2024年4月10日发(作者：柔如曼)
基因组学与应用生物学，2020年，第39卷，第9期，第4053-4057页
研究报告
ResearchReport
适用于ATMT介导的RNA干扰载体的构建及在苹果炭疽叶枯病菌中
的应用
徐杰
2
王美玉
2
王娜
2
周宗山
2
张俊祥
1,2*
1农业部园艺作物种质资源利用重点实验室,兴城,125100;2中国农业科学院果树研究所,兴城,125100
*通信作者,*********************
本研究旨在构建1个适用于农杆菌介导真菌遗传转化(ATMT)的RNA干扰载体pCamhybgfp4，为
系统研究植物病原真菌基因功能提供便利。通过基因工程及分子生物学技术，将pSilent-1载体的RNAi发
夹结构与潮霉素抗性基因(
Hyg
R
)整合到能被根癌农杆菌识别的T-DNA序列中。以
eGFP
为靶基因，构建
eGFPRNAi载体，并将eGFPRNAi载体转入根癌农杆菌LBA4404，通过ATMT方法，获得eGFPRNAi菌
株。绿色荧光检测和定量PCR分析结果显示，eGFPRNAi菌株
eGFP
无表达或表达量明显降低，表明RNA
干扰载体pCamhybgfp4适用于ATMT介导的苹果炭疽叶枯病菌遗传转化。RNAi载体的成功构建为进一步
通过RNA干扰技术研究苹果炭疽叶枯病菌致病机制研究奠定了基础。
关键词
炭疽病,基因沉默,苹果,农杆菌介导转化,基因
摘要
ConstructionofRNAiVectorandApplicationofATMT-mediatedGenetic
Transformationin
Colletotrichumgloeosporioides
ofApple
XuJie
2
WangMeiyu
2
WangNa
2
ZhouZongshan
2
ZhangJunxiang
1,2*
1KeyLaboratoryofHorticultureCropsGermplasmResourcesUtilization,MinistryofAgriculture,Xingcheng,125100;2ResearchInstituteofPomol-
ogy,ChineseAcademyofAgriculturalSciences,Xingcheng,125100
*Correspondingauthor,*********************
DOI:10.13417/.039.004053
Abstract
ThisstudyisaimedtoconstructoneRNAinterference(RNAi)vectorpCamhybgfp4thatappliestothe
genetictransformationofthefungusbyATMT,tofacilitatetheresearchinthegenefunctionofplantpathogenic
irpinstructuresofpSilent-1vectorandhygromycinresistancegene(
Hyg
R
)wereintegratedintothe
T-DNAsequencerecognizedby
Agrobacteriumtumefaciens
,usingbiologyandgeneticengineeringtheoryand
PRNAivectorwasconstructedwitheGFPasthetargetgene,transferredintothe
Agrobac
-
teriumtumefaciens
ultofgreen
fluorescencedetectionandquantitativePCRanalysisshowedthatthe
eGFP
isnotexpressedorthattheexpression
leveloftheeGFPissignificantlydecreasedinRNAistrain,indicatingthatRNAivectorpCamhybgfp4wassuitable
forATMT-mediatedgenetictransformationof
Colletotrichumgloeosporioides
.SuccessfulconstructionofRNAi
vectorwilllayafoundationforfurtherresearchonthepathogenicmechanismof
C．gloeosporioides
byusingRNA
interferencetechnology.
