2024年6月12日发(作者：溥菊华)

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第１７卷第３期　

草　业　学　报　

ＡＣＴＡ　ＰＲＡＴＡＣＵＬＴＵＲＡＥ　ＳＩＮＩＣＡ　

７９—８５　

Ｖｏ１．１７。Ｎｏ．３　

６／２００８　

狗牙根ＳＲＡＰ—ＰＣＲ反应体系优化及引物筛选　

王志勇　，袁学军　，刘建秀　，郭海林　

（１．南京农业大学园艺学院，江苏南京２１００９５；２．江苏省中国科学院植物研究所，江苏南京２１００１４）　

摘要：利用正交设计，从Ｍｇ　、ｄＮＴＰ、引物浓度和ＤＮＡ聚合酶４种因素３个水平以及不同的模板ＤＮＡ浓度来优　

化狗牙根ｓＲＡＰ—ＰＣＲ反应体系，并对引物进行了全面筛选。狗牙根ＳＲＡＰ—ＰＣＲ优化反应体系结果为：２　Ｌ　１０　

×ｂｕｆｆｅｒ、４０　ｎｇ模板ＤＮＡ、Ｍｇ　１．２５　ｍｍｏｌ／Ｌ、ｄＮＴＰ　２６０　ｐｍｏｌ／Ｌ、引物０．２　ｐｍｏｌ／Ｉ　、Ｔａｑ　ＤＮＡ聚合酶１．０　Ｕ，总　

体积２Ｏ“Ｌ。运用该结果从９Ｏ对引物中共筛选出扩增条带清晰、多态性丰富的ＳＲＡＰ引物３４对。优化体系的建　

立及其引物的筛选为今后利用ＳＲＡＰ标记技术进行狗牙根遗传分析、图谱构建、基因定位与种质资源鉴定奠定了　

技术基础。　

关键词：狗牙根；ＳＲＡＰ标记；正交试验；体系优化；引物　

中图分类号：￥５４３　．９０２　文献标识码：Ａ　文章编号：１００４—５７５９（２００８）０３—００７９—０７　

目前，常用的ＤＮＡ分子标记有ＲＦＬＰ、ＲＡＰＤ、ＡＦＬＰ和ＳＳＲ等，它们各有优缺点＿１　］。美国Ｄｕ，Ｊ，Ｉ，Ｉ大学蔬菜作　

物系Ｌｉ和Ｏｕｉｒｏｓ＿３　于２００１年在研究芸薹属（Ｂｒａｓｓｉｃａ）作物中开发的～种基于ＰＣＲ的新型标记ＳＲＡＰ（ｓｅ－　

ｑｕｅｎｃｅ—ｒｅｌａｔｅｄ　ａｍｐｌｉｆｉｅｄ　ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ），该标记具备ＲＦＬＰ、ＲＡＰＤ、ＳＳＲ和ＡＦＬＰ等分子的优点，克服了它们的　

缺点，并已经在许多植物研究中得到应用，如在构建图谱　引、遗传多样性　

以及其他方面＿１阳的研究。　

、ＱＴＬ定位　、杂种优势的预测　］　

狗牙根属（Ｃｙｎｏｄｏｎ　ｓｐｐ．）属禾本科（Ｇｒａｍｉｎｅａｅ）画眉草亚科（Ｅｒａｇａｏｓｔｏｉｄｅｅ）虎尾草族（Ｃｈｌｏｒｉｄｏｉｅａｅ）多年生　

草本植物口　。狗牙根属植物全世界共有９种、１０变种，目前用于草坪研究和生产的狗牙根主要有３种，分别是普　

通狗牙根（Ｃ．ｄａｃｔｙｌｏｎ）、非洲狗牙根（Ｃ．ｔｒａｎｓｖａａｌｅｎｓｉｓ）以及种间杂交三倍体狗牙根（Ｃ．ｄａｃｔｙｌｏｎ×Ｃ．ｔｒａｎｓ—　

ｖａａｌｅｎｓｉｓ）口　ｎ］。其中普通狗牙根是世界广布种，原产于非洲东部，现广泛分布于世界各地的热带和亚热带（４５。　

Ｎ～４５。Ｓ）。目前，虽在狗牙根属的生长习性　～　、抗逆性　～　、育种　］、染色体　］、同工酶　～　以及分子水平　

的分子标记Ｅｅ８￣３２］等方面已有研究报道。但有关ＳＲＡＰ分子标记在草坪草中的应用，除在野牛草（Ｂｕｃｈｌｏ￣ｄａｃ—　

ｔｙｌｏｉｄｅｓ）中有报道外　圳，其他类型的草坪草尚未见报道。本研究首次以坪用型狗牙根优良品种（种源）为材料，　

利用正交设计对ＳＲＡＰ反应体系进行优化，在获得最佳扩增效果的基础上进行引物的筛选并对狗牙根进行了扩　

增，将为今后ＳＲＡＰ标记在狗牙根遗传多样性评价、不同种源鉴定、遗传图谱构建、ＱＴＬ定位、比较基因组学、诱　

变后代的鉴定及亲缘关系分析等方面的研究提供较为可靠的技术支持。　

１材料与方法　

１．１材料　

试验所用的１１份狗牙根均取自江苏省中国科学院植物研究所草业中心种质资源圃。其中Ｃ４６１用于体系　

优化，Ｃｌ１７用于引物筛选，其他材料均用作体系验证。具体材料如表１所示。　

１．２　方法　

１．２．１基因组ＤＮＡ提取和检测　以狗牙根嫩叶为材料，采用ＳＤＳ微量法提取基因组ＤＮＡ，并用０．８　琼脂糖　

电泳检测ＤＮＡ质量完整性。采用琼脂糖凝胶电泳，取５　Ｌ　ＤＮＡ溶液，再加入２　Ｌ　０．２５　９／６溴酚蓝，对照为已知　

浓度的ＤＮＡ样品，上样于０．８　琼脂糖凝胶在１×ＴＡＥ的电泳缓冲液中进行水平板电泳（电泳仪为ＤＹＹ一５型，　

收稿日期：２００７—０７—１２；改回日期：２００７　１０－０９　

基金项目：江苏省高技术项目（ＢＧ２００６３２０）资助。　

作者简介：王志勇（１９７９），男，江西景德镇人，在读博士。Ｅ－ｍａｉｌ：｛ａｆｕ３０１＠ｙａｈｏｏ．ｃｏｒｎ．ｃｎ　

＊通讯作者。Ｅ—ｍａｉｌ：ｔｕｒｆｕｎｉｔ＠ｙａｈｏｏ．ｃｏｒｎ．ｃｎ　

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８０　ＡＣＴＡ　ＰＲＡＴＡＣＵＩ　ＴＵＲＡＥ　ＳＩＮＩＣＡ（Ｖｏ１．１　７，Ｎｏ．３）　

电泳槽为ＤＹＣＰ一３４Ａ水平），电泳电压为ｉ００　Ｖ，时间９０　ｍｉｎ左右，电泳结束后，用溴化乙锭（ＥＢ）染色，后在自动　

凝胶图象分析仪（上海培清科技有限公司ＪＳ一３８０）观测分析并照相，如图１所示，根据检测的结果稀释ＤＮＡ，最后　

确定ＤＮＡ浓度为５０　ｎｇ／ＦＬ，用于本试验的研究。　

表１　ＳＲＡＰ—ＰＣＲ体系优化试验材料　

Ｔａｂｌｅ　１　Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ　ｍａｔｅｒｉａｌ　ｆｏｒ　ｏｐｔｉｍｉｚｉｎｇ　ＳＲＡＰ—ＰＣＲ　ｓｙｓｔｅｍ　

１．２．２　ＰＣＲ反应体系正交试验　采用Ｌ。（３　）正交试验　

设计，对Ｍｇ　、ｄＮＴＰ、引物、Ｔａｑ　ＤＮＡ聚合酶进行４因　

素３水平筛选，方案如表２和３。ＳＲＡＰ引物购自上海博　

亚生物技术有限公司，ｄＮＴＰ和Ｔａｑ酶购自南京申能博　

彩公司。ＤＮＡ　ｍａｒｋｅｒ购自南京ＴａＫａＲａ公司。依照扩　

增条带的敏感性与特异性，即条带强弱及杂带多少做１　

～９计分，分数越高，表示敏感性、特异性越好。　

１．２．３　ＰＣＲ反应条件根据表２和３制备总体积为２Ｏ　

图１　部分狗牙根基因组ＤＮＡ原液电泳　

Ｆｉｇ．１　Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ　ｏｆ　ｇｅｎｏｍｉｃ　ＤＮＡ　ｆｏｒ　ｓｏｍｅ　

