2024年6月12日发(作者：潜梓暄)
单增李斯特菌P60单克隆抗体的制备及初步应用
殷茵;刘溯;王芳;朱学亮;周邦信;骆学农
【摘 要】目的 制备并筛选单增李斯特菌P60特异性单克隆抗体,初步建立其快速
检测方法.方法 以体外表达并纯化的李斯特菌P60蛋白为抗原免疫Balb/c小鼠,采
用杂交瘤技术制备抗李斯特菌P60的McAb,鉴定其抗体亚型,并对单抗的腹水效价、
稳定性及亲和力进行分析.用纯化的单克隆抗体包被酶标板,结合生物素化处理的
P60多克隆抗体,夹心ELISA筛选单增李斯特菌特异性单抗,并以重组P60为标准品,
建立标准曲线.结果 获得了4株可稳定分泌P60单克隆抗体的杂交瘤细胞株.ELISA
检测表明,筛选的6C2单克隆抗体株可特异性与单增李斯特菌(4b)P60反应.结论
建立的夹心ELISA方法可对单增李斯特菌进行特异性鉴别和定量检测.
【期刊名称】《中国人兽共患病学报》
【年(卷),期】2015(031)006
【总页数】5页(P527-531)
【关键词】单增李斯特菌;P60;单克隆抗体;鉴定;ELISA
【作 者】殷茵;刘溯;王芳;朱学亮;周邦信;骆学农
【作者单位】天津市动物疫病预防控制中心,天津300402;中国农业科学院兰州兽
医研究所,家畜疫病病原生物学国家重点实验室,兰州 730046;兰州生物制品研究所
有限责任公司,兰州 730046;中国农业科学院兰州兽医研究所,家畜疫病病原生物学
国家重点实验室,兰州 730046;中国农业科学院兰州兽医研究所,家畜疫病病原生物
学国家重点实验室,兰州 730046;中国农业科学院兰州兽医研究所,家畜疫病病原生
物学国家重点实验室,兰州 730046;中国农业科学院兰州兽医研究所,家畜疫病病原
生物学国家重点实验室,兰州 730046
【正文语种】中 文
【中图分类】R378.99
单核细胞增生性李斯特菌( Listeria monocytogenes , LM) 简称单增李斯特菌，是
一种能引起人兽共患的食源性致病菌。该菌属于细胞内寄生的革兰氏阳性杆菌，人
畜感染后，主要表现为脑膜炎、败血症和血液中单核细胞增多等症状，死亡率达
20%～30%[1]。该菌在自然界广泛存在，食品中存在的单增李斯特菌对人类安全
构成很大威胁，是21世纪对人类健康具有重大影响的12种病原微生物之一[2]。
李斯特菌包括单增李斯特菌(Listeria monocytogenes)、伊氏李斯特菌
(ii)、无害李斯特菌(a)、威氏李斯特菌(meri)、塞氏李斯
特菌(eri)。除L.M对人畜致病性高外，其它的都致病力很小或无致病力，
而且在自然界中普遍存在。因此，如何区分食品污染的是致病性李斯特菌还是其它
常在李斯特菌，是食品工业或动物李斯特菌病免疫学诊断的首要课题。目前，传统
的检测方法要经过增菌、细菌分离以及生化鉴定等过程，因而所需时间较长，花费
人力物力较大，不适合快速检测的需要。分子检测技术如PCR、基因探针等分子
生物学方法[3-4]，需要昂贵的实验仪器, 而且特异性差。 因此，不适合在现场对
大量样品进行快速检测。
国内外一些学者对单增李斯特菌单克隆抗体的制备以及ELISA检测方法进行了很
多研究，但这些研究大都以ActA、LLO等为研究对象。鉴于P60蛋白与李斯特菌
侵袭性、免疫原性和种属分类密切相关。本研究以原核表达的重组P60蛋白为免
疫原，制备并筛选出了单增李斯特菌特异性单克隆抗体，初步建立了基于P60的
夹心ELISA方法，用于食品及动物产品中单增李斯特菌的特异性检测。
1.1 菌株和细胞 单增李斯特菌(ATCC 19115，19117) 、绵羊李斯特菌(ATCC
19119)、无害李斯特菌(ATCC 51742)、塞氏李斯特菌(ATCC 35967)、维氏李斯
特菌(ATCC 35897)均购自美国模式培养物集存库(American type culture
