST
基因转录水平与结合的流感病毒量均呈正相关
。
本研究为进一步
探究
SA
及
ST
在流感病毒感染中的作用机制奠定了基础
,
同时为研究人/禽流感病毒中宿主细胞选择提供了参考依据
。
关键词:
流感病毒
;
唾液酸
;
唾液酸转移酶
;
细胞系
中图分类号:
S852.65
文献标识码
:
A
文章编号
:
1
008-0589
(2020)
10-0979-07
Study
on
the
types
of
sialic
acid
receptors
and
sialyltransferases
of
differe
nt
cells
and
their
sensitivity
to
in
flue
nza
virus
CHANG
Ji-xiang
1
-
2
,
YANG
Chun-guang
3,
YUAN
Bing
2
,
YANG
Zi-feng
3
,
ZHANG
Yun-hui
12
*
(1.
Medical
Faculty,
Kunming
University
of
Science
and
Technology,
Kunming
650504,
China;
2.
The
First
People's
Hospital
of
Yunnan
Province
&
Affiliated
Hospital
of
Kunming
University
of
Science
and
Technology,
Kunming
650032,
China;
3.
State
Key
Laboratory
of
Respiratory
Diseases,
National
Clinical
Research
Center
for
Respiratory
Diseases,
First
Affiliated
Hospital
of
Guangzhou
Medical
University,
Guangzhou
510120,
China)
♦Corresponding
author
收稿日期
:
2019-10-17
基金项目
:
国家自然科学基金国际(地区)合作与交流项目⑻
661168012)
;
国家自然科学基金
(81760379)
;
云南省高
层次卫生计生技术人才医学学科带头人培养项目
(
D-2017050
)
作者简介
:
常吉祥
(1995-),
男
,
安徽阜南人
,
硕士研究生
,
主要从事流感病毒动物感染模型研究.
*
通信作者
:
:
yunhuizhang31
88@
1
980
中国预防兽医学报
2020
年
Abstract:
In
order
to
study
the
sensitivity
differences
between
human
and
avian
influenza
viruses
to
different
cells,
9
commonly
used
cell
lines
were
selected
in
this
study.
We
infected
different
cells
with
10
5
TCIDso
of
human
influenza
A
virus
(IAV)
CA04
strain
or
avian
influenza
virus
(AIV)
Y280
strain,
and
detected
the
replication
levels
of influenza
viruses
in
different
cells.
We
applied
immunofluorescence
to
detect
the
sialic
acid
(SA)
receptor
types
in
the
cell
surface
and
the
irabilities
to
bind
to
influenza
virus.
We
used
flow
cytometry
to
quantitatively
detect
the
types
and
the
relative
amounts
of
SA
on
the
surface
of
each
cell
line.
The
transcription
level
of
ST
(ST3GAL4,
ST6GAL1)
mRNAs
was
detected
by
RT-PCR
method.
The
results
showed
that
virus
titers
were
detected
in
cell
lines
including
MDCK,
16HBE,
DF-1
and
A549
after
infection
with
the
CA04
strain,
although
the
virus
titers
were
low
(3.2x10' TQD
5
o/O.l
mL-0.95x
10
1
TCID
5
o/O.l
mL).
After
infection
with
the
Y280
strain,
the
virus
titers
in
the
cell
lines
with
an
order
from
high
to
low
were
MDCK,
DF-1,
Vero,
293T,
CHO-kl,
Hep-2,
A549,
16HBE
and
BHK,
with
virus
titers
of
6.3x10
’
TCIDso/O.l
mL-9.9x
10
1
TCIDso/0
」
mL.
Immunofluorescence
test
results
showed
a
large
number
of
SAa(2-6)
Gal
on
the
surface
of
MDCK,
16HBE,
DF-1
and
A549
cells,
with
the
least
in
BHK
and
the
most
in
MDCK,
DF-1
and
16HBE
cells.
SAa(2-3)Gal
in
MDCK,
DF-1
and
A549
cells
have
the
strongest
binding
abilities
to
human
CA04
strain,
while
MDCK
and
DF-1
have
strong
binding
ability
to
AIV
Y280
strain.
The
results
of
quantitative
analysis
by
flow
cytometry
showed
that
the
amount
of
surface
SAa(2-6)Gal
in
MDCK
and
DF-1
cells
were
the
most
among
the
9
types
of
cells,
and
their
binding
to human
influenza
virus
CA04
were
stronger,
while
the
amouts
of
surface
SAa(2-3)
Gal
in
the
surface
of
these
cell
lines
were
comparable,
and
there
is
no
significant
difference
in
the
irabilities
to
bind
to
AIV
Y280
strain.
RT-PCR
results
showed
that
the
mRNA
transcription
levels
of
ST-related
genes
(ST3GAL4,
ST6GAL1)
in
MDCK
and
DF-1
cells
were
higher
than
those
in
other
cells,
while
the
transcription
levels
of
ST3GAL4
and
ST6GAL1
mRNAs
in
BHK
cells
were
the
lowest.
The
above
results
indicate
that
cells
with more
SA
in
the
surface
and
higher
ST
transcription
level
have
larger
amounts
of
binding
influenza
virus
and
thus
are
more
sensitive
to
influenza
virus,
and
vice
versa.
This
study
lays
a
foundation
for
further
exploring
the
mechanism
of
SA
and
ST
in
influenza
virus
infection,
and
provides
a
reference
for
the
study
of
host
cell
selection
in
human/avian
influenza
viruses.
Key
words:
influenza
virus;
sialic
acid;
sialyltransferase;
cell
line
流感病毒
(
influenza
virus)
是一种呈杆状或丝状
到半乳糖
(Gal)
等糖脂或糖蛋白形成受体叫
ST
调控
SA
与
Gal
之间糖昔键的连接方式
,
不同的糖昔键结
的正粘病毒科
(
Orthomyxoviridae
)
病毒
,
根据病毒感
染种属可分为人流感病毒
、
禽流感病毒
(Avian
influ
enzavirus,
AIV)
、
以及猪流感病毒等
,
其中人流感
构可形成底物特异性不同的
SA
受体
,
最终影响
SA
与流感病毒表面
HA
的结合心
。
一般认为人类流感
病毒优先结合
a
(
2-6
)
唾液酸
(
SAa
(
2-6
)
Gal
、
Neu5Aca(
2-6
)
Gal)
,
而
AIV
优先识别
a
(
2-3
)
唾液
病毒根据其核蛋白的抗原性分为甲型流感病毒
(IAV)
和乙型流感病毒等
。
IAV
可通过人的呼吸道
传播引起严重的呼吸疾病
;
AIV
在家禽与野禽间呈
高度接触性传播
,也可直接感染人类引起死亡
,
严
酸
(SAa
(
2-3
)
Gal
、
Neu5Aca
(
2-3
)
Gal)
[6]
,
这种流感
病毒与受体结合特性可能限定了病毒感染宿主的范
围
。
已有文献报道
,
H5N1
AIV
(
A/duck/Guangxi/35
/
2001
(DK/35
)
株可以同时识别
SAa
(
2-3
)
Gal
和
SAa
重影响畜牧业发展且威胁人类生命安全叫
流感病毒表面血凝素
(Hemagglutinin,
HA
)
蛋白
与宿主呼吸道的唾液酸受体结合可介导病毒的吸附
(
2-6
)
Gal
受体叫
H9N2
AIV
流行株则趋向为结合人
及膜融合过程
,
是病毒侵入宿主细胞并产生有效复
制的前提
%
唾液酸
(Sialic
acid,
SA)
是经唾液酸转
源
SA
受体
SAa
(
2-6)
Gal
181
,
表明
IAV
感染人类的第
一步是其
HA
受体的亲和性要发生改变
。
目前未见
移酶
(
Sialyltransferase
,
ST
)
参与调控合成的流感病毒
受体决定簇
,
参与流感病毒感染人类的
ST
主要包括
NeuSAc
a
(
2-3
)
Gal
唾液酸转移酶
1~4
(
ST3GAL1-
宿主细胞
SA
受体及
ST
的表达与流感病毒相关性研
究的报道
。
因此
,
本研究将人源
IAV
CA04
株与
AIV
Y280
株感染
9
种细胞
,
初步探究宿主细胞
ST
表达与
ST3GAL
4
)
和
Neu5Ac
a
(
2-6)
Gal
唾液酸转移酶
1
(
ST6GAL1
),
它们分别将底物
CMP-
Neu5Ac
中的
流感病毒敏感性的相关性
,
为流感病毒侵入机制研
究奠定基础
,
为抗流感病毒药物研究选择合适的细
胞系提供参考依据
。
Neu5Ac
及
SA
以
a
(
2-3
)
和
a
(
2-6
)
糖甘键的形式转移
第
10
期
常吉祥
,
等.不同细胞唾液酸受体类型及唾液酸转移酶与流感病毒敏感性的研究
981
1
材料与方法
1.1
病毒与细胞
人源
IAV
A/Califomia/04/2009
/
(
H1N1
)
(
CA04
)
株
、
AIV
A/Duck/HongKong/Y280/1997
(
H9N2
)
(
¥280
)
株由香港大学
MalikPeris
教授惠赠
。
CA04
株在
MDCK
细胞中传代
,
Y280
株在
10
日龄鸡胚
传代后
,
测定病毒滴度后备用
。
犬肾细胞
(
MDCK
)
、
幼仓鼠肾细胞
(
BHK
)
、
人喉表皮样癌细胞
(
Hep-
2
)
、
人支气管上皮细胞
(
16HBE
)
、
人非小细胞肺癌
细胞
(
A549
)
、
非洲绿猴肾细胞
(
Vero
)
、
中国仓鼠卵
巢细胞
(
CHO-kl
)
、
鸡成纤维细胞系
(
DF-1
)
和人源
胚胎肾细胞
(
HEK293T
)
均购自美国标准培养物保存
库
(
ATCC
)
O
1.2
主要试剂高糖型细胞培养基
(
DMEM
)
、
胎牛
血清
(
FBS
)
、
青
/
链霉素购自
Gibco
公司
;
无血清培
养基
VIVO
15
购自
Lonza
公司
;
TPCK
胰酶
、
牛血清
白蛋白
(
BSA
)
购自
Sigma
公司
;
新鲜鸡血样品采自活
禽市场
;
FITC
标记的素黑接骨木凝集素
(
Sambucus
Nigra
,
SNA
)
、
怀愧凝集素
l
(
Maackiaamurensis
,
MAA
I
)
购自
Vector
Laboratories
公司
;
鼠源抗
IAV
核
蛋白
IgG
抗体
、
羊抗鼠
IgG-FITC
购自
ABcam
公司
;
去唾液酸化
BSA
、
含
DAPI
的封片介质购自
Thermo
Fisher
公司
;
核酸提取试剂盒购自诺唯赞公司
;
RT-
PCR
试剂盒
、
荧光定量
PCR
试剂盒均购自
TaKaRa
公司
。
1.3
流感病毒感染不同细胞后的增殖水平的测定
将
MDCK
、
BHK
、
HEP-
2
、
16HBE
、
A549
、
Vero
、
CHO-kl,
DF-1
和
293T
细胞传代至
96
孔板
。
37
X.
