2024年3月8日发(作者：谷梁飞光)
环球中医药2022年7月第15卷第7期摇GlobalTraditionalChineseMedicine,July2022,Vol郾15,No郾7摇1165·中药研究·羚羊角水解液的氨基酸薄层鉴别与含量测定刘妍摇刘静摇陈扬摇赵苑伶摇张雪摇陈林珍摇赵崇军摇马志强揖摘要铱摇目的摇建立羚羊角水解液中氨基酸类成分的薄层鉴别方法并测定其中游离氨基酸的含量,为羚羊角药材的质量控制提供依据。方法摇采用硅胶G薄层板,以十二烷基硫酸钠—正丁醇—正己烷—水按质量比(1.5颐7.0颐1.0颐1.7)组成的微乳液为展开剂,分别定性鉴别羚羊角水解液中的5种氨基酸,并对建立的薄层方法进行耐用性考察;采用异硫氰酸苯酯柱前衍生结合高效液相色谱法对水解液中16种游离氨基酸进行含量测定,并进行方法学考察。结果摇改变温度(4益~30益)、相对湿度(32%~88%)、微乳液含水量(10%~20%)等条件均能分离鉴别出羚羊角水解液中的5种氨基酸;16种氨基酸能完全分离,供试品溶液在24小时内稳定,平均回收率(n=6)在96.70%~103.02%,相对标准偏差均<3%,其中亮氨酸含量最高,组氨酸含量最低。结论摇建立的微乳薄层方法稳定、耐用性好,高效液相色谱法经方法学验证亦适用于羚羊角水解液中16种游离氨基酸的含量测定,可用于羚羊角药材的质量控制。揖关键词铱摇羚羊角水解液;摇含量测定;摇微乳薄层色谱;摇氨基酸;摇高效液相色谱揖中图分类号铱摇R282.5摇揖文献标识码铱摇A摇doi:10.3969/.1674鄄1749.2022.07.010TLCidentificationandcontentdeterminationofaminoacidsinthehydrolysateofantelopehornLIUYan,LIUJing,CHENYang,ZHAOYuanling,ZHANGXue,CHENLinzhen,ZHAOChongjun,MAZhiqiangBeijingKeyLabforQualityEvaluationofChineseMateriaMedica,SchoolofChineseMateriaMedica,BeijingUniversityofChineseMedicine,Beijing100102,ChinaCorrespondingauthor:MAZhiqiang,E鄄mail:mazq1968@揖Abstract铱摇Objective摇Toestablishathinlayerchromatography(TLC)methodforidentifyingaminoacidsinantelopehornhydrolysateanddeterminethecontentoffreeaminoacids,s摇Usingsilicagel鄄Gplate,SDS鄄n鄄butanol鄄hexane鄄wateratmassratio(1.5颐7.0颐1.0颐1.7)asthedevelopingagent,5aminoacidsinantelopehornThecontentof16freeaminoacidswasdeterminedbypre鄄columnderivatizationofphenylisothiocyanateandhighperformanceliquidchromatography,s摇Whentheconditionssuchastemperature(4益~30益),therelativehumidity(32%~88%)andwatercontent(10%~20%)ofthemicroemulsionwerechanged,5aragerecoverieswere96.70%~103.02%,andtheRSDswerelessthan3%.Thecosion摇Theestablished作者单位:100102摇北京中医药大学中药学院中药品质评价北京市重点实验室[刘妍(硕士研究生)、刘静(硕士研究生)、陈扬(硕士研究生)、赵苑伶(硕士研究生)、张雪(硕士研究生)、陈林珍(硕士研究生)、赵崇军、马志强]作者简介:刘妍(1996-),2018级在读硕士研究生。研究方向:中药品质评价。E鄄mail:2466583576@通信作者:马志强(1968-),博士,研究员,硕士生导师。研究方向:中药药效物质基础研究。E鄄mail:mazq1968@
摇1166环球中医药2022年7月第15卷第7期摇GlobalTraditionalChineseMedicine,July2022,Vol郾15,No郾hperformanceliquidchromatographymethodverifiedbymethodologyisalsosuitableforthedeterminationof16freeaminoacidsinantelopehornhydrolysate,aphy;摇Aminoacid;摇Highperformanceliquidchromatography揖Keywords铱摇Antelopehornhydrolysate;摇Contentdetermination;摇Microemulsionthinlayerchro鄄摇Linnaeus摇羚羊角为牛科动物赛加羚羊Saigatatarica农本草经的角》,在我国已有,是传统名贵中药材之一2000多年的药用历史,始载于。