ｐｒｏｇｅｎｉｅｓ　ｏｆ　Ｃ　ｄａｃｔｙｌｏｎ　

肚Ｌ的ＰＣＲ反应体系，除表中变化因素外，每管中还含有　

２　ｕＬ　１ＯｘＰＣＲ　ｂｕｆｆｅｒ和５Ｏ　ｎｇ模板ＤＮＡ，引物为Ｍｅ３　

和Ｅｍｌ组合（表４）。ＰＣＲ扩增程序为：９４＾Ｃ预变性４　

ａ～ｆ：代表部分不同种源狗牙根基因组ＤＮＡ原液；１～５为已知浓　

度ＤＮＡ，浓度从左至右分别为２５０，２００，１５０，１００，５０　ｎｇ／￣Ｌ　ａ—ｆ：　

Ｇｅｎｏｍｉｃ　ＤＮＡ　ｆｏｒ　ｓｏｍｅ　ｐｒｏｇｅｎｉｅｓ　ｏｆ　Ｃ．ｄａｃｔｙｌｏｎ．１—５：Ｃｏｎｔｅｎｔ　ｏｆ　

ｋｎｏｗｎ　ＤＮＡ，ｃｏｎｔｅｎｔｓ　ｆｒｏｍ　ｌｅｆｔ　ｔｏ　ｒｉｇｈｔ　ａｒｅ　２５０，２００，１５０，１００．５０　

ｍｉｎ；９４℃变性１　ｍｉｎ，３７℃退火１　ｍｉｎ，７２。Ｃ延伸１０　Ｓ，５　

个循环；９４℃变性ｌ　ｍｉｎ，５０℃退火ｌ　ｍｉｎ，７２℃延伸ｌ０　

Ｓ，３５个循环；循环结束后７２℃延伸７　ｍｉｎ，４℃保存，扩　

ｎｇ／＞Ｉ　

扩增产物取１Ｏ肚Ｌ，用６．Ｏ　９／６变性聚丙烯酰胺凝胶分　

增反应在英国ＴＥＣＨＮＥ公司的ＴＣ－４１２　ＰＣＲ仪上进行。　

离，快速银染检测（电泳仪为ＤＹＹ一８Ｂ型，电泳槽为ＪＹ—ＳＣＺ６双垂直型）。　

１．２．４模板ＤＮＡ浓度筛选　应用上述体系最佳组合，引物运用Ｍｅ１和Ｅｍ２组合。在２Ｏ肚Ｌ体系中，设定９个　

模板浓度，分别加入０．２，０．３，０．４，０．５，０．８，１．２，１．６，２．０和２．４肚Ｌ的模板ＤＮＡ，即模板ＤＮＡ浓度设为ｌＯ，ｌ５，　

２Ｏ，２５，４Ｏ，６Ｏ，８０，１００和１２０　ｎｇ／２０肚Ｌ共９个处理，其他成分按最佳组合加入，不足的体积用灭菌水补充。　

１．２．５优化体系应用与引物筛选　根据以上试验结果确定ｓＲＡＰ—ＰＣＲ的最佳反应体系和扩增条件。从筛选　

的引物中随机选取引物为Ｍｅ２和Ｅｍ４组合，对ｌｌ份（其中Ｃ４６１用于体系优化和Ｃｌｌ７用于引物筛选）国内外坪　

用型狗牙根中９份狗牙根进行扩增，筛选出最佳体系并进行稳定性检测和引物筛选。　

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第ｌ７卷第３期　草业学报２００８年　

２结果与分析　

２．１　ＰＣＲ正交试验设计的扩增效果分析　

狗牙根正交试验９个组合（表３）及ＳＲＡＰ扩增效果如图２所示，依照谱带强弱及杂带的多少，将９个处理结　

表２　ＳＲＡＰ—ＰＣＲ体系的因素和水平　

Ｔａｂｌｅ　２　ＳＲＡＰ—ＰＣＲ　ｆａｃｔｏｒｓ　ａｎｄ　ｌｅｖｅｌｓ　

表３　ｓＲＡＰ—ＰＣＲ正交试验设计表ＥＬ，（３　）］　

Ｔａｂｌｅ　３　Ｏｒｔｈｏｒｏｎａｌ　ｄｅｓｉｇｎ　ｆｏｒ　ＳＲＡＰ—ＰＣＲ［＇Ｌ９（３　）］　

表４　ＳＲＡＰ所用引物序列　

Ｔａｂｌｅ　４　Ｐｒｉｍｅｒｓ　ｓｅｑｕｅｎｃｅ　ｕｓｅｄ　ｉｎ　ＳＲＡＰ　ａｎａｌｙｓｉｓ　

编号Ｃｏｄｅｓ　反向引物Ｒｅｖｅｒｓｅ　ｐｒｉｍｅｒｓ　编号Ｃｏｄｅｓ　正向引物Ｆｏｒｗａｒｄ　ｐｒｉｍｅｒｓ　

Ｅｍｌ　５／＿ＧＡＣＴＧＣＧＴＡＣＧＡＡＴＴＣＡＡ一３　Ｍｅ１　５　一ＴＧＡＧＴＣＣＡＡＡＣＣＧＧＡＴＡ一３　

Ｅｍ２　５　一ＧＡＣＴＧＣＧＴＡＣＧＡＡＴＴＣＴＧ一３　Ｍｅ２　５　一ＴＧＡＧＴＣＣＡＡＡＣＣＧＧＡＧＣ一３　

Ｅｍ３　５　一ＧＡＣＴＧＣＧＴＡＣＧＡＡＴＴＧＡＣ一３　Ｍｅ３　５＇－ＴＧＡＧＴＣＣＡＡＡＣＣＧＧＡＣＣ一３　

Ｅｒａ４　５＇－ＧＡＣＴＧＣＧＴＡＣＧＡＡＴＴＴＧＡ一３　Ｍｅ４　５　一ＴＧＡＧＴＣＣＡＡＡＣＣＧＧＡＣＡ一３　

Ｅｍ５　５　一ＧＡＣＴＧＣＧＴＡＣＧＡＡＴＴＡＡＣ一３　Ｍｅ５　５　一ＴＧＡＧＴＣＣＡＡＡＣＣＧＧＴＧＣ一３　

Ｅｍ６　５　一ＧＡＣＴＧＣＧＴＡＣＧＡＡＴＴＧＣＡ一３　Ｍｅ６　５　一ＴＧＡＧＴＣＣＡＡＡＣＣＧＧＡＧＡ一３　

Ｅｍ７　５＇－ＧＡＣＴＧＣＧＴＡＣＧＡＡＴＴＧＡＧ一３　Ｍｅ７　５＇－ＴＧＡＧＴＣＣＡＡＡＣＣＧＧＡＣＧ一３　

Ｅｍ８　５　一ＧＡＣＴＧＣＧＴＡＣＧＡＡＴＴＧＣＣ一３　Ｍｅ８　５　一ＴＧＡＧＴＣＣＡＡＡＣＣＧＧＡＡＡ一３　

Ｅｍ９　５　一ＧＡＣＴＧＣＧＴＡＣＧＡＡＴＴＴＣＡ一３　Ｍｅ９　５　一ＴＧＡＧＴＣＣＡＡＡＣＣＧＧＡＡＣ－３　

Ｅｍｌ０　５　一ＧＡＣＴＧＣＧＴＡＣＧＡＡＴＴＣＡＴ一３　

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８２　ＡＣＴＡ　ＰＲＡＴＡＣＵＬＴＵＲＡＥ　ＳｒＮＩＣＡ（ＶｏＩ．Ｉ７，Ｎｏ．３）　

果划分为９个评分等级以便分析，从左至右（１～９）　

泳道评分为５，９，６，４，１，８，７，３和２。因此，组合２　

为此正交试验所获得的最佳反应体系，其次为组合　

６。在２、６组合中聚合酶Ｔａｑ　ＤＮＡ用量均为１．０　

Ｕ，而Ｍｇ　、ｄＮＴＰ和引物均处于不同的水平。表　

明聚合酶Ｔａｑ　ＤＮＡ可能为影响狗牙根ＳＲＡＰ—　

ＰＣＲ反应的关键因素，当其用量为１．０　Ｕ时ＳＲＡＰ　

的扩增效果较好，此时特异谱带多态性高、背景干扰　

低、主带清晰、副带明显，因此确定第２组合为　

ｓＲＡＰ—ＰＣＲ的最佳反应体系，即２０　Ｌ反应体系　

中含有Ｍｇ　１．２５　ｍｍｏｌ／Ｌ、ｄＮＴＰ　２６０／￣ｍｏｌ／Ｌ、引　

物０．２／￣ｍｏｌ／Ｌ、Ｔａｑ　ＤＮＡ聚合酶１．０　Ｕ。　

２．２模板浓度确定　

图２　正交设计ＳＲＡＰ—ＰＣＲ反应体系扩增结果　

Ｆｉｇ．２　Ａｍｐｌｉｆｉｅｄ　ｒｅｓｕｌｔｓ　ｏｆ　ｅｖｅｒｙ　ｔｒｅａｔｍｅｎｔ　ａｃｃｏｒｄｉｎｇ　ｔｏ　

ｔｈｅ　ｏｒｔｈｏｇｏｎａｌ　ｄｅｓｉｇｎ　ｄｉａｇｒａｍ　

由于ＳＲＡＰ—ＰＣＲ体系中模板ＤＮＡ浓度不　

同，其扩增结果也存在一定的差异（图３）。在２０　Ｌ　

ＳＲＡＰ—ＰＣＲ反应体系中ＤＮＡ模板的量在１Ｏ～　

１２０　ｎｇ／２０“Ｌ虽均能扩增出条带，但模板浓度较低　

ｌ～９为表３处理组合编号；Ｍ：ＤＮＡ　Ｍａｒｋｅｒ；引物：Ｍｅ３和Ｅｍｌ组合　

ｌ一９：Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ　１—９　ｓｅｅ　ｔａｂｌｅ　３；Ｍ：ＤＡＮ　ｍａｒｋｅｒ；Ｐｒｉｍｅｒ：Ｃｏｍｂｉｎａ　

ｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｍｅ３　ａｎｄ　Ｅｍ】　

（＜４０　ｎｇ／２０　Ｌ）或较高（≥１００　ｎｇ／２０　Ｌ）时，造成　

扩增条带弥散、模糊不清。在４０，６０或８Ｏ　ｎｇ／２０　Ｌ　

时谱带清晰；这说明ＳＲＡＰ扩增模板ＤＮＡ浓度适　

应范围较宽。通过比较模板ＤＮＡ用量发现４０　ｎｇ／　

２０肚Ｌ为佳，既可获得好的扩增效果又节约ＤＮＡ用　

量。因此，该反应体系中ＤＮＡ模板浓度确定为４０　

ｎｇ／２０　Ｌ。　

２．３　ＳＲＡＰ—ＰＣＲ反应体系应用　

利用优化后的２０　Ｌ　ＳＲＡＰ反应体系：２　Ｌ　１０　

×ｂｕｆｆｅｒ、４０　ｎｇ模板ＤＮＡ、Ｍｇ　１．２５　ｍｍｏｌ／Ｌ、　

ｄＮＴＰ　２６０￣ｍｏｌ／Ｌ、引物０．２／ｌｍｏｌ／Ｌ、Ｔａｑ　ＤＮＡ聚　

合酶１．０　Ｕ，运用Ｍｅ２和Ｅｒａ４引物组合对９份狗牙　

根进行ＳＲＡＰ扩增，检测结果如图４所示：条带清　

图３不同模板ＤＮＡ浓度扩增结果　

Ｆｉｇ．３　Ｒｅｓｕｌｔｓ　ｏｆ　ＳＲＡＰ—ＰＣＲ　ｗｉｔｈ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ　ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ　

ｏｆ　ｔｅｍｐｌａｔｅ　ＤＮＡ　

晰，不仅扩增强，而且特异性高；同时反应体系具有　

较好的稳定性。９份优良坪用型狗牙根种质在分子　

水平上表现出明显的多态性差异，表明利用优化的　

Ｍ：ＤＮＡ　Ｍａｒｋｅｒ；１～９的ｓＲＡＰ—ＰＣＲ反应体系中模板ＤＮＡ分别为１ｏ，　

１５，２０，２５，４０，６０，８０，１００和１２０　ｎｇ／２０“Ｌ；引物：Ｍｅｌ和Ｅｍ２组合　

Ｍ：ＤＮＡ　ｍａｒｋｅｒ；Ｔｈｅ　ｔｅｍｐｌａｔｅ　ＤＮＡ　ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ　ｆｒｏｍ　１　ｔｏ　９　ａｒｅ　１０，１５，　

反映体系能够有效地反映出普通狗牙根之间的多态　

性，并有效地对不同狗牙根品种（种源）基因组进行　

ＳＲＡＰ扩增，这都证实该反应体系实用性强。因此，　

利用现有的ＳＲＡＰ标记可用于狗牙根遗传多样性　

分析、种质资源鉴定、ＱＴＬ定位等方面的研究。　

２Ｏ，２５，４Ｏ，６Ｏ，８０，１００和１２０　ｎｇ／２０“Ｌ；Ｐｒｉｍｅｒ：Ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｍｅｌ　ａｎｄ　

Ｅｍ　

本研究采用最佳体系对引物进行了筛选，共获得３４对谱带清晰、多态性丰富的引物（表５），为日后运用该标　

记进行普通狗牙根的遗传多样性分析奠定基础，检测结果如图５所示。　

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第１７卷第３期　草业学报２００８年　８３　

３讨论　

ＳＲＡＰ分子标记的原理是利用独特的引物设　

计对ＯＲＦｓ（ｏｐｅｎ　ｒｅａｄｉｎｇ　ｆｒａｍｅｓ，开放阅读框架）进　

３００　ｂｐ　

行扩增，上游引物长１７　ｂｐ，５　端的前１Ｏ　ｂｐ是一段　

２５０　ｂｐ　

填充序列，紧接着是ＣＣＧＧ，它们组成核心序列及３　

端３个选择碱基，对外显子进行特异扩增。下游引　

物长１８　ｂｐ，５　端的前１１　ｂｐ是一段填充序列，紧接　

着是ＡＡＴＴ，它们组成核心序列及３　端３个选择碱　

基，对内含子区域、启动子区域进行特异扩增，因个　

体不同以及物种的内含子、启动子与间隔长度不等　

而产生多态性ｌ３］。　

利用正交试验设计对ＰＣＲ反应体系中多因素　

进行筛选，可以较快的找到最优水平组合，从而避免　

单因素试验的不足。在正交设计试验过程中，每个　

因素间都会进行相互作用，如引物与模板结合后在　

Ｔａｑ酶作用下进行延伸，Ｔａｑ　ＤＮＡ聚合酶是Ｍｇ　

图４　优化的ｓＲＡＰ—ＰＣＲ反应体系对９份狗牙根的扩增结果　

的依赖性酶，受Ｍｇ　。‘浓度的影响，而Ｍｇ　。‘又受　

Ｆｉｇ．４　Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｒｅｓｕｌｔｓ　ｏｆ　９　ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ　Ｃ．ｄａｃｔｙｌｏｎ　ｇｅｒｍｐｌａｓｍ　

ｄＮＴＰ的拮抗作用。因此体系中任何一种因素发生　

ＤＮＡ　ｗｉｔｈ　ｔｈｅ　ｂｅｓｔ　ＳＲＡＰ—ＰＣＲ　ｒｅａｃｔｉｏｎ　ｓｙｓｔｅｍ　

变化都可能影响扩增的结果。对于本试验狗牙根　

１～９为表１编号对应的狗牙根；Ｍ：ＤＮＡ　ｍａｒｋｅｒ；引物：Ｍｅ２和Ｅｍ４组　

合Ｍ：Ｍａｒｋｅｒ；ｌ一９：ｌ一９　ｏｆ　Ｃ．ｄａｃｔｙｌｏｎ　ｓｅｅ　ｔａｂｌｅ　１；Ｐｒｉｍｅｒｓ：Ｃｏｍｂｉ一　

ＳＲＡＰ反应体系来讲，当Ｍｇ抖、ｄＮＴＰ、引物和　

１＂１ａｔｉＯｎ　ｏｆ　Ｍｅ２　ａｎｄ　Ｅｍ４　

ＤＮＡ浓度分别为１．２５　ｍｍｏｌ／Ｌ，２６０／￣ｍｏｌ／Ｌ，０．２　

／￣ｍｏｌ／Ｌ，４０　ｎｇ／２０　Ｌ和Ｔａｑ　ＤＮＡ聚合酶为１．０　Ｕ时可得到较好的扩增结果，并运用优化得到的最佳体系在引　

物组合作用下验证普通狗牙根代表性种质问的差异，从而证明了ＳＲＡＰ标记技术在狗牙根上的可行性。　

Ｂｕｄａｋ等　利用ＳＲＡＰ、ＲＡＰＤ、ＳＳＲ和ＩＳＳＲ　４种标记系统分析野牛草种子繁殖类型、营养繁殖类型以及二　

者之间的遗传多样性，研究结果证实，ＳＲＡＰ多态性丰富，适合应用于野牛草近缘栽培种遗传多样性研究。本研　

１Ｏ０　ｂ　

图５　ｓＲＡＰ—ＰＣＲ反应体系对部分引物筛选结果　

Ｆｉｇ．５　Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｒｅｓｕｌｔｓ　ｏｆ　２４　ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ　ｐｒｉｍｅｒｓ　ｗｉｔｈ　ｔｈｅ　ＳＲＡＰ—ＰＣＲ　ｒｅａｃｔｉｏｎ　ｓｙｓｔｅｍ　

