2024年5月18日发(作者：戢昆)
山东医药２０１１年第５１卷第３６期
红系造血分化中分化调节因子的
表达及调控
谭业辉，王畅 ，王冠军
（吉林大学第一医院，长春１３００２１）
摘要：目的 探讨红系分化调节因子（ＥＤＲＦ）在红白血病及正常造血组织中的表达差异及可能的调控机制。
方法应用Ｎｏｒｔｈｅｒｎ ｂｌｏｔ方法检测红白血病细胞ＨＢ２２．２、ＣＢ３中ＥＤＲＦ基因的表达，并以正常小鼠胚胎肝脏组织
作为对照；通过改变培养条件，诱导红白血病细胞系ＨＢ６０—５成熟分化，探讨红系分化中ＥＤＲＦ表达的变化；采用
Ｓｏｕｔｈｅｒｎ ｂｌｏｔ方法对ＥＤＲＦ基因进行ＤＮＡ水平检测；通过转基因的方法探讨红系造血调控因子ＧＡＴＡ一１、ＮＦ—Ｅ２、
Ｆｌｉ一１对ＥＤＲＦ表达的影响。结果在胚胎肝组织中ＥＤＲＦ表达水平较高，在ＮＦ・Ｅ２缺陷的红白血病细胞株ＨＢ２２．２
及ＣＢ３中，ＥＤＲＦ表达降低，同时 一珠蛋白表达缺失；Ｓｏｕｔｈｅｒｎ ｂｌｏｔ检测未发现红白血病细胞与正常胚胎肝脏组织
ＥＤＲＦ基因的差别；ＨＢ２２．２及ＣＢ３转染ＮＦ．Ｅ２基因后，血红蛋白及ＥＤＲＦ表达水平均明显上调；诱导ＨＢ６０－５分化
成熟后。ＮＦ—Ｅ２、ＧＡＴＡ．１、ｄ．珠蛋白及ＥＤＲＦ的表达逐渐增高，具有一定的相关性；ＨＢ６０－５细胞转染ＧＡＴＡ一１基因后
可明显上调ＥＤＲＦ表达，转染Ｆｌｉ一１基因后则ＥＤＲＦ表达水平下降。结论ＥＤＲＦ是红系造血相关基因，在正常红
系细胞中具有高水平表达；红白血病细胞系中ＥＤＲＦ的表达受抑，这种表达减低不是ＤＮＡ突变所致；红系造血因子
ＧＡＴＡ一１、ＮＦ—Ｅ２可上调ＥＤＲＦ的表达，Ｆｌｉ一１可下调ＥＤＲＦ表达。
关键词：红系分化调节因子；红系造血分化；基因调控
中图分类号：Ｒ７３３．７ 文献标志码：Ａ 文章编号：１００２－２６６Ｘ（２０１１）３６４３０２７－０３
Ｅｘｐｅｒｅｓｓｉｏｎ ａｎｄ ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｅｒｙｔｈｒｏｉｄ ｄｉｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒ Ｉｎ ｅｒｙｔｈｒｏｄ ｄｉｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ
ⅣＹｅ．ｈｕｉ． ⅣＧ Ｃｈａｎｇ． ⅣＧ Ｇｕａｎ－ｊｕｎ
（ ｅ Ｆｉｒｓｔ Ｈｏｓｐｉｔａｌ ｏｆｊｉｌｉｎ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｃｈａｎｇｃｈｕｎ １３００２１，Ｐ．Ｒ．Ｃｈｉｎａ）
Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ Ｔｏ ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅ ｔｈｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｅｒｙｔｈｒｏｉｄ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ｒｅｇｕｌａｔｅ ｆａｃｔｏｒ（ＥＤＲＦ）ｉｎ ｎｏｒｍａｌ ｈｅ—
ｍａｔｏｐｏｉｔｉｃ ｔｉｓｓｕｅ ａｎｄ ｅｒｙｔｈｒｏｌｅｕｋｅｍｉａ ｃｅｌｌｓ．ａｎｄ ｔｏ ｅｘｐｌｏｒｅ ｔｈｅ ｍｅｃｈａｎｉｓｍ ｏｆ ＥＤＲＦ ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ．Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｔｈｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ
ｏｆ ＥＤＲＦ ｉｎ ｅｒｙｔｈｏｌｅｕｋｅｍｉａ ｃｅｌｌ ＮＦ—Ｅ２．ＨＢ２２．２ ａｎｄ ｉｎ ｍｉｃｅ ｆｅｔｕｓ ｌｉｖｅｒ ｔｉｓｓｕｅ ｗａｓ ｄｅｔｅｃｔｅｄ ｂｙ Ｎｏｒｔｈｅｒｎ ｂｌｏｔ ｍｅｔｈｏｄ，ｔｈｅ
ＤＮＡ ｔｒａｎｓｍｕｔａｔｉｏｎ ｗａｓ ｄｅｔｅｃｔｅｄ ｂｙ Ｓｏｕｔｈｅｒｎ ｂｌｏｔ ｍｅｔｈｏｄ．Ｔｈｅ ｇｒａｄｕａｌ ｃｈａｎｇｅ ｏｆ ＥＤＲＦ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｄｕｒｉｎｇ ｅｒｙｔｈｏｉｄ ｄｉｆｆｅｒｅｎ—
ｔｉａｔｉｏｎ ｗａｓ ｏｂｓｅｒｖｅｄ ｂｙ ｕｓｉｎｇ ｅｒｙｔｈｒｏｌｅｕｋｅｍｉａ ｃｅｌｌ ＨＢ６０—５ ｗｈｉｃｈ ｉｎｄｕｃｅｄ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ｂｙ ｃｈａｎｇｉｎｇ ｃｕｌｔｕｒｅ．Ｔｏ ｏｂｓｅｒｖｅ