collection)即ATCC公司。重组菌株pET-p60/BL21由本实验构建并保存，
SP2/0骨髓瘤细胞由本实验室液氮保存。
1.2 实验动物 Balb/c纯系雄性小鼠购自兰州生物制品研究所，鼠龄6～8周，体重
18～22 g，用于免疫和制备饲养细胞；5月龄雌鼠用于制备腹水。
1.3 主要试剂 镍琼脂糖凝胶FF蛋白纯化回收试剂(北京韦氏博慧)、改良型RPMI
1640培养基、胎牛血清(Hy Clone)、HAT、HT、聚乙二醇( PEG 1500 )、弗氏完
全佐剂、弗氏不完全佐剂(Sigma)，小鼠单克隆抗体亚型检测试剂盒(Iso Strip)、
羊抗鼠IgG-HRP(北京博奥森)、HiTrapTM Protein G HP Columns (GE)。生物
素N羟基丁二酰亚胺脂(BNHS)、二甲基甲酰氨(DMF)、辣根过氧化物酶标记的链
霉素(Sigma)。
1.4 免疫抗原的制备 将携带pET-p60质粒的BL21重组菌株37 ℃培养过夜，将
菌液按1.0%接种于含卡那霉素(50 μg/mL)的2×YT培养基中，37 ℃剧烈振摇
3～4 h，加IPTG(终浓度为1 mmol/L)诱导表达4～5 h。将诱导表达的菌液离心
收集菌体，反复冻融及超声波处理后收集上清，用镍琼脂糖凝胶FF纯化回收目的
蛋白。SDS-PAGE分析重组P60蛋白的纯化效果，用Thermo Scientific
NanoDrop 2000测定蛋白浓度。
1.5 Balb/ c小鼠的免疫与细胞融合 首次免疫用纯化的P60蛋白100 μg加等量弗
氏完全佐剂，混匀制成乳剂，皮下注射6～8周龄雌性Balb/c小鼠。此后改用弗
氏不完全佐剂乳化抗原，隔21 d进行加强免疫。于融合前3 d，经小鼠脚掌肌肉
进行加强免疫。断尾采血，用间接ELISA检测小鼠血清抗体效价，选取抗体效价
最高的小鼠进行细胞融合。将小鼠骨髓瘤细胞SP2/0与免疫小鼠脾细胞(1∶10)在
500 μg/L PEG介导下进行融合。加入含有次黄嘌呤-氨基蝶呤-胸腺嘧啶核苷(HAT)
的RPMI 1640选择性培养液，在37 ℃、5%CO2 条件下培养，2周后换次黄嘌
呤2胸腺嘧啶核苷(HT)培养液继续培养。
1.6 杂交瘤细胞的克隆与亚型鉴定 将HT培养液中生长的杂交瘤细胞，用有限稀释
法进行克隆化培养。当细胞生长至铺满孔底1/ 4～1/ 3 时，用间接ELISA方法进
行检测，选择阳性值高的单克隆细胞株进行再克隆，直至阳性率达到100 %。间
接ELISA操作步骤如下：用P60抗原包被酶标板，每孔100 μL，4 ℃包被过夜。
按100 μL/孔加入杂交瘤培养上清液，37 ℃反应1 h ，洗涤3次，加入辣根过氧
化物酶标记的羊抗鼠IgG抗体，每孔100 μL，37 ℃反应1 h，洗涤3 次，再加入
底物( OPD) 显色，每孔100 μL，并用2 mol/L H2SO4 终止，每孔50 μL，在酶
标仪上测定OD490 nm值。阴性对照孔为1∶200的正常Balb/c小鼠血清，阳性
对照孔为1∶200的免疫小鼠血清。
取细胞培养上清液，利用单克隆抗体亚型鉴定试剂盒鉴定单克隆抗体的免疫球蛋白
类型及亚型。
1.7 单克隆抗体腹水的制备与效价测定 Balb/c小鼠腹腔注射0. 5 mL液体石蜡(高
压灭菌)，7～10 d 后腹腔注入1×106～5×106个杂交瘤细胞。注射后7～10 d ，
可见小鼠腹部明显膨大，无菌操作采集腹水，1 000 r/ min离心10 min，弃去最
上层的脂肪层，收集中间液体层，即为单克隆抗体腹水。 用重组P60抗原包被
96孔酶标板，4 ℃过夜，将粗制腹水10倍系列稀释(1∶10～1∶109)，采用间接
EL ISA 测定抗体效价。
1.8 单克隆抗体的物理性质分析 用P60抗原包被酶标板，将腹水按不同比例稀释，