KeywordsColletotrichum
,RNAi,Apple,ATMT,Gene
基金项目：本研究由中央级公益性科研院所基本科研业务费专项资金(Y2019PT12)和中国农业科学院科技创新工程(CAAS-
ASTIP)共同资助
引用格式：XuJ.,WangM.Y.,WangN.,ZhouZ.S.,andZhangJ.X.,2020,ConstructionofafungusRNAivectorandapplicationof
ATMT-mediatedgenetictransformationin
Colletotrichumgloeosporioides
,JiyinzuxueYuYingyongShengwuxue(Genomicsand
AppliedBiology),39(9):4053-4057(徐杰,王美玉,王娜,周宗山,张俊祥,2020,适用于ATMT介导的RNA干扰载体的构建及在
苹果炭疽叶枯病菌中的应用,基因组学与应用生物学,39(9):4053-4057)
4054基因组学与应用生物学
RNA介导的基因沉默或RNA干扰(RNAinterf-
erence,RNAi)是真核生物中普遍存在的现象。在这一
过程中，病毒RNA、发夹RNA(hairpinRNA,hpRNA)
或病毒诱导的基因沉默编码RNA诱导双链RNA
(dsRNA)降解为小分子干扰RNA(smallinterfering
RNA,siRNAs)，这些siRNAs与细胞内一些酶结合形
成RNA沉默复合体(RISC)，RISC与靶标基因表达的
mRNA的同源区进行特异性结合，切割mRNA，导致
mRNA降解，进而影响靶标基因的表达(Liuetal.,
2002;NakayashikiandNguyen,2008)。Nakayashiki等
(2005)开发了一种类似于pHANNIBAL的沉默载体
pSilent-1，用于丝状真菌的RNA沉默研究。pSilent-1
载体被广泛应用于植物病原真菌致病相关基因RNAi
研究，如稻瘟病菌(
Magnaportheoryzae
)、黄瓜炭疽菌
(
Colletotrichumlagenarium
)和玉米小斑病菌(
Bipolaris
oryzae
)(Nakayashikietal.,2005;Moriwakietal.,2007)。
苹果炭疽叶枯病是由胶孢炭疽菌(
Colletotrichum
gloeosporioides
)引起的一种苹果重要叶部病害(张俊
祥等,2014;吴建圆等,2015)。该病原菌主要为‘害嘎
拉’(Gala)、‘金冠’(Goldendelicious)等苹果品种的叶
片和果实，导致严重的经济损失(吴建圆等,2017;王
美玉等,2018)。农杆菌介导的遗传转化(ATMT)在真
菌研究中得到了广泛的应用(张俊祥等,2014;张贝
等,2018)。本实验室在之前的研究中构建了苹果炭
疽叶枯病菌强致病力菌株W16的T-DNA插入突变
体库(张俊祥等,2014)，克隆和鉴定了一些致病性相
关基因(Wuetal.,2016;张俊祥等,2017;Zhouetal.,
2017;Wangetal.,2018;张俊祥等,2018)。在对一些
基因进行基因敲除研究中，本研究发现某些基因是
生长必需的，敲除后会造成细胞的死亡，但RNAi可
以有效地弥补基因敲除的不足(Lengetal.,2011)，
可是pSilent-1载体不能直接用于农杆菌介导的遗
传转化(ATMT)。因此，本研究以潮霉素抗性基因
(
Hyg
R
)作为选择性标记基因，构建了适用于ATMT
介导的双元表达载体pCamhybgfp4，并对其在苹果
炭疽叶枯病菌应用效果进行了分析。
1
结果与分析
1.1
沉默载体
pCamhybgfp4
和
eGFP
沉默载体的构建
载体pCamhybgfp4(图1)经测序确定正确后，
分别连结
eGFP
基因部分片段及其互补序列到pCa-
mhybgfp4载体多克隆位点1(MCS1)和2(MCS2)，经
引物SSS1(5'-cctattctacccaagcatcga-3')和SSS4(5'-
图1载体pCamhybgfp4的图谱
Figure1TheprofileofthevectorpCamhybgfp4
ggatccacttaacgttactgaaa-3')两端测序后，确定pCamhy-
bgfp4-eGFP正确。
1.2eGFP
沉默菌株的荧光检测
为检测pCamhybgfp4载体在苹果炭疽叶枯病
菌基因沉默中的应用效果，本研究将
eGFP
沉默结构
转化到
eGFP
强表达菌株W16-eGFP中。在11个潮