ｔｈｅ ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｅｒｙｔｈｒｏｉｄ ｆａｃｔｏｒｓ ＧＡＴＡ一１．ＮＦ—Ｅ２ ａｎｄ Ｆｌｉ一１ ｏｎ ＥＤＲＦ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｂｙ ｕｓｉｎｇ ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ．Ｒｅｓｕｌｔｓ
Ｔｈｅ ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ＮＦ—Ｅ２ ｉｎｔｏ ＣＢ３ ａｎｄ ＨＢ２２．２ ｃｏｕｌｄ ｒｅｓｔｏｒｅ ｔｈｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ＥＤＲＦ．Ｄｕｒｉｎｇ ｔｈｅ ｅｒｙｔｈｒｏｉｄ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ
ｏｆ ＨＢ６０－５ ｃｅｌｌ，ｔｈｅ ＮＦ－２，ＧＡＴＡ一１， —ｇｌｏｂｉｎ ａｎｄ ＥＤＲＦ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｗｅｒｅ ｇｒａｄｕａｌｌｙ ｅｖａｌｕａｔｅｄ ｓｉｍｕｌｔａｎｅｏｕｓｌｙ．Ｉｎ ＨＢ６０—５
ｃｅｌｌ，ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ＧＡＴＡ一１ ｃｏｕｌｄ ｐｒｏｍｏｔｅ ｔｈｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ＥＤＲＦ，ｉｎ ｃｏｎｔｒａｓｔ，ｔｈｅ ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｆｌｉ一１ ｓｕｐｐｒｅｓｓｅｄ ｔｈｅ
ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ＥＤＲＦ．Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎｓ ＥＤＲＦ ｗａｓ ｅｒｙｔｈｒｏｉｄ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｇｅｎｅ ｗｈｉｃｈ ｗａｓ ｈｉｇｈ ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ ｉｎ ｎｏｒｍａｌ ｅｒｙｔｈｒｏｉｄ ｔｉｓ—
ｓｕｅ，ｈｏｗｅｖｅｒ ｉｎ ｅｒｙｔｈｒｏｌｅｕｋｅｍｉａ ｃｅｌｌｓ ｔｈｅ ｈｉｇｈ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ＥＤＲＦ ｗａｓ ｇｒｅａｔｌｙ ｓｕｐｐｒｅｓｓｅｄ ｗｈｉｃｈ ｗａｓ ｎｏｔ ｃａｕｓｅｄ ｂｙ ＤＮＡ
ａｂｅｒｒａｔｉｏｎ．ＥＤＲＦ ｃｏｕｌｄ ｂｅ ｕｐ－ｒｅｇｕｌａｔｅｄ ｂｙ ｅｒｙｔｈｒｏｉｄ ｆａｃｔｏｒ ＧＡＴＡ一１ ａｎｄ ＮＦ—Ｅ２．ａｎｄ ｄｏｗｎ—ｒｅｇｕｌａｔｅｄ ｂｙ Ｆｌｉ一１．
Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ：ｅｒｙｔｈｒｏｉｄ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ｒｅｇｕｌａｔｅ ｆａｃｔｏｒ；ｅｒｙｔｈｒｏｉｄ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ；ｇｅｎｅ ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ
红白血病是急性白血病的特殊类型，伴有红系
达…，能够稳定仅一珠蛋白链及促进血红蛋白生成，
的异常增生和分化障碍。红系分化调节因子
同时也对血红蛋白生成的早期调节具有一定作
（ＥＤＲＦ）又称血红蛋白稳定蛋白（ＡＨＳＰ），是近年来
用 Ｊ，在红系分化中起重要作用。２００５年６月～
发现的一种红系造血相关因子，仅在红系细胞表
２００７年６月，我们通过对正常造血组织及红白血病
细胞中ＥＤＲＦ的检测，探讨红白血病中ＥＤＲＦ表达
基金项目：吉林省科技厅资助项目（２００８０１３５）。
变化，并进一步通过诱导分化和基因转染等方法，初
通讯作者，Ｅ—ｍａｉｌ：ｗａｄｅｔａｎ＠ｔｏｍ．ｃｏｒｎ
步探讨ＥＤＲＦ可能存在的表达调控机制。
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山东医药２０１１年第５１卷第３６期
１材料与方法
１．１ 主要材料 鼠红白血病细胞ＣＢ３、ＨＢ２２．２、
ＣＢ７、ＨＢ６０—５均为多伦多大学分子生物学系Ｙａａｃｏｖ