用间接ELISA以进行腹水亲和力测定。根据下列公式计算单克隆抗体的亲和常数
[10]：
AI=[2A1+2/(A1+A2)-1]×100%
上式中A 1 表示第1 株单抗的OD 490值；A 2 表示第2株单抗的OD 490值；
A 1+2 表示2 株单抗两两叠加后的OD 490值。
取粗制腹水用pH 7.2的PBS做1∶1 000稀释，置56 ℃水浴中4 h、8 h、12 h、
24 h、36 h、48 h，分别用ELISA检测其OD值的变化，分析单克隆抗体的热稳
定性；同时以pH 2.2的盐酸和pH9.6的碳酸盐缓冲液分别对腹水做1∶10稀释，
评价单抗对酸碱的稳定性。
采用饱和硫酸铵沉淀法结合HiTrapTM Protein G HP Columns纯化腹水，进行
SDS-PAGE分析，Thermo Scientific NanoDrop 2000测定纯化后腹水的浓度。
1.9 生物素化多克隆抗体的制备 用纯化的P60蛋白免疫家兔，制备P60多克隆抗
体。将多抗用饱和硫酸铵沉淀，然后用蛋白G柱进行纯化，测定蛋白含量。用
DMF将BNHS配成1 mg/mL溶液，再用0.1 mol/L pH9.0的NaHCO3将多抗
稀释至1 mg/mL，按BNHS∶IgG体积比1∶8～1∶15震荡混匀10 min，室温
静置3～4 h，将混合物装入透析袋中4 ℃透析过夜，加入等体积甘油，-20 ℃保
存备用。
1.10 夹心ELISA检测方法的初步建立 分别用100 μL的2E4、3H5和6C2(5F8单
抗效价太低)单抗包被酶标板。将togenes、ii、a、
meri和eri分别接种BH培养液，过夜培养后离心收集上清作为
待检样品，分别取100 μL加入已用单抗包被的酶标板中，再加入生物素化的P60
多抗，室温温育30 min后，加入辣根过氧化物酶标记的链霉亲合素
(Streptavidin)，室温温育30 min。加入TMB底物溶液显色，测定OD450nm
的值。根据OD450 nm的值确定仅与togenes反应的单抗株。用筛选
确定的togenes特异性单抗包被酶标板，用纯化的重组P60作为标准
品溶液(2 000 pg/mL)，倍比稀释后每孔100 μL分别加入酶标板的反应孔中，再
加入生物素化的P60多抗，室温温育30 min后，加入辣根过氧化物酶标记的
Streptavidin，室温温育后加入TMB底物溶液显色，测定OD450 nm的值。以
标准品的浓度为横坐标，所测OD450 nm为纵坐标绘制标准曲线。根据夹心
ELISA所测得的OD450 nm值，从标准曲线即可计算所测样品中P60蛋白的浓度。
2.1 抗原制备 将表达菌体裂解上清进行SDS-PAGE分析，大约在46 ku的位置有
一条浓染的蛋白条带，与预期分子量一致；镍琼脂糖凝胶FF纯化后的表达产物经
SDS-PAGE分析显示(图1)，在46 ku处有单一蛋白带，表明目的蛋白获得了较好
的纯化效果。
2.2 单克隆抗体亚型鉴定与效价测定 经细胞融合与克隆筛选，共获得4株P60单
克隆抗体杂交瘤细胞，分别为2E4、5F8、3H5和6C2。其中2E4、5F8和6C2
为IgG1亚型，3H5为IgG2a亚型。ELISA测定2E4的腹水效价为1∶104，3H5
为1∶104，5F8为1∶103，6C2为1∶106(图2)。
2.3 单克隆抗体物理性质分析 经测定腹水中McAb与包被抗原反应的饱和浓度，
2E4和3H5均为10-3，5F8为10-2，6C2为10-5。根据McAb饱和度，用间
接ELISA法相加试验进行4株单抗识别的抗原表位分析，检测结果见表1。
根据表中数据计算的AI值表明，2E4与3H5识别相同的抗原表位，2E4与5F8
识别相同的抗原表位；2E4与6C2识别相同的抗原表位；3H5与5F8识别相同的
抗原表位；3H5与6C2识别相同的抗原表位；5F8与6C2识别相同的抗原表位。
