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不同细胞唾液酸受体类型及唾液酸转移酶与流感病毒敏感性的研究

IT圈 admin 30浏览 0评论

2024年3月18日发(作者:掌元绿)

42

卷第

10

2020

10

中国预防兽医学报

Chinese

Journal

of

Preventive

Veterinary

Medicine

Vbl.42No.10

Oct.

2020

doi

:

1

0.3969/j

.issn.

1008-0589.201910017

不同细胞唾液酸受体类型及唾液酸转移酶

与流感病毒敏感性的研究

常吉祥

"

杨春光蔦袁

兵駕杨子峰

张云辉心

(1

.昆明理工大学医学院

云南昆明

650504;

2

.云南省第一人民医院昆明理工大学附属医院

云南昆明

650032;

3

.呼吸疾病国家重点实验室呼吸疾病国家临床研究中心

/

广州医科大学附属第一医院

广东广州

510120)

为研究人/禽流感病毒对细胞的敏感性差异,

本研究选取

9

种常用细胞

分别以

10

5

TCID

5

o

的人源甲型

流感病毒

(IAV

)

CA04

株与禽流感病毒

(AIV

)

Y280

株感染不同细胞

检测不同细胞中流感病毒的增殖水平

利用免疫

荧光试验检测细胞表面唾液酸

(

SA

)

受体类型及其与流感病毒的结合能力

采用流式细胞术定量检测每种细胞表面的

SA

类型及含量

通过

RT-PCR

方法检测唾液酸转移酶

(ST

)

(ST3GAL4

ST6GAL1)

基因

mRNA

的转录水平

结果显示

感染

CA04

株后

MDCK

16HBE

DF-1

A549

检测到了病毒滴度

但病毒低度较低为

3.2X10

2

TCID

50

/0.1

mL~

0.95X10

1

TCIDso/

感染

Y280

株后

病毒滴度从高到低依次为

MDCK

DF-1

Vero

293T

CHO-kl,

Hep-2

A549

16HBE

BHK,

病毒滴度为

6.3x10

TCIDMO.l

mL~9.9xl

(

y

TCID/;

免疫荧光试验结果显示

MDCK

16HBE

DF-1

A549

细胞表面存在大量

SAa

(

2-6)Gal

结构的糖链

BHK

细胞表面该糖链最少

MDCK

DF-1

16HBE

细胞表面比其它细胞含有更多的

SAa(2-3)Gal

结构的糖链

,因此

MDCK

DF-1

A549

细胞对人源流感病毒

CA04

株的结合能力最强

MDCK

DF-1

则对

AIVY280

株结合能力较强

流式细胞术定量分析结果显示,

9

种细胞中

MDCK

DF-1

细胞表面

SAa

(

2-6)Gal

糖链结构含量最高

其结合人流感病毒

CA04

株的能力较强

而不同细胞表面

SAa

(2-3)Gal

糖链结构含量差异不大

其结合

AIVY280

株的能力无显著差异

RT-PCR

检测结果显示

MDCK

DF-1

细胞

ST

相关基因

(

ST3GAL4

ST6GALl)mRNA

转录水平高于其它细胞

BHK

细胞的

ST3GAL4

ST6GAL1

mRNA

转录水平

则最低

因此

MDCK

DF-1

细胞与流感病毒的结合能力较强

BHK

细胞与流感病毒的结合能力较低

上述结果表

SA

含量

ST

转录水平较高的细胞

其结合流感病毒量也较多

对流感病毒的敏感性也高

反之

,则对流感病毒

敏感性较低

以上结果表明

细胞表面

SA

含量

ST

基因转录水平与结合的流感病毒量均呈正相关

本研究为进一步

探究

SA

ST

在流感病毒感染中的作用机制奠定了基础

同时为研究人/禽流感病毒中宿主细胞选择提供了参考依据

关键词:

流感病毒

唾液酸

唾液酸转移酶

细胞系

中图分类号:

S852.65

文献标识码

A

文章编号

1

008-0589

(2020)

10-0979-07

Study

on

the

types

of

sialic

acid

receptors

and

sialyltransferases

of

differe

nt

cells

and

their

sensitivity

to

in

flue

nza

virus

CHANG

Ji-xiang

1

-

2

,

YANG

Chun-guang

3,

YUAN

Bing

2

,

YANG

Zi-feng

3

,

ZHANG

Yun-hui

12

*

(1.

Medical

Faculty,

Kunming

University

of

Science

and

Technology,

Kunming

650504,

China;

2.

The

First

People's

Hospital

of

Yunnan

Province

&

Affiliated

Hospital

of

Kunming

University

of

Science

and

Technology,

Kunming

650032,

China;

3.

State

Key

Laboratory

of

Respiratory

Diseases,

National

Clinical

Research

Center

for

Respiratory

Diseases,

First

Affiliated

Hospital

of

Guangzhou

Medical

University,

Guangzhou

510120,

China)

♦Corresponding

author

收稿日期

2019-10-17

基金项目

国家自然科学基金国际(地区)合作与交流项目⑻

661168012)

国家自然科学基金

(81760379)

云南省高

层次卫生计生技术人才医学学科带头人培养项目

(

D-2017050

)

作者简介

常吉祥

(1995-),

安徽阜南人

硕士研究生

主要从事流感病毒动物感染模型研究.

*

通信作者

E-mail

:

yunhuizhang31

88@

1

980

中国预防兽医学报

2020

Abstract:

In

order

to

study

the

sensitivity

differences

between

human

and

avian

influenza

viruses

to

different

cells,

9

commonly

used

cell

lines

were

selected

in

this

study.

We

infected

different

cells

with

10

5

TCIDso

of

human

influenza

A

virus

(IAV)

CA04

strain

or

avian

influenza

virus

(AIV)

Y280

strain,

and

detected

the

replication

levels

of influenza

viruses

in

different

cells.

We

applied

immunofluorescence

to

detect

the

sialic

acid

(SA)

receptor

types

in

the

cell

surface

and

the

irabilities

to

bind

to

influenza

virus.

We

used

flow

cytometry

to

quantitatively

detect

the

types

and

the

relative

amounts

of

SA

on

the

surface

of

each

cell

line.

The

transcription

level

of

ST

(ST3GAL4,

ST6GAL1)

mRNAs

was

detected

by

RT-PCR

method.

The

results

showed

that

virus

titers

were

detected

in

cell

lines

including

MDCK,

16HBE,

DF-1

and

A549

after

infection

with

the

CA04

strain,

although

the

virus

titers

were

low

(3.2x10' TQD

5

o/O.l

mL-0.95x

10

1

TCID

5

o/O.l

mL).

After

infection

with

the

Y280

strain,

the

virus

titers

in

the

cell

lines

with

an

order

from

high

to

low

were

MDCK,

DF-1,

Vero,

293T,

CHO-kl,

Hep-2,

A549,

16HBE

and

BHK,

with

virus

titers

of

6.3x10

TCIDso/O.l

mL-9.9x

10

1

TCIDso/0

mL.

Immunofluorescence

test

results

showed

a

large

number

of

SAa(2-6)

Gal

on

the

surface

of

MDCK,

16HBE,

DF-1

and

A549

cells,

with

the

least

in

BHK

and

the

most

in

MDCK,

DF-1

and

16HBE

cells.

SAa(2-3)Gal

in

MDCK,

DF-1

and

A549

cells

have

the

strongest

binding

abilities

to

human

CA04

strain,

while

MDCK

and

DF-1

have

strong

binding

ability

to

AIV

Y280

strain.

The

results

of

quantitative

analysis

by

flow

cytometry

showed

that

the

amount

of

surface

SAa(2-6)Gal

in

MDCK

and

DF-1

cells

were

the

most

among

the

9

types

of

cells,

and

their

binding

to human

influenza

virus

CA04

were

stronger,

while

the

amouts

of

surface

SAa(2-3)

Gal

in

the

surface

of

these

cell

lines

were

comparable,

and

there

is

no

significant

difference

in

the

irabilities

to

bind

to

AIV

Y280

strain.

RT-PCR

results

showed

that

the

mRNA

transcription

levels

of

ST-related

genes

(ST3GAL4,

ST6GAL1)

in

MDCK

and

DF-1

cells

were

higher

than

those

in

other

cells,

while

the

transcription

levels

of

ST3GAL4

and

ST6GAL1

mRNAs

in

BHK

cells

were

the

lowest.