Ｂｅｎ—Ｄａｖｉｄ教授惠赠。１８～２２ ｇ昆明小鼠购自本校
１０×ＳＳＣ为转膜缓冲液转膜，紫外光下自动交联，８０
℃真空干烤，应用ＮＥＢｌｏｔ Ｋｉｔ制备同位素标记探针，
杂交过夜。洗膜后一８０℃过夜曝光，胶片显影。
１．２．８ Ｓｏｕｔｈｅｒｎ ｂｌｏｔ分析应用Ｈｉｎｄ Ｉｌｌ对基因组
动物室。ＰＭＸ．ＰＵＲＯ．ＧＡＴＡ．１逆转录病毒质粒，ＧＡ．
ＴＡ一１克隆于Ｘｈｏ Ｉ位点；ｐｃＤＮＡ３一Ｆｌｉ一１表达质粒，
Ｆｌｉ一１克隆于Ｈｉｎｄ ｍ—Ｘｂａ Ｉ位点；ｐＥＦ２一ｐ４５ＮＦ—Ｅ２真
ＤＮＡ酶切过夜，１％琼脂糖凝胶电泳分离，０．４
ｎｍｏｌ／Ｌ ＮａＯＨ为转膜缓冲液转膜，其后步骤同
Ｎｏｒｔｈｅｒｎ ｂｌｏｔ分析。
２ 结果
核表达质粒，ｐ４５ＮＦ—Ｅ２序列克隆于Ｎｏｔ Ｉ酶切位点。
以上质粒均来自多伦多大学分子生物学系Ｙａａｅｏｖ
２．１ ＥＤＲＦ基因的表达检测ＨＢ２２．２及ＣＢ３细胞
Ｂｅｎ—Ｄａｖｉｄ教授惠赠。探针包括ｐ４５ＮＦ．Ｅ２、 一珠蛋
白、Ｆｌｉ－１、Ｇａｔａ－１、ＥＤＲＦ等ｃＤＮＡ序列。ＮＥＢｌｏｔ Ｋｉｔ
中，由于ＮＦ—Ｅ２基因表达的缺失，导致红系分化受
阻，表现为血红蛋白珠蛋白链表达缺失，同时伴有
购自Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ公司，用于放射性核素标
记探针合成。ＴＲＩｚｏｌ反应试剂购自Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｌｉｆｅ
Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ公司，用于ＲＮＡ提取。
１．２实验方法
１．２．１胚胎肝脏的获得将雌雄鼠同笼饲养，每日
早晨观察精栓确定受孕，于孕１４ ｄ脱颈处死，显微
镜下取胚胎肝脏。
１．２．２ 细胞培养ＣＢ３、ＨＢ２２．２、ＣＢ７以含有５％
小牛血清的 ．ＭＥＭ培养液培养，ＨＢ６０．５以含有
１０％胎牛血清、１０％干细胞因子（ＳＣＦ）条件培养液
及０．４ Ｕ／ｍｌ促红细生成素（ＥＰＯ）的仪一ＭＥＭ培养液
常规传代培养。
１．２．３ ＨＢ６０—５细胞的诱导分化ＨＢ６０－５细胞在
含有ＳＣＦ与ＥＰＯ的培养液中可持续增殖；撤除
ＳＣＦ，单独应用ＥＰＯ的条件下可向红系成熟细胞分
化。
１．２．４细胞转染 取对数生长期细胞进行转染。
应用常规电转染的方法将２Ｆ—ｐ４５．ＮＦ．Ｅ２质粒导入
ｐ４５一ＮＦ—Ｅ２缺陷细胞ＨＢ２２．２，使用Ｇｅｎｅ ｐｕｌｓｅｒ电转
染仪，应用新霉素筛选；通过逆转录病毒转染方法将
ＧＡＴＡ－１导入ＨＢ６０－５细胞。采用ＧＰ＋Ａ细胞包装
病毒，应用嘌呤霉素进行筛选；通过应用脂质体
２０００将ｐｅＤＮＡ３．Ｆｌｉ．１转染至ＨＢ６０－５细胞，应用新
霉素进行筛选。
１．２．５ ＲＮＡ提取收取一定数量的对数生长期细
胞及小鼠胚胎肝脏组织，ＲＮＡ的提取采用ＴＲＩｚｏｌ反
应法，具体按ＴＲＩｚｏｌ试剂说明书进行。紫外分光光
度仪测定吸光度（Ａ）值确定其含量及纯度。
１．２．６ ＤＮＡ提取取小鼠胚胎肝脏组织及对数生
长期红白血病细胞，应用酚氯仿抽提的方法提取基
因组ＤＮＡ，紫外分光光度仪测定Ａ值确定其含量及
纯度。
１．２．７ Ｎｏｒｔｈｅｒｎ ｂｌｏｔ分析应用甲醛变性电泳对提
取的细胞总ＲＮＡ进行电泳分离，溴化乙啶染色，以
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ＥＤＲＦ基因表达明显减低，而在小鼠正常胚胎肝脏
组织，ＮＦ—Ｅ２、血红蛋白珠蛋白链及ＥＤＲＦ均表现为
高表达，见插页Ⅱ图８。
２．２ ＥＤＲＦ基因ＤＮＡ水平检测 与正常胚胎肝脏
组织比较，ＨＢ２２．２、ＣＢ３及ＨＢ６０—５白血病细胞中均
未见基因重排。
２．３ ＨＢ２２．２转染ＮＦ—Ｅ２基因后血红蛋白及ＥＤＲＦ
表达水平变化ＨＢ２２．２细胞转染ＮＦ—Ｅ２基因后，
血红蛋白珠蛋白链表达明显升高，同时ＥＤＲＦ表达
也明显上升，见图插页Ⅱ图９。
２．４红白血病细胞系ＨＢ６０—５诱导分化后ＥＤＲＦ及
其他红系造血相关因子表达变化ＨＢ６０—５细胞经
改变培养条件，出现红系分化，血红蛋白珠蛋白链表
达随培养时间延长逐渐增高，提示ＨＢ６０—５向红系
成熟分化，ＥＤＲＦ表达随着红系分化程度的增加而
逐渐增加，见插页Ⅱ图１０。
２．５ ＨＢ６０．５细胞转染ＧＡＴＡ一１、Ｆｌｉ．１后ＥＤＲＦ的表
达变化通过转基因的方法，ＨＢ６０—５细胞中获得了
ＧＡＴＡ．１、Ｆｌｉ一１的高表达，可以看出随着ＧＡＴＡ一１的
表达升高，ＥＤＲＦ表达升高，而随着Ｆｌｉ．１的表达升
高，ＥＤＲＦ表达减低，见插页Ⅱ图１１。
３讨论
在正常红系造血生成中，血红蛋白ｄ及８珠蛋
白链的生成和最终组装成为血红蛋白分化成熟的重
要标志，多种红系造血相关基因在此过程中发挥重要
作用，红细胞的最终发育成熟是多个基因有序开启