4株杂交瘤细胞株的腹水的稳定性均不受热和碱的影响，但均受酸的影响。
2.4 单克隆抗体腹水纯化与浓度测定 纯化前后单克隆抗体腹水的SDS-PAGE分析
结果见图3。2E4、3H5和6C2的浓度分别是1.039 mg/ mL，1.190 mg/ mL和
5.688 mg/ mL。
2.5 夹心ELISA的初步建立 不同单抗与李斯特菌属不同成员培养上清的夹心
ELISA反应结果表明，三株单抗6C2、3H5和2E4与单增李斯特菌LM4b反应的
OD450 nm在0.2以上，而单抗株6C2与其余菌株培养上清反应的OD450 nm
均在0.1以下(图4所示)。说明根据6C2单抗与李斯特菌反应的OD450 nm大小
可以区分致病菌(单增李斯特菌)与非致病菌。用重组P60为标准品，倍比稀释后包
被酶标板，以生物素标记的P60多抗和6C2单抗建立的夹心ELISA，测定不同浓
度P60所对应的OD450 nm。结果以P60浓度为横坐标，以OD450 nm为纵坐
标绘制的标准曲线(R2=0.992 2)如图5所示，基本呈一条直线。说明待检样品的
OD450nm值与待测样品中P60浓度成正比，可通过建立的标准曲线对待检样品
进行定量分析。
Boerlin[5]等学者用重组的LLO和inl A作为ELISA诊断抗原检测牛的
togenes抗体。结果敏感性特异性分别达82%和92%，说明用基因工
程生产的抗原建立的ELISA方法可用于togenes的诊断和检测。
Vazquez- Boland[6]等用纯化的重组溶血素蛋白包被聚苯乙烯板，利用间接
ELISA 方法，成功检测出了绵羊感染的togenes。崔焕忠[7]等以致病性
李斯特菌ActA蛋白为研究对象，原核表达了ActA 蛋白，制备了抗ActA 特异性
单克隆抗体，并从中筛选2株单克隆抗体，分别用于免疫胶体金标记和胶体金试
纸检测线的包被，从而研制成了检测togenes的胶体金试纸条。秦玉敏
[8]用纯化的重组LLO蛋白免疫小鼠，获得6株稳定分泌抗LLO单克隆抗体的杂
交瘤细胞株，以制备的腹水单抗为诊断抗体，分别与BHI培养基和TSB-YE培养
基培养的不同时段的togenes上清发生反应，建立了检测
togenes的阻断ELISA方法。但这些方法只能用于togenes
的定性检测，而且容易出现假阳性。因为其他非致病性李斯特菌也可能呈现阳性反
应。因此，进行致病性和非致病性李斯特菌的鉴别诊断或检测是非常重要的。
李斯特菌P60蛋白是由入侵相关蛋白(invasion-associated protein,iap)基因编码
的分子量为60 ku的蛋白质，是细胞分裂中非常重要的具有免疫原性的胞壁质水
解酶(murein hydrolase)，可大量分泌于培养介质中。因此，P60是开发单增李
斯特菌免疫学检测系统的理想靶标。Yu等[9]筛选了两株P60单克隆抗体p6007
和p6017，分别特异性识别单增李斯特菌和李斯特菌属的P60蛋白。利用两株单
抗结合P60多克隆抗体，建立了能特异性鉴别单增李斯特菌的夹心ELISA方法。
与上述研究相比，本研究用重组蛋白P60抗原免疫小鼠，获得了4株稳定性较高
的单克隆抗体，并从中筛选出了能特异性识别单增李斯特菌P60的单抗。制备重
组P60的多克隆抗体，并将其进行生物素化处理，利用生物素(Biotin)-亲合素
(Avidin)放大系统，大大提高了夹心ELISA检测的敏感性。同时，通过用重组P60
蛋白作为标准品建立的标准曲线，可实现对待检样品培养物中P60蛋白的定量检
测。上述研究结果将为建立基于6C2单克隆抗体的夹心ELISA方法，用于单增李
斯特菌病的鉴别诊断和食品单增李斯特菌污染的定量检测奠定了基础。
Supported by the National Science & Technology Pillar Program (No.
