2024年4月23日发(作者：嬴德曜)
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２００８年９月 第３期（总第１４０期） 草食家畜（季刊）
微卫星标记在湖羊中多态性检测
石国庆１，２，程瑞禾 ，阎玉琴 ，管 锋 ，杨利国
１．南京农业大学动物科技学院，江苏南京２０００９５；
２：新疆农垦科学院畜牧兽医所，新疆石河子８３２０００）
摘要：本实验的目的在于检测微卫星ＯａｒＡＥ１０１在湖羊中的多态性及这些多态性变化和多胎性的相关
关系．为进一步在杂交育种中检测并跟踪决定多胎这一性状的主效基因做早期选种准备。
关键词：微卫星标记；湖 羊；多态性
中图分类号：￥８１４．８ 文献标识码：Ａ 文章编号：１００３—６３７７（２００８）０３－００１４－０４
微卫星标记于１９７４年发现，在哺乳动物基因组中
献率（即决定表型的可能性大小），方法见图１。
平均每１０ｋｂ就存在一个微卫星，即核心为２—６ｂｐ的小
湖羊组织样品
片段重复序列，重复数大约２０次左右。鉴于微卫星的应
用有多态信息含量高、在基因组中均匀分布、易于定位
提取基因组
等优点，所以微卫星的应用十分广泛，它是基因遗传作
图和物理图谱的理想界标．也是基因定位的理想标记。
引物
在基因库中查找和多胎有关的
在目前ＱＴＬ定位分析中被广泛应用：同时微卫星在亲
ＰＣＲ扩增—
基因可设计或直接查找引物
缘关系研究以及个体识别和亲子鉴定中被广泛应用。微
卫星作为早期选种的遗传标记很早就被广泛应用。如荷 聚丙烯酰胺凝胶电泳
兰优利公司就把某一微卫星标记作为火鸡育种的专利
丫 Ｉ
标记，国外于１９９８报道绵羊的ＦｅｃＢ基因连锁的微卫星
直接可进行基因型分析
ＯａｒＡＥｌ０１和ＢＭ１３２９已成功用于鉴别多胎基因携带者
图１组织样品分析示意图
以及绵羊繁殖力的标记辅助选择。
２结 果
ＦｅｃＢ基因，即决定Ｂｏｏｍｏｌａ羊多胎效应的基因，
对湖羊１１７个组织样进行检测，共发现６个基因
Ｍｏｎｔｇｏｍｅｒｙ等已将该基因定位于绵羊第６条染色体上。
型，与储明星对３５只湖羊检测结果基本一致（检测出５
更进一步将其确切定位在微卫星标记ＯａｒＡＥｌ０１
个基因型）。这样可以比较不同基因型群体间的生产性
和ＢＭ１３２９之间的一个１０ｃＭ的区间内。微卫星在进化
能，然后计算各个基因型对生产性能的影响。在对杂交
中呈共显性遗传，Ｍｏｎｔｇｏｍｅ￣等报道微卫星标记
后代的选育中可以根据这一结果进行早期选育．以此达
ＯａｒＡＥ１０１与ＦｅｃＢ基因表型连锁，最大ｌｏｄ分数为
到加快育种进程的目的。
１７－３３，相距１３ｃＭ。
３讨论
本实验选用微卫星标记ＯａｒＡＥ１０１对湖羊多态性
３．１分子标记辅助育种
检测，并根据基因型在群体内分组，然后进行产羔数比
选择是育种中最重要的环节之一，是在一个群体中
较，并计算某一基因型和产羔数的相关关系。这样就可
选择符合要求的基因型。但在传统育种中．选择的依据
在湖羊杂交后代中跟踪并检测这一基因．由于其是共显
通常是表型而非基因型，这是因为人们无法直接知道个
性遗传，所以在后代中可检测有无并可知道这一基因的
体的基因型，很难从表型加以推断。也就是说，传统育种
遗传规律。这样，根据这一里理论对杂交后代的基因型
是通过表型间接对基因型进行选择的。这种选择方法对
分析便可进行早期选种。
质量性状而言一般是有效的，但对数量性状来说．则效
１材料与方法
率不高，因为数量性状的表型与基因型之间缺乏明确的
根据基因型分组，并对组间群体进行比较，计算基
对应关系。即使是质量性状，有的也可能会因表型测量
因型和表型的关系，以此得出某一侯选基因对表型的贡
难度较大或误差圈套而造成表型选择的困难．另外．在
收稿日期：２００８—０７—０３
个体发育过程中，每一性状都有其特定的表现时期。许
作者简介：石国庆（１９５９一），新疆人，新疆农垦科学院畜
多重要的性状（如产量和品质）都必须到发育后期或成
牧兽医所工作，从事动物繁殖研究，现南京农
熟时才得以表现，因而选择也只能等到那时才能进行。
业大学博士生。
所以基于表型的传统选择方法存在许多缺点，效率较
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２００８年９月第３期（总第１４０期） 草食家畜（季刊）
低。要提高选择的效率，最理想的方法应是能够直接对
于小鼠的遗传纯度监测取得了较好的结果。对远交群动
基因型进行选择。
物的遗传监测，就是对动物群体的遗传结构进行分析。
分子标记为直接对基因型的选择提供了可能。如果
其目的不是像近交系遗传监测那样为了了解动物是否
目标基因与某个分子标记紧密连锁，那么通过对分子标 受到遗传污染或发生了突变，而是通过遗传分析了解动
记基因型的检测．就能获知目标基因的基因型。因此，我
物群体的遗传概貌，得知不同种动物问或同一种动物不
们能够借助分子标记对目标性状的基因型进行选择，这
同群体问的遗传差异、遗传距离、在进化中的关系等，对
称为标记辅助选择（ＭＡＳ），这是分子标记在育种中应用 动物的分类，品种资源的保存、开发和利用，对动物的选