１—２４为表４编号对应的引物分别为Ｍｅｌ与Ｅｍｌ～１０、Ｍｅ２与Ｅｍｌ～１Ｏ及Ｍｅ３和Ｅｍｌ～４组合；Ｍ：ＤＮＡ　ｍａｒｋｅｒ　

１－－２４：１－－２４　ｏｆ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ　ｐｒｉｍｅｒｓ　ｓｅｅ　ｔａｂｌｅ　４；Ｐｒｉｍｅｒ：Ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｍｅｌ　ａｎｄ　Ｅｍ１～１０・　

Ｍｅ２　ａｎｄ　Ｅｍｌ～１０，Ｍｅ３　ａｎｄ　Ｅｍｌ～４　ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ；Ｍ：ＤＮＡ　ｍａｒｋｅｒ　

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８４　ＡＣＴＡ　ＰＲＡＴＡＣＵＬＴＵＲＡＥ　ＳＩＮＩＣＡ（Ｖｏ１．１　７，Ｎｏ．３）　６／２００８　

Ｍｅ１　

Ｍｅ２　

Ｍｅ３　

Ｍｅ４　

Ｍｅ５　

Ｍｅ６　

Ｍｅ７　

Ｍｅ８　

Ｍｅ９　

注：√为条带清晰且多态性丰富的引物；一为条带模糊且多态性差的引物。　

Ｎｏｔｅ：√ｍｅａｎ　ｔｈｅ　ｐｒｉｍｅｒｓ　ｗｉｔｈ　ａｂｕｎｄａｎｔ　ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ　ｂａｎｄｓ；——ｍｅａｎ　ｔｈｅ　ｐｒｉｍｅｒｓ　ｗｉｔｈｏｕｔ　ａｂｕｎｄａｎｔ　ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ　ｂａｎｄｓ．　

究结果同样表明，ＳＲＡＰ应用于狗牙根植物具有丰富的多态性，今后可进一步在狗牙根种源鉴定、遗传多样性、优　

良性状标记和诱变后代鉴定等方面有更加广泛和深入应用。　

参考文献：　

Ｅｌｉ方宣钧，吴为人，唐纪良．作物ＤＮＡ标记辅助育种［Ｍ］．北京：科学出版社，２００２．１—９．　

［２］　郭海林，刘建秀，高鹤，等．结缕草属优良品系ＳＳＲ指纹图谱的构建［Ｊ］．草业学报，２００７，１６（２）：５３—５９．　

［３］Ｌｉ　Ｇ，Ｏｕｉｒｏｓ　Ｃ　Ｆ．Ｓｅｑｕｅｎｃｅ—ｒｅｌａｔｅｄ　ａｍｐｌｉｆｉｅｄ　ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ（ＳＲＡＰ），ａ　ｎｅｗ　ｍａｒｋｅｒ　ｓｙｓｔｅｍ　ｂａｓｅｄ　ｏｎ　ａ　ｓｉｍｐｌｅ　ＰＣＲ　ｒｅａｃｔｉｏｎ：　

Ｉｔｓ　ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ＂ｔｏ　ｍａｐｐｉｎｇ　ａｎｄ　ｇｅｎｅ　ｔａｇｇｉｎｇ　ｉｎ　Ｂｒａｓｓｉｃａ［Ｊ］．Ｔｈｅｏｒｅｔｉｃａｌ　ａｎｄ　Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，２００１，１０３：４５５—４６１．　

［４］Ｌｉｎ　ｚ，Ｈｅ　Ｄ，Ｚｈａｎｇ　Ｘ，ｅｔ　ａ１．Ｌｉｎｋａｇｅ　ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ　ａｎｄ　ｍａｐｐｉｎｇ　ＱＴＬ　ｆｏｒ　ｃｏｔｔｏｎ　ｆｉｂｒｅ　ｑｕａｌｉｔｙ　ｕｓｉｎｇ　ＳＲＡＰ，ＳＳＲ　ａｎｄ　ＲＡＰＤ［Ｊ］．　

Ｐｌａｎｔ　Ｂｒｅｅｄｉｎｇ，２００５，１２４（２）：１８０—１８７．　

［５］林忠旭，张献龙，聂以春，等．棉花ＳＲＡＰ遗传连锁图构建［Ｊ］．科学通报，２００３，４８（１５）：１６７６—１６７９．　

［６］　Ｒｉａｚ　Ａ，Ｌｉ　Ｇ，Ｑｕｒｅｓｈ　ｚ，ｅｔ　ａ１．Ｇｅｎｅｔｉｃ　ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ　ｏｆ　ｏｉｌｓｅｅｄ　Ｂｒａｓｓｉｃａ　ｎａｐｕｓ　ｉｎｂｒｅｄ　ｌｉｎｅｓ　ｂａｓｅｄ　ｏｎ　ｓｅｑｕｅｎｃｅ－ｒｅｌａｔｅｄ　ａｍｐｌｉｆｉｅｄ　ｐｏｌ—　

ｙｍｏｒｐｈｉｓｍ　ａｎｄ　ｉｔｓ　ｒｅｌａｔｉｏｎ　ｔｏ　ｈｙｂｒｉｄ　ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ［Ｊ］．Ｐｌａｎｔ　Ｂｒｅｅｄｉｎｇ，２００１，１２０（５）：４１１—４１５．　

［７］Ｆｅｒｒｉｏｌ　Ｍ，Ｐｉｃｏ　Ｂ，Ｎｕｅｚ　Ｆ．Ｇｅｎｅｔｉｃ　ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ　ｏｆ　ａ　ｇｅｒｍｐｌａｓｍ　ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ　ｏｆ　ｃｕｃｕｒｂｉｔａｐｅｐｏ　ｕｓｉｎｇ　ＳＲＡＰ　ａｎｄ　ＡＦＬＰ　ｍａｒｋｅｒｓ［Ｊ］．　

Ｔｈｅｏｒｅｔｉｃａｌ　ａｎｄ　Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，２００３，１０７（２）：２７１－２８２．　

［８］文雁成，王汉中，沈金雄，等．用ＳＲＡＰ标记分析中国甘蓝型油菜品种的遗传多样性和遗传基础［Ｊ］．中国农业科学，２００６，　

３９（２）：２４６－２５０．　

［９］王刚，潘俊松，李效尊，等．黄瓜ＳＲＡＰ遗传连锁图的构建及侧枝基因定位［Ｊ］．中国科学（Ｃ辑），２００４，３４（６）：５１２—５１６．　

［１０］Ｌｉ　Ｇ，Ｇａｏ　Ｍ，Ｑｕｉｒｏｓ　Ｃ　Ｅ．Ｇｅｎｅ　ｆｏｒ　ｇｅｎｅ　ａｌｉｇｎｍｅｎｔ　ｂｅｔｗｅｅｎ　ｔｈｅ　Ｂｒａｓｓｉｃａ　ａｎｄ　ａ　ｒｏｂｉｄｏｐｓｉｓ　ｇｅｎｏｍｅｓ　ｂｙ　ｄｉｒｅｃｔ　ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｏｍｅ　

ｍａｐｐｉｎｇ［Ｊ］．Ｔｈｅｏｒｅｔｉｃａｌ　ａｎｄ　Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，２００３，１０７（１）：１６８—１８０．　

Ｅｌ１］Ｇａｔｓｃｈｅｔ　Ｊ　Ｒ，Ｔａｌｉａｆｅｒｒｏ　Ｃ　Ｍ，Ａｎｄｅｒｓｏｎ　Ｊ　Ａ，ｅｔ　ａ１．‘Ｃｏｌｄ　ａｃｃｌｉｍａｔｉｏｎ　ａｎｄ　ａｌｔｅｒａｔｉｏｎｓ　ｉｎ　ｐｒｏｔｅｉｎｓ　ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ　ｉｎ　ｂｅｒｍｕｄａｇｒａｓｓ　

ｃｒｏｗｎｓ［Ｊ］．Ｈｏｒｔ　Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９９４，１１９（３）：４７７—４８０．　

［１２－１谭继清，谭志坚．新编中国草坪与地被［Ｍ］．中国：重庆出版社，２０００．４６—４９．　

［１３］Ｈａｒｌａｎ　Ｊ　Ｒ，Ｄｅｗｅｔ　Ｊ　Ｍ　Ｊ．Ｓｏｕｒｃｅｓ　ｏｆ　ｖｉｒａｔｉｏｎ　ｉｎ　Ｃｙｎｏｄｏｎ　ｄａｃｔｙｌｏｎ（Ｌ．）Ｐｅｒｓ［Ｊ］．Ｃｒｏｐ　Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９９６，３６：７４８—７７４．　

［１４］Ｔａｌｉａｆｅｒｒｏ　Ｃ　Ｍ．Ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ　ａｎｄ　ｖｕｌｎｅｒａｂｉｌｉｔｙ　ｏｆ　Ｂｅｒｍｕｄａ　ｔｕｒｆｇｒａｓｓ　ｓｐｅｃｉｅｓ［Ｊ］．Ｃｒｏｐ　Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９９５，３５：３２７—３３１．　

［１５－１刘建秀，郭爱桂，郭海林．我国狗牙根种质资源形态变异及形态类型划分［Ｊ］．草业学报，２００３，１２（６）：．９９—１０４．　

［１６］刘建秀，郭爱佳，郭海林．我国狗牙根种质资源匍匐性的研究［Ｊ］．中国草地，２００２，２４（２）：３６—３８．　

［１７］刘建秀，贺善安，刘永东．华东地区狗牙根外部形态变异规律的研究［Ａ］．中国草地科学进展［Ｍ－１．北京：中国农业大学出　

版社，１９９８．　

维普资讯

第１７卷第３期　草业学报２００８年　８５　

Ｄｓ］　

Ｒｅｙｅｓ　Ｂ　Ｇ，Ｔａｌｉａｆｅｒｒｏ　Ｃ　Ｍ，Ａｎｄｅｒｓｏｎ　Ｍ　Ｐ，ｅｔ　ａ１．Ｉｎｄｕｃｅｄ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｃｌａｓｓ　ＩＩ　ｃｈｉｔｉｎａｓｅ　ｇｅｎｅ　ｄｕｒｉｎｇ　ｃｏｌｄ　ａｃｃｌｉｍａｔｉｏｎ　

ａｎｄ　ｄｅｈｙｄｒａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｂｅｒｍｕｄａｇｒａｓｓ（Ｃｙｎｏｄｏｎ　ｓｐ．）［Ｊ］．Ｔｈｅｏｒｅｔｉｃａｌ　ａｎｄ　Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，２００１，１０３（２—３）：２９７—３０６．　

［１９］　

Ｐｒａｔｔ　Ｒ　Ｇ．Ａｎ　ｅｘｃｉｓｅｄ—ｌｅａｆ　ｉｎｙｃｕｌａｔｉｏｎ　ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ　ｆｏｒ　ｅｖａｌｕａｔｉｎｙ　ｈｏｓｔ—ｙａｔｈｏｇｅｎ　ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ　ａｎｄ　ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ　ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ　ｏｆ　ｂｅｒ—　

ｍｕｄａｇｒａｓｓ　ｇｅｎｏｔｙｐｅｓ　ｔｏ　ｄｅｍａｔｉａｃｅｏｕｓ　ｈｙｐｈｏｍｙｃｅｔｅｓ［Ｊ］．Ｐｈｙｔｏｐａｔｈｏ１ｏｇｙ，２００３，９３（１２）：１５６５—１５７１．　

　Ｍ，Ｐｉａｎｏ　Ｅ，Ｃａｒｒｏｎｉ　Ａ　Ｍ，ｅｔ　ａ１．Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｎａｔｉｖｅ　ｂｅｒｍｕｄａｇｒａｓｓ（Ｃｙｎｏｄｏｎ　ｄａｃｔｙｌｏｎ）ｇｅｒｍｐｌａｓｍ　ｆｒｏｍ　Ｉｔａｌｙ　ｆｏｒ　

［２０］　

Ｒｏｍａｎｉ

ｔｈｅ　ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ　ｏｆ　ａｄａｐｔｅｄ　ｔｕｒｆｇｒａｓｓ　ｃｕｌｔｉｖａｒｓ［Ｊ］．Ａｃｔａ　Ｈｏｒｔｉｃｕｌｔｕｒａｅ，２００４，６６１　３８１—３８６．　