霉素抗性转化子中，除了RNAi1和RNAi5未检测到
荧光外，其他菌株均显示不同程度的荧光，但均比
W16-eGFP弱(图2)。
1.3eGFP
沉默菌株的荧光定量检测
荧光定量PCR检测结果表明，在11个
eGFP
RNAi沉默菌株中，
eGFP
基因的mRNA表达具有不
同水平。沉默菌株RNAi1和RNAi5，类似于野生型
菌株W16，检测不到
eGFP
的表达，其他沉默菌株
eGFP
的表达量均比对照菌株W16-eGFP低(图3)。
2
讨论
虽然RNAi已经在许多丝状真菌中进行了研
究，但它在苹果炭疽叶枯病菌中的应用尚未见报道。
以往的研究表明，有效的基因沉默可通过引入沉默
结构来实现，该沉默结构包含一个基因或是基因部
分序列的重复序列和反向重复序列。许多真菌沉默
载体，如pSGate1(Lengetal.,2011)和pSilent-1(Leng
etal.,2011)，已经被应用于真菌的基因沉默。然而，这
些载体不携带农杆菌识别的T-DNA两端20~25bp
的重复序列，因而无法被应用于ATMT介导的真菌遗
传转化试验。相比其他的真菌遗传转化方法，如PEG
适用于ATMT介导的RNA干扰载体的构建及在苹果炭疽叶枯病菌中的应用4055
图2eGFPRNAi沉默菌株绿色荧光检测
注:Bar
=
2
μ
m
Figure2GreenfluorescencedetectionoftheeGFPRNAistrains
Note:Bar
=
2
μ
m
图3
eGFP
在不同菌株中的表达
注:**:在
p=
0.01水平与W16-eGFP的显著性差异
Figure3Theexpressionof
eGFP
indifferentstrains
Note:**:StatisticallysignificantcomparisontoW16-eGFP,
p=
0.01
介导的原生质体的遗传转化、转座子敲除和Dels-
Gate等方法(Suguietal.,2005)，ATMT能以孢子、菌
丝和子实体等作为介导材料，且省时、省力(Michielse
etal.,2005)。本研究开发了一种适用于ATMT介导
的RNAi载体pCamhybgfp4，并进一步证明了其在真
菌基因沉默菌种构建中的高效性。
研究表明，eGFPRNAi转基因菌株均表现出一
定程度的
eGFP
基因沉默，其中2个eGFPRNAi突
变体(RNAi1和RNAi5)表现靶基因完全沉默，其他
表现为一定程度的沉默。这与前人研究结果相一致
(Huetal.,2012;TetoryaandRajam,2018)。基因部分
沉默可能使表型变得复杂。然而，将目标基因与报告
基因(如
eGFP
)共沉默可能会解决这个问题。比如在
本研究中，eGFPRNAi突变体RNAi1和RNAi5未
检测到荧光，在定量PCR检测中，也未检测到
eGFP
的表达。本研究RNAi载体的成功构建为通过RNA
干扰技术研究苹果炭疽叶枯病菌致病机制研究提供
理论依据。
3
材料与方法
3.1
供试材料
苹果炭疽叶枯病菌(
Colletotrichumgloeosporioides
)
菌株W16-eGFP(
eGFP
强表达菌株)、农杆菌(
Agrob
-
acteriumtumefaciens
)菌株LBA4404和大肠杆菌(
Esc
-
herichiacoli
)菌株TG1均由本实验室保存。载体pCa-
mhybgfp1、pEGFP和pSilent-1也由本实验室保存。
3.2
供试试剂
限制性内切酶、T4DNA连接酶等生物酶购于T
hermoFisher公司；Easy
pfu
DNA聚合酶等常规分子
生物学试剂购于北京全式金公司；抗生素、质粒小量
提取试剂盒及常规试剂购于上海生工生物有限公司。
3.3
载体的构建
RNAi载体pCamhybgfp4的构建：载体pCamhy-
bgfp1用
XbaⅠ
酶切后，切胶回收，骨架自连，自连结
的载体记作pCamhybgfp2。以pSilent-1载体为模板，
用引物RNA1(5'-ttttctagaggccgctttgaaatcagtgg-3')和
RNA2(5'-ttttctagaggatccacagaaaagaaggattac-3')扩增
pSilent-1载体的发夹结构片段，经
XbaⅠ
酶切后，连
结到
XbaⅠ
酶切的pCamhybgfp2，连结质粒定名为
pCamhybgfp3。以pCamhybgfp1质粒为模板，用引物
HH1(5'-tttactagtaagatgatattgaaggagcactttttgg-3')和HH2