的最主要方面。借助各种标记（Ｍａ￣ｅｒｓ）对家畜进行选
种．选育具有指导意义。
择和培育，是常规动物育种的主要形式。利用形态遗传
３＿４品种起源与进化
标记（Ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｉｃａｌ ｍａｒｋｅｒｓ）、细胞遗传标记ｆＣｙｔｏｌｏｇｉｃａｌ
ＤＮＡ序列差异数量与物种分化年代存在着较松散
ｍａｒｋｅｒｓ）、生化遗传标记ｆＢｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｍａ￣ｅｒｓ）
的相关关系．假设物种以恒定的速率进化，则这种相关
和免疫遗传标记ｆＩｍｍｕｎａｌｏｇｉｃａｌ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｍｇ￣ｅｒｓ）选择
关系可以用来构建系统发育树和推算物种的分化年代。
和培育家畜，无疑具有一定的积极意义，但由于它们标
通过不同种群ＤＮＡ多态性的比较，并结合地质变迁资
记数量有限，在育种实践中应用和产生效果的局限很
料和化石数据校准，不仅可阐明现今种群相互问的亲缘
大。２０世纪８０年代以来，随着生化遗传和分子遗传学
关系，而且还可推测它们的起源、分化和扩散途径，以及
的迅速发展，对基因结构和功能的研究走向深人，在分 探讨地理隔离等因素在物种形成中的作用。傅衍测定了
子水平上以ＤＮＡ多态为标记进行遗传分析，识别个体
６个家鸡品种３０个个体的线粒体Ｄ一环区５３９ ｂｐ的碱
基因差异成为可能，从而产生了分子遗传标记
基序列．并与Ｇｅｎｅ Ｂａｎｋ中的红原鸡、灰原鸡、绿原鸡、
ｆＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｍａ￣ｅｒｓ），其广泛而普遍的多态性、 黑尾原鸡及鹌鹑的相应序列作比较分析，构建了分子系
准确性、稳定的孟德尔遗传机制使之在动物育种领域迅
统树。结果表明，原鸡属４个种间差异较大，其中家鸡
速渗透．逐渐形成和发展为一种新的技术和方法——动
与泰国及邻近地区红原鸡关系最近，与印尼红原鸡、黑
物分子育种，并形成一门新型学科。 尾原鸡、灰原鸡、绿原鸡及鹌鹑的关系依次变远。提示中
动物分子育种（Ａｎｉｍａｌ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｒｅｅｄｉｎｇ）是依据
国家鸡可能起源于泰国及邻近地区的红原鸡。
分子遗传学和数量遗传学理论．利用ＤＮＡ重组技术改
４绵羊ＣＬＰＧ基因和ＢＭＰ１５基因
良畜禽品种的新方法。研究内容包括转基因育种
４．１绵羊ＣＬＰＧ基因
（Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ Ｂｒｅｅｄｉｎｇ）和基因组育种ｆＧｅｎｏｍｉｃ Ｂｒｅｅｄｉｎｇ、
４．１．１ Ｃａｌｌｉｐｙｇｅ基因定位１９８３年，在美国的陶赛特
两个方面。前者由于基因的整合、表达调控机制尚不明
羊群体中发现了一只后臀极度发达的个体．人们称这种
了仍处于试验阶段，尽管多种转基因家畜相继出现，但
表型为双肌臀性状，根据表型将该基因命名为Ｃａｌｌｉｐｙｇｅ
不能形成产业，带给人们更多的是希望；而后者则随基
基因．用符号ＣＬＰＧ表示。研究后发现该性状是由于常
因组研究的不断进步，有望进人应用阶段，即通过ＤＮＡ 染色体上的正常基因发生突变所致，而且该突变基因以
标记技术对某些重要生产性状座位直接选择改良，随研 非孟德尔方式遗传，其遗传方式为“极性超显性”。极性
究工作的深人，其理论和方法也不断完善。毫无疑问，以 超显性遗传的特点是．只有从父本中获得该基因的杂合
ＤＮＡ标记为手段的分子育种将在以后的家畜育种进程 子后代才表现出双肌臀性状。ＣＬＰＧ座位是由１对等位
中日益显示出巨大的价值和前景。
基因Ｃ（代表突变基因Ｃａｌｌｉｐｙｇｅ）和Ｎ（代表正常野生型
３．２品种间遗传关系的分析
基因）控制，组成４种基因型，仅有ＣＮ基因型的羊才表
应用ＤＮＡ序列研究物种的进化关系，大致分为两
现出双肌臀性状，其它３种基因型个体都表现正常。目
个步骤：一是根据研究的对象和目的。选择适当的ＤＮＡ
前，已经侧翼ＤＮＡ标记将Ｃａｌｌｉｐｙｇｅ基因精确定位于第
序列和基因，一般原则是，对于近缘物种的研究，应选用 １８号染色体的末端区域．位于微卫星标记ＣＳＳＭ１８和
进化速度较快的区域，而对于远源物种则应选择进化速 ＴＧＬＡ１２２之间。
度较慢的区域；二是通过ＤＮＡ同源序列的比较，确定
在哺乳动物的两性配子发生过程和个体发育过程
构建系统树的途径和方法。动物基因组中存在较为丰富 中，来自某一亲本的等位基因缄，使后代的表型特征完
的ＤＮＡ多态标记，特别是ＶＮＴＲｓ多态信息含量
全模仿或拷贝另一亲本的表型特征，即等位基因是否表
（Ｐｏｌｙｍｏｗｈｉｓｍ ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｃｏｎｔｅｎｔ，ＰＩＣ）较高．因而在不 达，取决于它来自哪个亲本，这种同源染色体上基因表