（或表达增强）和关闭（或表达降低）的结果。它们的
表达异常可能导致血液病的发生。ＥＤＲＦ是红系造
血生成相关蛋白，在红系细胞中特异性高表达，能够
与游离ｄ．珠蛋白结合从而减少其细胞毒性，对维持
红细胞的寿命起重要作用＿３．４］。在红细胞的分化成熟
过程中，ＥＤＲＦ随着ｏ【 珠蛋白表达的增多而逐渐升
高，提示ＥＤＲＦ表达可能受红系分化相关基因调
节 Ｊ。有文献报道，ＧＡＴＡ．１可以上调ＥＤＲＦ表达 。
山东医药２０１１年第５１卷第３６期
但在红系造血生成过程中，其他红系造血相关因子如
ＮＦ．２、Ｆｌｉ．１等对ＥＤＲＦ表达是否存在影响尚不清楚。
红白血病是急性髓系白血病中一种少见类型，
其发病机制与多种红系造血相关基因调节异常有
关。在红白血病细胞系中，往往存在一些红系造血
相关原癌基因的过表达和抑癌基因失表达，如ＧＡ－
ＴＡ一１表达的减低、ＮＦ．Ｅ２基因的失活、Ｆｌｉ一１基因持
续表达等。通过转基因及反义核苷酸的方法对这些
强子区域中，并未发现ＮＦ—Ｅ２的结合作用位点，因
此，ＮＦ．Ｅ２对ＥＤＲＦ的调节机制尚不清楚。
在红系分化过程中，同时还伴有Ｆｌｉ．１的降低和
ＧＡＴＡ．１的升高，而ＧＡＴＡ．１可以直接与ＥＤＲＦ启动
子区域结合，从而启动ＥＤＲＦ的表达 Ｊ，在红系造血
过程中，Ｆｌｉ．１和ＧＡＴＡ．１之间具有相互负调节的作
用。因此，可以推测Ｆｌｉ．１可能对ＥＤＲＦ也存在负调
节的作用。为了进一步明确Ｆｌｉ．１和ＧＡＴＡ一１所引起
基因表达进行调节，可以用来观察红系分化过程中
各种转录因子的作用及血红蛋白调节的相关机制，
很大程度上反映出红系造血生成及分化成熟的生理
及病理过程，是研究红系造血调控的理想细胞模型。
本研究结果也可以看出，在胚胎肝细胞中ＥＤＲＦ
具有极高的表达，而在Ｆｒｉｅｎｄ病毒诱导产生的ＣＢ３、
ＨＢ２２．２细胞系中，因ＮＦ．Ｅ２缺陷而导致仅一珠蛋白表
达明显减低，同时伴有ＥＤＲＦ的低表达，同样证明了
ＥＤＲＦ与红系分化密切相关。为了明确红白血病细
胞中ＥＤＲＦ基因表达减低的原因，我们首先应用
Ｓｏｕｔｈｅｒｎ ｂｌｏｔ法检测了ＤＮＡ水平的变化，在各种红白
血病细胞中，两种内切酶完全酶切后进行的杂交结果
与正常组织相比都没有变化，排除了由于病毒插入导
致基因失活的可能性，提示ＥＤＲＦ的失活可能与转录
或转录后调节有关。通过基因转染的研究发现，
ＣＢ３、ＨＢ２２．２细胞转染外源ｐ４５ＮＦ—Ｅ２后，ＥＤＲＦ明显
升高，提示ＮＦ—Ｅ２可促进ＥＤＲＦ的表达上调。同样，
在ＨＢ６０．５细胞系中，通过改变培养条件的方法，促使
ＨＢ６０．５向红系终末分化的过程中，随着ｐ４５ＮＦ—Ｅ２和
珠蛋白的表达增高，ＥＤＲＦ的转录也增高。以上结果
均提示ＮＦ．Ｅ２对ＥＤＲＦ具有正向调节作用。
ＮＦ．Ｅ２是红系分化中的重要调节因子，能够与
血红蛋白珠蛋白基因局部控制区域中的增强子序列
相结合从而促进其转录，对血红蛋白的表达起决定
性作用。在ｐ４５ＮＦ．Ｅ２表达缺陷的红白血病细胞株
中，血红蛋白的表达极大减低甚至消失。而在本研
究中，ＮＦ．Ｅ２缺陷的红白血病细胞系中，ＥＤＲＦ同样
明显减低，外源ＮＦ—Ｅ２基因的转染可极大恢复
ＥＤＲＦ的表达，提示ＮＦ—Ｅ２对ＥＤＲＦ的转录调节可
能同样起到决定性作用。但在ＥＤＲＦ的启动子及增
的ＥＤＲＦ基因转录变化，我们分别将这两种基因转染
到ＨＢ６０－５细胞中，发现外源的Ｆｌｉ．１基因能够抑制
ＥＤＲＦ的表达，而ＧＡＴＡ一１能够促进ＥＤＲＦ的表达。
以上分析可以看出，ＥＤＲＦ在红系分化过程中
具有重要作用，在正常红系细胞中具有高水平表达；
在分化过程中，多种红系造血相关因子的表达水平
均可对ＥＤＲＦ表达产生影响。在红白血病细胞系中
ＥＤＲＦ的表达明显受抑，这种表达减低不是ＤＮＡ突
变所致；红系造血因子ＧＡＴＡ一１、ＮＦ—Ｅ２可上调
ＥＤＲＦ的表达，Ｆｌｉ．１可下调ＥＤＲＦ表达，其中ＮＦ—Ｅ２
对于ＥＤＲＦ的表达可能起到不可缺失的作用，但具
体调节机制尚需进一步研究。
参考文献：
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ｍｏｇｌｏｂｉｎ ｓｔａｂｉｌｉｚｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ ｇｅｎｅ ｄｕｒｉｎｇ ｈｕｍａｎ ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｉｅｓｉｓ［Ｊ］．
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ｑｕｉｒｅｄ ｆｏｒ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｈｕｍａｎ ａｌｐｈａ－－ｈｅｍｏｇｌｏｂｉｎ・－ｓｔａｂｉｌｉｚｉｎｇ ｐｒｏ・－
