2024年5月11日发(作者：斋江雪)
实验前应明确的问题：
1. 选择适当的细胞接种浓度
一般情况下，96孔培养板的一孔贴壁细胞长满时约有105个/ml细胞。但由于不同细
胞贴壁后面积差异很大，因此，在进行MTT试验前，要进行预实验检测其贴壁率、倍增时
间以及不同接种细胞数条件下的生长曲线，确定试验中每孔的接种细胞数和培养时间，以
保证培养终止致细胞过满。这样，才能保证MTT结晶形成数量与细胞数呈的线性关系。否
则细胞数太多敏感性降低，太少观察不到差异。
2. 药物浓度的设定
在不同时间点的测定OD值，输入Excel表，最后得到不同时间点的抑制率变化情况，
画出变化的曲线，曲线什么时候变得平坦了（到了平台期）那个时间点应该就是最好的时
间点（因为这个时候的细胞增殖抑制表现的最明显）。
4. 培养时间
200ul的培养液对于10的4~5次方的增殖期细胞来说，很难维持68h，如果营养不
够的话，细胞会由增殖期渐渐趋向G0期而趋于静止，影响结果，我们是在48h换液的。
5. MTT法只能测定细胞相对数和相对活力，不能测定细胞绝对数
做MTT时，尽量无菌操作，因为细菌也可以导致MTT比色OD值的升高。
6. 理论未必都是对的要根据自己的实际情况调整。
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7. 实验时应设置调零孔，对照孔，加药孔 调零孔加培养基、MTT、二甲基亚砜。对
照孔和加药孔都要加细胞、培养液、MTT、二甲基亚砜，不同的是对照孔加溶解药物的介
质，而加药组加入不同浓度的药物。
8. 避免血清干扰 用含15%胎牛血清培养液培养细胞时，高的血清物质会影响试验孔
的光吸收值。由于试验本底增加，会试验敏感性。因此，一般选小于10％胎牛血清的培养
液进行。在呈色后，尽量吸净培养孔内残余培养液。
实验步骤：
贴壁细胞：
1. 收集对数期细胞，调整细胞悬液浓度，每孔加入100ul，铺板使待测细胞调密度至
1000~10000孔（边缘孔用无菌PBS填充）。
2. 5%CO2，37℃孵育，至细胞单层铺满孔底（96孔平底板），加入浓度梯度的药物，
原则上，细胞贴壁后即可加药，或两小时，或半天时间，但我们常在前一天下午铺板，次
日上午加药。一般5~7个梯度，每孔100ul，设3~5个复孔。建议设5个，否则难以反
应真实情况。
3. 5%CO2，37℃孵育16~48小时，倒置显微镜下观察。
4. 每孔加入10ul MTT溶液（5mg/ml，即0.5%MTT），继续培养4h。若药物与MTT
能够反应，可先离心后弃去培养液，小心用PBS冲2-3遍后，再加入含MTT的培养液。
5. 终止培养，小心吸去孔内培养液。
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2024年5月11日发(作者：斋江雪)
实验前应明确的问题：
1. 选择适当的细胞接种浓度
一般情况下，96孔培养板的一孔贴壁细胞长满时约有105个/ml细胞。但由于不同细
胞贴壁后面积差异很大，因此，在进行MTT试验前，要进行预实验检测其贴壁率、倍增时
间以及不同接种细胞数条件下的生长曲线，确定试验中每孔的接种细胞数和培养时间，以
保证培养终止致细胞过满。这样，才能保证MTT结晶形成数量与细胞数呈的线性关系。否
则细胞数太多敏感性降低，太少观察不到差异。
2. 药物浓度的设定
在不同时间点的测定OD值，输入Excel表，最后得到不同时间点的抑制率变化情况，
画出变化的曲线，曲线什么时候变得平坦了（到了平台期）那个时间点应该就是最好的时
间点（因为这个时候的细胞增殖抑制表现的最明显）。
4. 培养时间
200ul的培养液对于10的4~5次方的增殖期细胞来说，很难维持68h，如果营养不
够的话，细胞会由增殖期渐渐趋向G0期而趋于静止，影响结果，我们是在48h换液的。
5. MTT法只能测定细胞相对数和相对活力，不能测定细胞绝对数
做MTT时，尽量无菌操作，因为细菌也可以导致MTT比色OD值的升高。
6. 理论未必都是对的要根据自己的实际情况调整。
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7. 实验时应设置调零孔，对照孔，加药孔 调零孔加培养基、MTT、二甲基亚砜。对
照孔和加药孔都要加细胞、培养液、MTT、二甲基亚砜，不同的是对照孔加溶解药物的介
质，而加药组加入不同浓度的药物。
8. 避免血清干扰 用含15%胎牛血清培养液培养细胞时，高的血清物质会影响试验孔
的光吸收值。由于试验本底增加，会试验敏感性。因此，一般选小于10％胎牛血清的培养
液进行。在呈色后，尽量吸净培养孔内残余培养液。
实验步骤：
贴壁细胞：
1. 收集对数期细胞，调整细胞悬液浓度，每孔加入100ul，铺板使待测细胞调密度至
1000~10000孔（边缘孔用无菌PBS填充）。
2. 5%CO2，37℃孵育，至细胞单层铺满孔底（96孔平底板），加入浓度梯度的药物，
原则上，细胞贴壁后即可加药，或两小时，或半天时间，但我们常在前一天下午铺板，次
日上午加药。一般5~7个梯度，每孔100ul，设3~5个复孔。建议设5个，否则难以反
应真实情况。
3. 5%CO2，37℃孵育16~48小时，倒置显微镜下观察。
4. 每孔加入10ul MTT溶液（5mg/ml，即0.5%MTT），继续培养4h。若药物与MTT
能够反应，可先离心后弃去培养液，小心用PBS冲2-3遍后，再加入含MTT的培养液。
5. 终止培养，小心吸去孔内培养液。
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