2007BAD40B01)
【相关文献】
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2024年6月12日发(作者：潜梓暄)
单增李斯特菌P60单克隆抗体的制备及初步应用
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【摘 要】目的 制备并筛选单增李斯特菌P60特异性单克隆抗体,初步建立其快速
检测方法.方法 以体外表达并纯化的李斯特菌P60蛋白为抗原免疫Balb/c小鼠,采
用杂交瘤技术制备抗李斯特菌P60的McAb,鉴定其抗体亚型,并对单抗的腹水效价、
稳定性及亲和力进行分析.用纯化的单克隆抗体包被酶标板,结合生物素化处理的
P60多克隆抗体,夹心ELISA筛选单增李斯特菌特异性单抗,并以重组P60为标准品,
建立标准曲线.结果 获得了4株可稳定分泌P60单克隆抗体的杂交瘤细胞株.ELISA
检测表明,筛选的6C2单克隆抗体株可特异性与单增李斯特菌(4b)P60反应.结论
建立的夹心ELISA方法可对单增李斯特菌进行特异性鉴别和定量检测.
【期刊名称】《中国人兽共患病学报》
【年(卷),期】2015(031)006
【总页数】5页(P527-531)
【关键词】单增李斯特菌;P60;单克隆抗体;鉴定;ELISA
【作 者】殷茵;刘溯;王芳;朱学亮;周邦信;骆学农
【作者单位】天津市动物疫病预防控制中心,天津300402;中国农业科学院兰州兽
医研究所,家畜疫病病原生物学国家重点实验室,兰州 730046;兰州生物制品研究所
有限责任公司,兰州 730046;中国农业科学院兰州兽医研究所,家畜疫病病原生物学
国家重点实验室,兰州 730046;中国农业科学院兰州兽医研究所,家畜疫病病原生物
学国家重点实验室,兰州 730046;中国农业科学院兰州兽医研究所,家畜疫病病原生
物学国家重点实验室,兰州 730046;中国农业科学院兰州兽医研究所,家畜疫病病原
生物学国家重点实验室,兰州 730046
【正文语种】中 文
【中图分类】R378.99
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一种能引起人兽共患的食源性致病菌。该菌属于细胞内寄生的革兰氏阳性杆菌，人
畜感染后，主要表现为脑膜炎、败血症和血液中单核细胞增多等症状，死亡率达
20%～30%[1]。该菌在自然界广泛存在，食品中存在的单增李斯特菌对人类安全
构成很大威胁，是21世纪对人类健康具有重大影响的12种病原微生物之一[2]。
李斯特菌包括单增李斯特菌(Listeria monocytogenes)、伊氏李斯特菌
(ii)、无害李斯特菌(a)、威氏李斯特菌(meri)、塞氏李斯
特菌(eri)。除L.M对人畜致病性高外，其它的都致病力很小或无致病力，
而且在自然界中普遍存在。因此，如何区分食品污染的是致病性李斯特菌还是其它
常在李斯特菌，是食品工业或动物李斯特菌病免疫学诊断的首要课题。目前，传统
的检测方法要经过增菌、细菌分离以及生化鉴定等过程，因而所需时间较长，花费
人力物力较大，不适合快速检测的需要。分子检测技术如PCR、基因探针等分子
生物学方法[3-4]，需要昂贵的实验仪器, 而且特异性差。 因此，不适合在现场对
大量样品进行快速检测。
国内外一些学者对单增李斯特菌单克隆抗体的制备以及ELISA检测方法进行了很
多研究，但这些研究大都以ActA、LLO等为研究对象。鉴于P60蛋白与李斯特菌
侵袭性、免疫原性和种属分类密切相关。本研究以原核表达的重组P60蛋白为免
疫原，制备并筛选出了单增李斯特菌特异性单克隆抗体，初步建立了基于P60的
夹心ELISA方法，用于食品及动物产品中单增李斯特菌的特异性检测。
1.1 菌株和细胞 单增李斯特菌(ATCC 19115，19117) 、绵羊李斯特菌(ATCC
19119)、无害李斯特菌(ATCC 51742)、塞氏李斯特菌(ATCC 35967)、维氏李斯