ｔｅｉｎ ｇｅｎｅ［Ｊ１．Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ，２００５，２８０（４７）：３９０１６－３９０２３．
（收稿日期：２０１０－０９－２１）
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山东医药２０１１年第５１卷第３６期
红系造血分化中分化调节因子的
表达及调控
谭业辉，王畅 ，王冠军
（吉林大学第一医院，长春１３００２１）
摘要：目的 探讨红系分化调节因子（ＥＤＲＦ）在红白血病及正常造血组织中的表达差异及可能的调控机制。
方法应用Ｎｏｒｔｈｅｒｎ ｂｌｏｔ方法检测红白血病细胞ＨＢ２２．２、ＣＢ３中ＥＤＲＦ基因的表达，并以正常小鼠胚胎肝脏组织
作为对照；通过改变培养条件，诱导红白血病细胞系ＨＢ６０—５成熟分化，探讨红系分化中ＥＤＲＦ表达的变化；采用
Ｓｏｕｔｈｅｒｎ ｂｌｏｔ方法对ＥＤＲＦ基因进行ＤＮＡ水平检测；通过转基因的方法探讨红系造血调控因子ＧＡＴＡ一１、ＮＦ—Ｅ２、
Ｆｌｉ一１对ＥＤＲＦ表达的影响。结果在胚胎肝组织中ＥＤＲＦ表达水平较高，在ＮＦ・Ｅ２缺陷的红白血病细胞株ＨＢ２２．２
及ＣＢ３中，ＥＤＲＦ表达降低，同时 一珠蛋白表达缺失；Ｓｏｕｔｈｅｒｎ ｂｌｏｔ检测未发现红白血病细胞与正常胚胎肝脏组织
ＥＤＲＦ基因的差别；ＨＢ２２．２及ＣＢ３转染ＮＦ．Ｅ２基因后，血红蛋白及ＥＤＲＦ表达水平均明显上调；诱导ＨＢ６０－５分化
成熟后。ＮＦ—Ｅ２、ＧＡＴＡ．１、ｄ．珠蛋白及ＥＤＲＦ的表达逐渐增高，具有一定的相关性；ＨＢ６０－５细胞转染ＧＡＴＡ一１基因后
可明显上调ＥＤＲＦ表达，转染Ｆｌｉ一１基因后则ＥＤＲＦ表达水平下降。结论ＥＤＲＦ是红系造血相关基因，在正常红
系细胞中具有高水平表达；红白血病细胞系中ＥＤＲＦ的表达受抑，这种表达减低不是ＤＮＡ突变所致；红系造血因子
ＧＡＴＡ一１、ＮＦ—Ｅ２可上调ＥＤＲＦ的表达，Ｆｌｉ一１可下调ＥＤＲＦ表达。
关键词：红系分化调节因子；红系造血分化；基因调控
中图分类号：Ｒ７３３．７ 文献标志码：Ａ 文章编号：１００２－２６６Ｘ（２０１１）３６４３０２７－０３
Ｅｘｐｅｒｅｓｓｉｏｎ ａｎｄ ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｅｒｙｔｈｒｏｉｄ ｄｉｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒ Ｉｎ ｅｒｙｔｈｒｏｄ ｄｉｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ
ⅣＹｅ．ｈｕｉ． ⅣＧ Ｃｈａｎｇ． ⅣＧ Ｇｕａｎ－ｊｕｎ
（ ｅ Ｆｉｒｓｔ Ｈｏｓｐｉｔａｌ ｏｆｊｉｌｉｎ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｃｈａｎｇｃｈｕｎ １３００２１，Ｐ．Ｒ．Ｃｈｉｎａ）
Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ Ｔｏ ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅ ｔｈｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｅｒｙｔｈｒｏｉｄ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ｒｅｇｕｌａｔｅ ｆａｃｔｏｒ（ＥＤＲＦ）ｉｎ ｎｏｒｍａｌ ｈｅ—
ｍａｔｏｐｏｉｔｉｃ ｔｉｓｓｕｅ ａｎｄ ｅｒｙｔｈｒｏｌｅｕｋｅｍｉａ ｃｅｌｌｓ．ａｎｄ ｔｏ ｅｘｐｌｏｒｅ ｔｈｅ ｍｅｃｈａｎｉｓｍ ｏｆ ＥＤＲＦ ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ．Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｔｈｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ
ｏｆ ＥＤＲＦ ｉｎ ｅｒｙｔｈｏｌｅｕｋｅｍｉａ ｃｅｌｌ ＮＦ—Ｅ２．ＨＢ２２．２ ａｎｄ ｉｎ ｍｉｃｅ ｆｅｔｕｓ ｌｉｖｅｒ ｔｉｓｓｕｅ ｗａｓ ｄｅｔｅｃｔｅｄ ｂｙ Ｎｏｒｔｈｅｒｎ ｂｌｏｔ ｍｅｔｈｏｄ，ｔｈｅ
ＤＮＡ ｔｒａｎｓｍｕｔａｔｉｏｎ ｗａｓ ｄｅｔｅｃｔｅｄ ｂｙ Ｓｏｕｔｈｅｒｎ ｂｌｏｔ ｍｅｔｈｏｄ．Ｔｈｅ ｇｒａｄｕａｌ ｃｈａｎｇｅ ｏｆ ＥＤＲＦ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｄｕｒｉｎｇ ｅｒｙｔｈｏｉｄ ｄｉｆｆｅｒｅｎ—