《神羚羊角性寒,味咸,归肝、心经,具有平肝息风、清肝明目、散血解毒的功效,主治肝风内动、惊痫抽搐、妊娠子痫、高热痉厥、癫痫发狂、头痛眩晕、目赤翳障、温毒发斑、痈肿疮毒[1]解液经加工而成的现代药物制剂。羚羊角颗粒是由羚羊角水,氨基酸是羚羊角的主要成分之一[2鄄3]乳液来分离鉴别动物中的氨基酸。目前笔者未见国内文献用微(microemulsion展开剂是微乳液thin,因其具有较大的增溶量和超低界layerchromatography,METLC)。微乳薄层色谱的面张力,能让难以分离的复杂体系和难溶化合物得以分离[4鄄6]酮[8鄄11]、糖类,近些年来已经成功运用于生物碱[7][12]、氨基酸[13]等多种化合物的分离鉴、黄别中。为了更好地对羚羊角水解液中的氨基酸进行dodecyl分析,本实验采用十二烷基硫酸钠(sodium比(1.5sulfate,SDS)—颐7.0颐1.0颐1.正丁醇7)为展开剂对羚羊角水解—正己烷—水按质量液中的氨基酸进行定性鉴别,用异硫氰酸苯酯柱前衍生法对水解液中16种游离氨基酸进行含量测定,进一步丰富了微乳液应用于氨基酸薄层鉴别研究的方法,也为羚羊角药材的质量控制提供研究基础。1摇仪器与材料1.1摇实验仪器十万分之一分析天平(MettlerToledo公司),循1100环水式多用真空泵型旋转蒸发仪(,郑州长城科工贸有限公司水浴锅(上海爱朗仪器有限公),N鄄司Thermo),SorvallFisherSTScientific8R台式公司高),速硅胶冷冻G离板心(100机(美mm伊国20190322、2mm,青岛海洋化工厂分厂,批号:20181205、20200410),1),硅胶G板(企业A,批号双槽滋L、2滋L定量点样毛细管(润泽康),:DHG鄄9023AP鄄1型薄层色谱展开缸(100mm伊100mm),设备有限公司型电热恒温鼓风干燥箱),高效液相色谱仪(Waters(上海精宏实验2695)包括2695四元梯度泵,自动进样器,2998PDA检测器,在线脱气机,柱温箱,Empower色谱工作站。1.2摇实验药物羚羊角对照药材,中国食品药品检定研究院,批号B,:PS210423鄄04;羚羊角粉鉴定为羚羊角粉批号:20201011,(过200目筛),企业;羚羊角水解液由北京中医药大学杨瑶珺教授,实验室自制。1.3摇实验试剂99%限公司16,种氨基酸对照品购自上海源叶生物科技有天冬氨酸Asp(批号:S24A8I34463,纯度逸丝氨酸)、谷氨酸Ser(批号Glu(:S04J9I51507,批号:S27M6G1,纯度纯度逸98%逸99%)、甘氨)、酸His(Gly(批号(批号:Z19A9H59384,:SM0315GA14,纯度纯度逸98%逸99%)、精氨酸)、组氨Arg酸号批号:MKBD3032V,纯度逸98%)、苏氨酸Thr(批S20A6G17672,:S01F4G1,纯S30J6G1,纯度度逸98%)、丙氨酸Ala(批号:SM0503GE13,纯度S06D8I49809,纯逸度逸99%逸98%99%)、)、)、酪脯缬氨氨酸Pro(批号:氨酸酸TyrVal((批批号号::SLBK1770V,SM0503GD13,纯纯度S10D9I76995,纯度度逸逸98%逸98%98%)、)、)、异甲硫氨酸亮亮氨氨酸酸Met(批号:LeuIle((批批号号::H20N8H48638,纯度S26A8I34751,纯度逸98%逸98%)、)、苯丙氨酸赖氨酸PheLys(批号:药股份有限公司纯度,批号逸98%:1;)。SDS,购自湖南尔康制(批号:正丁醇、无水乙酸钠、浓盐酸、乙酸(分析纯),均购自北京化工20170215;厂,批号依次为:20170816、20180605、20180712、设备国际有限公司乙腈、正己烷,批号依次为(色谱纯:190263、192565;),购自费希尔控制三乙胺(分析纯),购自上海麦克林生化科技有限公司,批号:C10487468;异硫氰酸苯酯购自博纳艾杰尔,批号:BCBB1912V;茚三酮(分析纯)、乙醇(分析纯),均购自于福晨(天津)化学试剂有限公司,批号依次为:20190402、20210108。2摇方法与结果22..1摇1.1摇羚羊角水解液的薄层色谱分析对照品溶液的制备摇精密称取L鄄天冬氨
环球中医药2022年7月第15卷第7期摇GlobalTraditionalChineseMedicine,July2022,Vol郾15,No郾7摇1167酸、L鄄谷氨酸、L鄄缬氨酸、L鄄亮氨酸、L鄄赖氨酸对照品70%适量甲醇,分别、90%加入甲醇制成50%甲0.醇3、50%mg/mL甲的对照品溶液醇、70%甲醇羊角对照药材及羚羊角粉(过200目筛)1.精密称取羚。、2.1.2摇对照药材、供试品溶液的制备摇0g置于100取3mL小时圆底烧瓶中,抽滤。第二次加入,第一次加入40mL40水mL,回流提取水,回流提2小时,抽滤,合并两次滤液。剩余药渣中加入16mL2加入调成糊状的氢氧化钙mol/L硫酸溶液回流水解,调6小时pH值为,抽滤后4,沉淀,滤液中24小时,抽滤得其滤液,将之与水提取滤液合并浓缩后进行60%醇沉,在4益下沉淀24小时。抽滤,浓缩,用水定容至10mL。再以5000r/分钟的转速离心20溶液分钟得其上清液即为羚羊角水解液的供试品。