5%
CO?
培养
。
分别将
CA04
株
(
1x10,
TCIDso/O.l
|±L
)
和
Y280
株
(lxlO
5
TCID
50
/0.1
|
jl
L
)
用无血清
DMEM
培
养基
10
倍倍比稀释至
10J10
,
倍
,
将
6
个稀释度的病
毒液以每孔
100
分别接种至长成单层上述细胞的
96
孔板中
,
每个稀释度设
6
个复孔
。
48h
后
,
每孔
取
50
jjl
L
上清液于
U
型血凝板中与
0.5%
的鸡红细胞
悬液混合
,
记录每孔凝集度
,
并采用
Reed-Muench
法分别计算半数细胞感染剂量
(
TCIDJ
。
1.4
SA
受体类型及其与流感病毒结合能力的检测
将
1.3
中所述细胞传代至带有爬片的
24
孔板中,每
种细胞设
2
个复孔
,
待细胞长至
50%
时
,
弃去培养
基
。
每种细胞选两孔分别加入
100
jiUjlFITC
标记
的植物凝集素
SNA
(
特异性结合
SAa
(
2-6
)
Gal
)
和
MAA
I
(
特异性结合
SAa(
2
-
3
)
Gal
)
(
终浓度
5
pg/mL
)
,
室温孵育
lh
后
,
以含有抗荧光淬灭剂的封片液
(
含
有
DAPI)
封片
,
经直接免疫荧光法检测各细胞表面
受体类型
;
同上述细胞爬片操作
,
待细胞长至
50%
时
,
每种细胞取
2
孔
,
分别接种
M0I
10
的
CA04
和
Y280
株病毒液
,
4T
孵育
90
min,
PBS
洗涤后
,
每
孔加
500
jjl
L
的
4%
多聚甲醛固定
30
min,
每孔加
100
4
鼠源抗
IVA
核蛋白
IgG
(
5
jig/mL
)
,
4
T
孵育
过夜
,
每孔加
100
jjl
L
羊抗鼠
IgG-FITC
(
5
jig/mL
)
室
温孵育
lh
。
经间接免疫荧光试验
(
IFA
)
检测各细胞
表面
SA
受体与流感病毒的结合情况
。
1.5
细胞表面
SA
受体的定量检测
将
1.3
中所述细
胞传代至
6
孔板
,
细胞长至
90%
时
,
收集细胞
,
以
ixio,
个
/
管分装
,
4
七离心
,
预冷的
PBS
重悬
、
离
心
,
重复上述步骤
3
遍
。
加
3%
去唾液酸化
BSA,
室
温封闭
1
h,
每种细胞分装两管分别加入
200
r
L
FICT
标记的植物凝集素溶液
SNA
和
MAA
I
(
终浓度
分别为
5
jig/mL
)
,
室温避光孵育
30
min
o
经过预冷
的
PBS
重悬
、
离心
,
重复
3
遍后
,
经流式细胞仪检
测
FITC
通道的荧光强度
。
利用
Flowjo
V10
软件统计
分析各组细胞样品的平均荧光强度
(
MFI
)
。
1.6
各细胞
ST
相关基因
mRNA
转录水平的检测
根据
GenBank
中登录的不同物种的
GAPDH
(
NM_
001357943;
NM_001244854;
NM_001003142;
NM_
204305
)
、
ST3GAL4
(
NR_145671
;
NM_001246699
;
XM_
014113293
;
JX035870
)
和
ST6GAL1
(
NM_173216
;
XM_
015276836
;
NM_001246815
;
XM_022414319
)
基因序
列
,
利用
Primer
Premier
6.0
软件设计引物
(
表
1
)
,
并
由北京六合华大基因科技有限公司合成
。
收集
1.3
中所述细胞
,
利用核酸提取试剂盒提取各细胞总
RNA,
反转录为
cDNA,
以其为模板
,
利用表
1
中的
引物
,
经荧光定量
PCR
检测各细胞中
ST3GAI4
和
ST6GAL1
基因的
mRNA
转录水平
。
2
结果
2.1
各细胞中流感病毒滴度测定的结果两种流感
病毒
(
CA04
、
Y280
株
)
感染
9
种细胞
(
MDCK
、
BHK
、
Hep-2
、
16HBE
、
A549
、
Vem
、
CHO-kl
、
DF-1
和
293T)
48h
后
,
检测细胞上清中病毒滴度
。
结果显示
,
感染
CA04
株后
,
MDCK
、
16HBE
、
DF-1
和
A549
检测到了病毒滴度
,
分别为
3.2X10
2
TCID
50
/0.1
mL
、
3.2X101
TCIDso/O.l
mL
、
2.6x10*
TCID/0.1
mL
、
0.95
x
10
1
TCIDso/O.l
mL
;
而
AIV
Y280
株在
9
种细胞中系均
982
中国预防兽医学报
2020
年
有复制
,
其中病毒滴度从咼到低依次为
MDCK
、
DF-1
、
Vero
、
293T
、
CHO-kl
、
Hep-
2
、
A549
、
16HBE
、
和
BHK,
分别为
6.3xl0
3
TCID
s
>«)
.l
mL.
bJxKfTCIDso/O.l
mL.
3.9X10
2
TCIDso/O.l
mL.
3.9X10
2
TCID/O.l
mL
、
3.2X10
2
TCIDdO.l
mL
、
3.2X10
2
TCKWO.l
mL
、
2.5
xlO
2
TCID50/
0.1
mL
、
1.9X10
2
TCID50/0.I
mL
、
9.9X10
1
TCID/O.l
mL
(
图
1
)
。
表明人流感病毒
CA04
株仅在
MDCK
、
DF-1
、
16HBE
和
A549
细胞中有一定的复制能力
;
AIV
Y280
株在
MDCK
细胞中的复制能力最强
,
而在其余细胞
中的复制能力相近
。
表
1
实验所用引物信息
Table
1
Primers used
in
this
study
引物
序列
(
5-3
,
)
Primer
Sequence
Chinese
F:
ACCACGGTCCATGCCATCACT
amster-GAPDH
R:
TGCCTGCTTCACCACCTTCTTG
Chinese
F:
ACGCTCCTGTGGCTGGTTATGA
hamster-ST3GAL4
R:
CCTGTGGTTGGCTTCTGCTTGA
Chinese
F:
GCACCAGTAGCCAACTTCCAACAGGAT
hamster-ST6GAL
1
R:
GGTCGGGATACAGCTTGCGATAACTCTT
Human-GAPDH
F
:
GCTCTCCAGAACATCATCCCTGCCTCT
R:
CGACGCCTGCTTCACCACCTTCTTG
Hiunan-ST3GAL4
F
:
AACAACCCAGACACACTCCTCGTCCTG
R:
ACCCTTTCGCACCCGCTTCTTATCACT
Human-ST6GAL1
F:
GGCAGGTGTGCTGTTGTGTCGTCAG
R
:
ATCTTGTTGGAAGTTGGCTGTGGGTGC
F:
CTCTGCTCCTTCTGCTGATGCC
°
g
~
R:
TCCGATGCCTGCTTCACTACCT
F:
AAGTGTCGGAGGTGCGTGGT
°
g
~
R:
AGCAGCGTGTTCGGATTGTTCT
F
:
ACCCACCGTCTTCAGGAATGCT
R
:
TGTCCGTCTGCCGCTTAGAAGG
Gallus-GAPDH
F:
CCCAGAACATCATCCCAGCGTCCACT
R
:
ACGGCAGGTCAGGTCAACAACAGAGA
Gdlus-ST3GAL4
F:
GCCTGAGAGCATCCAGAGCCTGAAGT
R:
GCACCAGCAGCGTGTTCGGATTGTT
Gallus-ST6GAL1
F:
GGTCGCTGTGCTGTTGTGTCCTCA
R:
TGGATTTCTGCATGATACGGTGCTGGAT
g
5
口
CA04
E3Y280
O
I
i-
.