The

above

results

indicate

that

cells

with more

SA

in

the

surface

and

higher

ST

transcription

level

have

larger

amounts

of

binding

influenza

virus

and

thus

are

more

sensitive

to

influenza

virus,

and

vice

versa.

This

study

lays

a

foundation

for

further

exploring

the

mechanism

of

SA

and

ST

in

influenza

virus

infection,

and

provides

a

reference

for

the

study

of

host

cell

selection

in

human/avian

influenza

viruses.

Key

words:

influenza

virus;

sialic

acid;

sialyltransferase;

cell

line

流感病毒

(

influenza

virus)

是一种呈杆状或丝状

到半乳糖

(Gal)

等糖脂或糖蛋白形成受体叫

ST

调控

SA

Gal

之间糖昔键的连接方式

不同的糖昔键结

的正粘病毒科

(

Orthomyxoviridae

)

病毒

根据病毒感

染种属可分为人流感病毒

禽流感病毒

(Avian

influ

­

enzavirus,

AIV)

以及猪流感病毒等

其中人流感

构可形成底物特异性不同的

SA

受体

最终影响

SA

与流感病毒表面

HA

的结合心

一般认为人类流感

病毒优先结合

a

(

2-6

)

唾液酸

(

SAa

(

2-6

)

Gal

Neu5Aca(

2-6

)

Gal)

,

AIV

优先识别

a

(

2-3

)

唾液

病毒根据其核蛋白的抗原性分为甲型流感病毒

(IAV)

和乙型流感病毒等

IAV

可通过人的呼吸道

传播引起严重的呼吸疾病

AIV

在家禽与野禽间呈

高度接触性传播

,也可直接感染人类引起死亡

(SAa

(

2-3

)

Gal

Neu5Aca

(

2-3

)

Gal)

[6]

,

这种流感

病毒与受体结合特性可能限定了病毒感染宿主的范

已有文献报道

H5N1

AIV

(

A/duck/Guangxi/35

/

2001

(DK/35

)

株可以同时识别

SAa

(

2-3

)

Gal

SAa

重影响畜牧业发展且威胁人类生命安全叫

流感病毒表面血凝素

(Hemagglutinin,

HA

)

蛋白

与宿主呼吸道的唾液酸受体结合可介导病毒的吸附

(

2-6

)

Gal

受体叫

H9N2

AIV

流行株则趋向为结合人

及膜融合过程

是病毒侵入宿主细胞并产生有效复

制的前提

唾液酸

(Sialic

acid,

SA)

是经唾液酸转

SA

受体

SAa

(

2-6)

Gal

181

,

表明

IAV

感染人类的第

一步是其

HA

受体的亲和性要发生改变

目前未见

移酶

(

Sialyltransferase

,

ST

)

参与调控合成的流感病毒

受体决定簇

参与流感病毒感染人类的

ST

主要包括

NeuSAc

a

(

2-3

)

Gal

唾液酸转移酶

1~4

(

ST3GAL1-

宿主细胞

SA

受体及

ST

的表达与流感病毒相关性研

究的报道

因此

本研究将人源

IAV

CA04

株与

AIV

Y280

株感染

9

种细胞

初步探究宿主细胞

ST

表达与

ST3GAL

4

)

Neu5Ac

a

(

2-6)

Gal

唾液酸转移酶

1

(

ST6GAL1

),

它们分别将底物

CMP-

Neu5Ac

中的

流感病毒敏感性的相关性

为流感病毒侵入机制研

究奠定基础

为抗流感病毒药物研究选择合适的细

胞系提供参考依据

Neu5Ac

SA

a

(

2-3

)

a

(

2-6

)

糖甘键的形式转移

10

常吉祥

等.不同细胞唾液酸受体类型及唾液酸转移酶与流感病毒敏感性的研究

981

1

材料与方法

1.1

病毒与细胞

人源

IAV

A/Califomia/04/2009

/

H1N1

CA04

AIV

A/Duck/HongKong/Y280/1997

H9N2

¥280

株由香港大学

MalikPeris

教授惠赠

CA04

株在

MDCK

细胞中传代

Y280

株在

10

日龄鸡胚

传代后

测定病毒滴度后备用

犬肾细胞

MDCK

幼仓鼠肾细胞

BHK

人喉表皮样癌细胞

Hep-

2

人支气管上皮细胞

16HBE

人非小细胞肺癌

细胞

A549

非洲绿猴肾细胞

Vero

中国仓鼠卵

巢细胞

CHO-kl

鸡成纤维细胞系

DF-1

和人源

胚胎肾细胞

HEK293T

均购自美国标准培养物保存

ATCC

O

1.2

主要试剂高糖型细胞培养基

DMEM

胎牛

血清

FBS

/

链霉素购自

Gibco

公司

无血清培

养基

VIVO

15

购自

Lonza

公司

TPCK

胰酶

牛血清

白蛋白

BSA

购自

Sigma

公司

新鲜鸡血样品采自活

禽市场

FITC

标记的素黑接骨木凝集素

Sambucus

Nigra

,

SNA

怀愧凝集素

l

Maackiaamurensis

,

MAA

I

购自

Vector

Laboratories

公司

鼠源抗

IAV

蛋白

IgG

抗体

羊抗鼠

IgG-FITC

购自

ABcam

公司

去唾液酸化

BSA

DAPI

的封片介质购自

Thermo

Fisher

公司

核酸提取试剂盒购自诺唯赞公司

RT-

PCR

试剂盒

荧光定量

PCR

试剂盒均购自

TaKaRa

公司

1.3

流感病毒感染不同细胞后的增殖水平的测定

MDCK

BHK

HEP-

2

16HBE

A549

Vero

CHO-kl,

DF-1

293T

细胞传代至

96

孔板

37

X.

5%

CO?

培养

分别将

CA04

1x10,

TCIDso/O.l

|±L

Y280

(lxlO

5

TCID

50

/0.1

|

jl

L

用无血清

DMEM

养基

10

倍倍比稀释至

10J10

6

个稀释度的病

毒液以每孔

100

分别接种至长成单层上述细胞的

96

孔板中

每个稀释度设

6

个复孔

48h

每孔

50

jjl

L

上清液于

U

型血凝板中与

0.5%

的鸡红细胞

悬液混合

记录每孔凝集度

并采用

Reed-Muench

法分别计算半数细胞感染剂量

TCIDJ

1.4

SA

受体类型及其与流感病毒结合能力的检测

1.3

中所述细胞传代至带有爬片的

24

孔板中,每

种细胞设

2

个复孔

待细胞长至

50%

弃去培养

每种细胞选两孔分别加入

100

jiUjlFITC

标记

的植物凝集素

SNA

特异性结合

SAa

2-6

Gal

MAA

I

特异性结合

SAa(

2

-

3

Gal

终浓度

5

pg/mL

,

室温孵育

lh

以含有抗荧光淬灭剂的封片液

DAPI)

封片

经直接免疫荧光法检测各细胞表面

受体类型

同上述细胞爬片操作

待细胞长至

50%

每种细胞取

2

分别接种

M0I

10

CA04

Y280

株病毒液

4T

孵育

90

min,

PBS

洗涤后

孔加

500

jjl

L

4%

多聚甲醛固定

30

min,

每孔加

100

4

鼠源抗

IVA

核蛋白

IgG

5

jig/mL

,

4

T

孵育

过夜

每孔加

100

jjl

L

羊抗鼠

IgG-FITC

5

jig/mL

温孵育

lh

经间接免疫荧光试验

IFA

检测各细胞

表面

SA

受体与流感病毒的结合情况

1.5

细胞表面

SA

受体的定量检测

1.3

中所述细

胞传代至

6

孔板

细胞长至

90%

收集细胞

ixio,

/

管分装

4

七离心

预冷的

PBS

重悬

重复上述步骤

3

3%

去唾液酸化

BSA,

温封闭

1

h,

每种细胞分装两管分别加入

200

r

L

FICT

标记的植物凝集素溶液

SNA

MAA

I

终浓度

分别为

5

jig/mL

,

室温避光孵育

30

min

o

经过预冷

PBS

重悬

离心

重复

3

遍后

经流式细胞仪检

FITC

通道的荧光强度

利用

Flowjo

V10

软件统计

分析各组细胞样品的平均荧光强度

MFI

1.6

各细胞

ST

相关基因

mRNA

转录水平的检测

根据

GenBank

中登录的不同物种的

GAPDH

NM_

001357943;

NM_001244854;

NM_001003142;