2.己烷1.3摇、水按质量比微乳液展开剂的配制(1.5颐7.0颐1.摇0将颐、7)混匀即得含正丁醇、正水量15%的微乳液[14鄄15]2.。《天冬氨酸中华人民共和国药典1.4摇羚羊角水解液的薄层鉴别、谷氨酸、缬氨酸(四部摇参考2020版、亮氨酸)》通则、赖氨酸对照品0502[16],吸取溶液各2滋L,吸取供试品溶液及对照药材溶液0.胶5G滋L薄层板上分别点于事先在,以含水量为110益15%活化半小时的同一硅的微乳液上行展开,展距为8cm时将薄层板取出,晾干,喷以2%茚三酮乙醇溶液,在105益烘至斑点显色清晰。自制8批羚羊角水解液的薄层图谱见图1。羚羊角水解液除与对照品色谱相应位置上显集中且圆的斑点外,与对照药材所示色谱条带一致,分离效果佳,天冬氨酸、谷氨酸、缬氨酸、亮氨酸、赖氨酸的Rf值依次为0.20、0.14、0.50、0.61、0.33。2.2摇羚羊角水解液的薄层耐用性考察2.液2.、对照品溶液按1摇不同薄层板的分离效果考察2.1.4项下方法点于不同厂家薄摇取供试品溶层板(企业A、青岛海洋化工厂分厂)及同一厂家不同批号薄层板(青岛海洋化工厂分厂,批号:20181205、20190322、20190802),化工厂分厂所制薄板分离效果要优于企业见图2。青岛海洋A。2.对照品溶液按2.2摇不同温度的分离效果考察2.1.4项下方法点于同一批号薄层摇取供试品溶液、板,分别置于4益与30益的环境下展开,见图3。羚羊角水解液的色谱图在4益与30益下大致一致。注:1天冬氨酸;2谷氨酸;3缬氨酸;4亮氨酸;5赖氨酸;6羚羊角对照药材;7~14自制8批羚羊角水解液。图1摇自制8批羚羊角水解液的薄层色谱图注:1天冬氨酸;2谷氨酸;3缬氨酸;4亮氨酸;5赖氨酸;6~8自制3批羚羊角水解液。A:企业A;B、C、D:青岛海洋化工厂分厂,B:批号为20181205,C:批号为20190322,D:批号为20190802。图2摇羚羊角水解液在不同硅胶G板的薄层色谱图注:1天冬氨酸;2谷氨酸;3缬氨酸;4亮氨酸;5赖氨酸;6~8自制3批羚羊角水解液。A:温度4益;B:温度30益。图3摇羚羊角水解液在不同温度下的薄层色谱图2.对照品溶液按2.3摇不同湿度的分离效果考察2.1.4项下方法点于同一批号薄层摇取供试品溶液、板,分别置于相对湿度为32%、58%、88%的环境下
摇1168环球中医药2022年7月第15卷第7期摇GlobalTraditionalChineseMedicine,July2022,Vol郾15,No郾7展开,结果见图4。羚羊角水解液的色谱图在相对湿度32%、58%、88%环境下基本相同。注:1天冬氨酸;2谷氨酸;3缬氨酸;4亮氨酸;5赖氨酸;6~8自制3批羚羊角水解液。A:相对湿度32%;B:相对湿度58%;C:相对湿度88%。图4摇羚羊角水解液在不同湿度下的薄层色谱图2.液2.、对照品溶液按4摇不同点样量的分离效果考察2.1.4项下方法点于同一薄层板摇取供试品溶上,供试品点样量由左往右依次为0.5滋L、1滋L、1.0.5滋L,结果见图5。羚羊角水解液最佳点样量为明显5滋L,。其次为1滋L,当点样量为1.5滋L时拖尾摇摇摇摇摇摇注6~:18点样量依次为天冬氨酸;2谷氨酸0.5滋L、1;3缬氨酸滋L、1.;45亮氨酸滋L。;5赖氨酸;图5摇羚羊角水解液在不同点样量下的薄层色谱图2.试品溶液2.5摇不同含水量微乳液的分离效果考察、对照品溶液按2.1.4项下方法点于同一摇取供批号薄层板上,在固定SDS、正丁醇、正己烷质量比为1.5颐7.0颐1.0的配比下,分别用含水量为10%、13%、15%、17%、20%的微乳液展开,结果见图6。各含水量图谱基本一致。注:1天冬氨酸;2谷氨酸;3缬氨酸;4亮氨酸;5赖氨酸;6~8自制3批羚羊角水解液。A:含水量10%;B:含水量13%;C:含水量15%;D:含水量17%;E:含水量20%。图6摇羚羊角水解液在不同含水量微乳液下的薄层色谱图2.3摇羚羊角水解液中游离氨基酸的分析2.用柱3.1摇(博纳艾杰尔色谱分析条件,4.6伊250摇Venusilmm,5滋m),AA氨基酸分析专柱温40益,样品室温度为4益,流速1.0mL/分,检测波长254乙酸钠nm,(pH一次进样量6.5)—乙腈10(93滋L。颐流动相7),流动相A:0.B1为mol80%/L乙腈,梯度洗脱:0分钟:0%B;14分钟:9.5%B;22分钟:19.5%B;37分钟:30.6%B;41分钟:31.6%2.B;423.分钟:34.0%B。1.得4;异硫氰酸苯酯乙腈溶液mL2摇的三乙胺加入到衍生化溶液的制备8.摇三乙胺乙腈溶液:将:将6mL25滋L的乙腈中混匀即的异硫氰酸苯酯加入到2mL乙腈中混匀即可。2.酸3.33.3摇28混合对照品溶液的配制mg、谷氨酸36.78mg、丝氨酸摇分别称取天冬氨26.31mg、甘