ｔｉａｔｉｏｎ ｗａｓ ｏｂｓｅｒｖｅｄ ｂｙ ｕｓｉｎｇ ｅｒｙｔｈｒｏｌｅｕｋｅｍｉａ ｃｅｌｌ ＨＢ６０—５ ｗｈｉｃｈ ｉｎｄｕｃｅｄ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ｂｙ ｃｈａｎｇｉｎｇ ｃｕｌｔｕｒｅ．Ｔｏ ｏｂｓｅｒｖｅ
ｔｈｅ ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｅｒｙｔｈｒｏｉｄ ｆａｃｔｏｒｓ ＧＡＴＡ一１．ＮＦ—Ｅ２ ａｎｄ Ｆｌｉ一１ ｏｎ ＥＤＲＦ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｂｙ ｕｓｉｎｇ ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ．Ｒｅｓｕｌｔｓ
Ｔｈｅ ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ＮＦ—Ｅ２ ｉｎｔｏ ＣＢ３ ａｎｄ ＨＢ２２．２ ｃｏｕｌｄ ｒｅｓｔｏｒｅ ｔｈｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ＥＤＲＦ．Ｄｕｒｉｎｇ ｔｈｅ ｅｒｙｔｈｒｏｉｄ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ
ｏｆ ＨＢ６０－５ ｃｅｌｌ，ｔｈｅ ＮＦ－２，ＧＡＴＡ一１， —ｇｌｏｂｉｎ ａｎｄ ＥＤＲＦ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｗｅｒｅ ｇｒａｄｕａｌｌｙ ｅｖａｌｕａｔｅｄ ｓｉｍｕｌｔａｎｅｏｕｓｌｙ．Ｉｎ ＨＢ６０—５
ｃｅｌｌ，ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ＧＡＴＡ一１ ｃｏｕｌｄ ｐｒｏｍｏｔｅ ｔｈｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ＥＤＲＦ，ｉｎ ｃｏｎｔｒａｓｔ，ｔｈｅ ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｆｌｉ一１ ｓｕｐｐｒｅｓｓｅｄ ｔｈｅ
ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ＥＤＲＦ．Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎｓ ＥＤＲＦ ｗａｓ ｅｒｙｔｈｒｏｉｄ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｇｅｎｅ ｗｈｉｃｈ ｗａｓ ｈｉｇｈ ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ ｉｎ ｎｏｒｍａｌ ｅｒｙｔｈｒｏｉｄ ｔｉｓ—
ｓｕｅ，ｈｏｗｅｖｅｒ ｉｎ ｅｒｙｔｈｒｏｌｅｕｋｅｍｉａ ｃｅｌｌｓ ｔｈｅ ｈｉｇｈ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ＥＤＲＦ ｗａｓ ｇｒｅａｔｌｙ ｓｕｐｐｒｅｓｓｅｄ ｗｈｉｃｈ ｗａｓ ｎｏｔ ｃａｕｓｅｄ ｂｙ ＤＮＡ
ａｂｅｒｒａｔｉｏｎ．ＥＤＲＦ ｃｏｕｌｄ ｂｅ ｕｐ－ｒｅｇｕｌａｔｅｄ ｂｙ ｅｒｙｔｈｒｏｉｄ ｆａｃｔｏｒ ＧＡＴＡ一１ ａｎｄ ＮＦ—Ｅ２．ａｎｄ ｄｏｗｎ—ｒｅｇｕｌａｔｅｄ ｂｙ Ｆｌｉ一１．
Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ：ｅｒｙｔｈｒｏｉｄ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ｒｅｇｕｌａｔｅ ｆａｃｔｏｒ；ｅｒｙｔｈｒｏｉｄ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ；ｇｅｎｅ ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ
红白血病是急性白血病的特殊类型，伴有红系
达…，能够稳定仅一珠蛋白链及促进血红蛋白生成，
的异常增生和分化障碍。红系分化调节因子
同时也对血红蛋白生成的早期调节具有一定作
（ＥＤＲＦ）又称血红蛋白稳定蛋白（ＡＨＳＰ），是近年来
用 Ｊ，在红系分化中起重要作用。２００５年６月～
发现的一种红系造血相关因子，仅在红系细胞表
２００７年６月，我们通过对正常造血组织及红白血病
细胞中ＥＤＲＦ的检测，探讨红白血病中ＥＤＲＦ表达
基金项目：吉林省科技厅资助项目（２００８０１３５）。
变化，并进一步通过诱导分化和基因转染等方法，初
通讯作者，Ｅ—ｍａｉｌ：ｗａｄｅｔａｎ＠ｔｏｍ．ｃｏｒｎ
步探讨ＥＤＲＦ可能存在的表达调控机制。