NM_

204305

ST3GAL4

NR_145671

NM_001246699

XM_

014113293

JX035870

ST6GAL1

NM_173216

XM_

015276836

NM_001246815

XM_022414319

基因序

利用

Primer

Premier

6.0

软件设计引物

1

,

由北京六合华大基因科技有限公司合成

收集

1.3

中所述细胞

利用核酸提取试剂盒提取各细胞总

RNA,

反转录为

cDNA,

以其为模板

利用表

1

中的

引物

经荧光定量

PCR

检测各细胞中

ST3GAI4

ST6GAL1

基因的

mRNA

转录水平

2

结果

2.1

各细胞中流感病毒滴度测定的结果两种流感

病毒

CA04

Y280

感染

9

种细胞

MDCK

BHK

Hep-2

16HBE

A549

Vem

CHO-kl

DF-1

293T)

48h

检测细胞上清中病毒滴度

结果显示

感染

CA04

株后

MDCK

16HBE

DF-1

A549

检测到了病毒滴度

分别为

3.2X10

2

TCID

50

/0.1

mL

3.2X101

TCIDso/O.l

mL

2.6x10*

TCID/0.1

mL

0.95

x

10

1

TCIDso/O.l

mL

;

AIV

Y280

株在

9

种细胞中系均

982

中国预防兽医学报

2020

有复制

其中病毒滴度从咼到低依次为

MDCK

DF-1

Vero

293T

CHO-kl

Hep-

2

A549

16HBE

BHK,

分别为

6.3xl0

3

TCID

s

>«)

.l

mL.

bJxKfTCIDso/O.l

mL.

3.9X10

2

TCIDso/O.l

mL.

3.9X10

2

TCID/O.l

mL

3.2X10

2

TCIDdO.l

mL

3.2X10

2

TCKWO.l

mL

2.5

xlO

2

TCID50/

0.1

mL

1.9X10

2

TCID50/0.I

mL

9.9X10

1

TCID/O.l

mL

1

表明人流感病毒

CA04

株仅在

MDCK

DF-1

16HBE

A549

细胞中有一定的复制能力

AIV

Y280

株在

MDCK

细胞中的复制能力最强

而在其余细胞

中的复制能力相近

1

实验所用引物信息

Table

1

Primers used

in

this

study

引物

序列

5-3

Primer

Sequence

Chinese

F:

ACCACGGTCCATGCCATCACT

amster-GAPDH

R:

TGCCTGCTTCACCACCTTCTTG

Chinese

F:

ACGCTCCTGTGGCTGGTTATGA

hamster-ST3GAL4

R:

CCTGTGGTTGGCTTCTGCTTGA

Chinese

F:

GCACCAGTAGCCAACTTCCAACAGGAT

hamster-ST6GAL

1

R:

GGTCGGGATACAGCTTGCGATAACTCTT

Human-GAPDH

F

GCTCTCCAGAACATCATCCCTGCCTCT

R:

CGACGCCTGCTTCACCACCTTCTTG

Hiunan-ST3GAL4

F

AACAACCCAGACACACTCCTCGTCCTG

R:

ACCCTTTCGCACCCGCTTCTTATCACT

Human-ST6GAL1

F:

GGCAGGTGTGCTGTTGTGTCGTCAG

R

ATCTTGTTGGAAGTTGGCTGTGGGTGC

F:

CTCTGCTCCTTCTGCTGATGCC

°

g

~

R:

TCCGATGCCTGCTTCACTACCT

F:

AAGTGTCGGAGGTGCGTGGT

°

g

~

R:

AGCAGCGTGTTCGGATTGTTCT

F

ACCCACCGTCTTCAGGAATGCT

R

TGTCCGTCTGCCGCTTAGAAGG

Gallus-GAPDH

F:

CCCAGAACATCATCCCAGCGTCCACT

R

ACGGCAGGTCAGGTCAACAACAGAGA

Gdlus-ST3GAL4

F:

GCCTGAGAGCATCCAGAGCCTGAAGT

R:

GCACCAGCAGCGTGTTCGGATTGTT

Gallus-ST6GAL1

F:

GGTCGCTGTGCTGTTGTGTCCTCA

R:

TGGATTTCTGCATGATACGGTGCTGGAT

g

5

CA04

E3Y280

O

I

i-

.

'

4

-

3.8

Q

m

5

3

2.8

2.5

2.8

2.6

2.6

2.5

2.3

1

2

2.0

1.5

$

1.0

1

A

0

少余

3

神膚

3P

n

炉护

1

两株流感病毒在不同细胞中的复制能力的检测结果

Fig.

1

Detection

of

replication

abilities

of

two

influenza

viruses

in

different

cells

2.2

SA

受体类型及其与流感病毒结合的检测结

9

种细胞分别加入

FITC

标记的植物凝集素

SNA

MAAI

采用直接免疫荧光法检测各细胞

表面特异性受体

结果显示

SNA

处理细胞后,

MDCK

16HBE

DF-1

A549

细胞可见大量绿色

荧光

BHK

细胞绿色荧光最少

1A

,

表明前

4

种细胞含有大量

SAa

2-6

Gal

结构的糖链

BHK

SAa

2-6

Gal

含量最少

这与人源

IAV

CA04

株在

各细胞中病毒滴度测定的结果一致

即有大量

SAa

2-6

Gal

糖链的细胞对

CA04

株敏感性较高

SAa

2-6

Gal

糖链含量较少的

BHK

细胞对

CA04

株敏感

性较低

MAAI

处理细胞后

MDCK

DF-1

16HBE

细胞表面可见很强的绿色荧光信号

BHK

HEP-2

A549

Vero

CHO-kl

293T

细胞绿色荧

光信号明显较弱

2B

,

表明

MDCK

DF-1

16HBE

细胞表面比其它细胞含有更多的

SAa

2-3

Gal

结构的糖链

因此

SAa

2-3

Gal

含量高的细

胞对

AIV

Y280

株敏感性较高

同时也表明细胞对流

感病毒的敏感性与其表面

SA

受体含量呈正相关

为进一步研究流感病毒与

SA

受体类型的关

IFA

检测各细胞表面受体与病毒的结合能

结果可见

人源

IAV

CA04

株感染各细胞后,

MDCK

DF-1

A549

细胞的荧光强度最高

2C

;

AIV

Y280

株感染细胞后

MDCK

DF-1

细胞

的荧光强度高于其余细胞

2D

结果表明

,不

同细胞对流感病毒的结合能力存在差异

MDCK

DF-1

A540

细胞含较多的

SAa

2-6

Gal

糖链

此对人流感病毒

CA04

株结合能力较强

细胞表面

有更多的

SAa

2-3

Gal

糖链结构的

MDCK

DF-1

AIV

Y280

株结合能力较强

病毒与细胞表面受体

结合能力与其表面

ST

糖链含量呈正相关

2.3

细胞表面流感病毒

SA

受体的定量检测结果

9

种细胞分别加入

FITC

标记的植物凝集素

SNA

MAAI

采用流式细胞技术检测细胞表面被标记

的唾液酸受体的荧光强度

并采用

Flowjo

V10

软件

分析各细胞表面的

MFI

SA

的含量

结果显示,

SNA

标记的

DF-1

细胞的荧光强度显著高于其它

细胞

p<0.05

,

MDCK

的荧光强度显著高于

293T

Hep-

2,

A549

16HBE

BHK

p<0.05

3A

,

MDCK

的荧光强度与

CHO-kl

Vero

无统计学差异

p>0.05

3A

;

MAA

I

标记的各细胞之间的荧光

强度差异不显著

3B

表明

9

种细胞中

MDCK

10

常吉祥

等.

不同细胞唾液酸受体类型及唾液酸转移酶与流感病毒敏感性的研究

983

DF

-

1

细胞表面

SAa(2-6)Gal

糖链结构最为丰富

Y280

株的能力无显著差异

2.1

的结果基本一

结合人流感病毒

CA04

株的能力较强

SAa

(

2-3)

Gal

糖链结构在细胞之间差异不大

其结合

AIV

A

C

同时进一步表明

SA

糖链含量与流感病毒的敏

感性呈正相关

A

SNA

标记的各细胞

B

MAAI

标记的各细胞

C

CA04

株与各细胞受体结合的检测结果

D

Y280

株与各细胞受体结合的

检测结果

蓝色

DAPI

染色细胞核

绿色

FITC;

刻度尺为

50

jim

A;

Cell

labeled

with

SNA;

B;

Cell

labeled

with

MAA

I;

C;

The

results

of

CA04

binding

to

different

cell

receptors;

D:

Detection

results

of

the

binding

of

Y280

strain

to

different

cell

receptors;

Blue:

DAPI

stained

cell

nucleus;

Green:

FITC;

Scale

bar:

50

jim

2

各细胞表面

SA

受体及其对不同病毒结合能力的检测结果

Fig.