同种群间遗传关系的研究上显示出较高的灵敏度。对动
达活性不同的遗传现象称之为基因组印记（ｇｅｎｏｍｉｃ
物ＤＮＡ进行检测，然后对检测结果进行数据分析，可根
ｉｍｐｒｉｎｔｉｎｇ）。目前已知印记只发生于动物的常染色体基因
据数据计算结果进一步构建分子系统树，可以精确地反
上，而且基因的印记或缄默只发生于脊椎动物．特别是在
映出物种间或群体间在进化过程中发生的极微细的遗
哺乳动物中。基因的印记是由于基因的ＤＮＡ双螺旋胞嘧
传变异。 啶核苷的嘧啶环５’位甲基化，并与其３ 端的鸟嘌呤形成
３．３近交水平的监测
ＣｐＧ。许多ＣｐＧ聚集在一起，形成ＣｐＧ岛．因而ＣｐＧ岛是
为确保每个近交系动物固有的生物学特性．适时对
印记基因的一个重要特征。印记的另一个特征是印记基
其进行遗传监测至关重要。ＤＮＡ指纹在近交系的监测
因有特殊的示差甲基区（ｄｉｆｅｒｅｎｃｉｌａ ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ ｒｅｇｉｏｎｓ．
中，仅需要较少量新鲜或冷冻组织样本．其优点是特异
ＤＭＲｓ），也可以作为印记的一个标志。
性强，有望成为实验动物遗传检测有效的工具．但此法
极性超显性模式见图２。
费用高、用时长。一些研究者尝试将ＲＡＰＤ和微卫星用
１５
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２００８年９月第３期（总第１４０期） 草食家畜（季刊）
图２极性超显性模式图
Ｆｉｇ２ Ｗｏｒｋｉｎｇ ｍｏｄｅｌ ｆｏｒ ｐｏｌａｒ ｏｖｅｒｄｏｍｉｎａｎｃｅ．
４．１．２ Ｃａｌｌｉｐｙｇｅ基因主要作用 Ｃａｌｌｉｐｙｇｅ基因可显著
提高双肌臀羊的瘦肉率，使某些部位的肌肉过度发育布
显著增大，但各部影响并不完全相同，影响较大的是腰
部和腿部的肌肉。Ｃａｌｌｉｐｙｇｅ基因使双肌臀羊肌肉过度发
育的同时，也使皮下的、肌间的、肌内的和肾周的脂肪减
少，有研究表明，在２１４．９日龄时，双肌臀羊与正常羊相
比瘦肉多７．３％，而脂肪却少了７．２％。Ｃａｌｌｉｐｙｇｅ基因能
显著提高屠宰率，在对ＣＬＰＧ座位杂合子陶赛特公羊
Ｆｅｃｘ突变的纯合子正常的２型卵泡向３型卵泡的转
化受到阻碍。
４．１．４ ＢＭＰ一１５基因 骨形态发生蛋白１５（ｂｏｎｅ
ｍｏｒｐｈｏｇｅｎｅｔｉｃ ｐｒｏｔｅｉｎｌ５．ＢＭＰ一１５）又称为生长分化因子
９Ｂ（ｇｒｏｗｔｈ ｄｉｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒ－９Ｂ，ＧＤＦ－９Ｂ），是ＴＧＦ １３
超家族的成员。ＢＭＰ－１５基因的结构分别在小鼠、人、绵
羊中确定。绵羊ＢＭＰ－１５的基因结构由２个外显子和一
个约５．４Ｋｂ的内含子组成，共编码３９３个氨基酸 有２５
个氨基酸组成的信号肽，２４４个氨基酸前肽区和１２５个
与兰布莱、哥伦比和萨福克母羊杂交产生的后代中，双
肌臀羊在５４．５ ｋｇ重时的屠宰率比正常羊高４－３％、
２．５％和４．２％，初步认为，Ｃａｌｌｉｐｙｇｅ基因使屠宰率增高
的部分原因是双肌臀羊的毛皮、内脏器官以及周围脂
肪重量的降低引起的。由于ＣＭｌｉｐｙｇｅ基因作用使肌肉
过度发育，肌原纤维的断裂减少以及肌内脂肪的减少，
导致肌肉的嫩度降低而变得坚硬。
由于Ｃａｌｌｉｐｙｇｅ基因对绵羊的产肉性能有显著的影
响，可以将专门化的Ｃａｌｌｉｐｙｇｅ基因型用于交配，以大幅
度提高绵羊的屠宰率、瘦肉生长率、改良肌肉形状和胴
体组成。而且Ｃａｌｌｉｐｙｇｅ基因对胴体组成的作用超过以
氨基酸的成熟肽。绵羊ＢＭ １５基因编码区与人、大鼠
和小鼠的同源性分别为８２．９％、７８．８％和７８．４％。
ＢＭＰ一１５基因的ｍＲＮＡ在小鼠卵巢的初级卵母细
胞中表达，并被翻译成蛋白质，在原始卵母细胞中很难
检测到ｍＲＮＡ存在。随着卵母细胞的生长和颗粒细胞
数的增加，ＢＭＰ一１５的表达量逐渐升高，利用重组的
ＢＭＰ一１５蛋白处理培养的颗粒细胞发现．ＢＭＰ一１５可
以直接刺激颗粒细胞的有丝分裂，并且这种活性不受
ＦＳＨ的影响；同时ＢＭＰ一１５还参与颗粒细胞类固醇的
合成与ＢＭＰ一１５的增殖活性相反。ＢＭＰ一１５对类固醇
合成的应答依赖于 Ｈ的存在，它能显著抑制ＦＳＨ
诱导的孕酮的生物合成，同时对 Ｈ诱导的雌二醇的
产生没有任何影响。
有研究表明绵羊ＢＭＰ一１５基因可能与ＦｅｃＸＩ、
前报道的任何净品种效应。所以Ｃａｌｌｉｐｙｇｅ基因的发现
为绵羊育种工作及商品化生产提供了广阔的前景。
４．１－３绵羊高繁殖力的候选基因ＦｅｃＸＩ基因 ＦｅｃＸＩ
位点是指在绵羊ｘ染色体上影响排卵率的基因．对罗
姆尼羊的一个多产家系进行研究发现，该家系的共同祖
先Ａ２８１号母羊１１胎共产３３只羔羊，且群体中该羊的
后代都表现出高的排卵率和产羔数，对其家系成员分析
后发现，该位点在ｘ染色体上，被命名为ＦｅｃＸＩ
（Ｉｎｖｅｒｄａｌｅ）。ＦｅｃＸＨ（Ｈａｎｎａ）是在罗姆尼羊的另一个品系
Ｈａｎｎａ中Ｈａｎｎａ发现的，也位于ｘ染色体上。有一个拷