环球中医药2022年7月第15卷第7期摇GlobalTraditionalChineseMedicine,July2022,Vol郾15,No郾7摇1169氨酸18.70mg、组氨酸38.81mg、精氨酸43.56mg、苏氨酸29.76mg、丙氨酸22.23mg、脯氨酸28.82mg、37郾33mg、异亮氨酸32.75mg、亮氨酸32.86mg、苯丙氨酸41.29mg、赖氨酸36.50mg,加入0.1mol/L盐酸溶液超声溶解并定容至100mL。2.3.4摇供试品溶液的制备摇称取5g羚羊角粉末(过200目筛),第一次加入200mL水回流提取3小时,抽滤;第二次加入200mL水回流提取2小时,抽滤。滤渣用80mL2mol/L的硫酸溶液回流水解6小时,抽滤后用调成糊状的氢氧化钙调至pH值为4,沉淀24小时,滤过后将酸水解滤液与水提取滤液合并浓缩进行60%醇沉,4益沉淀24小时。滤过后回收乙醇定容至20mL,即得羚羊角水解液,5000r/min离心20分钟。精密吸取离心后的上清液2mL,加入6mL乙腈,摇匀过滤,用乙腈—水溶液(3颐1)清洗沉淀,旋转蒸发浓缩至干,2.3.5摇标准品与供试品的衍生摇精密吸取200滋L用0.1mol/L盐酸定容至5mL。酪氨酸45.26mg、缬氨酸29.24mg、甲硫氨酸取滤液200滋L,加800滋L纯净水稀释,摇匀制得空白衍生化溶液、氨基酸对照衍生化溶液和供试品衍生化溶液。图谱如图7所示。2.4摇方法学考察2.4.1摇线性关系考察摇精密称取对照品天冬氨酸、谷氨酸、丝氨酸、组氨酸、精氨酸、苏氨酸、丙氨酸、甲硫氨酸适量,用0.1mol/L盐酸溶液逐级稀释,将对照品溶液配制成0.0125滋mol/mL、0.0625滋mol/mL、0.125滋mol/mL、0.25滋mol/mL、0.625滋mol/mL、1.25滋mol/mL、2.5滋mol/mL;精密称取对照品甘氨酸、脯氨酸、酪氨酸、缬氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、赖氨酸适量,用0.1mol/L盐酸溶液0.0625滋mol/mL、0.125滋mol/mL、0.25滋mol/mL、0.625滋mol/mL、1.25滋mol/mL、2.5滋mol/mL。按2.3.5项下分别衍生化,再按2.3.1项下色谱条件进样。以各氨基酸的浓度(滋mol/mL)为横坐标,相应色谱峰峰面积为纵坐标制作线性回归方程。回2.4.2摇检测限和定量限摇将氨基酸对照品溶液依3颐1和10颐1时确定检测限和定量限,具体见表1。次稀释衍生进样,分别以16种氨基酸的信噪比为归方程具体见表1。逐级稀释,将对照品溶液配制成0.0069滋mol/mL、0.1mol/L盐酸溶液、氨基酸混合对照品溶液及供试品溶液于1.5mL离心管中,加入100滋L三乙胺乙腈溶液和100滋L异硫氰酸苯酯乙腈溶液,混匀,于室温下放置1小时。接着加入400滋L正己烷,振摇后放置10分钟,取下层溶液,过0.22滋m滤膜,注:1天冬氨酸;2谷氨酸;3丝氨酸;4甘氨酸;5组氨酸;6精氨酸;7苏氨酸;8丙氨酸;9脯氨酸;10酪氨酸;11缬氨酸;12甲硫氨酸;13异亮氨酸;14亮氨酸;15苯丙氨酸;16赖氨酸。A空白衍生化溶液;B氨基酸对照衍生化溶液;C供试品衍生化溶液。图7摇空白溶液、氨基酸对照品溶液、供试品溶液衍生化后的高效液相色谱图
摇1170环球中医药2022年7月第15卷第7期摇GlobalTraditionalChineseMedicine,July2022,Vol郾15,No郾7表1摇16种氨基酸的相关参数峰号氨基酸天冬氨酸谷氨酸丝氨酸甘氨酸组氨酸精氨酸苏氨酸丙氨酸脯氨酸酪氨酸甲硫氨酸异亮氨酸苯丙氨酸赖氨酸亮氨酸缬氨酸线性回归方程y=590731x+5791.8y=611640x+4812.7y=733817x+551.95y=810744x-4052.5y=652626x-338.62y=742383x-1693.3y=806505x-5397.1y=838993x-9109.1y=909075x-9627.1y=843207x+6599.6y=880929x-4050.7y=899921x-6243.4y=870184x-4411.8y=902245x-8056.2y=1000000x-14073y=850557x-21355r0.99920.99920.99970.99920.99940.99980.99970.99940.99980.99930.99950.99990.9998111线性范围(滋g/mL)1.66~332.751.84~367.831.31~262.730.52~187.681.94~387.902.18~435.501.49~297.801.11~222.730.80~287.831.26~452.980.81~292.881.87~373.030.91~327.930.91~327.931.15~412.981.02~365.48检测限(滋g/mL)0.500.560.400.170.590.660.450.340.270.420.270.570.300.300.380.34定量限(滋g/mL)1.661.841.310.521.942.181.491.110.801.260.811.870.910.911.151.022.4.3摇精密度试验摇将同一瓶供试品溶液,按2.3.1项下色谱条件连续进样6次,记录各氨基酸的峰面积。羚羊角水解液中16种游离氨基酸峰面积的相对标准偏差(relativestandarddeviation,RSD)为0.75%~2.28%,表明仪器精密度良好。相应氨基酸的线性方程计算各氨基酸含量,结果以羚羊角药材与水解液体积比例为1颐1时表示,具体见表2。