2

Detection

results

of

sialic

acid

receptors

on

cell

surface

and

their

binding

ability

to

different

viruses

2.4

各细胞

ST

相关基因的

mRNA

转录水平的检测结

E

w

m

V

N

S

为了从基因水平分析细胞表面

SA

受体含量

经荧

光定量

PCR

检测

9

种细胞

ST

相关基因

(ST3GAL4.

ST6GAL1)

mRNA

转录水平

结果显示

MDCK

DF-

1

细胞的

ST3GAL4

ST6GAL1

mRNA

转录水平高于

其它细胞

Vero

293T

CHO-kl.

Hep

-

2

A549

16HBE

细胞两种

ST

mRNA

转录水平均较低

BHK

胞的两种

ST

mRNA

转录水平均最低(图

4

)

结合

2.1

的结果表明

MDCK

DF

-

1

细胞

ST

(ST3GAL4.

ST6GAL1)

含量较高

其与流感病毒的结合能力较

BHK

细胞的

ST(ST3GAL4

ST6GAL1)

转录水

平最低

其结合流感病毒的能力也最低甚至无结合

*:p<0.05;**:p<0.01

A:

SNA

i

論胞

B;

MAA

I

标记细胞

MFI

平均荧光强度

a.u.

:

荧光数值单位

能力

细胞结合流感病毒的能力与其表面的

ST

转录

水平也呈正相关

结合

2.3

的结果表明

MDCK

DF-

1

细胞的

ST(ST3GAL4

ST6GAL1)

含量较高

A:

Cell

labeled

with

SNA;

B:

Cell

labeled

with

MAA

I

MFI:

Mean

fluorescence

intensity;

a.u.:

Fluorescence

value

unit

3

各细胞衷面

SA

的定■检测结果

Fig.

3

Quantitative

detection

results

of

SA

on

the

surface

of

various

cell

lines

细胞表面

SAa

(

2-6

)

Gal/SAa

(

2-3

)

Gal

糖链结构最丰

BHK

细胞的

ST

(ST3GAL4

ST6GAL1)

转录水

平最低

其细胞表面

SAa

(

2-6

)

Gal/SAa

(

2-3

)

Gal

984

中国预防兽医学报

2020

链结构最少

细胞表面

SAa

(

2-6

)

Gal/SAa

(

2-3

)

Gal

糖链与其胞内

ST

转录水平也呈正相关

A

30

000

20

000

IQA2

UOHd

-c

oSUBTl

4

000

3

000

2

000

1

000

15

10

-

-=H

T

5

----------

1

n

n

4

ST

相关基因

ST6GAL1

(

A

)

ST3GAL4(B)

各细胞中转录水平的检测结果

Fig.

4

Results

of

transcription

levels

of

sialyltransferase

ST6GAL1

(A)

and

ST3GAL4

(B)

in

each

ceU

3

讨论

细胞作为流感病毒的增殖基质

具有经济方

便,

外界影响因素少

重复性好

质量稳定等优

MDCK

广泛应用于人类流感病毒的分离和增

其对流感病毒敏感性较高

但其却不适于人源

H3N2

流感病毒的生长%为寻找更多合适流感病毒

增殖的宿主细胞

本研究通过人

/

禽两种流感病毒感

9

种常用细胞后测定病毒的

TCID

50

,

比较不同的

细胞对人

/

禽流感病毒的敏感性

结果显示

含有丰

SAa

(2-6)

Gal

糖链的

MDCK

16HBE

DF-1

对人

源流感病毒

CA04

株敏感

Vero

293T

CH0-

kl

Hep-2

BHK

对该病毒不敏感

含丰富

SAa

(

2-3

)

Gal

糖链的

MDCK

DF-1

细胞同时也对

AIV

Y280

株敏感

存在于细胞表面糖蛋白或糖脂中的

SA

是流感病

毒受体

流感病毒感染宿主细胞是由其表面

HA

宿主细胞表面上的糖链受体

SA

共同介导的

这可能

是本研究中细胞对流感病毒敏感性差异的原因

此,

为分析不同细胞对流感病毒敏感性差异的原

本研究利用免疫荧光技术检测

9

种细胞表面的

流感病毒受体类型

并通过间接免疫荧光技术以及

流式细胞术对

9

种细胞表面

SAa

(

2-6

)

Gal

SAa

(

2

-

3

)

Gal

两种糖链进行定性定量分析

结果显示

,细

胞表面含有大量

SAa

(

2-6)

Gal

SAa

(

2-3

)Gal

糖链

结构的

MDCK

DF-1

细胞表面吸附大量流感病毒

,

SAa

(

2-6

)

Gal

SAa

(

2-3

)

Gal

含量较少的

BHK

Hep-2

CHO-kl

细胞则结合少量流感病毒

表明细

胞对流感病毒的敏感性与细胞表面

SA

SAa

(

2-6)

Gal

/

SAa

(

2-3

)

GaU

糖链含量呈正相关

为分析细胞表面

SA

含量与

ST

相关基因

mRNA

转录的关系

本研究检测了

SA

受体合成途径中的关

键酶

ST

在不同细胞中的

mRNA

转录水平

结果显

MDCK

DF-1

ST3GAL1

ST6GAL1

mRNA

录水平较高

文献报道干扰

ST6GAL1

ST3GAU

表达水平

能够抑制流感病毒在

Ver

细胞中的增

2

过表达

ST6GAL1

则能增加

MDCK

对人流感

病毒的敏感性即

表明

ST

的表达水平影响流感病毒

对宿主细胞的感染

本研究中

ST6GALlmRNA

录水平高的细胞表面有着丰富的人流感病毒受体

SAa

(

2-6

)

Gal,

同样

ST3GAL4

mRNA

转录水平高的

细胞则有着丰富的

AIV

受体

SAa

(

2-3

)

Gal,

受体丰

富的细胞

(MDCK

DF-1)

表现出对流感病毒高的结

合能力以及较高的敏感性

由此表明

细胞对流感

病毒的敏感性与

SA

受体含量有关

SA

含量受

ST

表达影响

ST

表达影响细胞对流感病毒的敏感

但是

本研究中

16HBE

等细胞

ST

的转录水平与

其受体含量

病毒结合量结果并不完全一致

这可

能是因为

SA

受体并非流感病毒感染传播的唯一决定

因子网

Vero

A549

CHO-kl

细胞对

Y280

株敏

但其

ST3GAL4mRNA

转录水平并不高

这可能

是因为

SAa

(

2-3

)

Gal

的合成还受

ST3

家族中其它酶

的调控丽

免疫荧光与流式细胞术的结果显示

16HBE

Vero

293T

CHO-kl

Hep-2

A549

细胞

表面

AIV

受体

SAa

(

2-3

)

Gal

的荧光值不高

可能是

因为

MAA

I

仅特异性识别

SAa2-3GalBl-4GlcNAc,

而对

SAa2-3GalBl-3GlcNAc

特异性不强

而该细胞

系表面可能还存在丰富的

SAa2

-

3GalBl-3GlcNAc

o

本研究的

MDCK

DF-1

中的

ST3GAL4

ST6GAL1

具有较高的转录水平

无法证明单一类型

ST

与流感

病毒感染宿主细胞能力的相关性

因此

ST

在流感

病毒侵入宿主细胞中的作用还需进一步深入研究

Kosuke

Takada

等人发现

MDCK

中过表达人类流

10

常吉祥

等.不同细胞唾液酸受体类型及唾液酸转移酶与流感病毒敏感性的研究

985

感病毒受体

[SAa

(

2-6)

Gal]

和降低

AIV

受体

[SAa

(2

-

3)

Gal]

的表达水平

其比野生

MDCK

更有效支持人

H3N2

流感病毒的分离和生长

并且保持更高的

遗传稳定性阴

这为后续研究提供思路

即能否通

过修饰表达不同

ST

的表达水平

从而改变细胞对不

同流感病毒的敏感性

综上所述

本研究结果表明

不同细胞对人

/

流感病毒的敏感性存在差异

这与细胞表面

SA

量以及

ST

的转录水平相关

这为开发新的适用于流

感病毒培养的细胞提参考依据

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(本文编辑

英文编辑

钟功勋)

2024年3月18日发(作者:掌元绿)

42

卷第

10

2020

10

中国预防兽医学报

Chinese

Journal

of

Preventive

Veterinary

Medicine

Vbl.42No.10

Oct.