贝的公羊（ＩＹ）与杂合型女儿配对表明纯合型（ＩＩ）有一
个肉质的卵巢并且不孕。
ＦｅｃＸＩ对胎儿发育也有很重要影响．Ｉ＋型与＋＋型
相比４０ ｄ时生殖细胞的数量明显的较低．在９０ｄ时明
显高。妊娠９０ｄ时，Ｉ＋的卵泡平均直径明显小于＋＋或
ＦｅｃＸＨ基因有关。携带ＦｅｃＸＨ基因绵羊ＢＭＰ一１５基因
在编码成熟肽的核苷酸的第６７位存在Ｃ—Ｔ替换．使
得第２３位的谷氨酸变成终止密码子；而在携带ＦｅｃＸＩ
基因的绵羊中，该基因则在第９２位核苷酸处存在Ｔ＿÷
Ａ变异，结果使得第３１位缬氨酸突变为天冬氨酸（见图
３）。这两种突变都可能使ＢＭＰ－１５不能形成有功能的
二聚体从而阻断ＢＭＰ一１５基因功能的发挥．最终的结果
是ＦｅｃＸ ｃＸＩ或ＦｅｃｘＨ，ＦｅｃＸＨ绵羊发生不育。但只
有一个拷贝的ＢＭＰ一１５失活则可以增加排卵率，这可能
ＩＩ型卵巢。然而从妊娠１０５ ｄＩ＋型的卵泡发育与对照组
相似。在胎儿发育的早期ＩＩ生殖细胞群与对照组中的
是因为更大比例的卵泡腔内含有可对ＬＨ产生应答的
颗粒细胞：另一种解释是正常水平活性肽的５０％可
能通过减少有丝分裂的数量以及卵泡所产生的类固
醇或抑制素的数量．从而延迟对血浆 Ｈ浓度的抑制
作用等方式，使多个卵泡被选择性地排卵；最后一个
可能的原因是有生物活性的ＢＭＰ一１５水平的减少影
响了其他生长因子如ＧＤＦ一９对颗粒细胞的增殖和分
化的作用。
那些相似，但是在妊娠１０５ｄ时就发生不同。在这一时
期，Ⅱ胎儿的卵巢缺乏正常的３型卵泡．含有异常结构
包括缺乏卵泡细胞的卵母细胞，有退化的卵母细胞或
游离卵母细胞的卵泡。卵母细胞的直径和颗粒细胞的
数量显示当ＩＩ型卵母细胞扩大的时候．颗粒细胞没有
平行增加或组织颗粒细胞发育的证据。结果表明
１６
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２００８年９月第３期（总第１４０期） 草食家畜（季刊）
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图３绵羊ＢＭＰ－１５基因突变
Ｆｉｇ３ Ｓｈｅｅｐ ＢＭＰ－１５ ｇｅｎｅ ｍｕｔａｔｉｏｎ
参考文献：
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和ＢＭＰ１５基因多态性检测ｆＪ１．生命科学研究，
２００５，９（２）：１８４－１８８．
ｅｅｐｔｏｒ（ＡＬＫ一６）ｔｈａｔ ｉｓ ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ ｉｎ ｏｔｂｈ ｏｏｃｙｔｅｓ ａｎｄ
ｇｒａｎｕｌｏｓａ ｃｅｌｌｓ［Ｊ］．Ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ，２００１，
６４：】２２５－】２３５．
Ｔｈｅ Ｍｉｃｒｏｓａｔｅｌｌｉｔｅ Ｍａｒｋｅｒｓ ｉｓ ｉｎ Ｈｕ－ｓｈｅｅｐ Ｐｒｏｌｉｉｃａｃｙ ｆＥｘａｍｉｎｅｓ
ＳＨＩ Ｇｕｏ—ｑｉｎｇｌａ，ＣＨＥＮ Ｒｕｉ－ｈＣ，ＹＡＮ Ｙｕ－ｑｉｎＩ，ＧＵＡＮ ＦｅｎｇＩ，ＹＡＮＧ Ｌｉ—ｇｕｏ
１００９５，Ｃｈｉｎａ；
（１．Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ａｎｉｍａｌ Ｂｒｅｅｄｉｎｇ＆Ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ＮａｎＪｉｎｇ Ａｇａｃ Ｕｎｉｖ，ＮａｎＪｉｎｇ ２
２．Ｉｕｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ａｎｉｍａｌ Ｓｃｉｃｅ＆Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ，Ｘｉｎｊｉａｎｇ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｒｅｃｌａｍａｔｉｏｎ，Ｓｈｉｈｅｚｉ ８３２０００，Ｃｈｉｎａ）
．
Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｔｈｅ ｓｔｕｄｙ ａｎａｌｙｓｅｄ ｔｈｅ ｍｉｃｒｏｓａｔｅｌｌｉｔｅ ｍａｒｋｅｒｓ ＯａｒＡＥ１０１ ｉｎ ｔｈｅ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ ｏｆ ｔｈｅ ＨＵ ｓｈｅｅｐ ａｎｄ
ｔｈｅ ｒｅｌａｔｉｏｎ ｂｅｔｗｅｅｎ ｔｈｅ ｖａｒｉｅｔｙ ｏｆ ｔｈｉｓ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ ａｎｄ ｔｈｅ ｐｒｏｌｉｉｆｃａｃｙ
．
Ｆｏｒ ｆａｒｔｈｅｒ ｒｅｓｅａｒｃｈ ｔｈｅ ｍａｊｏｒ ｇｅｎｅ
ｏｆ ｈｉｔｓ ｐｒｏｌｉｆｉｃａｃｙ ｉｎ ｃｒｏｓｓｂｒｅｅｄ ａｎｄ ｐｒｅｐａｒｅ ｔｈｅ ｅａｒｌｙ ｂｒｅｅｄｉｎｇ ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ
．
Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ：Ｍｉｃｒｏｓａｔｅｌｌｉｔｅ ｍａｒｋｅｒ；Ｈｕ－ｓｈｅｅｐ；Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ
2024年4月23日发(作者：嬴德曜)
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２００８年９月 第３期（总第１４０期） 草食家畜（季刊）
微卫星标记在湖羊中多态性检测
石国庆１，２，程瑞禾 ，阎玉琴 ，管 锋 ，杨利国
１．南京农业大学动物科技学院，江苏南京２０００９５；
２：新疆农垦科学院畜牧兽医所，新疆石河子８３２０００）
摘要：本实验的目的在于检测微卫星ＯａｒＡＥ１０１在湖羊中的多态性及这些多态性变化和多胎性的相关
关系．为进一步在杂交育种中检测并跟踪决定多胎这一性状的主效基因做早期选种准备。
关键词：微卫星标记；湖 羊；多态性
中图分类号：￥８１４．８ 文献标识码：Ａ 文章编号：１００３—６３７７（２００８）０３－００１４－０４
微卫星标记于１９７４年发现，在哺乳动物基因组中
献率（即决定表型的可能性大小），方法见图１。
平均每１０ｋｂ就存在一个微卫星，即核心为２—６ｂｐ的小
湖羊组织样品
片段重复序列，重复数大约２０次左右。鉴于微卫星的应
用有多态信息含量高、在基因组中均匀分布、易于定位
提取基因组
等优点，所以微卫星的应用十分广泛，它是基因遗传作
图和物理图谱的理想界标．也是基因定位的理想标记。
引物
在基因库中查找和多胎有关的
在目前ＱＴＬ定位分析中被广泛应用：同时微卫星在亲
ＰＣＲ扩增—
基因可设计或直接查找引物
缘关系研究以及个体识别和亲子鉴定中被广泛应用。微
卫星作为早期选种的遗传标记很早就被广泛应用。如荷 聚丙烯酰胺凝胶电泳
兰优利公司就把某一微卫星标记作为火鸡育种的专利
丫 Ｉ
标记，国外于１９９８报道绵羊的ＦｅｃＢ基因连锁的微卫星
直接可进行基因型分析
ＯａｒＡＥｌ０１和ＢＭ１３２９已成功用于鉴别多胎基因携带者
图１组织样品分析示意图
以及绵羊繁殖力的标记辅助选择。
２结 果
ＦｅｃＢ基因，即决定Ｂｏｏｍｏｌａ羊多胎效应的基因，
对湖羊１１７个组织样进行检测，共发现６个基因
Ｍｏｎｔｇｏｍｅｒｙ等已将该基因定位于绵羊第６条染色体上。
型，与储明星对３５只湖羊检测结果基本一致（检测出５
更进一步将其确切定位在微卫星标记ＯａｒＡＥｌ０１
个基因型）。这样可以比较不同基因型群体间的生产性
和ＢＭ１３２９之间的一个１０ｃＭ的区间内。微卫星在进化
能，然后计算各个基因型对生产性能的影响。在对杂交
中呈共显性遗传，Ｍｏｎｔｇｏｍｅ￣等报道微卫星标记
后代的选育中可以根据这一结果进行早期选育．以此达
ＯａｒＡＥ１０１与ＦｅｃＢ基因表型连锁，最大ｌｏｄ分数为
到加快育种进程的目的。
１７－３３，相距１３ｃＭ。
３讨论
本实验选用微卫星标记ＯａｒＡＥ１０１对湖羊多态性
３．１分子标记辅助育种
检测，并根据基因型在群体内分组，然后进行产羔数比
选择是育种中最重要的环节之一，是在一个群体中
较，并计算某一基因型和产羔数的相关关系。这样就可
选择符合要求的基因型。但在传统育种中．选择的依据
在湖羊杂交后代中跟踪并检测这一基因．由于其是共显
通常是表型而非基因型，这是因为人们无法直接知道个
性遗传，所以在后代中可检测有无并可知道这一基因的
体的基因型，很难从表型加以推断。也就是说，传统育种
遗传规律。这样，根据这一里理论对杂交后代的基因型
是通过表型间接对基因型进行选择的。这种选择方法对
分析便可进行早期选种。
质量性状而言一般是有效的，但对数量性状来说．则效
１材料与方法
率不高，因为数量性状的表型与基因型之间缺乏明确的
根据基因型分组，并对组间群体进行比较，计算基
对应关系。即使是质量性状，有的也可能会因表型测量
因型和表型的关系，以此得出某一侯选基因对表型的贡
难度较大或误差圈套而造成表型选择的困难．另外．在
收稿日期：２００８—０７—０３
个体发育过程中，每一性状都有其特定的表现时期。许
作者简介：石国庆（１９５９一），新疆人，新疆农垦科学院畜
多重要的性状（如产量和品质）都必须到发育后期或成
牧兽医所工作，从事动物繁殖研究，现南京农
熟时才得以表现，因而选择也只能等到那时才能进行。
业大学博士生。
所以基于表型的传统选择方法存在许多缺点，效率较
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低。要提高选择的效率，最理想的方法应是能够直接对
于小鼠的遗传纯度监测取得了较好的结果。对远交群动
基因型进行选择。
物的遗传监测，就是对动物群体的遗传结构进行分析。
分子标记为直接对基因型的选择提供了可能。如果
其目的不是像近交系遗传监测那样为了了解动物是否
目标基因与某个分子标记紧密连锁，那么通过对分子标 受到遗传污染或发生了突变，而是通过遗传分析了解动