3摇讨论用含水量15%的微乳液即SDS—正丁醇—正己烷—水按质量比(1.5颐7.0颐1.0颐1.7)进行配比用于薄层色谱展开时,用恰当适宜的点样量,即便温度、相对湿度发生变化,羚羊角水解液中的天冬氨酸、谷氨酸、缬氨酸、亮氨酸、赖氨酸这5种氨基酸均能实现良好分离,说明所建立的微乳薄层方法可以应对全国各地不同气候对结果的影响。羚羊角水解液中游离氨基酸含缬氨酸、异亮氨酸、7种人体必需氨基酸,也含有对婴儿而言所必需的组氨酸,此外亦有天冬氨酸、谷氨酸、丝氨酸、甘氨酸、精氨酸、丙氨酸、脯氨酸、酪氨酸。曾对液相流速(0.6mL/分钟、0.8mL/分钟、1.0mL/分钟)及0.6mL/分钟时,4号峰甘氨酸与5号峰组氨酸不能完全分离,而流速0.8mL/分钟能使甘氨酸与组氨酸的色谱峰完全分开但较流速为1.0mL/分钟耗费的时间长。固定流速为1.0mL/分钟考察温度,温度为30益时,发现8号峰丙氨酸与9号峰脯温度(30益、35益、40益)进行考察,发现流速为亮氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、苏氨酸、赖氨酸这2.4.4摇稳定性试验摇将供试品衍生化溶液于制备后0小时、4小时、8小时、12小时、16小时、24小时进样分析,结果显示羚羊角水解液中16种游离氨基酸峰面积的RSD为0.72%~2.72%,这表明供试品2.4.5摇重复性试验摇取同一批次水解液平行制样6份,测定氨基酸的峰面积,羚羊角水解液中16种游离氨基酸峰面积的RSD为0.81%~2.59%,说明此法重复性良好。2.4.6摇回收率试验摇取6份同一批已测定含量的羚羊角水解液的上清液1mL,加入3mL乙腈,摇匀过滤,用乙腈颐水溶液(3颐1)清洗沉淀,旋转蒸发浓缩至干,加入与之含量相近的氨基酸混合对照品,用0.1mol/L盐酸定容至5mL。羚羊角水解液96郾70%~103郾02%之间,RSD均<3%,符合要求。中16种游离氨基酸的平均回收率(n=6)在衍生化溶液在4益、24小时内稳定。2.4.7摇样品含量测定摇将自制的8批羚羊角水解液按“2.3.4、2.3.5冶项下制样衍生,随后按“2.3.1冶项下色谱条件进样,记录各氨基酸的峰面积,代入
环球中医药2022年7月第15卷第7期摇GlobalTraditionalChineseMedicine,July2022,Vol郾15,No郾7摇1171表2摇羚羊角水解液中游离氨基酸的含量(mg/mL)编号氨基酸天冬氨酸谷氨酸丝氨酸甘氨酸组氨酸精氨酸苏氨酸丙氨酸脯氨酸酪氨酸缬氨酸甲硫氨酸异亮氨酸亮氨酸苯丙氨酸赖氨酸10.38211.43610.97061.03960.10891.17100.47771.12550.95620.81550.62510.17980.43762.02670.70540.547220.30710.55390.44970.49600.01770.35620.23760.66810.75330.65100.45270.10620.36681.88220.69940.161530.30930.55730.45260.49430.01780.35620.28300.66900.75490.65050.44530.10280.36691.87940.68770.164540.30710.55390.44970.49600.01770.35620.23760.66810.75330.65050.45270.10620.36681.86890.69940.161550.30930.55730.45260.49430.01780.35620.23880.66900.75490.65050.44530.10280.36691.87940.68770.164560.31270.55190.44540.48680.01820.35540.23700.66220.74490.64120.43920.09980.36061.85290.68740.165070.31730.55350.44780.48630.01820.35450.23750.66170.74500.63580.43860.10070.37381.87320.68110.168480.31460.54950.44540.48560.01890.34810.23410.65660.74290.63720.43900.10070.35671.84320.67930.1693注:结果以羚羊角药材与水解液体积比例为1颐1时表示。氨酸无法分离,35益时这两个色谱峰可以分离,由于在其他条件一定时,柱温上升会使容量因子变小,使色谱峰流出加快,综合考虑在保证分离度的前提下,为省时选择流速为1.0mL/分钟、柱温为40益。本次实验没有考察微乳液中表面活性剂、助表面活性剂、油相的种类与占比对羚羊角水解液的薄层色谱图的影响,期待后续研究能完善这部分。“BAW系统冶进行展开,无论怎样调试比例亦或是增加甲醇、丙酮、二氯甲烷使展开系统变成五元乃至六元皆无法让羚羊角水解液中的5种氨基酸获得良好分离,而采用W/O型微乳液作为展开剂却能达到分离的目的,这可能是因为微乳色谱中,溶质在固定相、油或水连续相及内核和介面膜等数相之间进行分配,层析过程是集吸附、分配、静电、疏水、立体、萃取与反萃取等多效应于一体,从而使各物质迁移速率不同而使Rf值有差异[17鄄20]。