(5'-tttactagtctattcctttgccctcggacg-3')扩增HygR片段，
经
SpeⅠ
酶切后，连接到
SpeⅠ
酶切的pCamhybgfp3，
最终连结载体命名为pCamhybgfp4。
eGFP
沉默载体的构建：以载体pEGFP为模板，
用引物G1(5'-tttctcgaggctggacggcgacgtaaa-3')
/
G2(5'-
tttaagcttggggtgttctgctggtagtg-3')和G3(5'-tttagatctggg
gtgttctgctggtagtg-3')/G4(5'-tttggtaccgctggacggcgacgtaa
a-3')引物分别扩增
eGFP
基因上游片段，经酶切后，
依次连接到载体pCamhybgfp4，生成
eGFP
沉默载体
pCamhybgfp4-eGFP。目标载体pCamhybgfp4-eGFP
通过PCR扩增进行鉴定。
3.4eGFP
沉默菌株的构建及分子鉴定
将pCamhybgfp4-eGFP电转到农杆菌LBA4404
中(吴建圆等,2015)，利用ATMT方法(张俊祥等,2014)
将
eGFP
沉默结构转化到
eGFP
表达菌株W16-eGFP
中。利用含有100
μ
g/mL潮霉素B的PDA平板筛选转
4056基因组学与应用生物学
MoriwakiA.,UenoM.,AraseS.,andKiharaJ.,2007,RNA-me-
diatedgenesilencinginthephytopathogenicfungus
Bipolaris
oryzae
,.,269(1):85-89
NakayashikiH.,HanadaS.,QuocN.B.,KadotaniN.,TosaY.,
andMayamaS.,2005,RNAsilencingasatoolforexploring
genefunctioninascomycetefungi,.,42
(4):275-283
化子。对候选的
eGFP
沉默菌株进行
eGFP
荧光检测分
析(激光共聚焦显微镜,Leica,TCSSP8)。
3.5eGFP
沉默菌株沉默效果分析
真菌菌丝总RNA的提取采用RNA提取试剂盒
(北京天根生化科技有限公司)进行。cDNA的合成采
用1
st
cDNA合成试剂盒(大连宝生物有限公司)进行。
qRT-PCR分析采用荧光定量PCR试剂盒(北京全式
金生物技术有限公司)进行。qRT-PCR按照张俊祥
等(2017)的研究方法进行。以
β
-微观蛋白基因(
β
-
tubulin
)作为内参基因，用2
-
ΔΔ
Ct
方法(LivakandSchm-
ittgen,2001)计算各被检测基因的相对表达量。
作者贡献
徐杰是本研究的实验设计者和实验研究的执行
人，完成数据分析，论文初稿的写作；王美玉和王娜
参与了真菌的农杆菌遗传转化试验；周宗山在选题
方面给予了指导；张俊祥是项目的构思者及负责人，
指导实验设计、数据分析和论文写作与修改。全体
作者都阅读并同意最终的文本。
致谢
本研究由中央级公益性科研院所基本科研业务
费专项资金(Y2019PT12)和中国农业科学院科技创
新工程(CAAS-ASTIP)共同资助。
参考文献
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Comparativetranscriptomeanalysisrevealssignificantdif-
ferencesingeneexpressionbetweenappressoriaandhyphae
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Colletotrichumgloeosporioides
,Gene,670:63-69
WuJ.Y.,JiZ.R.,WangN.,ChiF.M.,XuC.N.,ZhouZ.S.,and
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nptⅡ
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4057
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炭疽叶枯病菌GcAP1复合体
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ZhouZ.S.,WuJ.Y.,WangM.Y.,andZhangJ.X.,2017,ABC