特菌(ATCC 35897)均购自美国模式培养物集存库(American type culture
collection)即ATCC公司。重组菌株pET-p60/BL21由本实验构建并保存，
SP2/0骨髓瘤细胞由本实验室液氮保存。
1.2 实验动物 Balb/c纯系雄性小鼠购自兰州生物制品研究所，鼠龄6～8周，体重
18～22 g，用于免疫和制备饲养细胞；5月龄雌鼠用于制备腹水。
1.3 主要试剂 镍琼脂糖凝胶FF蛋白纯化回收试剂(北京韦氏博慧)、改良型RPMI
1640培养基、胎牛血清(Hy Clone)、HAT、HT、聚乙二醇( PEG 1500 )、弗氏完
全佐剂、弗氏不完全佐剂(Sigma)，小鼠单克隆抗体亚型检测试剂盒(Iso Strip)、
羊抗鼠IgG-HRP(北京博奥森)、HiTrapTM Protein G HP Columns (GE)。生物
素N羟基丁二酰亚胺脂(BNHS)、二甲基甲酰氨(DMF)、辣根过氧化物酶标记的链
霉素(Sigma)。
1.4 免疫抗原的制备 将携带pET-p60质粒的BL21重组菌株37 ℃培养过夜，将
菌液按1.0%接种于含卡那霉素(50 μg/mL)的2×YT培养基中，37 ℃剧烈振摇
3～4 h，加IPTG(终浓度为1 mmol/L)诱导表达4～5 h。将诱导表达的菌液离心
收集菌体，反复冻融及超声波处理后收集上清，用镍琼脂糖凝胶FF纯化回收目的
蛋白。SDS-PAGE分析重组P60蛋白的纯化效果，用Thermo Scientific
NanoDrop 2000测定蛋白浓度。
1.5 Balb/ c小鼠的免疫与细胞融合 首次免疫用纯化的P60蛋白100 μg加等量弗
氏完全佐剂，混匀制成乳剂，皮下注射6～8周龄雌性Balb/c小鼠。此后改用弗
氏不完全佐剂乳化抗原，隔21 d进行加强免疫。于融合前3 d，经小鼠脚掌肌肉
进行加强免疫。断尾采血，用间接ELISA检测小鼠血清抗体效价，选取抗体效价
最高的小鼠进行细胞融合。将小鼠骨髓瘤细胞SP2/0与免疫小鼠脾细胞(1∶10)在
500 μg/L PEG介导下进行融合。加入含有次黄嘌呤-氨基蝶呤-胸腺嘧啶核苷(HAT)
的RPMI 1640选择性培养液，在37 ℃、5%CO2 条件下培养，2周后换次黄嘌
呤2胸腺嘧啶核苷(HT)培养液继续培养。
1.6 杂交瘤细胞的克隆与亚型鉴定 将HT培养液中生长的杂交瘤细胞，用有限稀释
法进行克隆化培养。当细胞生长至铺满孔底1/ 4～1/ 3 时，用间接ELISA方法进
行检测，选择阳性值高的单克隆细胞株进行再克隆，直至阳性率达到100 %。间
接ELISA操作步骤如下：用P60抗原包被酶标板，每孔100 μL，4 ℃包被过夜。
按100 μL/孔加入杂交瘤培养上清液，37 ℃反应1 h ，洗涤3次，加入辣根过氧
化物酶标记的羊抗鼠IgG抗体，每孔100 μL，37 ℃反应1 h，洗涤3 次，再加入
底物( OPD) 显色，每孔100 μL，并用2 mol/L H2SO4 终止，每孔50 μL，在酶
标仪上测定OD490 nm值。阴性对照孔为1∶200的正常Balb/c小鼠血清，阳性
对照孔为1∶200的免疫小鼠血清。
取细胞培养上清液，利用单克隆抗体亚型鉴定试剂盒鉴定单克隆抗体的免疫球蛋白
类型及亚型。
1.7 单克隆抗体腹水的制备与效价测定 Balb/c小鼠腹腔注射0. 5 mL液体石蜡(高
压灭菌)，7～10 d 后腹腔注入1×106～5×106个杂交瘤细胞。注射后7～10 d ，
可见小鼠腹部明显膨大，无菌操作采集腹水，1 000 r/ min离心10 min，弃去最
上层的脂肪层，收集中间液体层，即为单克隆抗体腹水。 用重组P60抗原包被
96孔酶标板，4 ℃过夜，将粗制腹水10倍系列稀释(1∶10～1∶109)，采用间接
EL ISA 测定抗体效价。
1.8 单克隆抗体的物理性质分析 用P60抗原包被酶标板，将腹水按不同比例稀释，