与传统薄分离的成分增多、斑点圆而集中、重现性好、点样量少等优势[21鄄22],在中药有效成分的分析应用中也越来越广泛。笔者将微乳薄层色谱应用于羚羊角水解液的氨基酸分离鉴别中,进一步丰富了W/O型微乳用于氨基酸薄层分离分析的研究,亦为羚羊角笔者也曾用经典的正丁醇—冰醋酸—水即药材的质量控制提供科学依据。参考文献[1]摇国家药典委员会.中华人民共和国药典(一部)[S].北京:中国医药科技出版社,2020:339.医药,2019,26(18):190鄄191.药,2007,39(12):75鄄77.[2]摇赵小伟,宋飞滨,毛克臣.羚羊角的临床应用[J].首都食品与[3]摇李友宾,彭蕴茹,段金廒.羚羊角的研究概况[J].江苏中医[4]摇刘朝亮,程轩轩.微乳色谱在药物分析中的应用[J].中药材,[5]摇魏红,王唯红,吕健华,等.胶束色谱和微乳色谱在药物分析1390鄄1394.2010,33(1):143鄄146.中的研究与进展[J].药物分析杂志,2008,28(8):[6]摇房德敏,高颖,严震,等.微乳薄层色谱在中药成分分析中的应用[J].中草药,2011,42(9):1852鄄1856.[7]摇闫鱼青,赵惠茹,麻妍,等.微乳在天然药物提取和分离鉴定中的应用[J].广州化工,2018,46(22):21鄄22,27.[8]摇赵惠茹,郭德喜,李娜,等.槐米中黄酮类成分的微乳薄层色谱分离鉴定[J].化工科技,2016,24(4):27鄄30,40.[9]摇夏提古丽·塔西买买提,胡曙晨,热娜·卡斯木.欧矢车菊根不同极性萃取部位体外抗氧化活性及其总黄酮的微乳薄层研究[J].新疆医科大学学报,2016,39(3):277鄄282.[10]摇高颖,房德敏,周波,等.基于微乳薄层色谱技术分离鉴定22015,21(12):58鄄61.种医院制剂中的黄酮类成分[J].中国实验方剂学杂志,层色谱相较,微乳薄层色谱有分离效果显著提高、
摇1172环球中医药2022年7月第15卷第7期摇GlobalTraditionalChineseMedicine,July2022,Vol郾15,No郾7[11]摇王艳层色谱鉴别,张俊妹[J].,郭金凤新疆医科大学学报,等.榆叶合叶子黄酮类成分的微乳薄,2015,38(1):61鄄63.[12]摇[J].孙悦,化学分析计量张茜,毕静文,2010,19(1):74鄄76.,等.微乳薄层色谱用于糖分离的研究[13]摇谱分析田大听[J].,史伯安色谱,谢艳,2003,21(1):91鄄93..一种新的展开剂用于氨基酸的薄层色[14]摇谭志斗应用[J].,田大听湖北民族学院学报,陈小强,等.微乳液在氨基酸薄层色谱中的(自然科学版),2001,19(1):[15]摇78鄄80.谭建宁西中医药,马雯芳,2016,39(3):76鄄78.,李耀华.龙脷叶中氨基酸的成分分析[J].广[16]摇国家药典委员会国医药科技出版社.中华人民共和国药典,2020:59鄄60.(四部)[S].北京:中[17]摇王金铃,孙进,何仲贵.微乳及其在药学中应用[J].中国药剂学杂志(网络版),2009,7(4):356鄄364.[18]摇陈珏进展,,2013,37(9):441鄄448.齐炼文,李萍.微乳及其在中药分析中的应用[J].药学[19]摇张秋霞[J].金华职业技术学院学报,郭航鸣.薄层色谱法对几种氨基酸鉴定实验的改进[20]摇张晓梦,陈静静,贺石磷,等时.,2001,1(3):45鄄46.乳薄层色谱研究[J].复方中药制剂槐花甘枳丸的微珍国医国药,2014,25(10):[21]摇2422鄄2423.肖珊,刘海涛,马虹英,等.微乳色谱在药物分析中的应用[22]摇李法威[J].中国药房,2013,24(33):3155鄄3158.中国药物经济学,付京,李萍,2018,13(6):109鄄112..微乳技术在中药分析中的研究进展[J].(收稿日期(本文编辑:2021鄄09鄄23):张楠)
2024年3月8日发(作者：谷梁飞光)
环球中医药2022年7月第15卷第7期摇GlobalTraditionalChineseMedicine,July2022,Vol郾15,No郾7摇1165·中药研究·羚羊角水解液的氨基酸薄层鉴别与含量测定刘妍摇刘静摇陈扬摇赵苑伶摇张雪摇陈林珍摇赵崇军摇马志强揖摘要铱摇目的摇建立羚羊角水解液中氨基酸类成分的薄层鉴别方法并测定其中游离氨基酸的含量,为羚羊角药材的质量控制提供依据。方法摇采用硅胶G薄层板,以十二烷基硫酸钠—正丁醇—正己烷—水按质量比(1.5颐7.0颐1.0颐1.7)组成的微乳液为展开剂,分别定性鉴别羚羊角水解液中的5种氨基酸,并对建立的薄层方法进行耐用性考察;采用异硫氰酸苯酯柱前衍生结合高效液相色谱法对水解液中16种游离氨基酸进行含量测定,并进行方法学考察。结果摇改变温度(4益~30益)、相对湿度(32%~88%)、微乳液含水量(10%~20%)等条件均能分离鉴别出羚羊角水解液中的5种氨基酸;16种氨基酸能完全分离,供试品溶液在24小时内稳定,平均回收率(n=6)在96.70%~103.02%,相对标准偏差均<3%,其中亮氨酸含量最高,组氨酸含量最低。结论摇建立的微乳薄层方法稳定、耐用性好,高效液相色谱法经方法学验证亦适用于羚羊角水解液中16种游离氨基酸的含量测定,可用于羚羊角药材的质量控制。