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opment,appressorialformationandplantinfectionin
Colle
-
totrichumgloeosporioides
,.,110:85-92
2024年4月10日发(作者：柔如曼)
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王美玉
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王娜
2
周宗山
2
张俊祥
1,2*
1农业部园艺作物种质资源利用重点实验室,兴城,125100;2中国农业科学院果树研究所,兴城,125100
*通信作者,*********************
本研究旨在构建1个适用于农杆菌介导真菌遗传转化(ATMT)的RNA干扰载体pCamhybgfp4，为
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eGFP
无表达或表达量明显降低，表明RNA
干扰载体pCamhybgfp4适用于ATMT介导的苹果炭疽叶枯病菌遗传转化。RNAi载体的成功构建为进一步
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关键词
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ThisstudyisaimedtoconstructoneRNAinterference(RNAi)vectorpCamhybgfp4thatappliestothe
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eGFP
isnotexpressedorthattheexpression
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ATMT-mediatedgenetictransformationin
Colletotrichumgloeosporioides
,JiyinzuxueYuYingyongShengwuxue(Genomicsand
AppliedBiology),39(9):4053-4057(徐杰,王美玉,王娜,周宗山,张俊祥,2020,适用于ATMT介导的RNA干扰载体的构建及在
苹果炭疽叶枯病菌中的应用,基因组学与应用生物学,39(9):4053-4057)
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RNA介导的基因沉默或RNA干扰(RNAinterf-
erence,RNAi)是真核生物中普遍存在的现象。在这一
过程中，病毒RNA、发夹RNA(hairpinRNA,hpRNA)
或病毒诱导的基因沉默编码RNA诱导双链RNA
(dsRNA)降解为小分子干扰RNA(smallinterfering
RNA,siRNAs)，这些siRNAs与细胞内一些酶结合形
成RNA沉默复合体(RISC)，RISC与靶标基因表达的
mRNA的同源区进行特异性结合，切割mRNA，导致
mRNA降解，进而影响靶标基因的表达(Liuetal.,
2002;NakayashikiandNguyen,2008)。Nakayashiki等
(2005)开发了一种类似于pHANNIBAL的沉默载体
pSilent-1，用于丝状真菌的RNA沉默研究。pSilent-1
载体被广泛应用于植物病原真菌致病相关基因RNAi
研究，如稻瘟病菌(
Magnaportheoryzae
)、黄瓜炭疽菌
(
Colletotrichumlagenarium
)和玉米小斑病菌(
Bipolaris
oryzae
)(Nakayashikietal.,2005;Moriwakietal.,2007)。
苹果炭疽叶枯病是由胶孢炭疽菌(
Colletotrichum
gloeosporioides
)引起的一种苹果重要叶部病害(张俊
祥等,2014;吴建圆等,2015)。该病原菌主要为‘害嘎
拉’(Gala)、‘金冠’(Goldendelicious)等苹果品种的叶
片和果实，导致严重的经济损失(吴建圆等,2017;王
美玉等,2018)。农杆菌介导的遗传转化(ATMT)在真
菌研究中得到了广泛的应用(张俊祥等,2014;张贝
等,2018)。本实验室在之前的研究中构建了苹果炭