'
4
-
3.8
Q
m
5
3
2.8
2.5
2.8
2.6
2.6
2.5
2.3
1
2
2.0
1.5
$
1.0
居
1
A
0
少余
、
3
神膚
3P
n
炉护
图
1
两株流感病毒在不同细胞中的复制能力的检测结果
Fig.
1
Detection
of
replication
abilities
of
two
influenza
viruses
in
different
cells
2.2
SA
受体类型及其与流感病毒结合的检测结
果
将
9
种细胞分别加入
FITC
标记的植物凝集素
SNA
和
MAAI
后
,
采用直接免疫荧光法检测各细胞
表面特异性受体
。
结果显示
,
SNA
处理细胞后,
MDCK
、
16HBE
、
DF-1
和
A549
细胞可见大量绿色
荧光
,
而
BHK
细胞绿色荧光最少
(
图
1A
)
,
表明前
4
种细胞含有大量
SAa
(
2-6
)
Gal
结构的糖链
,
而
BHK
的
SAa
(
2-6
)
Gal
含量最少
。
这与人源
IAV
CA04
株在
各细胞中病毒滴度测定的结果一致
,
即有大量
SAa
(
2-6
)
Gal
糖链的细胞对
CA04
株敏感性较高
;
SAa
(
2-6
)
Gal
糖链含量较少的
BHK
细胞对
CA04
株敏感
性较低
。
MAAI
处理细胞后
,
MDCK
、
DF-1
和
16HBE
细胞表面可见很强的绿色荧光信号
,
BHK
、
HEP-2
、
A549
、
Vero
、
CHO-kl
和
293T
细胞绿色荧
光信号明显较弱
(
图
2B
)
,
表明
MDCK
、
DF-1
和
16HBE
细胞表面比其它细胞含有更多的
SAa
(
2-3
)
Gal
结构的糖链
。
因此
,
SAa
(
2-3
)
Gal
含量高的细
胞对
AIV
Y280
株敏感性较高
。
同时也表明细胞对流
感病毒的敏感性与其表面
SA
受体含量呈正相关
。
为进一步研究流感病毒与
SA
受体类型的关
系
,
经
IFA
检测各细胞表面受体与病毒的结合能
力
。
结果可见
,
人源
IAV
CA04
株感染各细胞后,
MDCK
、
DF-1
和
A549
细胞的荧光强度最高
(
图
2C
)
;
AIV
Y280
株感染细胞后
,
MDCK
、
DF-1
细胞
的荧光强度高于其余细胞
(
图
2D
)
。
结果表明
,不
同细胞对流感病毒的结合能力存在差异
,
MDCK
、
DF-1
和
A540
细胞含较多的
SAa
(
2-6
)
Gal
糖链
,
因
此对人流感病毒
CA04
株结合能力较强
;
细胞表面
有更多的
SAa
(
2-3
)
Gal
糖链结构的
MDCK
、
DF-1
则
对
AIV
Y280
株结合能力较强
。
病毒与细胞表面受体
结合能力与其表面
ST
糖链含量呈正相关
。
2.3
细胞表面流感病毒
SA
受体的定量检测结果
将
9
种细胞分别加入
FITC
标记的植物凝集素
SNA
和
MAAI
后
,
采用流式细胞技术检测细胞表面被标记
的唾液酸受体的荧光强度
,
并采用
Flowjo
V10
软件
分析各细胞表面的
MFI
即
SA
的含量
。
结果显示,
SNA
标记的
DF-1
细胞的荧光强度显著高于其它
细胞
(
p<0.05
)
,
MDCK
的荧光强度显著高于
293T
、
Hep-
2,
A549
、
16HBE
、
和
BHK
(
p<0.05
)
(
图
3A
)
,
MDCK
的荧光强度与
CHO-kl
、
Vero
无统计学差异
(
p>0.05
)
(
图
3A
)
;
MAA
I
标记的各细胞之间的荧光
强度差异不显著
(
图
3B
)
。
表明
9
种细胞中
MDCK
和
第
10
期
常吉祥
,
等.
不同细胞唾液酸受体类型及唾液酸转移酶与流感病毒敏感性的研究
983
DF
-
1
细胞表面
SAa(2-6)Gal
糖链结构最为丰富
,
其
Y280
株的能力无显著差异
,
与
2.1
的结果基本一
结合人流感病毒
CA04
株的能力较强
;
而
SAa
(
2-3)
Gal
糖链结构在细胞之间差异不大
,
其结合
AIV
A
C
致
。
同时进一步表明
,
SA
糖链含量与流感病毒的敏
感性呈正相关
。
A
:
SNA
标记的各细胞
;
B
:
MAAI
标记的各细胞
;
C
:
CA04
株与各细胞受体结合的检测结果
;
D
:
Y280
株与各细胞受体结合的
检测结果
;
蓝色
:
DAPI
染色细胞核
;
绿色
:
FITC;
刻度尺为
50
jim
A;
Cell
labeled
with
SNA;
B;
Cell
labeled
with
MAA
I;
C;
The
results
of
CA04
binding
to
different
cell
receptors;
D:
Detection
results
of
the
binding
of
Y280
strain
to
different
cell
receptors;
Blue:
DAPI
stained
cell
nucleus;
Green:
FITC;
Scale
bar:
50
jim
图
2
各细胞表面
SA
受体及其对不同病毒结合能力的检测结果
Fig.
2
Detection
results
of
sialic
acid
receptors
on
cell
surface
and
their
binding
ability
to
different
viruses
2.4
各细胞
ST
相关基因的
mRNA
转录水平的检测结
E
w
m
—
V
N
S
果
为了从基因水平分析细胞表面
SA
受体含量
,
经荧
光定量
PCR
检测
9
种细胞
ST
相关基因
(ST3GAL4.
ST6GAL1)
的
mRNA
转录水平
。
结果显示
,
MDCK
、
DF-
1
细胞的
ST3GAL4
、
ST6GAL1
mRNA
转录水平高于
其它细胞
,
Vero
、
293T
、
CHO-kl.
Hep
-
2
、
A549
、
16HBE
细胞两种
ST
mRNA
转录水平均较低
,
BHK
细
胞的两种
ST
mRNA
转录水平均最低(图
4
)
。
结合
2.1
的结果表明
,
MDCK
、
DF
-
1
细胞
ST
(ST3GAL4.
ST6GAL1)
含量较高
,
其与流感病毒的结合能力较
强
;
而
BHK
细胞的
ST(ST3GAL4
、
ST6GAL1)
转录水
平最低
,
其结合流感病毒的能力也最低甚至无结合
*:p<0.05;**:p<0.01
A:
SNA
标
i
論胞
;
B;
MAA
I
标记细胞
;
MFI
:
平均荧光强度
;
a.u.
:
荧光数值单位
能力
。
细胞结合流感病毒的能力与其表面的
ST
转录
水平也呈正相关
。
结合
2.3
的结果表明
,
MDCK
、
DF-
1
细胞的
ST(ST3GAL4
、
ST6GAL1)
含量较高
,
其
A:
Cell
labeled
with
SNA;
B:
Cell
labeled
with
MAA
I
MFI:
Mean
fluorescence
intensity;
a.u.:
Fluorescence
value
unit
图
3
各细胞衷面
SA
的定■检测结果
Fig.