用间接ELISA以进行腹水亲和力测定。根据下列公式计算单克隆抗体的亲和常数
[10]：
AI=[2A1+2/(A1+A2)-1]×100%
上式中A 1 表示第1 株单抗的OD 490值；A 2 表示第2株单抗的OD 490值；
A 1+2 表示2 株单抗两两叠加后的OD 490值。
取粗制腹水用pH 7.2的PBS做1∶1 000稀释，置56 ℃水浴中4 h、8 h、12 h、
24 h、36 h、48 h，分别用ELISA检测其OD值的变化，分析单克隆抗体的热稳
定性；同时以pH 2.2的盐酸和pH9.6的碳酸盐缓冲液分别对腹水做1∶10稀释，
评价单抗对酸碱的稳定性。
采用饱和硫酸铵沉淀法结合HiTrapTM Protein G HP Columns纯化腹水，进行
SDS-PAGE分析，Thermo Scientific NanoDrop 2000测定纯化后腹水的浓度。
1.9 生物素化多克隆抗体的制备 用纯化的P60蛋白免疫家兔，制备P60多克隆抗
体。将多抗用饱和硫酸铵沉淀，然后用蛋白G柱进行纯化，测定蛋白含量。用
DMF将BNHS配成1 mg/mL溶液，再用0.1 mol/L pH9.0的NaHCO3将多抗
稀释至1 mg/mL，按BNHS∶IgG体积比1∶8～1∶15震荡混匀10 min，室温
静置3～4 h，将混合物装入透析袋中4 ℃透析过夜，加入等体积甘油，-20 ℃保
存备用。
1.10 夹心ELISA检测方法的初步建立 分别用100 μL的2E4、3H5和6C2(5F8单
抗效价太低)单抗包被酶标板。将togenes、ii、a、
meri和eri分别接种BH培养液，过夜培养后离心收集上清作为
待检样品，分别取100 μL加入已用单抗包被的酶标板中，再加入生物素化的P60
多抗，室温温育30 min后，加入辣根过氧化物酶标记的链霉亲合素
(Streptavidin)，室温温育30 min。加入TMB底物溶液显色，测定OD450nm
的值。根据OD450 nm的值确定仅与togenes反应的单抗株。用筛选
确定的togenes特异性单抗包被酶标板，用纯化的重组P60作为标准
品溶液(2 000 pg/mL)，倍比稀释后每孔100 μL分别加入酶标板的反应孔中，再
加入生物素化的P60多抗，室温温育30 min后，加入辣根过氧化物酶标记的
Streptavidin，室温温育后加入TMB底物溶液显色，测定OD450 nm的值。以
标准品的浓度为横坐标，所测OD450 nm为纵坐标绘制标准曲线。根据夹心
ELISA所测得的OD450 nm值，从标准曲线即可计算所测样品中P60蛋白的浓度。
2.1 抗原制备 将表达菌体裂解上清进行SDS-PAGE分析，大约在46 ku的位置有
一条浓染的蛋白条带，与预期分子量一致；镍琼脂糖凝胶FF纯化后的表达产物经
SDS-PAGE分析显示(图1)，在46 ku处有单一蛋白带，表明目的蛋白获得了较好
的纯化效果。
2.2 单克隆抗体亚型鉴定与效价测定 经细胞融合与克隆筛选，共获得4株P60单
克隆抗体杂交瘤细胞，分别为2E4、5F8、3H5和6C2。其中2E4、5F8和6C2
为IgG1亚型，3H5为IgG2a亚型。ELISA测定2E4的腹水效价为1∶104，3H5
为1∶104，5F8为1∶103，6C2为1∶106(图2)。
2.3 单克隆抗体物理性质分析 经测定腹水中McAb与包被抗原反应的饱和浓度，
2E4和3H5均为10-3，5F8为10-2，6C2为10-5。根据McAb饱和度，用间
接ELISA法相加试验进行4株单抗识别的抗原表位分析，检测结果见表1。
根据表中数据计算的AI值表明，2E4与3H5识别相同的抗原表位，2E4与5F8
识别相同的抗原表位；2E4与6C2识别相同的抗原表位；3H5与5F8识别相同的
抗原表位；3H5与6C2识别相同的抗原表位；5F8与6C2识别相同的抗原表位。