［２１］　

王玉刚　

阿不来提，齐曼．两种狗牙根品种对干旱胁迫反应的差异ｌ－Ｊ］．草业学报，２００６，１５（４）；５８—６４．　

［２２］　

王友保　

张莉，刘惠，等．铜对狗牙根生长及活性氧清除系统的影响［Ｊ］．草业学报，２００７，１６（１）：５２—５７　

［２３］　

刘建秀　

刘永东，贺善安，等．南京狗牙根的选育［Ｊ］．草业科学，２００３，２１（１１）：８４—８５．　

［２４］　

郭海林　

刘建秀，郭爱桂，等．中国狗牙根染色体数变异研究初报广Ｊ］．草地学报，２００２，３：６９—７３．　

［２５］　

Ｄａｂｏ　Ｓ　Ｍ．Ｂｅｒｍｕｄａｇｒａｓｓ　ｃｕｌｔｉｖａｒ　ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｂｙ　ｕｓｅ　ｏｆ　ｉｓｏｅｎｚｙｍｅ　ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｔｉｃ　ｐａｔｔｅｒｎｓ［Ｊ］．Ｅｕｐｈｙｔｉｃａ，１９９０，５１：２５—　

３１．　

［２６］　

Ｖｅｒｍｅｕｌｅｎ　Ｐ　Ｈ．Ｓｔａｃｈ　ｇｅｌｅｌｅｃｔｒｏｎｐｈｏｒｅｓｉｓ　ｕｓｅｄ　ｆｏｒ　ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｔｕｒｆｔｙｐｅ　Ｃｙｎｏｄｏｎ　ｄａｃｔｙｌｏｎ　ｇｅｎｅｔｙｐｅ［Ｊ］．Ｃｒｏｐ　Ｓｃｉｅｎｃｅ，　

１９９１，３１：２３３—２３７．　

［２７］　何惠琴，干友民，李绍才。等．不同温度下野生狗牙根过氧化物酶同工酶分析［Ｊ］．中国草地学报，２００６，２８（５）：７２—７６．　

ａｆｅｒｒｏ　Ｃ　Ｍ，Ｂａｉ　Ｇ　Ｈ。ｅｔ　ａ１．Ｇｅｎｅｔｉｃ　ａｎａｌｙｓｉｓ　ｏｆ　Ｃｈｉｎｅｓｅ　Ｃｙｎｏｄｏｎ　ａｃｃｅｓｓｉｏｎｓ　ｂｙ　ｆｌｏｗ　ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ　ａｎｄ　ＡＦＩ　Ｐ　

［２８］　

Ｗｕ　Ｙ　Ｑ，Ｔａｌｉ

ｍａｒｋｅｒｓ［Ｊ］．Ｃｒｏｐ　ｓｃｉｅｎｃｅ，２００６，４６（２）：９１７－９２６．　

　Ｃ　Ｍ，Ｓｃｉａｒａ　Ｅ　Ｂ，Ｅｓｔｉｌｌ　Ｊ　Ｃ，ｅｔ　ａ１．Ａ　ｆｒａｍｅｗｏｒｋ　ｌｉｎｋａｇｅ　ｍａｐ　ｏｆ　ｂｅｒｍｕｄａｇｒａｓｓ（Ｃｙｎｏｄｏｎ　ｄａｃｔｙｌｏｎ×Ｃ．ｔｒａｎｓｖａａｌｅｎ—　

［２９］　

Ｂｅｔｈｅｌ

ｓｉｓ）ｂａｓｅｄ　ｏｎ　ｓｉｎｇｌｅ－ｄｏｓｅ　ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ　ｆｒａｇｍｅｎｔｓ［Ｊ］．Ｔｈｅｏｒｅｔｉｃａｌ　ａｎｄ　Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，２００６，１１２（４）：７２７—７３７．　

［３０］　刘伟．西南区野生狗牙根种质资源遗传多样性与坪用价值研究ＶＤ］．雅安：四川农业大学博士学位论文，２００６．　

［３１］　

Ｗａｎｇ　Ｍ　Ｉ　，Ｂａｒｋｌｅｙ　Ｊ　Ｋ，Ｙｕ　Ｊ　Ｋ，ｅｔ　ａ１．Ｔｒａｎｓｆｅｒ　ｏｆ　ｓｉｍｐｌｅ　ｓｅｑｕｅｎｃｅ　ｒｅｐｅａｔ（ＳＳＲ）ｍａｒｋｅｒｓ　ｆｒｏｍ　ｍａｊｏｒ　ｃｅｒｅａｌ　ｃｒｏｐｓ　ｔｏ　ｍｉｎｏｒ　

ｇｒａｓｓ　ｓｐｅｃｉｅｓ　ｆｏｒ　ｇｅｒｍｐｌａｓｍ　ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ　ａｎｄ　ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ［Ｊ］．Ｐｌａｎｔ　Ｇｅｎｅｔｉｃ　Ｒｅｓｏｕｒｃｅｓ，２００５，３（１）：４５—５７．　

［３２］　刘伟，张新全，李芳，等．西南地区野生狗牙根遗传多样性的ＩＳＳＲ标记与地理来源分析ｌ－Ｊ］．草业学报，２００７，１６（３）：５５—　

６１．　

［３３］　

Ｂｕｄａｋ　Ｈ，Ｓｈｅａｒｍａｎ　Ｒ　Ｃ，Ｐａｒｍａｋｓｉｚ　Ｉ，ｅｔ　ａ１．　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｂｕｆａｌｏｇｒａｓｓ　ｇｅｒｍｐｌａｓｍ　ｕｓｉｎｇ　ｓｅｑｕｅｎｃ　ｒｅｌａｔｅｄ　

ａｍｐｌｉｆｉｅｄ　ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ　ｍａｒｋｅｒｓ［Ｊ］．Ｔｈｅｏｒｅｔｉｃａｌ　ａｎｄ　Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，２００４，１０８（２）：３２８—３３４．　

　ｏｆ　ｓｅｅｄｅｄ　ａｎｄ　ｖｅｇｅｔａｔｉｖｅ　ｂｉｏｔｙｐｅ　ｂｕｆａｌｏｇｒａｓｓｅｓ　ｂａｓｅｄ　ｏｒ　ｐｈｙｌｏｇｅ—　

［３４］　

Ｂｕｄａｋ　Ｈ，Ｓｈｅａｒｍａｎ　Ｒ　Ｃ，Ｐａｒｍａｋｓｉｚ　Ｉ．Ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ　ａｎａｌｙｓｉｓ

ｎｅｔｉｃ　ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐ　ｕｓｉｎｇ　ＩＳＳＲｓ，ＳＳＲｓ，ＲＡＰＤｓ，ａｎｄ　ＳＲＡＰｓ［Ｊ］．Ｔｈｅｏｒｅｔｉｃａｌ　ａｎｄ　Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，２００４，１０９（２）：２８０—２８８．　

Ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ　ｆｏｒ　ＳＲＡＰ－－ＰＣＲ　ｓｙｓｔｅｍ　ｉｎ　Ｃｙｎｏｄｏｎ　ｄａｃｔｙｌｏｎ　ａｎｄ　ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ　ｏｆ　ｐｒｉｍｅｒｓ　

ＷＡＮＧ　Ｚｈｉ—ｙｏｎｇＩ’。，ＹＵＡＮ　Ｘｕｅ—ｊ　ｕｎ。，ＬＩＵ　Ｊｉａｎ—ｘｉｕ。，ＧＵＯ　Ｈａｉ—ｌｉｎ。　

（１．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ　ｏｆ－Ｈｏｒｔｉｃｕｌｔｕｒｅ，Ｎａｎｊｉｎｇ　Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ　Ｕｎｉｖｅｒｉｓｔｙ，Ｎａｎｊｉｎｇ　２１００９５，Ｃｈｉｎａ；２．Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ　ｏｆ　

Ｂｏｔａｎｙ，Ｊｉａｎｇｓｕ　Ｐｒｏｖｉｎｃｅ　ａｎｄ　Ｃｈｉｎｅｓｅ　Ａｃａｄｅｍｙ　ｏｆ　Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｎａｎｊｉｎｇ　２１００１４，Ｃｈｉｎａ）　

Ａｂｓｔｒａｃｔ：ｃｙｎｏｄｏｎ　ｄａｃｔｙｌｏｎ　ｇｅｎｏｍｉｃ　ＤＮＡ　ｆｒｏｍ　ｌｅａｆ　ｔｉｓｓｕｅ　ｗａｓ　ｉｓｏｌａｔｅｄ　ａｃｃｏｒｄｉｎｇ　ｔｏ　ｔｈｅ　ＳＤＳ　ｐｒｏｃｅｄｕｃｅ．Ａｎ　ｏｒ—　

ｔｈｏｇｏｎａｌ　ｄｉａｇｒａｍ　ａｓ　ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ　ｄｅｓｉｇｎ　ｗａｓ　ａｐｐｌｉｅｄ　ｔｏ　ｓｔｕｄｙ　ｔｈｅ　ｅｆｆｅｃｔｓ　ｏｆ　ｔｈｒｅｅ　ｌｅｖｅｌｓ　ｏｆ　Ｍｇ抖，ｄＮＴＰ，ｐｒｉｍ—　

ｅｒｓ　ａｎｄ　Ｔａｑ　ＤＮＡ　ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ　ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ　ｏｎ　ｔｈｅ　ｒｅａｃｔｉｏｎ　ｓｙｓｔｅｍ　ｏｆ　ＳＲＡＰ，ａｎｄ　ｔｈｅ　ＳＲＡＰ　ｒｅａｃｔｉｏｎ　ｓｙｓｔｅｍ　ｗａｓ　

ｆｉｎａｌｌｙ　ｏｐｔｉｍｉｚｅｄ　ｂｙ　ａｎａｌｙｚｅｄ　ｅｆｆｅｃｔｓ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓ　ｏｆ　ＤＮＡ　ｔｅｍｐｌａｔｅ．Ｔｈｅ　ｒｅｓｕｌｔｓ　ｓｈｏｗｅｄ　ｔｈａｔ　ａｌｌ　ｆａｃｔｏｒｓ　

ｈａｄ　ｔｈｅ　ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ　ｅｆｆｅｃｔ　ｏｎ　ｔｈｅ　ｒｅｓｕｌｔ　ｏｆ　ＳＲＡＰ—ＰＣＲ．Ａｎｄ　ａ　ｂｅｔｔｅｒ　ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｏｆ　ＳＲＡＰ—ＰＣＲ　ｗａｓ　ｏｂｔａｉｎｅｄ　

ｗｉｔｈ　ｔｈｅ　ｒｅａｃｔｉｏｎ　ｓｙｓｔｅｍ　ｆｏｒ　Ｃ．ｄａｃｔｙｌｏｎ　ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ　２“Ｌ　１０×ｂｕｆｆｅｒ，４０　ｎｇ　ｇｅｎｏｍｉｃ　ｔｅｍｐｌａｔｅｓ　ＤＮＡ，１．２５　

ｍｍｏｌ／Ｌ　Ｍｇ计，２６０　ｕｍｏｌ／Ｌ　ｄＮＴＰ，０．２／２ｍｏｌ／Ｌ　Ｐｒｉｍｅｒ，１．０　Ｕ　Ｔａｑ　ＤＮＡ　ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ　ｉｎ　ｔｈｅ　ｔｏｔａｌ　ｖｏｌｕｍｅ　ｏｆ　２Ｏ　

“Ｌ．Ａｔ　ｔｈｅ　ｓａｍｅ　ｔｉｍｅ，３４　ｐｒｉｍｅｒ　ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎｓ　ｗｅｒｅ　ｓｅｌｅｃｔｅｄ　ｗｉｔｈ　ｔｈｅ　ｏｐｔｉｍｉｚｅｄ　ｓｙｓｔｅｍ　ａｍｏｎｇ　９０　ｐｒｉｍｅｒ　ｃｏｍ—　

ｂｉｎａｔｉｏｎｓ。ｗｈｉｃｈ　ｈａｄ　ａｂｕｎｄａｎｔ　ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ　ｂａｎｄｓ．Ｔｈｉｓ　ｓｔｕｄｙ　ｗｏｕｌｄ　ｂｅ　ｃｏｎｄｕｃｔｅｄ　ｔｏ　ｔｈｅ　ｏｐｔｉｍｉｚｅｄ　ＳＲＡＰ—　

ＰＣＲ　ｓｙｓｔｅｍ　ａｎｄ　ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ　ｏｆ　ｐｒｉｍｅｒｓ　ｗｈｉｃｈ　ｗｏｕｌｄ　ｐｌａｙ　ａｎ　ｉｍｐｏｒｔａｎｔ　ｒｏｌｅ　ｉｎ　Ｃ．ｄａｃｔｙｌｏｎ　ｇｅｎｅｔｉｃ　ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ　ａｎａｌｙ—　

ｓｉｓ，ｍａｐ　ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ，ｇｅｎｅ　ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｉｍｐｏｒｔａｎｔ　ｔｒａｉｔｓ，ｇｅｒｍｐｌａｓｍ　ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｉｎ　Ｃ．ｄａｃｔｙｌｏｎ　ｗｉｔｈ　

ＳＲＡＰ　ｍａｒｋｅｒｓ．　

Ｋｅｙ　ｗｏｒｄｓ：Ｃｙｎｏｄｏｎ　ｄａｃｔｙｌｏｎ；ＳＲＡＰ　ｍａｒｋｅｒ；ｏｒｔｈｏｎｇｏｎａｌ　ｄｅｓｉｇｎ；ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｓｙｓｔｅｍ；ｐｒｉｍｅｒｓ　