3
Quantitative
detection
results
of
SA
on
the
surface
of
various
cell
lines
细胞表面
SAa
(
2-6
)
Gal/SAa
(
2-3
)
Gal
糖链结构最丰
富
;
而
BHK
细胞的
ST
(ST3GAL4
、
ST6GAL1)
转录水
平最低
,
其细胞表面
SAa
(
2-6
)
Gal/SAa
(
2-3
)
Gal
984
中国预防兽医学报
2020
年
链结构最少
。
细胞表面
SAa
(
2-6
)
Gal/SAa
(
2-3
)
Gal
糖链与其胞内
ST
转录水平也呈正相关
。
A
30
000
20
000
IQA2
UOHd
-c
oSUBTl
4
000
3
000
2
000
1
000
15
10
-
-=H
T
5
----------
1
n
n
十
图
4
ST
相关基因
ST6GAL1
(
A
)
、
ST3GAL4(B)
在
各细胞中转录水平的检测结果
Fig.
4
Results
of
transcription
levels
of
sialyltransferase
ST6GAL1
(A)
and
ST3GAL4
(B)
in
each
ceU
3
讨论
细胞作为流感病毒的增殖基质
,
具有经济方
便,
外界影响因素少
,
重复性好
,
质量稳定等优
点
。
MDCK
广泛应用于人类流感病毒的分离和增
殖
,
其对流感病毒敏感性较高
,
但其却不适于人源
H3N2
流感病毒的生长%为寻找更多合适流感病毒
增殖的宿主细胞
,
本研究通过人
/
禽两种流感病毒感
染
9
种常用细胞后测定病毒的
TCID
50
,
比较不同的
细胞对人
/
禽流感病毒的敏感性
。
结果显示
,
含有丰
富
SAa
(2-6)
Gal
糖链的
MDCK
、
16HBE
和
DF-1
对人
源流感病毒
CA04
株敏感
,
而
Vero
、
293T
、
CH0-
kl
、
Hep-2
和
BHK
对该病毒不敏感
;
含丰富
SAa
(
2-3
)
Gal
糖链的
MDCK
、
DF-1
细胞同时也对
AIV
Y280
株敏感
。
存在于细胞表面糖蛋白或糖脂中的
SA
是流感病
毒受体
㈣
,
流感病毒感染宿主细胞是由其表面
HA
与
宿主细胞表面上的糖链受体
SA
共同介导的
,
这可能
是本研究中细胞对流感病毒敏感性差异的原因
。
因
此,
为分析不同细胞对流感病毒敏感性差异的原
因
,
本研究利用免疫荧光技术检测
9
种细胞表面的
流感病毒受体类型
,
并通过间接免疫荧光技术以及
流式细胞术对
9
种细胞表面
SAa
(
2-6
)
Gal
和
SAa
(
2
-
3
)
Gal
两种糖链进行定性定量分析
。
结果显示
,细
胞表面含有大量
SAa
(
2-6)
Gal
和
SAa
(
2-3
)Gal
糖链
结构的
MDCK
与
DF-1
细胞表面吸附大量流感病毒
,
而
SAa
(
2-6
)
Gal
和
SAa
(
2-3
)
Gal
含量较少的
BHK
、
Hep-2
与
CHO-kl
细胞则结合少量流感病毒
。
表明细
胞对流感病毒的敏感性与细胞表面
SA
中
SAa
(
2-6)
Gal
和
/
或
SAa
(
2-3
)
GaU
糖链含量呈正相关
。
为分析细胞表面
SA
含量与
ST
相关基因
mRNA
转录的关系
,
本研究检测了
SA
受体合成途径中的关
键酶
ST
在不同细胞中的
mRNA
转录水平
。
结果显
示
,
MDCK
、
DF-1
的
ST3GAL1
和
ST6GAL1
mRNA
转
录水平较高
。
文献报道干扰
ST6GAL1
与
ST3GAU
的
表达水平
,
能够抑制流感病毒在
Ver
。
细胞中的增
殖
2
坷
;
过表达
ST6GAL1
则能增加
MDCK
对人流感
病毒的敏感性即
,
表明
ST
的表达水平影响流感病毒
对宿主细胞的感染
。
本研究中
,
ST6GALlmRNA
转
录水平高的细胞表面有着丰富的人流感病毒受体
SAa
(
2-6
)
Gal,
同样
ST3GAL4
mRNA
转录水平高的
细胞则有着丰富的
AIV
受体
SAa
(
2-3
)
Gal,
受体丰
富的细胞
(MDCK
和
DF-1)
表现出对流感病毒高的结
合能力以及较高的敏感性
。
由此表明
,
细胞对流感
病毒的敏感性与
SA
受体含量有关
,
而
SA
含量受
ST
表达影响
,
即
ST
表达影响细胞对流感病毒的敏感
性
。
但是
,
本研究中
16HBE
等细胞
ST
的转录水平与
其受体含量
、
病毒结合量结果并不完全一致
,
这可
能是因为
SA
受体并非流感病毒感染传播的唯一决定
因子网
;
Vero
、
A549
和
CHO-kl
细胞对
Y280
株敏
感
,
但其
ST3GAL4mRNA
转录水平并不高
,
这可能
是因为
SAa
(
2-3
)
Gal
的合成还受
ST3
家族中其它酶
的调控丽
;
免疫荧光与流式细胞术的结果显示
,
16HBE
、
Vero
、
293T
、
CHO-kl
、
Hep-2
、
A549
细胞
表面
AIV
受体
SAa
(
2-3
)
Gal
的荧光值不高
,
可能是
因为
MAA
I
仅特异性识别
SAa2-3GalBl-4GlcNAc,
而对
SAa2-3GalBl-3GlcNAc
特异性不强
,
而该细胞
系表面可能还存在丰富的
SAa2
-
3GalBl-3GlcNAc
o
本研究的
MDCK
、
DF-1
中的
ST3GAL4
与
ST6GAL1
均
具有较高的转录水平
,
无法证明单一类型
ST
与流感
病毒感染宿主细胞能力的相关性
。
因此
,
ST
在流感
病毒侵入宿主细胞中的作用还需进一步深入研究
。
Kosuke
Takada
等人发现
,
在
MDCK
中过表达人类流
第
10
期
常吉祥
,
等.不同细胞唾液酸受体类型及唾液酸转移酶与流感病毒敏感性的研究
985
感病毒受体
[SAa
(
2-6)
Gal]
和降低
AIV
受体
[SAa
(2
-
3)
Gal]
的表达水平
,
其比野生
MDCK
更有效支持人
源
H3N2
流感病毒的分离和生长
,
并且保持更高的
遗传稳定性阴
。
这为后续研究提供思路
,
即能否通
过修饰表达不同
ST
的表达水平
,
从而改变细胞对不
同流感病毒的敏感性
。
综上所述
,
本研究结果表明
,
不同细胞对人
/
禽
流感病毒的敏感性存在差异
,
这与细胞表面
SA
含
量以及
ST
的转录水平相关
,
这为开发新的适用于流
感病毒培养的细胞提参考依据
。
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hemagglutinin
or
neuraminidase
mutations
when
propagated
for
antigenic
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D,
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D
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the
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receptor
and
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silencing
of
beta-
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alpha-
2,
6
-
sialyltransferase
1
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human
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H5N1
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ing
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Y,
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S
L,
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al.
a2,
3-
Sialyltransferase
ST3Gal
III
Modulates
pancreatic
cancer
cell
motility
and
adhesion
in
vitro
and
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its
metastatic
potential
in
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MDCK
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line
for
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efficient
isolation
and
propagation
of
human
influenza
viruses
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Nat
Microbiol,
2019,
4
(8):
1268-1273.
(本文编辑
:
李
娜
;
英文编辑
:
钟功勋)
2024年3月18日发(作者:掌元绿)
第
42
卷第
10
期
2020
年
10
月
中国预防兽医学报
Chinese
Journal
of
Preventive
Veterinary
Medicine
Vbl.42No.10
Oct.
2020
doi
:
1
0.3969/j
.issn.
