2024年5月6日发(作者：利惠美)
流式triton x100破膜染色实验步骤
一、溶液与试剂
注：利用反渗透去离子水(RODI)或同等级别的水制备溶液。
1X磷酸盐缓冲盐水（PBS）：配制1 L的1X PBS：添加100 ml 10X PBS(#12528)
至900 ml水，然后将其混合。
4%甲醛，无甲醇(#47746)
细胞通透缓冲液：购买即用型(#39487)或者通过添加30µl Triton™X-100至10 ml
抗体稀释缓冲液来制备10 ml。4°C保存。
抗体稀释缓冲液：购买即用型流式细胞术抗体稀释缓冲液(#13616)，或在100 ml 1x
PBS中溶解0.5 g牛血清白蛋白(BSA)(#9998)来制备0.5%BSA PBS缓冲液。4°C保存。
推荐的二抗：要检测未偶联的抗体，请选择与您的一抗（例如兔）的宿主物种匹配的
二抗。点击此处以获取被批准用于流式细胞术的二抗的最新列表。
二、固定与透化
注：固定前，应分离贴壁细胞或组织，使它成为单细胞悬浮液。
注：理想的离心条件根据细胞类型和试剂容量有所不同。一般，1-5分钟150-300g
将足以使细胞沉淀下来。
注：如果使用全血，则需在固定前裂解红细胞并通过离心分离来洗涤。
注：如果表位被甲醛和/或Triton™X-100破坏，可以在固定前添加靶向CD标记物或
其他胞外蛋白的抗体。在固定和透化过程期间，这类抗体将保持与目的靶标结合。如果您
不确定，请进行小规模实验。
通过离心使细胞沉淀下来，移除上清液。
按每100万个细胞大约100µl 4%甲醛重悬细胞。混匀以解离沉淀物并防止各个细胞
交联。
室温(20-25°C)固定15分钟。
通过离心用过量1X PBS洗涤。将上清液弃于合适的废液缸中。
在每一百万个细胞约100μl细胞透化缓冲液中重悬细胞。
在室温孵育10分钟。
继续进行染色或将细胞在PBS中-4°C保存过夜。
三、免疫染色
注：使用血细胞计数器或备选方法计数细胞。
将所需数目的细胞分装入试管或小孔中。（通常，每次检测用5x105至1x106个细
胞）。
将细胞离心，弃去清液。
在100µl稀释的一抗中重悬细胞，这种一抗按建议的稀释度或如通过滴定所确定那样
以抗体稀释缓冲液配制。
室温(20-25°C)孵育1小时。
在抗体稀释缓冲液或1X PBS中通过离心洗涤。弃去上清液。重复。如果使用直接偶
联抗体，则跳到步骤9。
在100µl稀释的荧光素偶联的二抗（按建议的稀释比例用抗体稀释缓冲液制备）中重
悬细胞。
在室温(20-25°C)下孵育30分钟。避光。
在抗体稀释缓冲液或1X PBS中通过离心洗涤。弃去上清液。重复。
在1X PBS中重悬细胞，在流式细胞分析仪上分析。
2024年5月6日发(作者：利惠美)
流式triton x100破膜染色实验步骤
一、溶液与试剂
注：利用反渗透去离子水(RODI)或同等级别的水制备溶液。
1X磷酸盐缓冲盐水（PBS）：配制1 L的1X PBS：添加100 ml 10X PBS(#12528)
至900 ml水，然后将其混合。
4%甲醛，无甲醇(#47746)
细胞通透缓冲液：购买即用型(#39487)或者通过添加30µl Triton™X-100至10 ml
抗体稀释缓冲液来制备10 ml。4°C保存。
抗体稀释缓冲液：购买即用型流式细胞术抗体稀释缓冲液(#13616)，或在100 ml 1x
PBS中溶解0.5 g牛血清白蛋白(BSA)(#9998)来制备0.5%BSA PBS缓冲液。4°C保存。
推荐的二抗：要检测未偶联的抗体，请选择与您的一抗（例如兔）的宿主物种匹配的
二抗。点击此处以获取被批准用于流式细胞术的二抗的最新列表。
二、固定与透化
注：固定前，应分离贴壁细胞或组织，使它成为单细胞悬浮液。
注：理想的离心条件根据细胞类型和试剂容量有所不同。一般，1-5分钟150-300g
将足以使细胞沉淀下来。
注：如果使用全血，则需在固定前裂解红细胞并通过离心分离来洗涤。
注：如果表位被甲醛和/或Triton™X-100破坏，可以在固定前添加靶向CD标记物或
其他胞外蛋白的抗体。在固定和透化过程期间，这类抗体将保持与目的靶标结合。如果您
不确定，请进行小规模实验。
通过离心使细胞沉淀下来，移除上清液。
按每100万个细胞大约100µl 4%甲醛重悬细胞。混匀以解离沉淀物并防止各个细胞
交联。
室温(20-25°C)固定15分钟。
通过离心用过量1X PBS洗涤。将上清液弃于合适的废液缸中。
在每一百万个细胞约100μl细胞透化缓冲液中重悬细胞。
在室温孵育10分钟。
继续进行染色或将细胞在PBS中-4°C保存过夜。
三、免疫染色
注：使用血细胞计数器或备选方法计数细胞。
将所需数目的细胞分装入试管或小孔中。（通常，每次检测用5x105至1x106个细
胞）。
将细胞离心，弃去清液。
在100µl稀释的一抗中重悬细胞，这种一抗按建议的稀释度或如通过滴定所确定那样
以抗体稀释缓冲液配制。
室温(20-25°C)孵育1小时。
在抗体稀释缓冲液或1X PBS中通过离心洗涤。弃去上清液。重复。如果使用直接偶
联抗体，则跳到步骤9。
在100µl稀释的荧光素偶联的二抗（按建议的稀释比例用抗体稀释缓冲液制备）中重
悬细胞。
在室温(20-25°C)下孵育30分钟。避光。
在抗体稀释缓冲液或1X PBS中通过离心洗涤。弃去上清液。重复。
在1X PBS中重悬细胞，在流式细胞分析仪上分析。