记基因型的检测．就能获知目标基因的基因型。因此，我
物群体的遗传概貌，得知不同种动物问或同一种动物不
们能够借助分子标记对目标性状的基因型进行选择，这
同群体问的遗传差异、遗传距离、在进化中的关系等，对
称为标记辅助选择（ＭＡＳ），这是分子标记在育种中应用 动物的分类，品种资源的保存、开发和利用，对动物的选
的最主要方面。借助各种标记（Ｍａ￣ｅｒｓ）对家畜进行选
种．选育具有指导意义。
择和培育，是常规动物育种的主要形式。利用形态遗传
３＿４品种起源与进化
标记（Ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｉｃａｌ ｍａｒｋｅｒｓ）、细胞遗传标记ｆＣｙｔｏｌｏｇｉｃａｌ
ＤＮＡ序列差异数量与物种分化年代存在着较松散
ｍａｒｋｅｒｓ）、生化遗传标记ｆＢｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｍａ￣ｅｒｓ）
的相关关系．假设物种以恒定的速率进化，则这种相关
和免疫遗传标记ｆＩｍｍｕｎａｌｏｇｉｃａｌ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｍｇ￣ｅｒｓ）选择
关系可以用来构建系统发育树和推算物种的分化年代。
和培育家畜，无疑具有一定的积极意义，但由于它们标
通过不同种群ＤＮＡ多态性的比较，并结合地质变迁资
记数量有限，在育种实践中应用和产生效果的局限很
料和化石数据校准，不仅可阐明现今种群相互问的亲缘
大。２０世纪８０年代以来，随着生化遗传和分子遗传学
关系，而且还可推测它们的起源、分化和扩散途径，以及
的迅速发展，对基因结构和功能的研究走向深人，在分 探讨地理隔离等因素在物种形成中的作用。傅衍测定了
子水平上以ＤＮＡ多态为标记进行遗传分析，识别个体
６个家鸡品种３０个个体的线粒体Ｄ一环区５３９ ｂｐ的碱
基因差异成为可能，从而产生了分子遗传标记
基序列．并与Ｇｅｎｅ Ｂａｎｋ中的红原鸡、灰原鸡、绿原鸡、
ｆＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｍａ￣ｅｒｓ），其广泛而普遍的多态性、 黑尾原鸡及鹌鹑的相应序列作比较分析，构建了分子系
准确性、稳定的孟德尔遗传机制使之在动物育种领域迅
统树。结果表明，原鸡属４个种间差异较大，其中家鸡
速渗透．逐渐形成和发展为一种新的技术和方法——动
与泰国及邻近地区红原鸡关系最近，与印尼红原鸡、黑
物分子育种，并形成一门新型学科。 尾原鸡、灰原鸡、绿原鸡及鹌鹑的关系依次变远。提示中
动物分子育种（Ａｎｉｍａｌ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｒｅｅｄｉｎｇ）是依据
国家鸡可能起源于泰国及邻近地区的红原鸡。
分子遗传学和数量遗传学理论．利用ＤＮＡ重组技术改
４绵羊ＣＬＰＧ基因和ＢＭＰ１５基因
良畜禽品种的新方法。研究内容包括转基因育种
４．１绵羊ＣＬＰＧ基因
（Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ Ｂｒｅｅｄｉｎｇ）和基因组育种ｆＧｅｎｏｍｉｃ Ｂｒｅｅｄｉｎｇ、
４．１．１ Ｃａｌｌｉｐｙｇｅ基因定位１９８３年，在美国的陶赛特
两个方面。前者由于基因的整合、表达调控机制尚不明
羊群体中发现了一只后臀极度发达的个体．人们称这种
了仍处于试验阶段，尽管多种转基因家畜相继出现，但
表型为双肌臀性状，根据表型将该基因命名为Ｃａｌｌｉｐｙｇｅ
不能形成产业，带给人们更多的是希望；而后者则随基
基因．用符号ＣＬＰＧ表示。研究后发现该性状是由于常
因组研究的不断进步，有望进人应用阶段，即通过ＤＮＡ 染色体上的正常基因发生突变所致，而且该突变基因以
标记技术对某些重要生产性状座位直接选择改良，随研 非孟德尔方式遗传，其遗传方式为“极性超显性”。极性
究工作的深人，其理论和方法也不断完善。毫无疑问，以 超显性遗传的特点是．只有从父本中获得该基因的杂合
ＤＮＡ标记为手段的分子育种将在以后的家畜育种进程 子后代才表现出双肌臀性状。ＣＬＰＧ座位是由１对等位
中日益显示出巨大的价值和前景。
基因Ｃ（代表突变基因Ｃａｌｌｉｐｙｇｅ）和Ｎ（代表正常野生型
３．２品种间遗传关系的分析
基因）控制，组成４种基因型，仅有ＣＮ基因型的羊才表
应用ＤＮＡ序列研究物种的进化关系，大致分为两
现出双肌臀性状，其它３种基因型个体都表现正常。目
个步骤：一是根据研究的对象和目的。选择适当的ＤＮＡ
前，已经侧翼ＤＮＡ标记将Ｃａｌｌｉｐｙｇｅ基因精确定位于第
序列和基因，一般原则是，对于近缘物种的研究，应选用 １８号染色体的末端区域．位于微卫星标记ＣＳＳＭ１８和
进化速度较快的区域，而对于远源物种则应选择进化速 ＴＧＬＡ１２２之间。
度较慢的区域；二是通过ＤＮＡ同源序列的比较，确定
在哺乳动物的两性配子发生过程和个体发育过程
构建系统树的途径和方法。动物基因组中存在较为丰富 中，来自某一亲本的等位基因缄，使后代的表型特征完