1008-0589.201910017
不同细胞唾液酸受体类型及唾液酸转移酶
与流感病毒敏感性的研究
常吉祥
"
,
杨春光蔦袁
兵駕杨子峰
,
,
张云辉心
(1
.昆明理工大学医学院
,
云南昆明
650504;
2
.云南省第一人民医院昆明理工大学附属医院
,
云南昆明
650032;
3
.呼吸疾病国家重点实验室呼吸疾病国家临床研究中心
/
广州医科大学附属第一医院
,
广东广州
510120)
摘
要
:
为研究人/禽流感病毒对细胞的敏感性差异,
本研究选取
9
种常用细胞
,
分别以
10
5
TCID
5
o
的人源甲型
流感病毒
(IAV
)
CA04
株与禽流感病毒
(AIV
)
Y280
株感染不同细胞
,
检测不同细胞中流感病毒的增殖水平
;
利用免疫
荧光试验检测细胞表面唾液酸
(
SA
)
受体类型及其与流感病毒的结合能力
;
采用流式细胞术定量检测每种细胞表面的
SA
类型及含量
;
通过
RT-PCR
方法检测唾液酸转移酶
(ST
)
(ST3GAL4
、
ST6GAL1)
基因
mRNA
的转录水平
。
结果显示
,
感染
CA04
株后
,
MDCK
、
16HBE
、
DF-1
和
A549
检测到了病毒滴度
,
但病毒低度较低为
:
3.2X10
2
TCID
50
/0.1
mL~
0.95X10
1
TCIDso/
感染
Y280
株后
,
病毒滴度从高到低依次为
MDCK
、
DF-1
、
Vero
、
293T
、
CHO-kl,
Hep-2
、
A549
、
16HBE
和
BHK,
病毒滴度为
6.3x10
’
TCIDMO.l
mL~9.9xl
(
y
TCID/;
免疫荧光试验结果显示
,
MDCK
、
16HBE
、
DF-1
和
A549
细胞表面存在大量
SAa
(
2-6)Gal
结构的糖链
,
BHK
细胞表面该糖链最少
,
MDCK
、
DF-1
和
16HBE
细胞表面比其它细胞含有更多的
SAa(2-3)Gal
结构的糖链
,因此
MDCK
、
DF-1
和
A549
细胞对人源流感病毒
CA04
株的结合能力最强
,
MDCK
、
DF-1
则对
AIVY280
株结合能力较强
;
流式细胞术定量分析结果显示,
9
种细胞中
MDCK
和
DF-1
细胞表面
SAa
(
2-6)Gal
糖链结构含量最高
,
其结合人流感病毒
CA04
株的能力较强
;
而不同细胞表面
SAa
(2-3)Gal
糖链结构含量差异不大
,
其结合
AIVY280
株的能力无显著差异
;
RT-PCR
检测结果显示
,
MDCK
、
DF-1
细胞
的
ST
相关基因
(
ST3GAL4
、
ST6GALl)mRNA
转录水平高于其它细胞
,
BHK
细胞的
ST3GAL4
、
ST6GAL1
mRNA
转录水平
则最低
。
因此
,
MDCK
、
DF-1
细胞与流感病毒的结合能力较强
,
而
BHK
细胞与流感病毒的结合能力较低
。
上述结果表
明
,
SA
含量
、
ST
转录水平较高的细胞
,
其结合流感病毒量也较多
,
对流感病毒的敏感性也高
;
反之
,则对流感病毒
敏感性较低
。
以上结果表明
,
细胞表面
SA
含量
、
ST
基因转录水平与结合的流感病毒量均呈正相关
。
本研究为进一步
探究
SA
及
ST
在流感病毒感染中的作用机制奠定了基础
,
同时为研究人/禽流感病毒中宿主细胞选择提供了参考依据
。
关键词:
流感病毒
;
唾液酸
;
唾液酸转移酶
;
细胞系
中图分类号:
S852.65
文献标识码
:
A
文章编号
:
1
008-0589
(2020)
10-0979-07
Study
on
the
types
of
sialic
acid
receptors
and
sialyltransferases
of
differe
nt
cells
and
their
sensitivity
to
in
flue
nza
virus
CHANG
Ji-xiang
1
-
2
,
YANG
Chun-guang
3,
YUAN
Bing
2
,
YANG
Zi-feng
3
,
ZHANG
Yun-hui
12
*
(1.
Medical
Faculty,
Kunming
University
of
Science
and
Technology,
Kunming
650504,
China;
2.
The
First
People's
Hospital
of
Yunnan
Province
&
Affiliated
Hospital
of
Kunming
University
of
Science
and
Technology,
Kunming
650032,
China;
3.
State
Key
Laboratory
of
Respiratory
Diseases,
National
Clinical
Research
Center
for
Respiratory
Diseases,
First
Affiliated
Hospital
of
Guangzhou
Medical
University,
Guangzhou
510120,
China)
♦Corresponding
author
收稿日期
:
2019-10-17
基金项目
:
国家自然科学基金国际(地区)合作与交流项目⑻
661168012)
;
国家自然科学基金
(81760379)
;
云南省高
层次卫生计生技术人才医学学科带头人培养项目
(
D-2017050
)
作者简介
:
常吉祥
(1995-),
男
,
安徽阜南人
,
硕士研究生
,
主要从事流感病毒动物感染模型研究.
*
通信作者
:
:
yunhuizhang31
88@
1
980
中国预防兽医学报
2020
年
Abstract:
In
order
to
study
the
sensitivity
differences
between
human
and
avian
influenza
viruses
to
different
cells,
9
commonly
used
cell
lines
were
selected
in
this
study.
We
infected
different
cells
with
10
5
TCIDso
of
human
influenza
A
virus
(IAV)
CA04
strain
or
avian
influenza
virus
(AIV)
Y280
strain,
and
detected
the
replication
levels
of influenza
viruses
in
different
cells.
We
applied
immunofluorescence
to
detect
the
sialic
acid
(SA)
receptor
types
in
the
cell
surface
and
the
irabilities
to
bind
to
influenza
virus.
We
used
flow
cytometry
to
quantitatively
detect
the
types
and
the
relative
amounts
of
SA
on
the
surface
of
each
cell
line.
The
transcription
level
of
ST
(ST3GAL4,
ST6GAL1)
mRNAs
was
detected
by
RT-PCR
method.
The
results
showed
that
virus
titers
were
detected
in
cell
lines
including
MDCK,
16HBE,
DF-1
and
A549
after
infection
with
the
CA04
strain,
although
the
virus
titers
were
low
(3.2x10' TQD
5
o/O.l
mL-0.95x
10
1
TCID
5
o/O.l
mL).
After
infection
with
the
Y280
strain,
the
virus
titers
in
the
cell
lines
with
an
order
from
high
to
low
were
MDCK,
DF-1,
Vero,
293T,
CHO-kl,
Hep-2,
A549,
16HBE
and
BHK,
with
virus
titers
of
6.3x10
’
TCIDso/O.l
mL-9.9x
10
1
TCIDso/0
」
mL.
Immunofluorescence
test
results
showed
a
large
number
of
SAa(2-6)
Gal
on
the
surface
of
MDCK,
16HBE,
DF-1
and
A549
cells,
with
the
least
in
BHK
and
the
most
in
MDCK,
DF-1
and
16HBE
cells.
SAa(2-3)Gal
in
MDCK,
DF-1
and
A549
cells
have
the
strongest
binding
abilities
to
human
CA04
strain,
while
MDCK
and
DF-1
have
strong
binding
ability
to
AIV
Y280
strain.
The
results
of
quantitative
analysis
by
flow
cytometry
showed
that
the
amount
of
surface
SAa(2-6)Gal
in
MDCK
and
DF-1
cells
were
the
most
among
the
9
types
of
cells,
and
their
binding
to human
influenza
virus
CA04
were
stronger,
while
the
amouts
of
surface
SAa(2-3)
Gal
in
the
surface
of
these
cell
lines
were
comparable,
and
there
is
no
significant
difference
in
the
irabilities
to
bind
to
AIV
Y280
strain.
RT-PCR
results
showed
that
the
mRNA
transcription
levels
of
ST-related
genes
(ST3GAL4,
ST6GAL1)
in
MDCK
and
DF-1
cells
were
higher
than
those
in
other
cells,
while
the
transcription
levels
of
ST3GAL4
and
ST6GAL1
mRNAs
in
BHK
cells
were
the
lowest.
The
above
results
indicate
that
cells
with more
SA
in
the
surface
and
higher
ST
transcription
level
have
larger
amounts
of
binding
influenza
virus
and
thus
are
more
sensitive
to
influenza
virus,
and
vice
versa.
This
study
lays
a
foundation
for
further
exploring
the
mechanism
of
SA
and
ST
in
influenza
virus
infection,
and
provides
a
reference
for
the
study
of
host
cell
selection
in
human/avian
influenza
viruses.