2020

doi

:

1

0.3969/j

.issn.

1008-0589.201910017

不同细胞唾液酸受体类型及唾液酸转移酶

与流感病毒敏感性的研究

常吉祥

"

杨春光蔦袁

兵駕杨子峰

张云辉心

(1

.昆明理工大学医学院

云南昆明

650504;

2

.云南省第一人民医院昆明理工大学附属医院

云南昆明

650032;

3

.呼吸疾病国家重点实验室呼吸疾病国家临床研究中心

/

广州医科大学附属第一医院

广东广州

510120)

为研究人/禽流感病毒对细胞的敏感性差异,

本研究选取

9

种常用细胞

分别以

10

5

TCID

5

o

的人源甲型

流感病毒

(IAV

)

CA04

株与禽流感病毒

(AIV

)

Y280

株感染不同细胞

检测不同细胞中流感病毒的增殖水平

利用免疫

荧光试验检测细胞表面唾液酸

(

SA

)

受体类型及其与流感病毒的结合能力

采用流式细胞术定量检测每种细胞表面的

SA

类型及含量

通过

RT-PCR

方法检测唾液酸转移酶

(ST

)

(ST3GAL4

ST6GAL1)

基因

mRNA

的转录水平

结果显示

感染

CA04

株后

MDCK

16HBE

DF-1

A549

检测到了病毒滴度

但病毒低度较低为

3.2X10

2

TCID

50

/0.1

mL~

0.95X10

1

TCIDso/

感染

Y280

株后

病毒滴度从高到低依次为

MDCK

DF-1

Vero

293T

CHO-kl,

Hep-2

A549

16HBE

BHK,

病毒滴度为

6.3x10

TCIDMO.l

mL~9.9xl

(

y

TCID/;

免疫荧光试验结果显示

MDCK

16HBE

DF-1

A549

细胞表面存在大量

SAa

(

2-6)Gal

结构的糖链

BHK

细胞表面该糖链最少

MDCK

DF-1

16HBE

细胞表面比其它细胞含有更多的

SAa(2-3)Gal

结构的糖链

,因此

MDCK

DF-1

A549

细胞对人源流感病毒

CA04

株的结合能力最强

MDCK

DF-1

则对

AIVY280

株结合能力较强

流式细胞术定量分析结果显示,

9

种细胞中

MDCK

DF-1

细胞表面

SAa

(

2-6)Gal

糖链结构含量最高

其结合人流感病毒

CA04

株的能力较强

而不同细胞表面

SAa

(2-3)Gal

糖链结构含量差异不大

其结合

AIVY280

株的能力无显著差异

RT-PCR

检测结果显示

MDCK

DF-1

细胞

ST

相关基因

(

ST3GAL4

ST6GALl)mRNA

转录水平高于其它细胞

BHK

细胞的

ST3GAL4

ST6GAL1

mRNA

转录水平

则最低

因此

MDCK

DF-1

细胞与流感病毒的结合能力较强

BHK

细胞与流感病毒的结合能力较低

上述结果表

SA

含量

ST

转录水平较高的细胞

其结合流感病毒量也较多

对流感病毒的敏感性也高

反之

,则对流感病毒

敏感性较低

以上结果表明

细胞表面

SA

含量

ST

基因转录水平与结合的流感病毒量均呈正相关

本研究为进一步

探究

SA

ST

在流感病毒感染中的作用机制奠定了基础

同时为研究人/禽流感病毒中宿主细胞选择提供了参考依据

关键词:

流感病毒

唾液酸

唾液酸转移酶

细胞系

中图分类号:

S852.65

文献标识码

A

文章编号

1

008-0589

(2020)

10-0979-07

Study

on

the

types

of

sialic

acid

receptors

and

sialyltransferases

of

differe

nt

cells

and

their

sensitivity

to

in

flue

nza

virus

CHANG

Ji-xiang

1

-

2

,

YANG

Chun-guang

3,

YUAN

Bing

2

,

YANG

Zi-feng

3

,

ZHANG

Yun-hui

12

*

(1.

Medical

Faculty,

Kunming

University

of

Science

and

Technology,

Kunming

650504,

China;

2.

The

First

People's

Hospital

of

Yunnan

Province

&

Affiliated

Hospital

of

Kunming

University

of

Science

and

Technology,

Kunming

650032,

China;

3.

State

Key

Laboratory

of

Respiratory

Diseases,

National

Clinical

Research

Center

for

Respiratory

Diseases,

First

Affiliated

Hospital

of

Guangzhou

Medical

University,

Guangzhou

510120,

China)

♦Corresponding

author

收稿日期

2019-10-17

基金项目

国家自然科学基金国际(地区)合作与交流项目⑻

661168012)

国家自然科学基金

(81760379)

云南省高

层次卫生计生技术人才医学学科带头人培养项目

(

D-2017050

)

作者简介

常吉祥

(1995-),

安徽阜南人

硕士研究生

主要从事流感病毒动物感染模型研究.

*

通信作者

E-mail

:

yunhuizhang31

88@

1

980

中国预防兽医学报

2020

Abstract:

In

order

to

study

the

sensitivity

differences

between

human

and

avian

influenza

viruses

to

different

cells,

9

commonly

used

cell

lines

were

selected

in

this

study.

We

infected

different

cells

with

10

5

TCIDso

of

human

influenza

A

virus

(IAV)

CA04

strain

or

avian

influenza

virus

(AIV)

Y280

strain,

and

detected

the

replication

levels

of influenza

viruses

in

different

cells.

We

applied

immunofluorescence

to

detect

the

sialic

acid

(SA)

receptor

types

in

the

cell

surface

and

the

irabilities

to

bind

to

influenza

virus.

We

used

flow

cytometry

to

quantitatively

detect

the

types

and

the

relative

amounts

of

SA

on

the

surface

of

each

cell

line.

The

transcription

level

of

ST

(ST3GAL4,

ST6GAL1)

mRNAs

was

detected

by

RT-PCR

method.

The

results

showed

that

virus

titers

were

detected

in

cell

lines

including

MDCK,

16HBE,

DF-1

and

A549

after

infection

with

the

CA04

strain,

although

the

virus

titers

were

low

(3.2x10' TQD

5

o/O.l

mL-0.95x

10

1

TCID

5

o/O.l

mL).

After

infection

with

the

Y280

strain,

the

virus

titers

in

the

cell

lines

with

an

order

from

high

to

low

were

MDCK,

DF-1,

Vero,

293T,

CHO-kl,

Hep-2,

A549,

16HBE

and

BHK,

with

virus

titers

of

6.3x10

TCIDso/O.l

mL-9.9x

10

1

TCIDso/0

mL.

Immunofluorescence

test

results

showed

a

large

number

of

SAa(2-6)

Gal

on

the

surface

of

MDCK,

16HBE,

DF-1

and

A549

cells,

with

the

least

in

BHK

and

the

most

in

MDCK,

DF-1

and

16HBE

cells.

SAa(2-3)Gal

in

MDCK,

DF-1

and

A549

cells

have

the

strongest

binding

abilities

to

human

CA04

strain,

while

MDCK

and

DF-1

have

strong

binding

ability

to

AIV

Y280

strain.

The

results

of

quantitative

analysis

by

flow

cytometry

showed

that

the

amount

of

surface

SAa(2-6)Gal

in

MDCK

and

DF-1

cells

were

the

most

among

the

9

types

of

cells,

and

their

binding

to human

influenza

virus

CA04

were

stronger,

while

the

amouts

of

surface

SAa(2-3)

Gal

in

the

surface

of

these

cell

lines

were

comparable,

and

there

is

no

significant

difference

in

the

irabilities

to

bind

to

AIV

Y280

strain.

RT-PCR

results

showed

that

the

mRNA

transcription

levels

of

ST-related

genes

(ST3GAL4,

ST6GAL1)

in

MDCK

and

DF-1

cells

were

higher

than

those

in

other

cells,

while

the

transcription

levels

of

ST3GAL4

and

ST6GAL1

mRNAs

in

BHK

cells

were

the

lowest.