的ＤＮＡ多态标记，特别是ＶＮＴＲｓ多态信息含量
全模仿或拷贝另一亲本的表型特征，即等位基因是否表
（Ｐｏｌｙｍｏｗｈｉｓｍ ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｃｏｎｔｅｎｔ，ＰＩＣ）较高．因而在不 达，取决于它来自哪个亲本，这种同源染色体上基因表
同种群间遗传关系的研究上显示出较高的灵敏度。对动
达活性不同的遗传现象称之为基因组印记（ｇｅｎｏｍｉｃ
物ＤＮＡ进行检测，然后对检测结果进行数据分析，可根
ｉｍｐｒｉｎｔｉｎｇ）。目前已知印记只发生于动物的常染色体基因
据数据计算结果进一步构建分子系统树，可以精确地反
上，而且基因的印记或缄默只发生于脊椎动物．特别是在
映出物种间或群体间在进化过程中发生的极微细的遗
哺乳动物中。基因的印记是由于基因的ＤＮＡ双螺旋胞嘧
传变异。 啶核苷的嘧啶环５’位甲基化，并与其３ 端的鸟嘌呤形成
３．３近交水平的监测
ＣｐＧ。许多ＣｐＧ聚集在一起，形成ＣｐＧ岛．因而ＣｐＧ岛是
为确保每个近交系动物固有的生物学特性．适时对
印记基因的一个重要特征。印记的另一个特征是印记基
其进行遗传监测至关重要。ＤＮＡ指纹在近交系的监测
因有特殊的示差甲基区（ｄｉｆｅｒｅｎｃｉｌａ ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ ｒｅｇｉｏｎｓ．
中，仅需要较少量新鲜或冷冻组织样本．其优点是特异
ＤＭＲｓ），也可以作为印记的一个标志。
性强，有望成为实验动物遗传检测有效的工具．但此法
极性超显性模式见图２。
费用高、用时长。一些研究者尝试将ＲＡＰＤ和微卫星用
１５
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图２极性超显性模式图
Ｆｉｇ２ Ｗｏｒｋｉｎｇ ｍｏｄｅｌ ｆｏｒ ｐｏｌａｒ ｏｖｅｒｄｏｍｉｎａｎｃｅ．
４．１．２ Ｃａｌｌｉｐｙｇｅ基因主要作用 Ｃａｌｌｉｐｙｇｅ基因可显著
提高双肌臀羊的瘦肉率，使某些部位的肌肉过度发育布
显著增大，但各部影响并不完全相同，影响较大的是腰
部和腿部的肌肉。Ｃａｌｌｉｐｙｇｅ基因使双肌臀羊肌肉过度发
育的同时，也使皮下的、肌间的、肌内的和肾周的脂肪减
少，有研究表明，在２１４．９日龄时，双肌臀羊与正常羊相
比瘦肉多７．３％，而脂肪却少了７．２％。Ｃａｌｌｉｐｙｇｅ基因能
显著提高屠宰率，在对ＣＬＰＧ座位杂合子陶赛特公羊
Ｆｅｃｘ突变的纯合子正常的２型卵泡向３型卵泡的转
化受到阻碍。
４．１．４ ＢＭＰ一１５基因 骨形态发生蛋白１５（ｂｏｎｅ
ｍｏｒｐｈｏｇｅｎｅｔｉｃ ｐｒｏｔｅｉｎｌ５．ＢＭＰ一１５）又称为生长分化因子
９Ｂ（ｇｒｏｗｔｈ ｄｉｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒ－９Ｂ，ＧＤＦ－９Ｂ），是ＴＧＦ １３
超家族的成员。ＢＭＰ－１５基因的结构分别在小鼠、人、绵
羊中确定。绵羊ＢＭＰ－１５的基因结构由２个外显子和一
个约５．４Ｋｂ的内含子组成，共编码３９３个氨基酸 有２５
个氨基酸组成的信号肽，２４４个氨基酸前肽区和１２５个
与兰布莱、哥伦比和萨福克母羊杂交产生的后代中，双
肌臀羊在５４．５ ｋｇ重时的屠宰率比正常羊高４－３％、
２．５％和４．２％，初步认为，Ｃａｌｌｉｐｙｇｅ基因使屠宰率增高
的部分原因是双肌臀羊的毛皮、内脏器官以及周围脂
肪重量的降低引起的。由于ＣＭｌｉｐｙｇｅ基因作用使肌肉
过度发育，肌原纤维的断裂减少以及肌内脂肪的减少，
导致肌肉的嫩度降低而变得坚硬。
由于Ｃａｌｌｉｐｙｇｅ基因对绵羊的产肉性能有显著的影
响，可以将专门化的Ｃａｌｌｉｐｙｇｅ基因型用于交配，以大幅
度提高绵羊的屠宰率、瘦肉生长率、改良肌肉形状和胴
体组成。而且Ｃａｌｌｉｐｙｇｅ基因对胴体组成的作用超过以
氨基酸的成熟肽。绵羊ＢＭ １５基因编码区与人、大鼠
和小鼠的同源性分别为８２．９％、７８．８％和７８．４％。
ＢＭＰ一１５基因的ｍＲＮＡ在小鼠卵巢的初级卵母细
胞中表达，并被翻译成蛋白质，在原始卵母细胞中很难
检测到ｍＲＮＡ存在。随着卵母细胞的生长和颗粒细胞
数的增加，ＢＭＰ一１５的表达量逐渐升高，利用重组的
ＢＭＰ一１５蛋白处理培养的颗粒细胞发现．ＢＭＰ一１５可
以直接刺激颗粒细胞的有丝分裂，并且这种活性不受
ＦＳＨ的影响；同时ＢＭＰ一１５还参与颗粒细胞类固醇的
合成与ＢＭＰ一１５的增殖活性相反。ＢＭＰ一１５对类固醇
合成的应答依赖于 Ｈ的存在，它能显著抑制ＦＳＨ
诱导的孕酮的生物合成，同时对 Ｈ诱导的雌二醇的
产生没有任何影响。
有研究表明绵羊ＢＭＰ一１５基因可能与ＦｅｃＸＩ、
前报道的任何净品种效应。所以Ｃａｌｌｉｐｙｇｅ基因的发现
为绵羊育种工作及商品化生产提供了广阔的前景。
４．１－３绵羊高繁殖力的候选基因ＦｅｃＸＩ基因 ＦｅｃＸＩ
位点是指在绵羊ｘ染色体上影响排卵率的基因．对罗
姆尼羊的一个多产家系进行研究发现，该家系的共同祖
先Ａ２８１号母羊１１胎共产３３只羔羊，且群体中该羊的