2024年6月12日发(作者：溥菊华)

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第１７卷第３期　

草　业　学　报　

ＡＣＴＡ　ＰＲＡＴＡＣＵＬＴＵＲＡＥ　ＳＩＮＩＣＡ　

７９—８５　

Ｖｏ１．１７。Ｎｏ．３　

６／２００８　

狗牙根ＳＲＡＰ—ＰＣＲ反应体系优化及引物筛选　

王志勇　，袁学军　，刘建秀　，郭海林　

（１．南京农业大学园艺学院，江苏南京２１００９５；２．江苏省中国科学院植物研究所，江苏南京２１００１４）　

摘要：利用正交设计，从Ｍｇ　、ｄＮＴＰ、引物浓度和ＤＮＡ聚合酶４种因素３个水平以及不同的模板ＤＮＡ浓度来优　

化狗牙根ｓＲＡＰ—ＰＣＲ反应体系，并对引物进行了全面筛选。狗牙根ＳＲＡＰ—ＰＣＲ优化反应体系结果为：２　Ｌ　１０　

×ｂｕｆｆｅｒ、４０　ｎｇ模板ＤＮＡ、Ｍｇ　１．２５　ｍｍｏｌ／Ｌ、ｄＮＴＰ　２６０　ｐｍｏｌ／Ｌ、引物０．２　ｐｍｏｌ／Ｉ　、Ｔａｑ　ＤＮＡ聚合酶１．０　Ｕ，总　

体积２Ｏ“Ｌ。运用该结果从９Ｏ对引物中共筛选出扩增条带清晰、多态性丰富的ＳＲＡＰ引物３４对。优化体系的建　

立及其引物的筛选为今后利用ＳＲＡＰ标记技术进行狗牙根遗传分析、图谱构建、基因定位与种质资源鉴定奠定了　

技术基础。　

关键词：狗牙根；ＳＲＡＰ标记；正交试验；体系优化；引物　

中图分类号：￥５４３　．９０２　文献标识码：Ａ　文章编号：１００４—５７５９（２００８）０３—００７９—０７　

目前，常用的ＤＮＡ分子标记有ＲＦＬＰ、ＲＡＰＤ、ＡＦＬＰ和ＳＳＲ等，它们各有优缺点＿１　］。美国Ｄｕ，Ｊ，Ｉ，Ｉ大学蔬菜作　

物系Ｌｉ和Ｏｕｉｒｏｓ＿３　于２００１年在研究芸薹属（Ｂｒａｓｓｉｃａ）作物中开发的～种基于ＰＣＲ的新型标记ＳＲＡＰ（ｓｅ－　

ｑｕｅｎｃｅ—ｒｅｌａｔｅｄ　ａｍｐｌｉｆｉｅｄ　ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ），该标记具备ＲＦＬＰ、ＲＡＰＤ、ＳＳＲ和ＡＦＬＰ等分子的优点，克服了它们的　

缺点，并已经在许多植物研究中得到应用，如在构建图谱　引、遗传多样性　

以及其他方面＿１阳的研究。　

、ＱＴＬ定位　、杂种优势的预测　］　

狗牙根属（Ｃｙｎｏｄｏｎ　ｓｐｐ．）属禾本科（Ｇｒａｍｉｎｅａｅ）画眉草亚科（Ｅｒａｇａｏｓｔｏｉｄｅｅ）虎尾草族（Ｃｈｌｏｒｉｄｏｉｅａｅ）多年生　

草本植物口　。狗牙根属植物全世界共有９种、１０变种，目前用于草坪研究和生产的狗牙根主要有３种，分别是普　

通狗牙根（Ｃ．ｄａｃｔｙｌｏｎ）、非洲狗牙根（Ｃ．ｔｒａｎｓｖａａｌｅｎｓｉｓ）以及种间杂交三倍体狗牙根（Ｃ．ｄａｃｔｙｌｏｎ×Ｃ．ｔｒａｎｓ—　

ｖａａｌｅｎｓｉｓ）口　ｎ］。其中普通狗牙根是世界广布种，原产于非洲东部，现广泛分布于世界各地的热带和亚热带（４５。　

Ｎ～４５。Ｓ）。目前，虽在狗牙根属的生长习性　～　、抗逆性　～　、育种　］、染色体　］、同工酶　～　以及分子水平　

的分子标记Ｅｅ８￣３２］等方面已有研究报道。但有关ＳＲＡＰ分子标记在草坪草中的应用，除在野牛草（Ｂｕｃｈｌｏ￣ｄａｃ—　

ｔｙｌｏｉｄｅｓ）中有报道外　圳，其他类型的草坪草尚未见报道。本研究首次以坪用型狗牙根优良品种（种源）为材料，　

利用正交设计对ＳＲＡＰ反应体系进行优化，在获得最佳扩增效果的基础上进行引物的筛选并对狗牙根进行了扩　

增，将为今后ＳＲＡＰ标记在狗牙根遗传多样性评价、不同种源鉴定、遗传图谱构建、ＱＴＬ定位、比较基因组学、诱　

变后代的鉴定及亲缘关系分析等方面的研究提供较为可靠的技术支持。　

１材料与方法　

１．１材料　

试验所用的１１份狗牙根均取自江苏省中国科学院植物研究所草业中心种质资源圃。其中Ｃ４６１用于体系　

优化，Ｃｌ１７用于引物筛选，其他材料均用作体系验证。具体材料如表１所示。　

１．２　方法　

１．２．１基因组ＤＮＡ提取和检测　以狗牙根嫩叶为材料，采用ＳＤＳ微量法提取基因组ＤＮＡ，并用０．８　琼脂糖　

电泳检测ＤＮＡ质量完整性。采用琼脂糖凝胶电泳，取５　Ｌ　ＤＮＡ溶液，再加入２　Ｌ　０．２５　９／６溴酚蓝，对照为已知　

浓度的ＤＮＡ样品，上样于０．８　琼脂糖凝胶在１×ＴＡＥ的电泳缓冲液中进行水平板电泳（电泳仪为ＤＹＹ一５型，　

收稿日期：２００７—０７—１２；改回日期：２００７　１０－０９　

基金项目：江苏省高技术项目（ＢＧ２００６３２０）资助。　

作者简介：王志勇（１９７９），男，江西景德镇人，在读博士。Ｅ－ｍａｉｌ：｛ａｆｕ３０１＠ｙａｈｏｏ．ｃｏｒｎ．ｃｎ　

＊通讯作者。Ｅ—ｍａｉｌ：ｔｕｒｆｕｎｉｔ＠ｙａｈｏｏ．ｃｏｒｎ．ｃｎ　

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８０　ＡＣＴＡ　ＰＲＡＴＡＣＵＩ　ＴＵＲＡＥ　ＳＩＮＩＣＡ（Ｖｏ１．１　７，Ｎｏ．３）　

电泳槽为ＤＹＣＰ一３４Ａ水平），电泳电压为ｉ００　Ｖ，时间９０　ｍｉｎ左右，电泳结束后，用溴化乙锭（ＥＢ）染色，后在自动　

凝胶图象分析仪（上海培清科技有限公司ＪＳ一３８０）观测分析并照相，如图１所示，根据检测的结果稀释ＤＮＡ，最后　

确定ＤＮＡ浓度为５０　ｎｇ／ＦＬ，用于本试验的研究。　

表１　ＳＲＡＰ—ＰＣＲ体系优化试验材料　

Ｔａｂｌｅ　１　Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ　ｍａｔｅｒｉａｌ　ｆｏｒ　ｏｐｔｉｍｉｚｉｎｇ　ＳＲＡＰ—ＰＣＲ　ｓｙｓｔｅｍ　

１．２．２　ＰＣＲ反应体系正交试验　采用Ｌ。（３　）正交试验　

设计，对Ｍｇ　、ｄＮＴＰ、引物、Ｔａｑ　ＤＮＡ聚合酶进行４因　

素３水平筛选，方案如表２和３。ＳＲＡＰ引物购自上海博　

亚生物技术有限公司，ｄＮＴＰ和Ｔａｑ酶购自南京申能博　

彩公司。ＤＮＡ　ｍａｒｋｅｒ购自南京ＴａＫａＲａ公司。依照扩　

增条带的敏感性与特异性，即条带强弱及杂带多少做１　

～９计分，分数越高，表示敏感性、特异性越好。　

１．２．３　ＰＣＲ反应条件根据表２和３制备总体积为２Ｏ　

图１　部分狗牙根基因组ＤＮＡ原液电泳　

Ｆｉｇ．１　Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ　ｏｆ　ｇｅｎｏｍｉｃ　ＤＮＡ　ｆｏｒ　ｓｏｍｅ　