4株杂交瘤细胞株的腹水的稳定性均不受热和碱的影响，但均受酸的影响。
2.4 单克隆抗体腹水纯化与浓度测定 纯化前后单克隆抗体腹水的SDS-PAGE分析
结果见图3。2E4、3H5和6C2的浓度分别是1.039 mg/ mL，1.190 mg/ mL和
5.688 mg/ mL。
2.5 夹心ELISA的初步建立 不同单抗与李斯特菌属不同成员培养上清的夹心
ELISA反应结果表明，三株单抗6C2、3H5和2E4与单增李斯特菌LM4b反应的
OD450 nm在0.2以上，而单抗株6C2与其余菌株培养上清反应的OD450 nm
均在0.1以下(图4所示)。说明根据6C2单抗与李斯特菌反应的OD450 nm大小
可以区分致病菌(单增李斯特菌)与非致病菌。用重组P60为标准品，倍比稀释后包
被酶标板，以生物素标记的P60多抗和6C2单抗建立的夹心ELISA，测定不同浓
度P60所对应的OD450 nm。结果以P60浓度为横坐标，以OD450 nm为纵坐
标绘制的标准曲线(R2=0.992 2)如图5所示，基本呈一条直线。说明待检样品的
OD450nm值与待测样品中P60浓度成正比，可通过建立的标准曲线对待检样品
进行定量分析。
Boerlin[5]等学者用重组的LLO和inl A作为ELISA诊断抗原检测牛的
togenes抗体。结果敏感性特异性分别达82%和92%，说明用基因工
程生产的抗原建立的ELISA方法可用于togenes的诊断和检测。
Vazquez- Boland[6]等用纯化的重组溶血素蛋白包被聚苯乙烯板，利用间接
ELISA 方法，成功检测出了绵羊感染的togenes。崔焕忠[7]等以致病性
李斯特菌ActA蛋白为研究对象，原核表达了ActA 蛋白，制备了抗ActA 特异性
单克隆抗体，并从中筛选2株单克隆抗体，分别用于免疫胶体金标记和胶体金试
纸检测线的包被，从而研制成了检测togenes的胶体金试纸条。秦玉敏
[8]用纯化的重组LLO蛋白免疫小鼠，获得6株稳定分泌抗LLO单克隆抗体的杂
交瘤细胞株，以制备的腹水单抗为诊断抗体，分别与BHI培养基和TSB-YE培养
基培养的不同时段的togenes上清发生反应，建立了检测
togenes的阻断ELISA方法。但这些方法只能用于togenes
的定性检测，而且容易出现假阳性。因为其他非致病性李斯特菌也可能呈现阳性反
应。因此，进行致病性和非致病性李斯特菌的鉴别诊断或检测是非常重要的。
李斯特菌P60蛋白是由入侵相关蛋白(invasion-associated protein,iap)基因编码
的分子量为60 ku的蛋白质，是细胞分裂中非常重要的具有免疫原性的胞壁质水
解酶(murein hydrolase)，可大量分泌于培养介质中。因此，P60是开发单增李
斯特菌免疫学检测系统的理想靶标。Yu等[9]筛选了两株P60单克隆抗体p6007
和p6017，分别特异性识别单增李斯特菌和李斯特菌属的P60蛋白。利用两株单
抗结合P60多克隆抗体，建立了能特异性鉴别单增李斯特菌的夹心ELISA方法。
与上述研究相比，本研究用重组蛋白P60抗原免疫小鼠，获得了4株稳定性较高
的单克隆抗体，并从中筛选出了能特异性识别单增李斯特菌P60的单抗。制备重
组P60的多克隆抗体，并将其进行生物素化处理，利用生物素(Biotin)-亲合素
(Avidin)放大系统，大大提高了夹心ELISA检测的敏感性。同时，通过用重组P60
蛋白作为标准品建立的标准曲线，可实现对待检样品培养物中P60蛋白的定量检
测。上述研究结果将为建立基于6C2单克隆抗体的夹心ELISA方法，用于单增李
斯特菌病的鉴别诊断和食品单增李斯特菌污染的定量检测奠定了基础。
Supported by the National Science & Technology Pillar Program (No.
2007BAD40B01)
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