揖关键词铱摇羚羊角水解液;摇含量测定;摇微乳薄层色谱;摇氨基酸;摇高效液相色谱揖中图分类号铱摇R282.5摇揖文献标识码铱摇A摇doi:10.3969/.1674鄄1749.2022.07.010TLCidentificationandcontentdeterminationofaminoacidsinthehydrolysateofantelopehornLIUYan,LIUJing,CHENYang,ZHAOYuanling,ZHANGXue,CHENLinzhen,ZHAOChongjun,MAZhiqiangBeijingKeyLabforQualityEvaluationofChineseMateriaMedica,SchoolofChineseMateriaMedica,BeijingUniversityofChineseMedicine,Beijing100102,ChinaCorrespondingauthor:MAZhiqiang,E鄄mail:mazq1968@揖Abstract铱摇Objective摇Toestablishathinlayerchromatography(TLC)methodforidentifyingaminoacidsinantelopehornhydrolysateanddeterminethecontentoffreeaminoacids,s摇Usingsilicagel鄄Gplate,SDS鄄n鄄butanol鄄hexane鄄wateratmassratio(1.5颐7.0颐1.0颐1.7)asthedevelopingagent,5aminoacidsinantelopehornThecontentof16freeaminoacidswasdeterminedbypre鄄columnderivatizationofphenylisothiocyanateandhighperformanceliquidchromatography,s摇Whentheconditionssuchastemperature(4益~30益),therelativehumidity(32%~88%)andwatercontent(10%~20%)ofthemicroemulsionwerechanged,5aragerecoverieswere96.70%~103.02%,andtheRSDswerelessthan3%.Thecosion摇Theestablished作者单位:100102摇北京中医药大学中药学院中药品质评价北京市重点实验室[刘妍(硕士研究生)、刘静(硕士研究生)、陈扬(硕士研究生)、赵苑伶(硕士研究生)、张雪(硕士研究生)、陈林珍(硕士研究生)、赵崇军、马志强]作者简介:刘妍(1996-),2018级在读硕士研究生。研究方向:中药品质评价。E鄄mail:2466583576@通信作者:马志强(1968-),博士,研究员,硕士生导师。研究方向:中药药效物质基础研究。E鄄mail:mazq1968@
摇1166环球中医药2022年7月第15卷第7期摇GlobalTraditionalChineseMedicine,July2022,Vol郾15,No郾hperformanceliquidchromatographymethodverifiedbymethodologyisalsosuitableforthedeterminationof16freeaminoacidsinantelopehornhydrolysate,aphy;摇Aminoacid;摇Highperformanceliquidchromatography揖Keywords铱摇Antelopehornhydrolysate;摇Contentdetermination;摇Microemulsionthinlayerchro鄄摇Linnaeus摇羚羊角为牛科动物赛加羚羊Saigatatarica农本草经的角》,在我国已有,是传统名贵中药材之一2000多年的药用历史,始载于。《神羚羊角性寒,味咸,归肝、心经,具有平肝息风、清肝明目、散血解毒的功效,主治肝风内动、惊痫抽搐、妊娠子痫、高热痉厥、癫痫发狂、头痛眩晕、目赤翳障、温毒发斑、痈肿疮毒[1]解液经加工而成的现代药物制剂。羚羊角颗粒是由羚羊角水,氨基酸是羚羊角的主要成分之一[2鄄3]乳液来分离鉴别动物中的氨基酸。目前笔者未见国内文献用微(microemulsion展开剂是微乳液thin,因其具有较大的增溶量和超低界layerchromatography,METLC)。微乳薄层色谱的面张力,能让难以分离的复杂体系和难溶化合物得以分离[4鄄6]酮[8鄄11]、糖类,近些年来已经成功运用于生物碱[7][12]、氨基酸[13]等多种化合物的分离鉴、黄别中。为了更好地对羚羊角水解液中的氨基酸进行dodecyl分析,本实验采用十二烷基硫酸钠(sodium比(1.5sulfate,SDS)—颐7.0颐1.0颐1.正丁醇7)为展开剂对羚羊角水解—正己烷—水按质量液中的氨基酸进行定性鉴别,用异硫氰酸苯酯柱前衍生法对水解液中16种游离氨基酸进行含量测定,进一步丰富了微乳液应用于氨基酸薄层鉴别研究的方法,也为羚羊角药材的质量控制提供研究基础。