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山东医药２０１１年第５１卷第３６期
１材料与方法
１．１ 主要材料 鼠红白血病细胞ＣＢ３、ＨＢ２２．２、
ＣＢ７、ＨＢ６０—５均为多伦多大学分子生物学系Ｙａａｃｏｖ
Ｂｅｎ—Ｄａｖｉｄ教授惠赠。１８～２２ ｇ昆明小鼠购自本校
１０×ＳＳＣ为转膜缓冲液转膜，紫外光下自动交联，８０
℃真空干烤，应用ＮＥＢｌｏｔ Ｋｉｔ制备同位素标记探针，
杂交过夜。洗膜后一８０℃过夜曝光，胶片显影。
１．２．８ Ｓｏｕｔｈｅｒｎ ｂｌｏｔ分析应用Ｈｉｎｄ Ｉｌｌ对基因组
动物室。ＰＭＸ．ＰＵＲＯ．ＧＡＴＡ．１逆转录病毒质粒，ＧＡ．
ＴＡ一１克隆于Ｘｈｏ Ｉ位点；ｐｃＤＮＡ３一Ｆｌｉ一１表达质粒，
Ｆｌｉ一１克隆于Ｈｉｎｄ ｍ—Ｘｂａ Ｉ位点；ｐＥＦ２一ｐ４５ＮＦ—Ｅ２真
ＤＮＡ酶切过夜，１％琼脂糖凝胶电泳分离，０．４
ｎｍｏｌ／Ｌ ＮａＯＨ为转膜缓冲液转膜，其后步骤同
Ｎｏｒｔｈｅｒｎ ｂｌｏｔ分析。
２ 结果
核表达质粒，ｐ４５ＮＦ—Ｅ２序列克隆于Ｎｏｔ Ｉ酶切位点。
以上质粒均来自多伦多大学分子生物学系Ｙａａｅｏｖ
２．１ ＥＤＲＦ基因的表达检测ＨＢ２２．２及ＣＢ３细胞
Ｂｅｎ—Ｄａｖｉｄ教授惠赠。探针包括ｐ４５ＮＦ．Ｅ２、 一珠蛋
白、Ｆｌｉ－１、Ｇａｔａ－１、ＥＤＲＦ等ｃＤＮＡ序列。ＮＥＢｌｏｔ Ｋｉｔ
中，由于ＮＦ—Ｅ２基因表达的缺失，导致红系分化受
阻，表现为血红蛋白珠蛋白链表达缺失，同时伴有
购自Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ公司，用于放射性核素标
记探针合成。ＴＲＩｚｏｌ反应试剂购自Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｌｉｆｅ
Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ公司，用于ＲＮＡ提取。
１．２实验方法
１．２．１胚胎肝脏的获得将雌雄鼠同笼饲养，每日
早晨观察精栓确定受孕，于孕１４ ｄ脱颈处死，显微
镜下取胚胎肝脏。
１．２．２ 细胞培养ＣＢ３、ＨＢ２２．２、ＣＢ７以含有５％
小牛血清的 ．ＭＥＭ培养液培养，ＨＢ６０．５以含有
１０％胎牛血清、１０％干细胞因子（ＳＣＦ）条件培养液
及０．４ Ｕ／ｍｌ促红细生成素（ＥＰＯ）的仪一ＭＥＭ培养液
常规传代培养。
１．２．３ ＨＢ６０—５细胞的诱导分化ＨＢ６０－５细胞在
含有ＳＣＦ与ＥＰＯ的培养液中可持续增殖；撤除
ＳＣＦ，单独应用ＥＰＯ的条件下可向红系成熟细胞分
化。
１．２．４细胞转染 取对数生长期细胞进行转染。
应用常规电转染的方法将２Ｆ—ｐ４５．ＮＦ．Ｅ２质粒导入
ｐ４５一ＮＦ—Ｅ２缺陷细胞ＨＢ２２．２，使用Ｇｅｎｅ ｐｕｌｓｅｒ电转
染仪，应用新霉素筛选；通过逆转录病毒转染方法将
ＧＡＴＡ－１导入ＨＢ６０－５细胞。采用ＧＰ＋Ａ细胞包装
病毒，应用嘌呤霉素进行筛选；通过应用脂质体
２０００将ｐｅＤＮＡ３．Ｆｌｉ．１转染至ＨＢ６０－５细胞，应用新
霉素进行筛选。
１．２．５ ＲＮＡ提取收取一定数量的对数生长期细
胞及小鼠胚胎肝脏组织，ＲＮＡ的提取采用ＴＲＩｚｏｌ反
应法，具体按ＴＲＩｚｏｌ试剂说明书进行。紫外分光光
度仪测定吸光度（Ａ）值确定其含量及纯度。
１．２．６ ＤＮＡ提取取小鼠胚胎肝脏组织及对数生
长期红白血病细胞，应用酚氯仿抽提的方法提取基
因组ＤＮＡ，紫外分光光度仪测定Ａ值确定其含量及
纯度。
１．２．７ Ｎｏｒｔｈｅｒｎ ｂｌｏｔ分析应用甲醛变性电泳对提
取的细胞总ＲＮＡ进行电泳分离，溴化乙啶染色，以
２８
ＥＤＲＦ基因表达明显减低，而在小鼠正常胚胎肝脏
组织，ＮＦ—Ｅ２、血红蛋白珠蛋白链及ＥＤＲＦ均表现为
高表达，见插页Ⅱ图８。
２．２ ＥＤＲＦ基因ＤＮＡ水平检测 与正常胚胎肝脏
组织比较，ＨＢ２２．２、ＣＢ３及ＨＢ６０—５白血病细胞中均
未见基因重排。
２．３ ＨＢ２２．２转染ＮＦ—Ｅ２基因后血红蛋白及ＥＤＲＦ
表达水平变化ＨＢ２２．２细胞转染ＮＦ—Ｅ２基因后，
血红蛋白珠蛋白链表达明显升高，同时ＥＤＲＦ表达
也明显上升，见图插页Ⅱ图９。
２．４红白血病细胞系ＨＢ６０—５诱导分化后ＥＤＲＦ及
其他红系造血相关因子表达变化ＨＢ６０—５细胞经
改变培养条件，出现红系分化，血红蛋白珠蛋白链表
达随培养时间延长逐渐增高，提示ＨＢ６０—５向红系
成熟分化，ＥＤＲＦ表达随着红系分化程度的增加而
逐渐增加，见插页Ⅱ图１０。
２．５ ＨＢ６０．５细胞转染ＧＡＴＡ一１、Ｆｌｉ．１后ＥＤＲＦ的表
达变化通过转基因的方法，ＨＢ６０—５细胞中获得了
ＧＡＴＡ．１、Ｆｌｉ一１的高表达，可以看出随着ＧＡＴＡ一１的
表达升高，ＥＤＲＦ表达升高，而随着Ｆｌｉ．１的表达升
高，ＥＤＲＦ表达减低，见插页Ⅱ图１１。
３讨论
在正常红系造血生成中，血红蛋白ｄ及８珠蛋
