2024年2月24日发(作者：庚榆)

T7 RiboMAXTM Express RNAi System (Promega)

一、dsRNA的大量合成

1. 在室温建立合适的反应体系（室温配制一下反应液）；

RiboMAXTM Express T7 2×Buffer* 10 μL

正义模板 4 μL

反义模板 4 μL

Enzyme Mix，T7 Express 2 μL

Total 20 μL

*冻存的RiboMAXTM Express T7 2×Buffer可能含有沉淀，可在37℃温浴中溶解后混匀。注意，试剂中含有亚精胺，在低于室温下可使DNA沉淀。

2. 轻微混匀，37℃温浴2-6 h；（4 h）

二、残留DNA模板的去除，dsRNA的退火生成，ssRNA的去除

3. 温浴结束后将反应液于70℃水浴10 min，之后缓慢降至室温（~20 min）；

4. 向冷却至室温的反应液中加入1 μL RNase A Solution（稀释200倍，1 μL RNase

Solution+199 μL RNA-free H2O）和1 μL RQ1 RNase-FreeDNase，37℃孵育30 min；（丢弃稀释后的RNase Solution，下次不可用）

三、双链RNA的纯化

5. 加入20 μL 3M醋酸钠，50 μL 95%的乙醇，冰浴5 min；（吸到1.5 mL离心管中）

6. 16 000g离心10 min，可见离心管底有白色沉淀；

7. 小心弃去（吸去）上清，用500 μL预冷的70%乙醇洗涤沉淀2次，弃上清，室温空气干燥15 min，加100 μL RNA-free H2O溶解沉淀；

8. 将产物放在-70℃保存。（取1 μL稀释100倍检测浓度，凝胶检测）

2024年2月24日发(作者：庚榆)

T7 RiboMAXTM Express RNAi System (Promega)

一、dsRNA的大量合成

1. 在室温建立合适的反应体系（室温配制一下反应液）；

RiboMAXTM Express T7 2×Buffer* 10 μL

正义模板 4 μL

反义模板 4 μL

Enzyme Mix，T7 Express 2 μL

Total 20 μL

*冻存的RiboMAXTM Express T7 2×Buffer可能含有沉淀，可在37℃温浴中溶解后混匀。注意，试剂中含有亚精胺，在低于室温下可使DNA沉淀。

2. 轻微混匀，37℃温浴2-6 h；（4 h）

二、残留DNA模板的去除，dsRNA的退火生成，ssRNA的去除

3. 温浴结束后将反应液于70℃水浴10 min，之后缓慢降至室温（~20 min）；

4. 向冷却至室温的反应液中加入1 μL RNase A Solution（稀释200倍，1 μL RNase

Solution+199 μL RNA-free H2O）和1 μL RQ1 RNase-FreeDNase，37℃孵育30 min；（丢弃稀释后的RNase Solution，下次不可用）

三、双链RNA的纯化

5. 加入20 μL 3M醋酸钠，50 μL 95%的乙醇，冰浴5 min；（吸到1.5 mL离心管中）

6. 16 000g离心10 min，可见离心管底有白色沉淀；

7. 小心弃去（吸去）上清，用500 μL预冷的70%乙醇洗涤沉淀2次，弃上清，室温空气干燥15 min，加100 μL RNA-free H2O溶解沉淀；

8. 将产物放在-70℃保存。（取1 μL稀释100倍检测浓度，凝胶检测）