The

above

results

indicate

that

cells

with more

SA

in

the

surface

and

higher

ST

transcription

level

have

larger

amounts

of

binding

influenza

virus

and

thus

are

more

sensitive

to

influenza

virus,

and

vice

versa.

This

study

lays

a

foundation

for

further

exploring

the

mechanism

of

SA

and

ST

in

influenza

virus

infection,

and

provides

a

reference

for

the

study

of

host

cell

selection

in

human/avian

influenza

viruses.

Key

words:

influenza

virus;

sialic

acid;

sialyltransferase;

cell

line

流感病毒

(

influenza

virus)

是一种呈杆状或丝状

到半乳糖

(Gal)

等糖脂或糖蛋白形成受体叫

ST

调控

SA

Gal

之间糖昔键的连接方式

不同的糖昔键结

的正粘病毒科

(

Orthomyxoviridae

)

病毒

根据病毒感

染种属可分为人流感病毒

禽流感病毒

(Avian

influ

­

enzavirus,

AIV)

以及猪流感病毒等

其中人流感

构可形成底物特异性不同的

SA

受体

最终影响

SA

与流感病毒表面

HA

的结合心

一般认为人类流感

病毒优先结合

a

(

2-6

)

唾液酸

(

SAa

(

2-6

)

Gal

Neu5Aca(

2-6

)

Gal)

,

AIV

优先识别

a

(

2-3

)

唾液

病毒根据其核蛋白的抗原性分为甲型流感病毒

(IAV)

和乙型流感病毒等

IAV

可通过人的呼吸道

传播引起严重的呼吸疾病

AIV

在家禽与野禽间呈

高度接触性传播

,也可直接感染人类引起死亡

(SAa

(

2-3

)

Gal

Neu5Aca

(

2-3

)

Gal)

[6]

,

这种流感

病毒与受体结合特性可能限定了病毒感染宿主的范

已有文献报道

H5N1

AIV

(

A/duck/Guangxi/35

/

2001

(DK/35

)

株可以同时识别

SAa

(

2-3

)

Gal

SAa

重影响畜牧业发展且威胁人类生命安全叫

流感病毒表面血凝素

(Hemagglutinin,

HA

)

蛋白

与宿主呼吸道的唾液酸受体结合可介导病毒的吸附

(

2-6

)

Gal

受体叫

H9N2

AIV

流行株则趋向为结合人

及膜融合过程

是病毒侵入宿主细胞并产生有效复

制的前提

唾液酸

(Sialic

acid,

SA)

是经唾液酸转

SA

受体

SAa

(

2-6)

Gal

181

,

表明

IAV

感染人类的第

一步是其

HA

受体的亲和性要发生改变

目前未见

移酶

(

Sialyltransferase

,

ST

)

参与调控合成的流感病毒

受体决定簇

参与流感病毒感染人类的

ST

主要包括

NeuSAc

a

(

2-3

)

Gal

唾液酸转移酶

1~4

(

ST3GAL1-

宿主细胞

SA

受体及

ST

的表达与流感病毒相关性研

究的报道

因此

本研究将人源

IAV

CA04

株与

AIV

Y280

株感染

9

种细胞

初步探究宿主细胞

ST

表达与

ST3GAL

4

)

Neu5Ac

a

(

2-6)

Gal

唾液酸转移酶

1

(

ST6GAL1

),

它们分别将底物

CMP-

Neu5Ac

中的

流感病毒敏感性的相关性

为流感病毒侵入机制研

究奠定基础

为抗流感病毒药物研究选择合适的细

胞系提供参考依据

Neu5Ac

SA

a

(

2-3

)

a

(

2-6

)

糖甘键的形式转移

10

常吉祥

等.不同细胞唾液酸受体类型及唾液酸转移酶与流感病毒敏感性的研究

981

1

材料与方法

1.1

病毒与细胞

人源

IAV

A/Califomia/04/2009

/

H1N1

CA04

AIV

A/Duck/HongKong/Y280/1997

H9N2

¥280

株由香港大学

MalikPeris

教授惠赠

CA04

株在

MDCK

细胞中传代

Y280

株在

10

日龄鸡胚

传代后

测定病毒滴度后备用

犬肾细胞

MDCK

幼仓鼠肾细胞

BHK

人喉表皮样癌细胞

Hep-

2

人支气管上皮细胞

16HBE

人非小细胞肺癌

细胞

A549

非洲绿猴肾细胞

Vero

中国仓鼠卵

巢细胞

CHO-kl

鸡成纤维细胞系

DF-1

和人源

胚胎肾细胞

HEK293T

均购自美国标准培养物保存

ATCC

O

1.2

主要试剂高糖型细胞培养基

DMEM

胎牛

血清

FBS

/

链霉素购自

Gibco

公司

无血清培

养基

VIVO

15

购自

Lonza

公司

TPCK

胰酶

牛血清

白蛋白

BSA

购自

Sigma

公司

新鲜鸡血样品采自活

禽市场

FITC

标记的素黑接骨木凝集素

Sambucus

Nigra

,

SNA

怀愧凝集素

l

Maackiaamurensis

,

MAA

I

购自

Vector

Laboratories

公司

鼠源抗

IAV

蛋白

IgG

抗体

羊抗鼠

IgG-FITC

购自

ABcam

公司

去唾液酸化

BSA

DAPI

的封片介质购自

Thermo

Fisher

公司

核酸提取试剂盒购自诺唯赞公司

RT-

PCR

试剂盒

荧光定量

PCR

试剂盒均购自

TaKaRa

公司

1.3

流感病毒感染不同细胞后的增殖水平的测定

MDCK

BHK

HEP-

2

16HBE

A549

Vero

CHO-kl,

DF-1

293T

细胞传代至

96

孔板

37

X.

5%

CO?

培养

分别将

CA04

1x10,

TCIDso/O.l

|±L

Y280

(lxlO

5

TCID

50

/0.1

|

jl

L

用无血清

DMEM

养基

10

倍倍比稀释至

10J10

6

个稀释度的病

毒液以每孔

100

分别接种至长成单层上述细胞的

96

孔板中

每个稀释度设

6

个复孔

48h

每孔

50

jjl

L

上清液于

U

型血凝板中与

0.5%

的鸡红细胞

悬液混合

记录每孔凝集度

并采用

Reed-Muench

法分别计算半数细胞感染剂量

TCIDJ

1.4

SA

受体类型及其与流感病毒结合能力的检测

1.3

中所述细胞传代至带有爬片的

24

孔板中,每

种细胞设

2

个复孔

待细胞长至

50%

弃去培养

每种细胞选两孔分别加入

100

jiUjlFITC

标记

的植物凝集素

SNA

特异性结合

SAa

2-6

Gal

MAA

I

特异性结合

SAa(

2

-

3

Gal

终浓度

5

pg/mL

,

室温孵育

lh

以含有抗荧光淬灭剂的封片液

DAPI)

封片

经直接免疫荧光法检测各细胞表面

受体类型

同上述细胞爬片操作

待细胞长至

50%

每种细胞取

2

分别接种

M0I

10

CA04

Y280

株病毒液

4T

孵育

90

min,

PBS

洗涤后

孔加

500

jjl

L

4%

多聚甲醛固定

30

min,

每孔加

100

4

鼠源抗

IVA

核蛋白

IgG

5

jig/mL

,

4

T

孵育

过夜

每孔加

100

jjl

L

羊抗鼠

IgG-FITC

5

jig/mL

温孵育

lh

经间接免疫荧光试验

IFA

检测各细胞

表面

SA

受体与流感病毒的结合情况

1.5

细胞表面

SA

受体的定量检测

1.3

中所述细

胞传代至

6

孔板

细胞长至

90%

收集细胞

ixio,

/

管分装

4

七离心

预冷的

PBS

重悬

重复上述步骤

3

3%

去唾液酸化

BSA,

温封闭

1

h,

每种细胞分装两管分别加入

200

r

L

FICT

标记的植物凝集素溶液

SNA

MAA

I

终浓度

分别为

5

jig/mL

,

室温避光孵育

30

min

o

经过预冷

PBS

重悬

离心

重复

3

遍后

经流式细胞仪检

FITC

通道的荧光强度

利用

Flowjo

V10

软件统计

分析各组细胞样品的平均荧光强度

MFI

1.6

各细胞

ST

相关基因

mRNA

转录水平的检测

根据

GenBank

中登录的不同物种的

GAPDH

NM_

001357943;

NM_001244854;

NM_001003142;