疽叶枯病菌强致病力菌株W16的T-DNA插入突变
体库(张俊祥等,2014)，克隆和鉴定了一些致病性相
关基因(Wuetal.,2016;张俊祥等,2017;Zhouetal.,
2017;Wangetal.,2018;张俊祥等,2018)。在对一些
基因进行基因敲除研究中，本研究发现某些基因是
生长必需的，敲除后会造成细胞的死亡，但RNAi可
以有效地弥补基因敲除的不足(Lengetal.,2011)，
可是pSilent-1载体不能直接用于农杆菌介导的遗
传转化(ATMT)。因此，本研究以潮霉素抗性基因
(
Hyg
R
)作为选择性标记基因，构建了适用于ATMT
介导的双元表达载体pCamhybgfp4，并对其在苹果
炭疽叶枯病菌应用效果进行了分析。
1
结果与分析
1.1
沉默载体
pCamhybgfp4
和
eGFP
沉默载体的构建
载体pCamhybgfp4(图1)经测序确定正确后，
分别连结
eGFP
基因部分片段及其互补序列到pCa-
mhybgfp4载体多克隆位点1(MCS1)和2(MCS2)，经
引物SSS1(5'-cctattctacccaagcatcga-3')和SSS4(5'-
图1载体pCamhybgfp4的图谱
Figure1TheprofileofthevectorpCamhybgfp4
ggatccacttaacgttactgaaa-3')两端测序后，确定pCamhy-
bgfp4-eGFP正确。
1.2eGFP
沉默菌株的荧光检测
为检测pCamhybgfp4载体在苹果炭疽叶枯病
菌基因沉默中的应用效果，本研究将
eGFP
沉默结构
转化到
eGFP
强表达菌株W16-eGFP中。在11个潮
霉素抗性转化子中，除了RNAi1和RNAi5未检测到
荧光外，其他菌株均显示不同程度的荧光，但均比
W16-eGFP弱(图2)。
1.3eGFP
沉默菌株的荧光定量检测
荧光定量PCR检测结果表明，在11个
eGFP
RNAi沉默菌株中，
eGFP
基因的mRNA表达具有不
同水平。沉默菌株RNAi1和RNAi5，类似于野生型
菌株W16，检测不到
eGFP
的表达，其他沉默菌株
eGFP
的表达量均比对照菌株W16-eGFP低(图3)。
2
讨论
虽然RNAi已经在许多丝状真菌中进行了研
究，但它在苹果炭疽叶枯病菌中的应用尚未见报道。
以往的研究表明，有效的基因沉默可通过引入沉默
结构来实现，该沉默结构包含一个基因或是基因部
分序列的重复序列和反向重复序列。许多真菌沉默
载体，如pSGate1(Lengetal.,2011)和pSilent-1(Leng
etal.,2011)，已经被应用于真菌的基因沉默。然而，这
些载体不携带农杆菌识别的T-DNA两端20~25bp
的重复序列，因而无法被应用于ATMT介导的真菌遗
传转化试验。相比其他的真菌遗传转化方法，如PEG
适用于ATMT介导的RNA干扰载体的构建及在苹果炭疽叶枯病菌中的应用4055
图2eGFPRNAi沉默菌株绿色荧光检测
注:Bar
=
2
μ
m
Figure2GreenfluorescencedetectionoftheeGFPRNAistrains
Note:Bar
=
2
μ
m
图3
eGFP
在不同菌株中的表达
注:**:在
p=
0.01水平与W16-eGFP的显著性差异
Figure3Theexpressionof
eGFP
indifferentstrains
Note:**:StatisticallysignificantcomparisontoW16-eGFP,
p=
0.01
介导的原生质体的遗传转化、转座子敲除和Dels-
Gate等方法(Suguietal.,2005)，ATMT能以孢子、菌
丝和子实体等作为介导材料，且省时、省力(Michielse
etal.,2005)。本研究开发了一种适用于ATMT介导
的RNAi载体pCamhybgfp4，并进一步证明了其在真
菌基因沉默菌种构建中的高效性。
研究表明，eGFPRNAi转基因菌株均表现出一
定程度的
eGFP
基因沉默，其中2个eGFPRNAi突
变体(RNAi1和RNAi5)表现靶基因完全沉默，其他
表现为一定程度的沉默。这与前人研究结果相一致
(Huetal.,2012;TetoryaandRajam,2018)。基因部分
沉默可能使表型变得复杂。然而，将目标基因与报告
基因(如
eGFP
)共沉默可能会解决这个问题。比如在
本研究中，eGFPRNAi突变体RNAi1和RNAi5未
检测到荧光，在定量PCR检测中，也未检测到
eGFP