后代都表现出高的排卵率和产羔数，对其家系成员分析
后发现，该位点在ｘ染色体上，被命名为ＦｅｃＸＩ
（Ｉｎｖｅｒｄａｌｅ）。ＦｅｃＸＨ（Ｈａｎｎａ）是在罗姆尼羊的另一个品系
Ｈａｎｎａ中Ｈａｎｎａ发现的，也位于ｘ染色体上。有一个拷
贝的公羊（ＩＹ）与杂合型女儿配对表明纯合型（ＩＩ）有一
个肉质的卵巢并且不孕。
ＦｅｃＸＩ对胎儿发育也有很重要影响．Ｉ＋型与＋＋型
相比４０ ｄ时生殖细胞的数量明显的较低．在９０ｄ时明
显高。妊娠９０ｄ时，Ｉ＋的卵泡平均直径明显小于＋＋或
ＦｅｃＸＨ基因有关。携带ＦｅｃＸＨ基因绵羊ＢＭＰ一１５基因
在编码成熟肽的核苷酸的第６７位存在Ｃ—Ｔ替换．使
得第２３位的谷氨酸变成终止密码子；而在携带ＦｅｃＸＩ
基因的绵羊中，该基因则在第９２位核苷酸处存在Ｔ＿÷
Ａ变异，结果使得第３１位缬氨酸突变为天冬氨酸（见图
３）。这两种突变都可能使ＢＭＰ－１５不能形成有功能的
二聚体从而阻断ＢＭＰ一１５基因功能的发挥．最终的结果
是ＦｅｃＸ ｃＸＩ或ＦｅｃｘＨ，ＦｅｃＸＨ绵羊发生不育。但只
有一个拷贝的ＢＭＰ一１５失活则可以增加排卵率，这可能
ＩＩ型卵巢。然而从妊娠１０５ ｄＩ＋型的卵泡发育与对照组
相似。在胎儿发育的早期ＩＩ生殖细胞群与对照组中的
是因为更大比例的卵泡腔内含有可对ＬＨ产生应答的
颗粒细胞：另一种解释是正常水平活性肽的５０％可
能通过减少有丝分裂的数量以及卵泡所产生的类固
醇或抑制素的数量．从而延迟对血浆 Ｈ浓度的抑制
作用等方式，使多个卵泡被选择性地排卵；最后一个
可能的原因是有生物活性的ＢＭＰ一１５水平的减少影
响了其他生长因子如ＧＤＦ一９对颗粒细胞的增殖和分
化的作用。
那些相似，但是在妊娠１０５ｄ时就发生不同。在这一时
期，Ⅱ胎儿的卵巢缺乏正常的３型卵泡．含有异常结构
包括缺乏卵泡细胞的卵母细胞，有退化的卵母细胞或
游离卵母细胞的卵泡。卵母细胞的直径和颗粒细胞的
数量显示当ＩＩ型卵母细胞扩大的时候．颗粒细胞没有
平行增加或组织颗粒细胞发育的证据。结果表明
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图３绵羊ＢＭＰ－１５基因突变
Ｆｉｇ３ Ｓｈｅｅｐ ＢＭＰ－１５ ｇｅｎｅ ｍｕｔａｔｉｏｎ
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６４：】２２５－】２３５．
Ｔｈｅ Ｍｉｃｒｏｓａｔｅｌｌｉｔｅ Ｍａｒｋｅｒｓ ｉｓ ｉｎ Ｈｕ－ｓｈｅｅｐ Ｐｒｏｌｉｉｃａｃｙ ｆＥｘａｍｉｎｅｓ
ＳＨＩ Ｇｕｏ—ｑｉｎｇｌａ，ＣＨＥＮ Ｒｕｉ－ｈＣ，ＹＡＮ Ｙｕ－ｑｉｎＩ，ＧＵＡＮ ＦｅｎｇＩ，ＹＡＮＧ Ｌｉ—ｇｕｏ
１００９５，Ｃｈｉｎａ；
（１．Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ａｎｉｍａｌ Ｂｒｅｅｄｉｎｇ＆Ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ＮａｎＪｉｎｇ Ａｇａｃ Ｕｎｉｖ，ＮａｎＪｉｎｇ ２
２．Ｉｕｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ａｎｉｍａｌ Ｓｃｉｃｅ＆Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ，Ｘｉｎｊｉａｎｇ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｒｅｃｌａｍａｔｉｏｎ，Ｓｈｉｈｅｚｉ ８３２０００，Ｃｈｉｎａ）
．
Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｔｈｅ ｓｔｕｄｙ ａｎａｌｙｓｅｄ ｔｈｅ ｍｉｃｒｏｓａｔｅｌｌｉｔｅ ｍａｒｋｅｒｓ ＯａｒＡＥ１０１ ｉｎ ｔｈｅ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ ｏｆ ｔｈｅ ＨＵ ｓｈｅｅｐ ａｎｄ
ｔｈｅ ｒｅｌａｔｉｏｎ ｂｅｔｗｅｅｎ ｔｈｅ ｖａｒｉｅｔｙ ｏｆ ｔｈｉｓ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ ａｎｄ ｔｈｅ ｐｒｏｌｉｉｆｃａｃｙ
．
Ｆｏｒ ｆａｒｔｈｅｒ ｒｅｓｅａｒｃｈ ｔｈｅ ｍａｊｏｒ ｇｅｎｅ
ｏｆ ｈｉｔｓ ｐｒｏｌｉｆｉｃａｃｙ ｉｎ ｃｒｏｓｓｂｒｅｅｄ ａｎｄ ｐｒｅｐａｒｅ ｔｈｅ ｅａｒｌｙ ｂｒｅｅｄｉｎｇ ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ
．
Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ：Ｍｉｃｒｏｓａｔｅｌｌｉｔｅ ｍａｒｋｅｒ；Ｈｕ－ｓｈｅｅｐ；Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