NM_

204305

ST3GAL4

NR_145671

NM_001246699

XM_

014113293

JX035870

ST6GAL1

NM_173216

XM_

015276836

NM_001246815

XM_022414319

基因序

利用

Primer

Premier

6.0

软件设计引物

1

,

由北京六合华大基因科技有限公司合成

收集

1.3

中所述细胞

利用核酸提取试剂盒提取各细胞总

RNA,

反转录为

cDNA,

以其为模板

利用表

1

中的

引物

经荧光定量

PCR

检测各细胞中

ST3GAI4

ST6GAL1

基因的

mRNA

转录水平

2

结果

2.1

各细胞中流感病毒滴度测定的结果两种流感

病毒

CA04

Y280

感染

9

种细胞

MDCK

BHK

Hep-2

16HBE

A549

Vem

CHO-kl

DF-1

293T)

48h

检测细胞上清中病毒滴度

结果显示

感染

CA04

株后

MDCK

16HBE

DF-1

A549

检测到了病毒滴度

分别为

3.2X10

2

TCID

50

/0.1

mL

3.2X101

TCIDso/O.l

mL

2.6x10*

TCID/0.1

mL

0.95

x

10

1

TCIDso/O.l

mL

;

AIV

Y280

株在

9

种细胞中系均

982

中国预防兽医学报

2020

有复制

其中病毒滴度从咼到低依次为

MDCK

DF-1

Vero

293T

CHO-kl

Hep-

2

A549

16HBE

BHK,

分别为

6.3xl0

3

TCID

s

>«)

.l

mL.

bJxKfTCIDso/O.l

mL.

3.9X10

2

TCIDso/O.l

mL.

3.9X10

2

TCID/O.l

mL

3.2X10

2

TCIDdO.l

mL

3.2X10

2

TCKWO.l

mL

2.5

xlO

2

TCID50/

0.1

mL

1.9X10

2

TCID50/0.I

mL

9.9X10

1

TCID/O.l

mL

1

表明人流感病毒

CA04

株仅在

MDCK

DF-1

16HBE

A549

细胞中有一定的复制能力

AIV

Y280

株在

MDCK

细胞中的复制能力最强

而在其余细胞

中的复制能力相近

1

实验所用引物信息

Table

1

Primers used

in

this

study

引物

序列

5-3

Primer

Sequence

Chinese

F:

ACCACGGTCCATGCCATCACT

amster-GAPDH

R:

TGCCTGCTTCACCACCTTCTTG

Chinese

F:

ACGCTCCTGTGGCTGGTTATGA

hamster-ST3GAL4

R:

CCTGTGGTTGGCTTCTGCTTGA

Chinese

F:

GCACCAGTAGCCAACTTCCAACAGGAT

hamster-ST6GAL

1

R:

GGTCGGGATACAGCTTGCGATAACTCTT

Human-GAPDH

F

GCTCTCCAGAACATCATCCCTGCCTCT

R:

CGACGCCTGCTTCACCACCTTCTTG

Hiunan-ST3GAL4

F

AACAACCCAGACACACTCCTCGTCCTG

R:

ACCCTTTCGCACCCGCTTCTTATCACT

Human-ST6GAL1

F:

GGCAGGTGTGCTGTTGTGTCGTCAG

R

ATCTTGTTGGAAGTTGGCTGTGGGTGC

F:

CTCTGCTCCTTCTGCTGATGCC

°

g

~

R:

TCCGATGCCTGCTTCACTACCT

F:

AAGTGTCGGAGGTGCGTGGT

°

g

~

R:

AGCAGCGTGTTCGGATTGTTCT

F

ACCCACCGTCTTCAGGAATGCT

R

TGTCCGTCTGCCGCTTAGAAGG

Gallus-GAPDH

F:

CCCAGAACATCATCCCAGCGTCCACT

R

ACGGCAGGTCAGGTCAACAACAGAGA

Gdlus-ST3GAL4

F:

GCCTGAGAGCATCCAGAGCCTGAAGT

R:

GCACCAGCAGCGTGTTCGGATTGTT

Gallus-ST6GAL1

F:

GGTCGCTGTGCTGTTGTGTCCTCA

R:

TGGATTTCTGCATGATACGGTGCTGGAT

g

5

CA04

E3Y280

O

I

i-

.

'

4

-

3.8

Q

m

5

3

2.8

2.5

2.8

2.6

2.6

2.5

2.3

1

2

2.0

1.5

$

1.0

1

A

0

少余

3

神膚

3P

n

炉护

1

两株流感病毒在不同细胞中的复制能力的检测结果

Fig.

1

Detection

of

replication

abilities

of

two

influenza

viruses

in

different

cells

2.2

SA

受体类型及其与流感病毒结合的检测结

9

种细胞分别加入

FITC

标记的植物凝集素

SNA

MAAI

采用直接免疫荧光法检测各细胞

表面特异性受体

结果显示

SNA

处理细胞后,

MDCK

16HBE

DF-1

A549

细胞可见大量绿色

荧光

BHK

细胞绿色荧光最少

1A

,

表明前

4

种细胞含有大量

SAa

2-6

Gal

结构的糖链

BHK

SAa

2-6

Gal

含量最少

这与人源

IAV

CA04

株在

各细胞中病毒滴度测定的结果一致

即有大量

SAa

2-6

Gal

糖链的细胞对

CA04

株敏感性较高

SAa

2-6

Gal

糖链含量较少的

BHK

细胞对

CA04

株敏感

性较低

MAAI

处理细胞后

MDCK

DF-1

16HBE

细胞表面可见很强的绿色荧光信号

BHK

HEP-2

A549

Vero

CHO-kl

293T

细胞绿色荧

光信号明显较弱

2B

,

表明

MDCK

DF-1

16HBE

细胞表面比其它细胞含有更多的

SAa

2-3

Gal

结构的糖链

因此

SAa

2-3

Gal

含量高的细

胞对

AIV

Y280

株敏感性较高

同时也表明细胞对流

感病毒的敏感性与其表面

SA

受体含量呈正相关

为进一步研究流感病毒与

SA

受体类型的关

IFA

检测各细胞表面受体与病毒的结合能

结果可见

人源

IAV

CA04

株感染各细胞后,

MDCK

DF-1

A549

细胞的荧光强度最高

2C

;

AIV

Y280

株感染细胞后

MDCK

DF-1

细胞

的荧光强度高于其余细胞

2D

结果表明

,不

同细胞对流感病毒的结合能力存在差异

MDCK

DF-1

A540

细胞含较多的

SAa

2-6

Gal

糖链

此对人流感病毒

CA04

株结合能力较强

细胞表面

有更多的

SAa

2-3

Gal

糖链结构的

MDCK

DF-1

AIV

Y280

株结合能力较强

病毒与细胞表面受体

结合能力与其表面

ST

糖链含量呈正相关

2.3

细胞表面流感病毒

SA

受体的定量检测结果

9

种细胞分别加入

FITC

标记的植物凝集素

SNA

MAAI

采用流式细胞技术检测细胞表面被标记

的唾液酸受体的荧光强度

并采用

Flowjo

V10

软件

分析各细胞表面的

MFI

SA

的含量

结果显示,

SNA

标记的

DF-1

细胞的荧光强度显著高于其它

细胞

p<0.05

,

MDCK

的荧光强度显著高于

293T

Hep-

2,

A549

16HBE

BHK

p<0.05

3A

,

MDCK

的荧光强度与

CHO-kl

Vero

无统计学差异

p>0.05

3A

;

MAA

I

标记的各细胞之间的荧光

强度差异不显著

3B

表明

9

种细胞中

MDCK

10

常吉祥

等.

不同细胞唾液酸受体类型及唾液酸转移酶与流感病毒敏感性的研究

983

DF

-

1

细胞表面

SAa(2-6)Gal

糖链结构最为丰富

Y280

株的能力无显著差异

2.1

的结果基本一

结合人流感病毒

CA04

株的能力较强

SAa

(

2-3)

Gal

糖链结构在细胞之间差异不大

其结合

AIV

A

C

同时进一步表明

SA

糖链含量与流感病毒的敏

感性呈正相关

A

SNA

标记的各细胞

B

MAAI

标记的各细胞

C

CA04

株与各细胞受体结合的检测结果

D

Y280

株与各细胞受体结合的

检测结果

蓝色

DAPI

染色细胞核

绿色

FITC;

刻度尺为

50

jim

A;

Cell

labeled

with

SNA;

B;

Cell

labeled

with

MAA

I;

C;

The

results

of

CA04

binding

to

different

cell

receptors;

D:

Detection

results

of

the

binding

of

Y280

strain

to

different

cell

receptors;

Blue:

DAPI

stained

cell

nucleus;

Green:

FITC;

Scale

bar:

50

jim

2

各细胞表面

SA

受体及其对不同病毒结合能力的检测结果

Fig.