Key
words:
influenza
virus;
sialic
acid;
sialyltransferase;
cell
line
流感病毒
(
influenza
virus)
是一种呈杆状或丝状
到半乳糖
(Gal)
等糖脂或糖蛋白形成受体叫
ST
调控
SA
与
Gal
之间糖昔键的连接方式
,
不同的糖昔键结
的正粘病毒科
(
Orthomyxoviridae
)
病毒
,
根据病毒感
染种属可分为人流感病毒
、
禽流感病毒
(Avian
influ
enzavirus,
AIV)
、
以及猪流感病毒等
,
其中人流感
构可形成底物特异性不同的
SA
受体
,
最终影响
SA
与流感病毒表面
HA
的结合心
。
一般认为人类流感
病毒优先结合
a
(
2-6
)
唾液酸
(
SAa
(
2-6
)
Gal
、
Neu5Aca(
2-6
)
Gal)
,
而
AIV
优先识别
a
(
2-3
)
唾液
病毒根据其核蛋白的抗原性分为甲型流感病毒
(IAV)
和乙型流感病毒等
。
IAV
可通过人的呼吸道
传播引起严重的呼吸疾病
;
AIV
在家禽与野禽间呈
高度接触性传播
,也可直接感染人类引起死亡
,
严
酸
(SAa
(
2-3
)
Gal
、
Neu5Aca
(
2-3
)
Gal)
[6]
,
这种流感
病毒与受体结合特性可能限定了病毒感染宿主的范
围
。
已有文献报道
,
H5N1
AIV
(
A/duck/Guangxi/35
/
2001
(DK/35
)
株可以同时识别
SAa
(
2-3
)
Gal
和
SAa
重影响畜牧业发展且威胁人类生命安全叫
流感病毒表面血凝素
(Hemagglutinin,
HA
)
蛋白
与宿主呼吸道的唾液酸受体结合可介导病毒的吸附
(
2-6
)
Gal
受体叫
H9N2
AIV
流行株则趋向为结合人
及膜融合过程
,
是病毒侵入宿主细胞并产生有效复
制的前提
%
唾液酸
(Sialic
acid,
SA)
是经唾液酸转
源
SA
受体
SAa
(
2-6)
Gal
181
,
表明
IAV
感染人类的第
一步是其
HA
受体的亲和性要发生改变
。
目前未见
移酶
(
Sialyltransferase
,
ST
)
参与调控合成的流感病毒
受体决定簇
,
参与流感病毒感染人类的
ST
主要包括
NeuSAc
a
(
2-3
)
Gal
唾液酸转移酶
1~4
(
ST3GAL1-
宿主细胞
SA
受体及
ST
的表达与流感病毒相关性研
究的报道
。
因此
,
本研究将人源
IAV
CA04
株与
AIV
Y280
株感染
9
种细胞
,
初步探究宿主细胞
ST
表达与
ST3GAL
4
)
和
Neu5Ac
a
(
2-6)
Gal
唾液酸转移酶
1
(
ST6GAL1
),
它们分别将底物
CMP-
Neu5Ac
中的
流感病毒敏感性的相关性
,
为流感病毒侵入机制研
究奠定基础
,
为抗流感病毒药物研究选择合适的细
胞系提供参考依据
。
Neu5Ac
及
SA
以
a
(
2-3
)
和
a
(
2-6
)
糖甘键的形式转移
第
10
期
常吉祥
,
等.不同细胞唾液酸受体类型及唾液酸转移酶与流感病毒敏感性的研究
981
1
材料与方法
1.1
病毒与细胞
人源
IAV
A/Califomia/04/2009
/
(
H1N1
)
(
CA04
)
株
、
AIV
A/Duck/HongKong/Y280/1997
(
H9N2
)
(
¥280
)
株由香港大学
MalikPeris
教授惠赠
。
CA04
株在
MDCK
细胞中传代
,
Y280
株在
10
日龄鸡胚
传代后
,
测定病毒滴度后备用
。
犬肾细胞
(
MDCK
)
、
幼仓鼠肾细胞
(
BHK
)
、
人喉表皮样癌细胞
(
Hep-
2
)
、
人支气管上皮细胞
(
16HBE
)
、
人非小细胞肺癌
细胞
(
A549
)
、
非洲绿猴肾细胞
(
Vero
)
、
中国仓鼠卵
巢细胞
(
CHO-kl
)
、
鸡成纤维细胞系
(
DF-1
)
和人源
胚胎肾细胞
(
HEK293T
)
均购自美国标准培养物保存
库
(
ATCC
)
O
1.2
主要试剂高糖型细胞培养基
(
DMEM
)
、
胎牛
血清
(
FBS
)
、
青
/
链霉素购自
Gibco
公司
;
无血清培
养基
VIVO
15
购自
Lonza
公司
;
TPCK
胰酶
、
牛血清
白蛋白
(
BSA
)
购自
Sigma
公司
;
新鲜鸡血样品采自活
禽市场
;
FITC
标记的素黑接骨木凝集素
(
Sambucus
Nigra
,
SNA
)
、
怀愧凝集素
l
(
Maackiaamurensis
,
MAA
I
)
购自
Vector
Laboratories
公司
;
鼠源抗
IAV
核
蛋白
IgG
抗体
、
羊抗鼠
IgG-FITC
购自
ABcam
公司
;
去唾液酸化
BSA
、
含
DAPI
的封片介质购自
Thermo
Fisher
公司
;
核酸提取试剂盒购自诺唯赞公司
;
RT-
PCR
试剂盒
、
荧光定量
PCR
试剂盒均购自
TaKaRa
公司
。
1.3
流感病毒感染不同细胞后的增殖水平的测定
将
MDCK
、
BHK
、
HEP-
2
、
16HBE
、
A549
、
Vero
、
CHO-kl,
DF-1
和
293T
细胞传代至
96
孔板
。
37
X.
5%
CO?
培养
。
分别将
CA04
株
(
1x10,
TCIDso/O.l
|±L
)
和
Y280
株
(lxlO
5
TCID
50
/0.1
|
jl
L
)
用无血清
DMEM
培
养基
10
倍倍比稀释至
10J10
,
倍
,
将
6
个稀释度的病
毒液以每孔
100
分别接种至长成单层上述细胞的
96
孔板中
,
每个稀释度设
6
个复孔
。
48h
后
,
每孔
取
50
jjl
L
上清液于
U
型血凝板中与
0.5%
的鸡红细胞
悬液混合
,
记录每孔凝集度
,
并采用
Reed-Muench
法分别计算半数细胞感染剂量
(
TCIDJ
。
1.4
SA
受体类型及其与流感病毒结合能力的检测
将
1.3
中所述细胞传代至带有爬片的
24
孔板中,每
种细胞设
2
个复孔
,
待细胞长至
50%
时
,
弃去培养
基
。
每种细胞选两孔分别加入
100
jiUjlFITC
标记
的植物凝集素
SNA
(
特异性结合
SAa
(
2-6
)
Gal
)
和
MAA
I
(
特异性结合
SAa(
2
-
3
)
Gal
)
(
终浓度
5
pg/mL
)
,
室温孵育
lh
后
,
以含有抗荧光淬灭剂的封片液
(
含
有
DAPI)
封片
,
经直接免疫荧光法检测各细胞表面
受体类型
;
同上述细胞爬片操作
,
待细胞长至
50%
时
,
每种细胞取
2
孔
,
分别接种
M0I
10
的
CA04
和
Y280
株病毒液
,
4T
孵育
90
min,
PBS
洗涤后
,
每
孔加
500
jjl
L
的
4%
多聚甲醛固定
30
min,
每孔加
100
4
鼠源抗
IVA
核蛋白
IgG
(
5
jig/mL
)
,
4
T
孵育
过夜
,
每孔加
100
jjl
L
羊抗鼠
IgG-FITC
(
5
jig/mL
)
室
温孵育
lh
。
经间接免疫荧光试验
(
IFA
)
检测各细胞
表面
SA
受体与流感病毒的结合情况
。
1.5
细胞表面
SA
受体的定量检测
将
1.3
中所述细
胞传代至
6
孔板
,
细胞长至
90%
时
,
收集细胞
,
以
ixio,
个
/
管分装
,
4
七离心
,
预冷的
PBS
重悬
、
离
心
,
重复上述步骤
3
遍
。
加
3%
去唾液酸化
BSA,
室
温封闭
1
h,
每种细胞分装两管分别加入
200
r
L
FICT
标记的植物凝集素溶液
SNA
和
MAA
I
(
终浓度
分别为
5
jig/mL
)
,
室温避光孵育
30
min
o
经过预冷
的
PBS
重悬
、
离心
,
重复
3
遍后
,
经流式细胞仪检
测
FITC
通道的荧光强度
。
利用
Flowjo
V10
软件统计
分析各组细胞样品的平均荧光强度
(
MFI
)
。
1.6
各细胞
ST
相关基因
mRNA
转录水平的检测
根据
GenBank
中登录的不同物种的
GAPDH
(
NM_
001357943;
NM_001244854;
NM_001003142;
NM_
204305
)
、
ST3GAL4
(
NR_145671
;
NM_001246699
;
XM_
014113293
;
JX035870
)
和
ST6GAL1
(
NM_173216
;
XM_
015276836
;
NM_001246815
;
XM_022414319
)
基因序
列
,
利用
Primer
Premier
6.0
软件设计引物
(
表
1
)
,
并
由北京六合华大基因科技有限公司合成
。
收集
1.3
中所述细胞
,
利用核酸提取试剂盒提取各细胞总
RNA,
反转录为
cDNA,
以其为模板
,
利用表
1
中的
引物
,
经荧光定量
PCR
检测各细胞中
ST3GAI4
和
ST6GAL1
基因的
mRNA
转录水平
。
2
结果
2.1
各细胞中流感病毒滴度测定的结果两种流感
病毒
(
CA04
、
Y280
株
)
感染
9
种细胞
(
MDCK
、
BHK
、
Hep-2
、
16HBE
、
A549
、
Vem
、
CHO-kl
、
DF-1
和
293T)
48h
后
,
检测细胞上清中病毒滴度
。
结果显示
,
感染
CA04
株后
,
MDCK
、
16HBE
、
DF-1
和
A549
检测到了病毒滴度
,
分别为
3.2X10
2
TCID
50
/0.1
mL
、
3.2X101
TCIDso/O.l
mL
、
2.6x10*
TCID/0.1
mL
、
0.95
x
10
1
TCIDso/O.l
mL
;
而
AIV
Y280
株在
9
种细胞中系均
982
中国预防兽医学报
2020
年
有复制
,
其中病毒滴度从咼到低依次为
MDCK
、
DF-1
、
Vero
、
293T
、
CHO-kl
、
Hep-
2
、
A549
、
16HBE
、
和
BHK,
分别为
6.3xl0
3
TCID
s
>«)
.l
mL.
bJxKfTCIDso/O.l
mL.