ｐｒｏｇｅｎｉｅｓ　ｏｆ　Ｃ　ｄａｃｔｙｌｏｎ　

肚Ｌ的ＰＣＲ反应体系，除表中变化因素外，每管中还含有　

２　ｕＬ　１ＯｘＰＣＲ　ｂｕｆｆｅｒ和５Ｏ　ｎｇ模板ＤＮＡ，引物为Ｍｅ３　

和Ｅｍｌ组合（表４）。ＰＣＲ扩增程序为：９４＾Ｃ预变性４　

ａ～ｆ：代表部分不同种源狗牙根基因组ＤＮＡ原液；１～５为已知浓　

度ＤＮＡ，浓度从左至右分别为２５０，２００，１５０，１００，５０　ｎｇ／￣Ｌ　ａ—ｆ：　

Ｇｅｎｏｍｉｃ　ＤＮＡ　ｆｏｒ　ｓｏｍｅ　ｐｒｏｇｅｎｉｅｓ　ｏｆ　Ｃ．ｄａｃｔｙｌｏｎ．１—５：Ｃｏｎｔｅｎｔ　ｏｆ　

ｋｎｏｗｎ　ＤＮＡ，ｃｏｎｔｅｎｔｓ　ｆｒｏｍ　ｌｅｆｔ　ｔｏ　ｒｉｇｈｔ　ａｒｅ　２５０，２００，１５０，１００．５０　

ｍｉｎ；９４℃变性１　ｍｉｎ，３７℃退火１　ｍｉｎ，７２。Ｃ延伸１０　Ｓ，５　

个循环；９４℃变性ｌ　ｍｉｎ，５０℃退火ｌ　ｍｉｎ，７２℃延伸ｌ０　

Ｓ，３５个循环；循环结束后７２℃延伸７　ｍｉｎ，４℃保存，扩　

ｎｇ／＞Ｉ　

扩增产物取１Ｏ肚Ｌ，用６．Ｏ　９／６变性聚丙烯酰胺凝胶分　

增反应在英国ＴＥＣＨＮＥ公司的ＴＣ－４１２　ＰＣＲ仪上进行。　

离，快速银染检测（电泳仪为ＤＹＹ一８Ｂ型，电泳槽为ＪＹ—ＳＣＺ６双垂直型）。　

１．２．４模板ＤＮＡ浓度筛选　应用上述体系最佳组合，引物运用Ｍｅ１和Ｅｍ２组合。在２Ｏ肚Ｌ体系中，设定９个　

模板浓度，分别加入０．２，０．３，０．４，０．５，０．８，１．２，１．６，２．０和２．４肚Ｌ的模板ＤＮＡ，即模板ＤＮＡ浓度设为ｌＯ，ｌ５，　

２Ｏ，２５，４Ｏ，６Ｏ，８０，１００和１２０　ｎｇ／２０肚Ｌ共９个处理，其他成分按最佳组合加入，不足的体积用灭菌水补充。　

１．２．５优化体系应用与引物筛选　根据以上试验结果确定ｓＲＡＰ—ＰＣＲ的最佳反应体系和扩增条件。从筛选　

的引物中随机选取引物为Ｍｅ２和Ｅｍ４组合，对ｌｌ份（其中Ｃ４６１用于体系优化和Ｃｌｌ７用于引物筛选）国内外坪　

用型狗牙根中９份狗牙根进行扩增，筛选出最佳体系并进行稳定性检测和引物筛选。　

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第ｌ７卷第３期　草业学报２００８年　

２结果与分析　

２．１　ＰＣＲ正交试验设计的扩增效果分析　

狗牙根正交试验９个组合（表３）及ＳＲＡＰ扩增效果如图２所示，依照谱带强弱及杂带的多少，将９个处理结　

表２　ＳＲＡＰ—ＰＣＲ体系的因素和水平　

Ｔａｂｌｅ　２　ＳＲＡＰ—ＰＣＲ　ｆａｃｔｏｒｓ　ａｎｄ　ｌｅｖｅｌｓ　

表３　ｓＲＡＰ—ＰＣＲ正交试验设计表ＥＬ，（３　）］　

Ｔａｂｌｅ　３　Ｏｒｔｈｏｒｏｎａｌ　ｄｅｓｉｇｎ　ｆｏｒ　ＳＲＡＰ—ＰＣＲ［＇Ｌ９（３　）］　

表４　ＳＲＡＰ所用引物序列　

Ｔａｂｌｅ　４　Ｐｒｉｍｅｒｓ　ｓｅｑｕｅｎｃｅ　ｕｓｅｄ　ｉｎ　ＳＲＡＰ　ａｎａｌｙｓｉｓ　

编号Ｃｏｄｅｓ　反向引物Ｒｅｖｅｒｓｅ　ｐｒｉｍｅｒｓ　编号Ｃｏｄｅｓ　正向引物Ｆｏｒｗａｒｄ　ｐｒｉｍｅｒｓ　

Ｅｍｌ　５／＿ＧＡＣＴＧＣＧＴＡＣＧＡＡＴＴＣＡＡ一３　Ｍｅ１　５　一ＴＧＡＧＴＣＣＡＡＡＣＣＧＧＡＴＡ一３　

Ｅｍ２　５　一ＧＡＣＴＧＣＧＴＡＣＧＡＡＴＴＣＴＧ一３　Ｍｅ２　５　一ＴＧＡＧＴＣＣＡＡＡＣＣＧＧＡＧＣ一３　

Ｅｍ３　５　一ＧＡＣＴＧＣＧＴＡＣＧＡＡＴＴＧＡＣ一３　Ｍｅ３　５＇－ＴＧＡＧＴＣＣＡＡＡＣＣＧＧＡＣＣ一３　

Ｅｒａ４　５＇－ＧＡＣＴＧＣＧＴＡＣＧＡＡＴＴＴＧＡ一３　Ｍｅ４　５　一ＴＧＡＧＴＣＣＡＡＡＣＣＧＧＡＣＡ一３　

Ｅｍ５　５　一ＧＡＣＴＧＣＧＴＡＣＧＡＡＴＴＡＡＣ一３　Ｍｅ５　５　一ＴＧＡＧＴＣＣＡＡＡＣＣＧＧＴＧＣ一３　

Ｅｍ６　５　一ＧＡＣＴＧＣＧＴＡＣＧＡＡＴＴＧＣＡ一３　Ｍｅ６　５　一ＴＧＡＧＴＣＣＡＡＡＣＣＧＧＡＧＡ一３　

Ｅｍ７　５＇－ＧＡＣＴＧＣＧＴＡＣＧＡＡＴＴＧＡＧ一３　Ｍｅ７　５＇－ＴＧＡＧＴＣＣＡＡＡＣＣＧＧＡＣＧ一３　

Ｅｍ８　５　一ＧＡＣＴＧＣＧＴＡＣＧＡＡＴＴＧＣＣ一３　Ｍｅ８　５　一ＴＧＡＧＴＣＣＡＡＡＣＣＧＧＡＡＡ一３　

Ｅｍ９　５　一ＧＡＣＴＧＣＧＴＡＣＧＡＡＴＴＴＣＡ一３　Ｍｅ９　５　一ＴＧＡＧＴＣＣＡＡＡＣＣＧＧＡＡＣ－３　

Ｅｍｌ０　５　一ＧＡＣＴＧＣＧＴＡＣＧＡＡＴＴＣＡＴ一３　

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８２　ＡＣＴＡ　ＰＲＡＴＡＣＵＬＴＵＲＡＥ　ＳｒＮＩＣＡ（ＶｏＩ．Ｉ７，Ｎｏ．３）　

果划分为９个评分等级以便分析，从左至右（１～９）　

泳道评分为５，９，６，４，１，８，７，３和２。因此，组合２　

为此正交试验所获得的最佳反应体系，其次为组合　

６。在２、６组合中聚合酶Ｔａｑ　ＤＮＡ用量均为１．０　

Ｕ，而Ｍｇ　、ｄＮＴＰ和引物均处于不同的水平。表　

明聚合酶Ｔａｑ　ＤＮＡ可能为影响狗牙根ＳＲＡＰ—　

ＰＣＲ反应的关键因素，当其用量为１．０　Ｕ时ＳＲＡＰ　

的扩增效果较好，此时特异谱带多态性高、背景干扰　

低、主带清晰、副带明显，因此确定第２组合为　

ｓＲＡＰ—ＰＣＲ的最佳反应体系，即２０　Ｌ反应体系　

中含有Ｍｇ　１．２５　ｍｍｏｌ／Ｌ、ｄＮＴＰ　２６０／￣ｍｏｌ／Ｌ、引　

物０．２／￣ｍｏｌ／Ｌ、Ｔａｑ　ＤＮＡ聚合酶１．０　Ｕ。　

２．２模板浓度确定　

图２　正交设计ＳＲＡＰ—ＰＣＲ反应体系扩增结果　

Ｆｉｇ．２　Ａｍｐｌｉｆｉｅｄ　ｒｅｓｕｌｔｓ　ｏｆ　ｅｖｅｒｙ　ｔｒｅａｔｍｅｎｔ　ａｃｃｏｒｄｉｎｇ　ｔｏ　

ｔｈｅ　ｏｒｔｈｏｇｏｎａｌ　ｄｅｓｉｇｎ　ｄｉａｇｒａｍ　

由于ＳＲＡＰ—ＰＣＲ体系中模板ＤＮＡ浓度不　

同，其扩增结果也存在一定的差异（图３）。在２０　Ｌ　

ＳＲＡＰ—ＰＣＲ反应体系中ＤＮＡ模板的量在１Ｏ～　

１２０　ｎｇ／２０“Ｌ虽均能扩增出条带，但模板浓度较低　

ｌ～９为表３处理组合编号；Ｍ：ＤＮＡ　Ｍａｒｋｅｒ；引物：Ｍｅ３和Ｅｍｌ组合　

ｌ一９：Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ　１—９　ｓｅｅ　ｔａｂｌｅ　３；Ｍ：ＤＡＮ　ｍａｒｋｅｒ；Ｐｒｉｍｅｒ：Ｃｏｍｂｉｎａ　

ｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｍｅ３　ａｎｄ　Ｅｍ】　

（＜４０　ｎｇ／２０　Ｌ）或较高（≥１００　ｎｇ／２０　Ｌ）时，造成　

扩增条带弥散、模糊不清。在４０，６０或８Ｏ　ｎｇ／２０　Ｌ　

时谱带清晰；这说明ＳＲＡＰ扩增模板ＤＮＡ浓度适　

应范围较宽。通过比较模板ＤＮＡ用量发现４０　ｎｇ／　

２０肚Ｌ为佳，既可获得好的扩增效果又节约ＤＮＡ用　

量。因此，该反应体系中ＤＮＡ模板浓度确定为４０　

ｎｇ／２０　Ｌ。　

２．３　ＳＲＡＰ—ＰＣＲ反应体系应用　

利用优化后的２０　Ｌ　ＳＲＡＰ反应体系：２　Ｌ　１０　

×ｂｕｆｆｅｒ、４０　ｎｇ模板ＤＮＡ、Ｍｇ　１．２５　ｍｍｏｌ／Ｌ、　

ｄＮＴＰ　２６０￣ｍｏｌ／Ｌ、引物０．２／ｌｍｏｌ／Ｌ、Ｔａｑ　ＤＮＡ聚　

合酶１．０　Ｕ，运用Ｍｅ２和Ｅｒａ４引物组合对９份狗牙　

根进行ＳＲＡＰ扩增，检测结果如图４所示：条带清　

图３不同模板ＤＮＡ浓度扩增结果　

Ｆｉｇ．３　Ｒｅｓｕｌｔｓ　ｏｆ　ＳＲＡＰ—ＰＣＲ　ｗｉｔｈ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ　ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ　

ｏｆ　ｔｅｍｐｌａｔｅ　ＤＮＡ　

晰，不仅扩增强，而且特异性高；同时反应体系具有　

较好的稳定性。９份优良坪用型狗牙根种质在分子　

水平上表现出明显的多态性差异，表明利用优化的　

Ｍ：ＤＮＡ　Ｍａｒｋｅｒ；１～９的ｓＲＡＰ—ＰＣＲ反应体系中模板ＤＮＡ分别为１ｏ，　

１５，２０，２５，４０，６０，８０，１００和１２０　ｎｇ／２０“Ｌ；引物：Ｍｅｌ和Ｅｍ２组合　

Ｍ：ＤＮＡ　ｍａｒｋｅｒ；Ｔｈｅ　ｔｅｍｐｌａｔｅ　ＤＮＡ　ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ　ｆｒｏｍ　１　ｔｏ　９　ａｒｅ　１０，１５，　

反映体系能够有效地反映出普通狗牙根之间的多态　

性，并有效地对不同狗牙根品种（种源）基因组进行　

ＳＲＡＰ扩增，这都证实该反应体系实用性强。因此，　

利用现有的ＳＲＡＰ标记可用于狗牙根遗传多样性　

分析、种质资源鉴定、ＱＴＬ定位等方面的研究。　

２Ｏ，２５，４Ｏ，６Ｏ，８０，１００和１２０　ｎｇ／２０“Ｌ；Ｐｒｉｍｅｒ：Ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｍｅｌ　ａｎｄ　

Ｅｍ　

本研究采用最佳体系对引物进行了筛选，共获得３４对谱带清晰、多态性丰富的引物（表５），为日后运用该标　

记进行普通狗牙根的遗传多样性分析奠定基础，检测结果如图５所示。　

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第１７卷第３期　草业学报２００８年　８３　

３讨论　

ＳＲＡＰ分子标记的原理是利用独特的引物设　

计对ＯＲＦｓ（ｏｐｅｎ　ｒｅａｄｉｎｇ　ｆｒａｍｅｓ，开放阅读框架）进　

３００　ｂｐ　

行扩增，上游引物长１７　ｂｐ，５　端的前１Ｏ　ｂｐ是一段　

２５０　ｂｐ　

填充序列，紧接着是ＣＣＧＧ，它们组成核心序列及３　

端３个选择碱基，对外显子进行特异扩增。下游引　

物长１８　ｂｐ，５　端的前１１　ｂｐ是一段填充序列，紧接　

着是ＡＡＴＴ，它们组成核心序列及３　端３个选择碱　

基，对内含子区域、启动子区域进行特异扩增，因个　

体不同以及物种的内含子、启动子与间隔长度不等　

而产生多态性ｌ３］。　

利用正交试验设计对ＰＣＲ反应体系中多因素　

进行筛选，可以较快的找到最优水平组合，从而避免　

单因素试验的不足。在正交设计试验过程中，每个　

因素间都会进行相互作用，如引物与模板结合后在　

Ｔａｑ酶作用下进行延伸，Ｔａｑ　ＤＮＡ聚合酶是Ｍｇ　

图４　优化的ｓＲＡＰ—ＰＣＲ反应体系对９份狗牙根的扩增结果　

的依赖性酶，受Ｍｇ　。‘浓度的影响，而Ｍｇ　。‘又受　

Ｆｉｇ．４　Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｒｅｓｕｌｔｓ　ｏｆ　９　ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ　Ｃ．ｄａｃｔｙｌｏｎ　ｇｅｒｍｐｌａｓｍ　

ｄＮＴＰ的拮抗作用。因此体系中任何一种因素发生　

ＤＮＡ　ｗｉｔｈ　ｔｈｅ　ｂｅｓｔ　ＳＲＡＰ—ＰＣＲ　ｒｅａｃｔｉｏｎ　ｓｙｓｔｅｍ　

变化都可能影响扩增的结果。对于本试验狗牙根　

１～９为表１编号对应的狗牙根；Ｍ：ＤＮＡ　ｍａｒｋｅｒ；引物：Ｍｅ２和Ｅｍ４组　

合Ｍ：Ｍａｒｋｅｒ；ｌ一９：ｌ一９　ｏｆ　Ｃ．ｄａｃｔｙｌｏｎ　ｓｅｅ　ｔａｂｌｅ　１；Ｐｒｉｍｅｒｓ：Ｃｏｍｂｉ一　

ＳＲＡＰ反应体系来讲，当Ｍｇ抖、ｄＮＴＰ、引物和　

１＂１ａｔｉＯｎ　ｏｆ　Ｍｅ２　ａｎｄ　Ｅｍ４　

ＤＮＡ浓度分别为１．２５　ｍｍｏｌ／Ｌ，２６０／￣ｍｏｌ／Ｌ，０．２　

／￣ｍｏｌ／Ｌ，４０　ｎｇ／２０　Ｌ和Ｔａｑ　ＤＮＡ聚合酶为１．０　Ｕ时可得到较好的扩增结果，并运用优化得到的最佳体系在引　

物组合作用下验证普通狗牙根代表性种质问的差异，从而证明了ＳＲＡＰ标记技术在狗牙根上的可行性。　

Ｂｕｄａｋ等　利用ＳＲＡＰ、ＲＡＰＤ、ＳＳＲ和ＩＳＳＲ　４种标记系统分析野牛草种子繁殖类型、营养繁殖类型以及二　

者之间的遗传多样性，研究结果证实，ＳＲＡＰ多态性丰富，适合应用于野牛草近缘栽培种遗传多样性研究。本研　

１Ｏ０　ｂ　

图５　ｓＲＡＰ—ＰＣＲ反应体系对部分引物筛选结果　

Ｆｉｇ．５　Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｒｅｓｕｌｔｓ　ｏｆ　２４　ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ　ｐｒｉｍｅｒｓ　ｗｉｔｈ　ｔｈｅ　ＳＲＡＰ—ＰＣＲ　ｒｅａｃｔｉｏｎ　ｓｙｓｔｅｍ　