2

Detection

results

of

sialic

acid

receptors

on

cell

surface

and

their

binding

ability

to

different

viruses

2.4

各细胞

ST

相关基因的

mRNA

转录水平的检测结

E

w

m

V

N

S

为了从基因水平分析细胞表面

SA

受体含量

经荧

光定量

PCR

检测

9

种细胞

ST

相关基因

(ST3GAL4.

ST6GAL1)

mRNA

转录水平

结果显示

MDCK

DF-

1

细胞的

ST3GAL4

ST6GAL1

mRNA

转录水平高于

其它细胞

Vero

293T

CHO-kl.

Hep

-

2

A549

16HBE

细胞两种

ST

mRNA

转录水平均较低

BHK

胞的两种

ST

mRNA

转录水平均最低(图

4

)

结合

2.1

的结果表明

MDCK

DF

-

1

细胞

ST

(ST3GAL4.

ST6GAL1)

含量较高

其与流感病毒的结合能力较

BHK

细胞的

ST(ST3GAL4

ST6GAL1)

转录水

平最低

其结合流感病毒的能力也最低甚至无结合

*:p<0.05;**:p<0.01

A:

SNA

i

論胞

B;

MAA

I

标记细胞

MFI

平均荧光强度

a.u.

:

荧光数值单位

能力

细胞结合流感病毒的能力与其表面的

ST

转录

水平也呈正相关

结合

2.3

的结果表明

MDCK

DF-

1

细胞的

ST(ST3GAL4

ST6GAL1)

含量较高

A:

Cell

labeled

with

SNA;

B:

Cell

labeled

with

MAA

I

MFI:

Mean

fluorescence

intensity;

a.u.:

Fluorescence

value

unit

3

各细胞衷面

SA

的定■检测结果

Fig.

3

Quantitative

detection

results

of

SA

on

the

surface

of

various

cell

lines

细胞表面

SAa

(

2-6

)

Gal/SAa

(

2-3

)

Gal

糖链结构最丰

BHK

细胞的

ST

(ST3GAL4

ST6GAL1)

转录水

平最低

其细胞表面

SAa

(

2-6

)

Gal/SAa

(

2-3

)

Gal

984

中国预防兽医学报

2020

链结构最少

细胞表面

SAa

(

2-6

)

Gal/SAa

(

2-3

)

Gal

糖链与其胞内

ST

转录水平也呈正相关

A

30

000

20

000

IQA2

UOHd

-c

oSUBTl

4

000

3

000

2

000

1

000

15

10

-

-=H

T

5

----------

1

n

n

4

ST

相关基因

ST6GAL1

(

A

)

ST3GAL4(B)

各细胞中转录水平的检测结果

Fig.

4

Results

of

transcription

levels

of

sialyltransferase

ST6GAL1

(A)

and

ST3GAL4

(B)

in

each

ceU

3

讨论

细胞作为流感病毒的增殖基质

具有经济方

便,

外界影响因素少

重复性好

质量稳定等优

MDCK

广泛应用于人类流感病毒的分离和增

其对流感病毒敏感性较高

但其却不适于人源

H3N2

流感病毒的生长%为寻找更多合适流感病毒

增殖的宿主细胞

本研究通过人

/

禽两种流感病毒感

9

种常用细胞后测定病毒的

TCID

50

,

比较不同的

细胞对人

/

禽流感病毒的敏感性

结果显示

含有丰

SAa

(2-6)

Gal

糖链的

MDCK

16HBE

DF-1

对人

源流感病毒

CA04

株敏感

Vero

293T

CH0-

kl

Hep-2

BHK

对该病毒不敏感

含丰富

SAa

(

2-3

)

Gal

糖链的

MDCK

DF-1

细胞同时也对

AIV

Y280

株敏感

存在于细胞表面糖蛋白或糖脂中的

SA

是流感病

毒受体

流感病毒感染宿主细胞是由其表面

HA

宿主细胞表面上的糖链受体

SA

共同介导的

这可能

是本研究中细胞对流感病毒敏感性差异的原因

此,

为分析不同细胞对流感病毒敏感性差异的原

本研究利用免疫荧光技术检测

9

种细胞表面的

流感病毒受体类型

并通过间接免疫荧光技术以及

流式细胞术对

9

种细胞表面

SAa

(

2-6

)

Gal

SAa

(

2

-

3

)

Gal

两种糖链进行定性定量分析

结果显示

,细

胞表面含有大量

SAa

(

2-6)

Gal

SAa

(

2-3

)Gal

糖链

结构的

MDCK

DF-1

细胞表面吸附大量流感病毒

,

SAa

(

2-6

)

Gal

SAa

(

2-3

)

Gal

含量较少的

BHK

Hep-2

CHO-kl

细胞则结合少量流感病毒

表明细

胞对流感病毒的敏感性与细胞表面

SA

SAa

(

2-6)

Gal

/

SAa

(

2-3

)

GaU

糖链含量呈正相关

为分析细胞表面

SA

含量与

ST

相关基因

mRNA

转录的关系

本研究检测了

SA

受体合成途径中的关

键酶

ST

在不同细胞中的

mRNA

转录水平

结果显

MDCK

DF-1

ST3GAL1

ST6GAL1

mRNA

录水平较高

文献报道干扰

ST6GAL1

ST3GAU

表达水平

能够抑制流感病毒在

Ver

细胞中的增

2

过表达

ST6GAL1

则能增加

MDCK

对人流感

病毒的敏感性即

表明

ST

的表达水平影响流感病毒

对宿主细胞的感染

本研究中

ST6GALlmRNA

录水平高的细胞表面有着丰富的人流感病毒受体

SAa

(

2-6

)

Gal,

同样

ST3GAL4

mRNA

转录水平高的

细胞则有着丰富的

AIV

受体

SAa

(

2-3

)

Gal,

受体丰

富的细胞

(MDCK

DF-1)

表现出对流感病毒高的结

合能力以及较高的敏感性

由此表明

细胞对流感

病毒的敏感性与

SA

受体含量有关

SA

含量受

ST

表达影响

ST

表达影响细胞对流感病毒的敏感

但是

本研究中

16HBE

等细胞

ST

的转录水平与

其受体含量

病毒结合量结果并不完全一致

这可

能是因为

SA

受体并非流感病毒感染传播的唯一决定

因子网

Vero

A549

CHO-kl

细胞对

Y280

株敏

但其

ST3GAL4mRNA

转录水平并不高

这可能

是因为

SAa

(

2-3

)

Gal

的合成还受

ST3

家族中其它酶

的调控丽

免疫荧光与流式细胞术的结果显示

16HBE

Vero

293T

CHO-kl

Hep-2

A549

细胞

表面

AIV

受体

SAa

(

2-3

)

Gal

的荧光值不高

可能是

因为

MAA

I

仅特异性识别

SAa2-3GalBl-4GlcNAc,

而对

SAa2-3GalBl-3GlcNAc

特异性不强

而该细胞

系表面可能还存在丰富的

SAa2

-

3GalBl-3GlcNAc

o

本研究的

MDCK

DF-1

中的

ST3GAL4

ST6GAL1

具有较高的转录水平

无法证明单一类型

ST

与流感

病毒感染宿主细胞能力的相关性

因此

ST

在流感

病毒侵入宿主细胞中的作用还需进一步深入研究

Kosuke

Takada

等人发现

MDCK

中过表达人类流

10

常吉祥

等.不同细胞唾液酸受体类型及唾液酸转移酶与流感病毒敏感性的研究

985

感病毒受体

[SAa

(

2-6)

Gal]

和降低

AIV

受体

[SAa

(2

-

3)

Gal]

的表达水平

其比野生

MDCK

更有效支持人

H3N2

流感病毒的分离和生长

并且保持更高的

遗传稳定性阴

这为后续研究提供思路

即能否通

过修饰表达不同

ST

的表达水平

从而改变细胞对不

同流感病毒的敏感性

综上所述

本研究结果表明

不同细胞对人

/

流感病毒的敏感性存在差异

这与细胞表面

SA

量以及

ST

的转录水平相关

这为开发新的适用于流

感病毒培养的细胞提参考依据

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