3.9X10
2
TCIDso/O.l
mL.
3.9X10
2
TCID/O.l
mL
、
3.2X10
2
TCIDdO.l
mL
、
3.2X10
2
TCKWO.l
mL
、
2.5
xlO
2
TCID50/
0.1
mL
、
1.9X10
2
TCID50/0.I
mL
、
9.9X10
1
TCID/O.l
mL
(
图
1
)
。
表明人流感病毒
CA04
株仅在
MDCK
、
DF-1
、
16HBE
和
A549
细胞中有一定的复制能力
;
AIV
Y280
株在
MDCK
细胞中的复制能力最强
,
而在其余细胞
中的复制能力相近
。
表
1
实验所用引物信息
Table
1
Primers used
in
this
study
引物
序列
(
5-3
,
)
Primer
Sequence
Chinese
F:
ACCACGGTCCATGCCATCACT
amster-GAPDH
R:
TGCCTGCTTCACCACCTTCTTG
Chinese
F:
ACGCTCCTGTGGCTGGTTATGA
hamster-ST3GAL4
R:
CCTGTGGTTGGCTTCTGCTTGA
Chinese
F:
GCACCAGTAGCCAACTTCCAACAGGAT
hamster-ST6GAL
1
R:
GGTCGGGATACAGCTTGCGATAACTCTT
Human-GAPDH
F
:
GCTCTCCAGAACATCATCCCTGCCTCT
R:
CGACGCCTGCTTCACCACCTTCTTG
Hiunan-ST3GAL4
F
:
AACAACCCAGACACACTCCTCGTCCTG
R:
ACCCTTTCGCACCCGCTTCTTATCACT
Human-ST6GAL1
F:
GGCAGGTGTGCTGTTGTGTCGTCAG
R
:
ATCTTGTTGGAAGTTGGCTGTGGGTGC
F:
CTCTGCTCCTTCTGCTGATGCC
°
g
~
R:
TCCGATGCCTGCTTCACTACCT
F:
AAGTGTCGGAGGTGCGTGGT
°
g
~
R:
AGCAGCGTGTTCGGATTGTTCT
F
:
ACCCACCGTCTTCAGGAATGCT
R
:
TGTCCGTCTGCCGCTTAGAAGG
Gallus-GAPDH
F:
CCCAGAACATCATCCCAGCGTCCACT
R
:
ACGGCAGGTCAGGTCAACAACAGAGA
Gdlus-ST3GAL4
F:
GCCTGAGAGCATCCAGAGCCTGAAGT
R:
GCACCAGCAGCGTGTTCGGATTGTT
Gallus-ST6GAL1
F:
GGTCGCTGTGCTGTTGTGTCCTCA
R:
TGGATTTCTGCATGATACGGTGCTGGAT
g
5
口
CA04
E3Y280
O
I
i-
.
'
4
-
3.8
Q
m
5
3
2.8
2.5
2.8
2.6
2.6
2.5
2.3
1
2
2.0
1.5
$
1.0
居
1
A
0
少余
、
3
神膚
3P
n
炉护
图
1
两株流感病毒在不同细胞中的复制能力的检测结果
Fig.
1
Detection
of
replication
abilities
of
two
influenza
viruses
in
different
cells
2.2
SA
受体类型及其与流感病毒结合的检测结
果
将
9
种细胞分别加入
FITC
标记的植物凝集素
SNA
和
MAAI
后
,
采用直接免疫荧光法检测各细胞
表面特异性受体
。
结果显示
,
SNA
处理细胞后,
MDCK
、
16HBE
、
DF-1
和
A549
细胞可见大量绿色
荧光
,
而
BHK
细胞绿色荧光最少
(
图
1A
)
,
表明前
4
种细胞含有大量
SAa
(
2-6
)
Gal
结构的糖链
,
而
BHK
的
SAa
(
2-6
)
Gal
含量最少
。
这与人源
IAV
CA04
株在
各细胞中病毒滴度测定的结果一致
,
即有大量
SAa
(
2-6
)
Gal
糖链的细胞对
CA04
株敏感性较高
;
SAa
(
2-6
)
Gal
糖链含量较少的
BHK
细胞对
CA04
株敏感
性较低
。
MAAI
处理细胞后
,
MDCK
、
DF-1
和
16HBE
细胞表面可见很强的绿色荧光信号
,
BHK
、
HEP-2
、
A549
、
Vero
、
CHO-kl
和
293T
细胞绿色荧
光信号明显较弱
(
图
2B
)
,
表明
MDCK
、
DF-1
和
16HBE
细胞表面比其它细胞含有更多的
SAa
(
2-3
)
Gal
结构的糖链
。
因此
,
SAa
(
2-3
)
Gal
含量高的细
胞对
AIV
Y280
株敏感性较高
。
同时也表明细胞对流
感病毒的敏感性与其表面
SA
受体含量呈正相关
。
为进一步研究流感病毒与
SA
受体类型的关
系
,
经
IFA
检测各细胞表面受体与病毒的结合能
力
。
结果可见
,
人源
IAV
CA04
株感染各细胞后,
MDCK
、
DF-1
和
A549
细胞的荧光强度最高
(
图
2C
)
;
AIV
Y280
株感染细胞后
,
MDCK
、
DF-1
细胞
的荧光强度高于其余细胞
(
图
2D
)
。
结果表明
,不
同细胞对流感病毒的结合能力存在差异
,
MDCK
、
DF-1
和
A540
细胞含较多的
SAa
(
2-6
)
Gal
糖链
,
因
此对人流感病毒
CA04
株结合能力较强
;
细胞表面
有更多的
SAa
(
2-3
)
Gal
糖链结构的
MDCK
、
DF-1
则
对
AIV
Y280
株结合能力较强
。
病毒与细胞表面受体
结合能力与其表面
ST
糖链含量呈正相关
。
2.3
细胞表面流感病毒
SA
受体的定量检测结果
将
9
种细胞分别加入
FITC
标记的植物凝集素
SNA
和
MAAI
后
,
采用流式细胞技术检测细胞表面被标记
的唾液酸受体的荧光强度
,
并采用
Flowjo
V10
软件
分析各细胞表面的
MFI
即
SA
的含量
。
结果显示,
SNA
标记的
DF-1
细胞的荧光强度显著高于其它
细胞
(
p<0.05
)
,
MDCK
的荧光强度显著高于
293T
、
Hep-
2,
A549
、
16HBE
、
和
BHK
(
p<0.05
)
(
图
3A
)
,
MDCK
的荧光强度与
CHO-kl
、
Vero
无统计学差异
(
p>0.05
)
(
图
3A
)
;
MAA
I
标记的各细胞之间的荧光
强度差异不显著
(
图
3B
)
。
表明
9
种细胞中
MDCK
和
第
10
期
常吉祥
,
等.
不同细胞唾液酸受体类型及唾液酸转移酶与流感病毒敏感性的研究
983
DF
-
1
细胞表面
SAa(2-6)Gal
糖链结构最为丰富
,
其
Y280
株的能力无显著差异
,
与
2.1
的结果基本一
结合人流感病毒
CA04
株的能力较强
;
而
SAa
(
2-3)
Gal
糖链结构在细胞之间差异不大
,
其结合
AIV
A
C
致
。
同时进一步表明
,
SA
糖链含量与流感病毒的敏
感性呈正相关
。
A
:
SNA
标记的各细胞
;
B
:
MAAI
标记的各细胞
;
C
:
CA04
株与各细胞受体结合的检测结果
;
D
:
Y280
株与各细胞受体结合的
检测结果
;
蓝色
:
DAPI
染色细胞核
;
绿色
:
FITC;
刻度尺为
50
jim
A;
Cell
labeled
with
SNA;
B;
Cell
labeled
with
MAA
I;
C;
The
results
of
CA04
binding
to
different
cell
receptors;
D:
Detection
results
of
the
binding
of
Y280
strain
to
different
cell
receptors;
Blue:
DAPI
stained
cell
nucleus;
Green:
FITC;
Scale
bar:
50
jim
图
2
各细胞表面
SA
受体及其对不同病毒结合能力的检测结果
Fig.