白链的生成和最终组装成为血红蛋白分化成熟的重
要标志，多种红系造血相关基因在此过程中发挥重要
作用，红细胞的最终发育成熟是多个基因有序开启
（或表达增强）和关闭（或表达降低）的结果。它们的
表达异常可能导致血液病的发生。ＥＤＲＦ是红系造
血生成相关蛋白，在红系细胞中特异性高表达，能够
与游离ｄ．珠蛋白结合从而减少其细胞毒性，对维持
红细胞的寿命起重要作用＿３．４］。在红细胞的分化成熟
过程中，ＥＤＲＦ随着ｏ【 珠蛋白表达的增多而逐渐升
高，提示ＥＤＲＦ表达可能受红系分化相关基因调
节 Ｊ。有文献报道，ＧＡＴＡ．１可以上调ＥＤＲＦ表达 。
山东医药２０１１年第５１卷第３６期
但在红系造血生成过程中，其他红系造血相关因子如
ＮＦ．２、Ｆｌｉ．１等对ＥＤＲＦ表达是否存在影响尚不清楚。
红白血病是急性髓系白血病中一种少见类型，
其发病机制与多种红系造血相关基因调节异常有
关。在红白血病细胞系中，往往存在一些红系造血
相关原癌基因的过表达和抑癌基因失表达，如ＧＡ－
ＴＡ一１表达的减低、ＮＦ．Ｅ２基因的失活、Ｆｌｉ一１基因持
续表达等。通过转基因及反义核苷酸的方法对这些
强子区域中，并未发现ＮＦ—Ｅ２的结合作用位点，因
此，ＮＦ．Ｅ２对ＥＤＲＦ的调节机制尚不清楚。
在红系分化过程中，同时还伴有Ｆｌｉ．１的降低和
ＧＡＴＡ．１的升高，而ＧＡＴＡ．１可以直接与ＥＤＲＦ启动
子区域结合，从而启动ＥＤＲＦ的表达 Ｊ，在红系造血
过程中，Ｆｌｉ．１和ＧＡＴＡ．１之间具有相互负调节的作
用。因此，可以推测Ｆｌｉ．１可能对ＥＤＲＦ也存在负调
节的作用。为了进一步明确Ｆｌｉ．１和ＧＡＴＡ一１所引起
基因表达进行调节，可以用来观察红系分化过程中
各种转录因子的作用及血红蛋白调节的相关机制，
很大程度上反映出红系造血生成及分化成熟的生理
及病理过程，是研究红系造血调控的理想细胞模型。
本研究结果也可以看出，在胚胎肝细胞中ＥＤＲＦ
具有极高的表达，而在Ｆｒｉｅｎｄ病毒诱导产生的ＣＢ３、
ＨＢ２２．２细胞系中，因ＮＦ．Ｅ２缺陷而导致仅一珠蛋白表
达明显减低，同时伴有ＥＤＲＦ的低表达，同样证明了
ＥＤＲＦ与红系分化密切相关。为了明确红白血病细
胞中ＥＤＲＦ基因表达减低的原因，我们首先应用
Ｓｏｕｔｈｅｒｎ ｂｌｏｔ法检测了ＤＮＡ水平的变化，在各种红白
血病细胞中，两种内切酶完全酶切后进行的杂交结果
与正常组织相比都没有变化，排除了由于病毒插入导
致基因失活的可能性，提示ＥＤＲＦ的失活可能与转录
或转录后调节有关。通过基因转染的研究发现，
ＣＢ３、ＨＢ２２．２细胞转染外源ｐ４５ＮＦ—Ｅ２后，ＥＤＲＦ明显
升高，提示ＮＦ—Ｅ２可促进ＥＤＲＦ的表达上调。同样，
在ＨＢ６０．５细胞系中，通过改变培养条件的方法，促使
ＨＢ６０．５向红系终末分化的过程中，随着ｐ４５ＮＦ—Ｅ２和
珠蛋白的表达增高，ＥＤＲＦ的转录也增高。以上结果
均提示ＮＦ．Ｅ２对ＥＤＲＦ具有正向调节作用。
ＮＦ．Ｅ２是红系分化中的重要调节因子，能够与
血红蛋白珠蛋白基因局部控制区域中的增强子序列
相结合从而促进其转录，对血红蛋白的表达起决定
性作用。在ｐ４５ＮＦ．Ｅ２表达缺陷的红白血病细胞株
中，血红蛋白的表达极大减低甚至消失。而在本研
究中，ＮＦ．Ｅ２缺陷的红白血病细胞系中，ＥＤＲＦ同样
明显减低，外源ＮＦ—Ｅ２基因的转染可极大恢复
ＥＤＲＦ的表达，提示ＮＦ—Ｅ２对ＥＤＲＦ的转录调节可
能同样起到决定性作用。但在ＥＤＲＦ的启动子及增
的ＥＤＲＦ基因转录变化，我们分别将这两种基因转染
到ＨＢ６０－５细胞中，发现外源的Ｆｌｉ．１基因能够抑制
ＥＤＲＦ的表达，而ＧＡＴＡ一１能够促进ＥＤＲＦ的表达。
以上分析可以看出，ＥＤＲＦ在红系分化过程中
具有重要作用，在正常红系细胞中具有高水平表达；
在分化过程中，多种红系造血相关因子的表达水平
均可对ＥＤＲＦ表达产生影响。在红白血病细胞系中
ＥＤＲＦ的表达明显受抑，这种表达减低不是ＤＮＡ突
变所致；红系造血因子ＧＡＴＡ一１、ＮＦ—Ｅ２可上调
ＥＤＲＦ的表达，Ｆｌｉ．１可下调ＥＤＲＦ表达，其中ＮＦ—Ｅ２
对于ＥＤＲＦ的表达可能起到不可缺失的作用，但具
体调节机制尚需进一步研究。
参考文献：
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ｑｕｉｒｅｄ ｆｏｒ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｈｕｍａｎ ａｌｐｈａ－－ｈｅｍｏｇｌｏｂｉｎ・－ｓｔａｂｉｌｉｚｉｎｇ ｐｒｏ・－
ｔｅｉｎ ｇｅｎｅ［Ｊ１．Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ，２００５，２８０（４７）：３９０１６－３９０２３．
（收稿日期：２０１０－０９－２１）
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