的表达。本研究RNAi载体的成功构建为通过RNA
干扰技术研究苹果炭疽叶枯病菌致病机制研究提供
理论依据。
3
材料与方法
3.1
供试材料
苹果炭疽叶枯病菌(
Colletotrichumgloeosporioides
)
菌株W16-eGFP(
eGFP
强表达菌株)、农杆菌(
Agrob
-
acteriumtumefaciens
)菌株LBA4404和大肠杆菌(
Esc
-
herichiacoli
)菌株TG1均由本实验室保存。载体pCa-
mhybgfp1、pEGFP和pSilent-1也由本实验室保存。
3.2
供试试剂
限制性内切酶、T4DNA连接酶等生物酶购于T
hermoFisher公司；Easy
pfu
DNA聚合酶等常规分子
生物学试剂购于北京全式金公司；抗生素、质粒小量
提取试剂盒及常规试剂购于上海生工生物有限公司。
3.3
载体的构建
RNAi载体pCamhybgfp4的构建：载体pCamhy-
bgfp1用
XbaⅠ
酶切后，切胶回收，骨架自连，自连结
的载体记作pCamhybgfp2。以pSilent-1载体为模板，
用引物RNA1(5'-ttttctagaggccgctttgaaatcagtgg-3')和
RNA2(5'-ttttctagaggatccacagaaaagaaggattac-3')扩增
pSilent-1载体的发夹结构片段，经
XbaⅠ
酶切后，连
结到
XbaⅠ
酶切的pCamhybgfp2，连结质粒定名为
pCamhybgfp3。以pCamhybgfp1质粒为模板，用引物
HH1(5'-tttactagtaagatgatattgaaggagcactttttgg-3')和HH2
(5'-tttactagtctattcctttgccctcggacg-3')扩增HygR片段，
经
SpeⅠ
酶切后，连接到
SpeⅠ
酶切的pCamhybgfp3，
最终连结载体命名为pCamhybgfp4。
eGFP
沉默载体的构建：以载体pEGFP为模板，
用引物G1(5'-tttctcgaggctggacggcgacgtaaa-3')
/
G2(5'-
tttaagcttggggtgttctgctggtagtg-3')和G3(5'-tttagatctggg
gtgttctgctggtagtg-3')/G4(5'-tttggtaccgctggacggcgacgtaa
a-3')引物分别扩增
eGFP
基因上游片段，经酶切后，
依次连接到载体pCamhybgfp4，生成
eGFP
沉默载体
pCamhybgfp4-eGFP。目标载体pCamhybgfp4-eGFP
通过PCR扩增进行鉴定。
3.4eGFP
沉默菌株的构建及分子鉴定
将pCamhybgfp4-eGFP电转到农杆菌LBA4404
中(吴建圆等,2015)，利用ATMT方法(张俊祥等,2014)
将
eGFP
沉默结构转化到
eGFP
表达菌株W16-eGFP
中。利用含有100
μ
g/mL潮霉素B的PDA平板筛选转
4056基因组学与应用生物学
MoriwakiA.,UenoM.,AraseS.,andKiharaJ.,2007,RNA-me-
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化子。对候选的
eGFP
沉默菌株进行
eGFP
荧光检测分
析(激光共聚焦显微镜,Leica,TCSSP8)。
3.5eGFP
沉默菌株沉默效果分析
真菌菌丝总RNA的提取采用RNA提取试剂盒
(北京天根生化科技有限公司)进行。cDNA的合成采
用1
st
cDNA合成试剂盒(大连宝生物有限公司)进行。
qRT-PCR分析采用荧光定量PCR试剂盒(北京全式
金生物技术有限公司)进行。qRT-PCR按照张俊祥
等(2017)的研究方法进行。以
β
-微观蛋白基因(
β
-
tubulin
)作为内参基因，用2
-
ΔΔ
Ct
方法(LivakandSchm-
ittgen,2001)计算各被检测基因的相对表达量。
作者贡献
徐杰是本研究的实验设计者和实验研究的执行
人，完成数据分析，论文初稿的写作；王美玉和王娜
参与了真菌的农杆菌遗传转化试验；周宗山在选题
方面给予了指导；张俊祥是项目的构思者及负责人，
指导实验设计、数据分析和论文写作与修改。全体
作者都阅读并同意最终的文本。
致谢
本研究由中央级公益性科研院所基本科研业务
费专项资金(Y2019PT12)和中国农业科学院科技创
新工程(CAAS-ASTIP)共同资助。
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