１—２４为表４编号对应的引物分别为Ｍｅｌ与Ｅｍｌ～１０、Ｍｅ２与Ｅｍｌ～１Ｏ及Ｍｅ３和Ｅｍｌ～４组合；Ｍ：ＤＮＡ　ｍａｒｋｅｒ　

１－－２４：１－－２４　ｏｆ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ　ｐｒｉｍｅｒｓ　ｓｅｅ　ｔａｂｌｅ　４；Ｐｒｉｍｅｒ：Ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｍｅｌ　ａｎｄ　Ｅｍ１～１０・　

Ｍｅ２　ａｎｄ　Ｅｍｌ～１０，Ｍｅ３　ａｎｄ　Ｅｍｌ～４　ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ；Ｍ：ＤＮＡ　ｍａｒｋｅｒ　

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８４　ＡＣＴＡ　ＰＲＡＴＡＣＵＬＴＵＲＡＥ　ＳＩＮＩＣＡ（Ｖｏ１．１　７，Ｎｏ．３）　６／２００８　

Ｍｅ１　

Ｍｅ２　

Ｍｅ３　

Ｍｅ４　

Ｍｅ５　

Ｍｅ６　

Ｍｅ７　

Ｍｅ８　

Ｍｅ９　

注：√为条带清晰且多态性丰富的引物；一为条带模糊且多态性差的引物。　

Ｎｏｔｅ：√ｍｅａｎ　ｔｈｅ　ｐｒｉｍｅｒｓ　ｗｉｔｈ　ａｂｕｎｄａｎｔ　ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ　ｂａｎｄｓ；——ｍｅａｎ　ｔｈｅ　ｐｒｉｍｅｒｓ　ｗｉｔｈｏｕｔ　ａｂｕｎｄａｎｔ　ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ　ｂａｎｄｓ．　

究结果同样表明，ＳＲＡＰ应用于狗牙根植物具有丰富的多态性，今后可进一步在狗牙根种源鉴定、遗传多样性、优　

良性状标记和诱变后代鉴定等方面有更加广泛和深入应用。　

参考文献：　

Ｅｌｉ方宣钧，吴为人，唐纪良．作物ＤＮＡ标记辅助育种［Ｍ］．北京：科学出版社，２００２．１—９．　

［２］　郭海林，刘建秀，高鹤，等．结缕草属优良品系ＳＳＲ指纹图谱的构建［Ｊ］．草业学报，２００７，１６（２）：５３—５９．　

［３］Ｌｉ　Ｇ，Ｏｕｉｒｏｓ　Ｃ　Ｆ．Ｓｅｑｕｅｎｃｅ—ｒｅｌａｔｅｄ　ａｍｐｌｉｆｉｅｄ　ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ（ＳＲＡＰ），ａ　ｎｅｗ　ｍａｒｋｅｒ　ｓｙｓｔｅｍ　ｂａｓｅｄ　ｏｎ　ａ　ｓｉｍｐｌｅ　ＰＣＲ　ｒｅａｃｔｉｏｎ：　

Ｉｔｓ　ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ＂ｔｏ　ｍａｐｐｉｎｇ　ａｎｄ　ｇｅｎｅ　ｔａｇｇｉｎｇ　ｉｎ　Ｂｒａｓｓｉｃａ［Ｊ］．Ｔｈｅｏｒｅｔｉｃａｌ　ａｎｄ　Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，２００１，１０３：４５５—４６１．　

［４］Ｌｉｎ　ｚ，Ｈｅ　Ｄ，Ｚｈａｎｇ　Ｘ，ｅｔ　ａ１．Ｌｉｎｋａｇｅ　ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ　ａｎｄ　ｍａｐｐｉｎｇ　ＱＴＬ　ｆｏｒ　ｃｏｔｔｏｎ　ｆｉｂｒｅ　ｑｕａｌｉｔｙ　ｕｓｉｎｇ　ＳＲＡＰ，ＳＳＲ　ａｎｄ　ＲＡＰＤ［Ｊ］．　

Ｐｌａｎｔ　Ｂｒｅｅｄｉｎｇ，２００５，１２４（２）：１８０—１８７．　

［５］林忠旭，张献龙，聂以春，等．棉花ＳＲＡＰ遗传连锁图构建［Ｊ］．科学通报，２００３，４８（１５）：１６７６—１６７９．　

［６］　Ｒｉａｚ　Ａ，Ｌｉ　Ｇ，Ｑｕｒｅｓｈ　ｚ，ｅｔ　ａ１．Ｇｅｎｅｔｉｃ　ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ　ｏｆ　ｏｉｌｓｅｅｄ　Ｂｒａｓｓｉｃａ　ｎａｐｕｓ　ｉｎｂｒｅｄ　ｌｉｎｅｓ　ｂａｓｅｄ　ｏｎ　ｓｅｑｕｅｎｃｅ－ｒｅｌａｔｅｄ　ａｍｐｌｉｆｉｅｄ　ｐｏｌ—　

ｙｍｏｒｐｈｉｓｍ　ａｎｄ　ｉｔｓ　ｒｅｌａｔｉｏｎ　ｔｏ　ｈｙｂｒｉｄ　ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ［Ｊ］．Ｐｌａｎｔ　Ｂｒｅｅｄｉｎｇ，２００１，１２０（５）：４１１—４１５．　

［７］Ｆｅｒｒｉｏｌ　Ｍ，Ｐｉｃｏ　Ｂ，Ｎｕｅｚ　Ｆ．Ｇｅｎｅｔｉｃ　ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ　ｏｆ　ａ　ｇｅｒｍｐｌａｓｍ　ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ　ｏｆ　ｃｕｃｕｒｂｉｔａｐｅｐｏ　ｕｓｉｎｇ　ＳＲＡＰ　ａｎｄ　ＡＦＬＰ　ｍａｒｋｅｒｓ［Ｊ］．　

Ｔｈｅｏｒｅｔｉｃａｌ　ａｎｄ　Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，２００３，１０７（２）：２７１－２８２．　

［８］文雁成，王汉中，沈金雄，等．用ＳＲＡＰ标记分析中国甘蓝型油菜品种的遗传多样性和遗传基础［Ｊ］．中国农业科学，２００６，　

３９（２）：２４６－２５０．　

［９］王刚，潘俊松，李效尊，等．黄瓜ＳＲＡＰ遗传连锁图的构建及侧枝基因定位［Ｊ］．中国科学（Ｃ辑），２００４，３４（６）：５１２—５１６．　

［１０］Ｌｉ　Ｇ，Ｇａｏ　Ｍ，Ｑｕｉｒｏｓ　Ｃ　Ｅ．Ｇｅｎｅ　ｆｏｒ　ｇｅｎｅ　ａｌｉｇｎｍｅｎｔ　ｂｅｔｗｅｅｎ　ｔｈｅ　Ｂｒａｓｓｉｃａ　ａｎｄ　ａ　ｒｏｂｉｄｏｐｓｉｓ　ｇｅｎｏｍｅｓ　ｂｙ　ｄｉｒｅｃｔ　ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｏｍｅ　

ｍａｐｐｉｎｇ［Ｊ］．Ｔｈｅｏｒｅｔｉｃａｌ　ａｎｄ　Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，２００３，１０７（１）：１６８—１８０．　

Ｅｌ１］Ｇａｔｓｃｈｅｔ　Ｊ　Ｒ，Ｔａｌｉａｆｅｒｒｏ　Ｃ　Ｍ，Ａｎｄｅｒｓｏｎ　Ｊ　Ａ，ｅｔ　ａ１．‘Ｃｏｌｄ　ａｃｃｌｉｍａｔｉｏｎ　ａｎｄ　ａｌｔｅｒａｔｉｏｎｓ　ｉｎ　ｐｒｏｔｅｉｎｓ　ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ　ｉｎ　ｂｅｒｍｕｄａｇｒａｓｓ　

ｃｒｏｗｎｓ［Ｊ］．Ｈｏｒｔ　Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９９４，１１９（３）：４７７—４８０．　

［１２－１谭继清，谭志坚．新编中国草坪与地被［Ｍ］．中国：重庆出版社，２０００．４６—４９．　

［１３］Ｈａｒｌａｎ　Ｊ　Ｒ，Ｄｅｗｅｔ　Ｊ　Ｍ　Ｊ．Ｓｏｕｒｃｅｓ　ｏｆ　ｖｉｒａｔｉｏｎ　ｉｎ　Ｃｙｎｏｄｏｎ　ｄａｃｔｙｌｏｎ（Ｌ．）Ｐｅｒｓ［Ｊ］．Ｃｒｏｐ　Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９９６，３６：７４８—７７４．　

［１４］Ｔａｌｉａｆｅｒｒｏ　Ｃ　Ｍ．Ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ　ａｎｄ　ｖｕｌｎｅｒａｂｉｌｉｔｙ　ｏｆ　Ｂｅｒｍｕｄａ　ｔｕｒｆｇｒａｓｓ　ｓｐｅｃｉｅｓ［Ｊ］．Ｃｒｏｐ　Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９９５，３５：３２７—３３１．　

［１５－１刘建秀，郭爱桂，郭海林．我国狗牙根种质资源形态变异及形态类型划分［Ｊ］．草业学报，２００３，１２（６）：．９９—１０４．　

［１６］刘建秀，郭爱佳，郭海林．我国狗牙根种质资源匍匐性的研究［Ｊ］．中国草地，２００２，２４（２）：３６—３８．　

［１７］刘建秀，贺善安，刘永东．华东地区狗牙根外部形态变异规律的研究［Ａ］．中国草地科学进展［Ｍ－１．北京：中国农业大学出　

版社，１９９８．　

维普资讯

第１７卷第３期　草业学报２００８年　８５　

Ｄｓ］　

Ｒｅｙｅｓ　Ｂ　Ｇ，Ｔａｌｉａｆｅｒｒｏ　Ｃ　Ｍ，Ａｎｄｅｒｓｏｎ　Ｍ　Ｐ，ｅｔ　ａ１．Ｉｎｄｕｃｅｄ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｃｌａｓｓ　ＩＩ　ｃｈｉｔｉｎａｓｅ　ｇｅｎｅ　ｄｕｒｉｎｇ　ｃｏｌｄ　ａｃｃｌｉｍａｔｉｏｎ　

ａｎｄ　ｄｅｈｙｄｒａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｂｅｒｍｕｄａｇｒａｓｓ（Ｃｙｎｏｄｏｎ　ｓｐ．）［Ｊ］．Ｔｈｅｏｒｅｔｉｃａｌ　ａｎｄ　Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，２００１，１０３（２—３）：２９７—３０６．　

［１９］　

Ｐｒａｔｔ　Ｒ　Ｇ．Ａｎ　ｅｘｃｉｓｅｄ—ｌｅａｆ　ｉｎｙｃｕｌａｔｉｏｎ　ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ　ｆｏｒ　ｅｖａｌｕａｔｉｎｙ　ｈｏｓｔ—ｙａｔｈｏｇｅｎ　ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ　ａｎｄ　ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ　ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ　ｏｆ　ｂｅｒ—　

ｍｕｄａｇｒａｓｓ　ｇｅｎｏｔｙｐｅｓ　ｔｏ　ｄｅｍａｔｉａｃｅｏｕｓ　ｈｙｐｈｏｍｙｃｅｔｅｓ［Ｊ］．Ｐｈｙｔｏｐａｔｈｏ１ｏｇｙ，２００３，９３（１２）：１５６５—１５７１．　

　Ｍ，Ｐｉａｎｏ　Ｅ，Ｃａｒｒｏｎｉ　Ａ　Ｍ，ｅｔ　ａ１．Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｎａｔｉｖｅ　ｂｅｒｍｕｄａｇｒａｓｓ（Ｃｙｎｏｄｏｎ　ｄａｃｔｙｌｏｎ）ｇｅｒｍｐｌａｓｍ　ｆｒｏｍ　Ｉｔａｌｙ　ｆｏｒ　

［２０］　

Ｒｏｍａｎｉ

ｔｈｅ　ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ　ｏｆ　ａｄａｐｔｅｄ　ｔｕｒｆｇｒａｓｓ　ｃｕｌｔｉｖａｒｓ［Ｊ］．Ａｃｔａ　Ｈｏｒｔｉｃｕｌｔｕｒａｅ，２００４，６６１　３８１—３８６．　