2
Detection
results
of
sialic
acid
receptors
on
cell
surface
and
their
binding
ability
to
different
viruses
2.4
各细胞
ST
相关基因的
mRNA
转录水平的检测结
E
w
m
—
V
N
S
果
为了从基因水平分析细胞表面
SA
受体含量
,
经荧
光定量
PCR
检测
9
种细胞
ST
相关基因
(ST3GAL4.
ST6GAL1)
的
mRNA
转录水平
。
结果显示
,
MDCK
、
DF-
1
细胞的
ST3GAL4
、
ST6GAL1
mRNA
转录水平高于
其它细胞
,
Vero
、
293T
、
CHO-kl.
Hep
-
2
、
A549
、
16HBE
细胞两种
ST
mRNA
转录水平均较低
,
BHK
细
胞的两种
ST
mRNA
转录水平均最低(图
4
)
。
结合
2.1
的结果表明
,
MDCK
、
DF
-
1
细胞
ST
(ST3GAL4.
ST6GAL1)
含量较高
,
其与流感病毒的结合能力较
强
;
而
BHK
细胞的
ST(ST3GAL4
、
ST6GAL1)
转录水
平最低
,
其结合流感病毒的能力也最低甚至无结合
*:p<0.05;**:p<0.01
A:
SNA
标
i
論胞
;
B;
MAA
I
标记细胞
;
MFI
:
平均荧光强度
;
a.u.
:
荧光数值单位
能力
。
细胞结合流感病毒的能力与其表面的
ST
转录
水平也呈正相关
。
结合
2.3
的结果表明
,
MDCK
、
DF-
1
细胞的
ST(ST3GAL4
、
ST6GAL1)
含量较高
,
其
A:
Cell
labeled
with
SNA;
B:
Cell
labeled
with
MAA
I
MFI:
Mean
fluorescence
intensity;
a.u.:
Fluorescence
value
unit
图
3
各细胞衷面
SA
的定■检测结果
Fig.
3
Quantitative
detection
results
of
SA
on
the
surface
of
various
cell
lines
细胞表面
SAa
(
2-6
)
Gal/SAa
(
2-3
)
Gal
糖链结构最丰
富
;
而
BHK
细胞的
ST
(ST3GAL4
、
ST6GAL1)
转录水
平最低
,
其细胞表面
SAa
(
2-6
)
Gal/SAa
(
2-3
)
Gal
984
中国预防兽医学报
2020
年
链结构最少
。
细胞表面
SAa
(
2-6
)
Gal/SAa
(
2-3
)
Gal
糖链与其胞内
ST
转录水平也呈正相关
。
A
30
000
20
000
IQA2
UOHd
-c
oSUBTl
4
000
3
000
2
000
1
000
15
10
-
-=H
T
5
----------
1
n
n
十
图
4
ST
相关基因
ST6GAL1
(
A
)
、
ST3GAL4(B)
在
各细胞中转录水平的检测结果
Fig.
4
Results
of
transcription
levels
of
sialyltransferase
ST6GAL1
(A)
and
ST3GAL4
(B)
in
each
ceU
3
讨论
细胞作为流感病毒的增殖基质
,
具有经济方
便,
外界影响因素少
,
重复性好
,
质量稳定等优
点
。
MDCK
广泛应用于人类流感病毒的分离和增
殖
,
其对流感病毒敏感性较高
,
但其却不适于人源
H3N2
流感病毒的生长%为寻找更多合适流感病毒
增殖的宿主细胞
,
本研究通过人
/
禽两种流感病毒感
染
9
种常用细胞后测定病毒的
TCID
50
,
比较不同的
细胞对人
/
禽流感病毒的敏感性
。
结果显示
,
含有丰
富
SAa
(2-6)
Gal
糖链的
MDCK
、
16HBE
和
DF-1
对人
源流感病毒
CA04
株敏感
,
而
Vero
、
293T
、
CH0-
kl
、
Hep-2
和
BHK
对该病毒不敏感
;
含丰富
SAa
(
2-3
)
Gal
糖链的
MDCK
、
DF-1
细胞同时也对
AIV
Y280
株敏感
。
存在于细胞表面糖蛋白或糖脂中的
SA
是流感病
毒受体
㈣
,
流感病毒感染宿主细胞是由其表面
HA
与
宿主细胞表面上的糖链受体
SA
共同介导的
,
这可能
是本研究中细胞对流感病毒敏感性差异的原因
。
因
此,
为分析不同细胞对流感病毒敏感性差异的原
因
,
本研究利用免疫荧光技术检测
9
种细胞表面的
流感病毒受体类型
,
并通过间接免疫荧光技术以及
流式细胞术对
9
种细胞表面
SAa
(
2-6
)
Gal
和
SAa
(
2
-
3
)
Gal
两种糖链进行定性定量分析
。
结果显示
,细
胞表面含有大量
SAa
(
2-6)
Gal
和
SAa
(
2-3
)Gal
糖链
结构的
MDCK
与
DF-1
细胞表面吸附大量流感病毒
,
而
SAa
(
2-6
)
Gal
和
SAa
(
2-3
)
Gal
含量较少的
BHK
、
Hep-2
与
CHO-kl
细胞则结合少量流感病毒
。
表明细
胞对流感病毒的敏感性与细胞表面
SA
中
SAa
(
2-6)
Gal
和
/
或
SAa
(
2-3
)
GaU
糖链含量呈正相关
。
为分析细胞表面
SA
含量与
ST
相关基因
mRNA
转录的关系
,
本研究检测了
SA
受体合成途径中的关
键酶
ST
在不同细胞中的
mRNA
转录水平
。
结果显
示
,
MDCK
、
DF-1
的
ST3GAL1
和
ST6GAL1
mRNA
转
录水平较高
。
文献报道干扰
ST6GAL1
与
ST3GAU
的
表达水平
,
能够抑制流感病毒在
Ver
。
细胞中的增
殖
2
坷
;
过表达
ST6GAL1
则能增加
MDCK
对人流感
病毒的敏感性即
,
表明
ST
的表达水平影响流感病毒
对宿主细胞的感染
。
本研究中
,
ST6GALlmRNA
转
录水平高的细胞表面有着丰富的人流感病毒受体
SAa
(
2-6
)
Gal,
同样
ST3GAL4
mRNA
转录水平高的
细胞则有着丰富的
AIV
受体
SAa
(
2-3
)
Gal,
受体丰
富的细胞
(MDCK
和
DF-1)
表现出对流感病毒高的结
合能力以及较高的敏感性
。
由此表明
,
细胞对流感
病毒的敏感性与
SA
受体含量有关
,
而
SA
含量受
ST
表达影响
,
即
ST
表达影响细胞对流感病毒的敏感
性
。
但是
,
本研究中
16HBE
等细胞
ST
的转录水平与
其受体含量
、
病毒结合量结果并不完全一致
,
这可
能是因为
SA
受体并非流感病毒感染传播的唯一决定
因子网
;
Vero
、
A549
和
CHO-kl
细胞对
Y280
株敏
感
,
但其
ST3GAL4mRNA
转录水平并不高
,
这可能
是因为
SAa
(
2-3
)
Gal
的合成还受
ST3
家族中其它酶
的调控丽
;
免疫荧光与流式细胞术的结果显示
,
16HBE
、
Vero
、
293T
、
CHO-kl
、
Hep-2
、
A549
细胞
表面
AIV
受体
SAa
(
2-3
)
Gal
的荧光值不高
,
可能是
因为
MAA
I
仅特异性识别
SAa2-3GalBl-4GlcNAc,
而对
SAa2-3GalBl-3GlcNAc
特异性不强
,
而该细胞
系表面可能还存在丰富的
SAa2
-
3GalBl-3GlcNAc
o
本研究的
MDCK
、
DF-1
中的
ST3GAL4
与
ST6GAL1
均
具有较高的转录水平
,
无法证明单一类型
ST
与流感
病毒感染宿主细胞能力的相关性
。
因此
,
ST
在流感
病毒侵入宿主细胞中的作用还需进一步深入研究
。
Kosuke
Takada
等人发现
,
在
MDCK
中过表达人类流
第
10
期
常吉祥
,
等.不同细胞唾液酸受体类型及唾液酸转移酶与流感病毒敏感性的研究
985
感病毒受体
[SAa
(
2-6)
Gal]
和降低
AIV
受体
[SAa
(2
-
3)
Gal]
的表达水平
,
其比野生
MDCK
更有效支持人
源
H3N2
流感病毒的分离和生长
,
并且保持更高的
遗传稳定性阴
。
这为后续研究提供思路
,
即能否通
过修饰表达不同
ST
的表达水平
,
从而改变细胞对不
同流感病毒的敏感性
。
综上所述
,
本研究结果表明
,
不同细胞对人
/
禽
流感病毒的敏感性存在差异
,
这与细胞表面
SA
含
量以及
ST
的转录水平相关
,
这为开发新的适用于流
感病毒培养的细胞提参考依据
。
参考文献
:
[
1
]
NUNEZ
I
A,
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(本文编辑
:
李
娜
;
英文编辑
:
钟功勋)