［２１］　

王玉刚　

阿不来提，齐曼．两种狗牙根品种对干旱胁迫反应的差异ｌ－Ｊ］．草业学报，２００６，１５（４）；５８—６４．　

［２２］　

王友保　

张莉，刘惠，等．铜对狗牙根生长及活性氧清除系统的影响［Ｊ］．草业学报，２００７，１６（１）：５２—５７　

［２３］　

刘建秀　

刘永东，贺善安，等．南京狗牙根的选育［Ｊ］．草业科学，２００３，２１（１１）：８４—８５．　

［２４］　

郭海林　

刘建秀，郭爱桂，等．中国狗牙根染色体数变异研究初报广Ｊ］．草地学报，２００２，３：６９—７３．　

［２５］　

Ｄａｂｏ　Ｓ　Ｍ．Ｂｅｒｍｕｄａｇｒａｓｓ　ｃｕｌｔｉｖａｒ　ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｂｙ　ｕｓｅ　ｏｆ　ｉｓｏｅｎｚｙｍｅ　ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｔｉｃ　ｐａｔｔｅｒｎｓ［Ｊ］．Ｅｕｐｈｙｔｉｃａ，１９９０，５１：２５—　

３１．　

［２６］　

Ｖｅｒｍｅｕｌｅｎ　Ｐ　Ｈ．Ｓｔａｃｈ　ｇｅｌｅｌｅｃｔｒｏｎｐｈｏｒｅｓｉｓ　ｕｓｅｄ　ｆｏｒ　ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｔｕｒｆｔｙｐｅ　Ｃｙｎｏｄｏｎ　ｄａｃｔｙｌｏｎ　ｇｅｎｅｔｙｐｅ［Ｊ］．Ｃｒｏｐ　Ｓｃｉｅｎｃｅ，　

１９９１，３１：２３３—２３７．　

［２７］　何惠琴，干友民，李绍才。等．不同温度下野生狗牙根过氧化物酶同工酶分析［Ｊ］．中国草地学报，２００６，２８（５）：７２—７６．　

ａｆｅｒｒｏ　Ｃ　Ｍ，Ｂａｉ　Ｇ　Ｈ。ｅｔ　ａ１．Ｇｅｎｅｔｉｃ　ａｎａｌｙｓｉｓ　ｏｆ　Ｃｈｉｎｅｓｅ　Ｃｙｎｏｄｏｎ　ａｃｃｅｓｓｉｏｎｓ　ｂｙ　ｆｌｏｗ　ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ　ａｎｄ　ＡＦＩ　Ｐ　

［２８］　

Ｗｕ　Ｙ　Ｑ，Ｔａｌｉ

ｍａｒｋｅｒｓ［Ｊ］．Ｃｒｏｐ　ｓｃｉｅｎｃｅ，２００６，４６（２）：９１７－９２６．　

　Ｃ　Ｍ，Ｓｃｉａｒａ　Ｅ　Ｂ，Ｅｓｔｉｌｌ　Ｊ　Ｃ，ｅｔ　ａ１．Ａ　ｆｒａｍｅｗｏｒｋ　ｌｉｎｋａｇｅ　ｍａｐ　ｏｆ　ｂｅｒｍｕｄａｇｒａｓｓ（Ｃｙｎｏｄｏｎ　ｄａｃｔｙｌｏｎ×Ｃ．ｔｒａｎｓｖａａｌｅｎ—　

［２９］　

Ｂｅｔｈｅｌ

ｓｉｓ）ｂａｓｅｄ　ｏｎ　ｓｉｎｇｌｅ－ｄｏｓｅ　ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ　ｆｒａｇｍｅｎｔｓ［Ｊ］．Ｔｈｅｏｒｅｔｉｃａｌ　ａｎｄ　Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，２００６，１１２（４）：７２７—７３７．　

［３０］　刘伟．西南区野生狗牙根种质资源遗传多样性与坪用价值研究ＶＤ］．雅安：四川农业大学博士学位论文，２００６．　

［３１］　

Ｗａｎｇ　Ｍ　Ｉ　，Ｂａｒｋｌｅｙ　Ｊ　Ｋ，Ｙｕ　Ｊ　Ｋ，ｅｔ　ａ１．Ｔｒａｎｓｆｅｒ　ｏｆ　ｓｉｍｐｌｅ　ｓｅｑｕｅｎｃｅ　ｒｅｐｅａｔ（ＳＳＲ）ｍａｒｋｅｒｓ　ｆｒｏｍ　ｍａｊｏｒ　ｃｅｒｅａｌ　ｃｒｏｐｓ　ｔｏ　ｍｉｎｏｒ　

ｇｒａｓｓ　ｓｐｅｃｉｅｓ　ｆｏｒ　ｇｅｒｍｐｌａｓｍ　ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ　ａｎｄ　ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ［Ｊ］．Ｐｌａｎｔ　Ｇｅｎｅｔｉｃ　Ｒｅｓｏｕｒｃｅｓ，２００５，３（１）：４５—５７．　

［３２］　刘伟，张新全，李芳，等．西南地区野生狗牙根遗传多样性的ＩＳＳＲ标记与地理来源分析ｌ－Ｊ］．草业学报，２００７，１６（３）：５５—　

６１．　

［３３］　

Ｂｕｄａｋ　Ｈ，Ｓｈｅａｒｍａｎ　Ｒ　Ｃ，Ｐａｒｍａｋｓｉｚ　Ｉ，ｅｔ　ａ１．　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｂｕｆａｌｏｇｒａｓｓ　ｇｅｒｍｐｌａｓｍ　ｕｓｉｎｇ　ｓｅｑｕｅｎｃ　ｒｅｌａｔｅｄ　

ａｍｐｌｉｆｉｅｄ　ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ　ｍａｒｋｅｒｓ［Ｊ］．Ｔｈｅｏｒｅｔｉｃａｌ　ａｎｄ　Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，２００４，１０８（２）：３２８—３３４．　

　ｏｆ　ｓｅｅｄｅｄ　ａｎｄ　ｖｅｇｅｔａｔｉｖｅ　ｂｉｏｔｙｐｅ　ｂｕｆａｌｏｇｒａｓｓｅｓ　ｂａｓｅｄ　ｏｒ　ｐｈｙｌｏｇｅ—　

［３４］　

Ｂｕｄａｋ　Ｈ，Ｓｈｅａｒｍａｎ　Ｒ　Ｃ，Ｐａｒｍａｋｓｉｚ　Ｉ．Ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ　ａｎａｌｙｓｉｓ

ｎｅｔｉｃ　ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐ　ｕｓｉｎｇ　ＩＳＳＲｓ，ＳＳＲｓ，ＲＡＰＤｓ，ａｎｄ　ＳＲＡＰｓ［Ｊ］．Ｔｈｅｏｒｅｔｉｃａｌ　ａｎｄ　Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，２００４，１０９（２）：２８０—２８８．　

Ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ　ｆｏｒ　ＳＲＡＰ－－ＰＣＲ　ｓｙｓｔｅｍ　ｉｎ　Ｃｙｎｏｄｏｎ　ｄａｃｔｙｌｏｎ　ａｎｄ　ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ　ｏｆ　ｐｒｉｍｅｒｓ　

ＷＡＮＧ　Ｚｈｉ—ｙｏｎｇＩ’。，ＹＵＡＮ　Ｘｕｅ—ｊ　ｕｎ。，ＬＩＵ　Ｊｉａｎ—ｘｉｕ。，ＧＵＯ　Ｈａｉ—ｌｉｎ。　

（１．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ　ｏｆ－Ｈｏｒｔｉｃｕｌｔｕｒｅ，Ｎａｎｊｉｎｇ　Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ　Ｕｎｉｖｅｒｉｓｔｙ，Ｎａｎｊｉｎｇ　２１００９５，Ｃｈｉｎａ；２．Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ　ｏｆ　

Ｂｏｔａｎｙ，Ｊｉａｎｇｓｕ　Ｐｒｏｖｉｎｃｅ　ａｎｄ　Ｃｈｉｎｅｓｅ　Ａｃａｄｅｍｙ　ｏｆ　Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｎａｎｊｉｎｇ　２１００１４，Ｃｈｉｎａ）　

Ａｂｓｔｒａｃｔ：ｃｙｎｏｄｏｎ　ｄａｃｔｙｌｏｎ　ｇｅｎｏｍｉｃ　ＤＮＡ　ｆｒｏｍ　ｌｅａｆ　ｔｉｓｓｕｅ　ｗａｓ　ｉｓｏｌａｔｅｄ　ａｃｃｏｒｄｉｎｇ　ｔｏ　ｔｈｅ　ＳＤＳ　ｐｒｏｃｅｄｕｃｅ．Ａｎ　ｏｒ—　

ｔｈｏｇｏｎａｌ　ｄｉａｇｒａｍ　ａｓ　ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ　ｄｅｓｉｇｎ　ｗａｓ　ａｐｐｌｉｅｄ　ｔｏ　ｓｔｕｄｙ　ｔｈｅ　ｅｆｆｅｃｔｓ　ｏｆ　ｔｈｒｅｅ　ｌｅｖｅｌｓ　ｏｆ　Ｍｇ抖，ｄＮＴＰ，ｐｒｉｍ—　

ｅｒｓ　ａｎｄ　Ｔａｑ　ＤＮＡ　ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ　ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ　ｏｎ　ｔｈｅ　ｒｅａｃｔｉｏｎ　ｓｙｓｔｅｍ　ｏｆ　ＳＲＡＰ，ａｎｄ　ｔｈｅ　ＳＲＡＰ　ｒｅａｃｔｉｏｎ　ｓｙｓｔｅｍ　ｗａｓ　

ｆｉｎａｌｌｙ　ｏｐｔｉｍｉｚｅｄ　ｂｙ　ａｎａｌｙｚｅｄ　ｅｆｆｅｃｔｓ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓ　ｏｆ　ＤＮＡ　ｔｅｍｐｌａｔｅ．Ｔｈｅ　ｒｅｓｕｌｔｓ　ｓｈｏｗｅｄ　ｔｈａｔ　ａｌｌ　ｆａｃｔｏｒｓ　

ｈａｄ　ｔｈｅ　ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ　ｅｆｆｅｃｔ　ｏｎ　ｔｈｅ　ｒｅｓｕｌｔ　ｏｆ　ＳＲＡＰ—ＰＣＲ．Ａｎｄ　ａ　ｂｅｔｔｅｒ　ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｏｆ　ＳＲＡＰ—ＰＣＲ　ｗａｓ　ｏｂｔａｉｎｅｄ　

ｗｉｔｈ　ｔｈｅ　ｒｅａｃｔｉｏｎ　ｓｙｓｔｅｍ　ｆｏｒ　Ｃ．ｄａｃｔｙｌｏｎ　ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ　２“Ｌ　１０×ｂｕｆｆｅｒ，４０　ｎｇ　ｇｅｎｏｍｉｃ　ｔｅｍｐｌａｔｅｓ　ＤＮＡ，１．２５　

ｍｍｏｌ／Ｌ　Ｍｇ计，２６０　ｕｍｏｌ／Ｌ　ｄＮＴＰ，０．２／２ｍｏｌ／Ｌ　Ｐｒｉｍｅｒ，１．０　Ｕ　Ｔａｑ　ＤＮＡ　ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ　ｉｎ　ｔｈｅ　ｔｏｔａｌ　ｖｏｌｕｍｅ　ｏｆ　２Ｏ　

“Ｌ．Ａｔ　ｔｈｅ　ｓａｍｅ　ｔｉｍｅ，３４　ｐｒｉｍｅｒ　ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎｓ　ｗｅｒｅ　ｓｅｌｅｃｔｅｄ　ｗｉｔｈ　ｔｈｅ　ｏｐｔｉｍｉｚｅｄ　ｓｙｓｔｅｍ　ａｍｏｎｇ　９０　ｐｒｉｍｅｒ　ｃｏｍ—　

ｂｉｎａｔｉｏｎｓ。ｗｈｉｃｈ　ｈａｄ　ａｂｕｎｄａｎｔ　ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ　ｂａｎｄｓ．Ｔｈｉｓ　ｓｔｕｄｙ　ｗｏｕｌｄ　ｂｅ　ｃｏｎｄｕｃｔｅｄ　ｔｏ　ｔｈｅ　ｏｐｔｉｍｉｚｅｄ　ＳＲＡＰ—　

ＰＣＲ　ｓｙｓｔｅｍ　ａｎｄ　ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ　ｏｆ　ｐｒｉｍｅｒｓ　ｗｈｉｃｈ　ｗｏｕｌｄ　ｐｌａｙ　ａｎ　ｉｍｐｏｒｔａｎｔ　ｒｏｌｅ　ｉｎ　Ｃ．ｄａｃｔｙｌｏｎ　ｇｅｎｅｔｉｃ　ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ　ａｎａｌｙ—　

ｓｉｓ，ｍａｐ　ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ，ｇｅｎｅ　ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｉｍｐｏｒｔａｎｔ　ｔｒａｉｔｓ，ｇｅｒｍｐｌａｓｍ　ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｉｎ　Ｃ．ｄａｃｔｙｌｏｎ　ｗｉｔｈ　

ＳＲＡＰ　ｍａｒｋｅｒｓ．　

Ｋｅｙ　ｗｏｒｄｓ：Ｃｙｎｏｄｏｎ　ｄａｃｔｙｌｏｎ；ＳＲＡＰ　ｍａｒｋｅｒ；ｏｒｔｈｏｎｇｏｎａｌ　ｄｅｓｉｇｎ；ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｓｙｓｔｅｍ；ｐｒｉｍｅｒｓ