1摇仪器与材料1.1摇实验仪器十万分之一分析天平(MettlerToledo公司),循1100环水式多用真空泵型旋转蒸发仪(,郑州长城科工贸有限公司水浴锅(上海爱朗仪器有限公),N鄄司Thermo),SorvallFisherSTScientific8R台式公司高),速硅胶冷冻G离板心(100机(美mm伊国20190322、2mm,青岛海洋化工厂分厂,批号:20181205、20200410),1),硅胶G板(企业A,批号双槽滋L、2滋L定量点样毛细管(润泽康),:DHG鄄9023AP鄄1型薄层色谱展开缸(100mm伊100mm),设备有限公司型电热恒温鼓风干燥箱),高效液相色谱仪(Waters(上海精宏实验2695)包括2695四元梯度泵,自动进样器,2998PDA检测器,在线脱气机,柱温箱,Empower色谱工作站。1.2摇实验药物羚羊角对照药材,中国食品药品检定研究院,批号B,:PS210423鄄04;羚羊角粉鉴定为羚羊角粉批号:20201011,(过200目筛),企业;羚羊角水解液由北京中医药大学杨瑶珺教授,实验室自制。1.3摇实验试剂99%限公司16,种氨基酸对照品购自上海源叶生物科技有天冬氨酸Asp(批号:S24A8I34463,纯度逸丝氨酸)、谷氨酸Ser(批号Glu(:S04J9I51507,批号:S27M6G1,纯度纯度逸98%逸99%)、甘氨)、酸His(Gly(批号(批号:Z19A9H59384,:SM0315GA14,纯度纯度逸98%逸99%)、精氨酸)、组氨Arg酸号批号:MKBD3032V,纯度逸98%)、苏氨酸Thr(批S20A6G17672,:S01F4G1,纯S30J6G1,纯度度逸98%)、丙氨酸Ala(批号:SM0503GE13,纯度S06D8I49809,纯逸度逸99%逸98%99%)、)、)、酪脯缬氨氨酸Pro(批号:氨酸酸TyrVal((批批号号::SLBK1770V,SM0503GD13,纯纯度S10D9I76995,纯度度逸逸98%逸98%98%)、)、)、异甲硫氨酸亮亮氨氨酸酸Met(批号:LeuIle((批批号号::H20N8H48638,纯度S26A8I34751,纯度逸98%逸98%)、)、苯丙氨酸赖氨酸PheLys(批号:药股份有限公司纯度,批号逸98%:1;)。SDS,购自湖南尔康制(批号:正丁醇、无水乙酸钠、浓盐酸、乙酸(分析纯),均购自北京化工20170215;厂,批号依次为:20170816、20180605、20180712、设备国际有限公司乙腈、正己烷,批号依次为(色谱纯:190263、192565;),购自费希尔控制三乙胺(分析纯),购自上海麦克林生化科技有限公司,批号:C10487468;异硫氰酸苯酯购自博纳艾杰尔,批号:BCBB1912V;茚三酮(分析纯)、乙醇(分析纯),均购自于福晨(天津)化学试剂有限公司,批号依次为:20190402、20210108。2摇方法与结果22..1摇1.1摇羚羊角水解液的薄层色谱分析对照品溶液的制备摇精密称取L鄄天冬氨
环球中医药2022年7月第15卷第7期摇GlobalTraditionalChineseMedicine,July2022,Vol郾15,No郾7摇1167酸、L鄄谷氨酸、L鄄缬氨酸、L鄄亮氨酸、L鄄赖氨酸对照品70%适量甲醇,分别、90%加入甲醇制成50%甲0.醇3、50%mg/mL甲的对照品溶液醇、70%甲醇羊角对照药材及羚羊角粉(过200目筛)1.精密称取羚。、2.1.2摇对照药材、供试品溶液的制备摇0g置于100取3mL小时圆底烧瓶中,抽滤。第二次加入,第一次加入40mL40水mL,回流提取水,回流提2小时,抽滤,合并两次滤液。剩余药渣中加入16mL2加入调成糊状的氢氧化钙mol/L硫酸溶液回流水解,调6小时pH值为,抽滤后4,沉淀,滤液中24小时,抽滤得其滤液,将之与水提取滤液合并浓缩后进行60%醇沉,在4益下沉淀24小时。抽滤,浓缩,用水定容至10mL。再以5000r/分钟的转速离心20溶液分钟得其上清液即为羚羊角水解液的供试品。2.己烷1.3摇、水按质量比微乳液展开剂的配制(1.5颐7.0颐1.摇0将颐、7)混匀即得含正丁醇、正水量15%的微乳液[14鄄15]2.。《天冬氨酸中华人民共和国药典1.4摇羚羊角水解液的薄层鉴别、谷氨酸、缬氨酸(四部摇参考2020版、亮氨酸)》通则、赖氨酸对照品0502[16],吸取溶液各2滋L,吸取供试品溶液及对照药材溶液0.胶5G滋L薄层板上分别点于事先在,以含水量为110益15%活化半小时的同一硅的微乳液上行展开,展距为8cm时将薄层板取出,晾干,喷以2%茚三酮乙醇溶液,在105益烘至斑点显色清晰。自制8批羚羊角水解液的薄层图谱见图1。羚羊角水解液除与对照品色谱相应位置上显集中且圆的斑点外,与对照药材所示色谱条带一致,分离效果佳,天冬氨酸、谷氨酸、缬氨酸、亮氨酸、赖氨酸的Rf值依次为0.20、0.14、0.50、0.61、0.33。2.2摇羚羊角水解液的薄层耐用性考察2.液2.、对照品溶液按1摇不同薄层板的分离效果考察2.1.4项下方法点于不同厂家薄摇取供试品溶层板(企业A、青岛海洋化工厂分厂)及同一厂家不同批号薄层板(青岛海洋化工厂分厂,批号:20181205、20190322、20190802),化工厂分厂所制薄板分离效果要优于企业见图2。青岛海洋A。2.对照品溶液按2.2摇不同温度的分离效果考察2.1.4项下方法点于同一批号薄层摇取供试品溶液、板,分别置于4益与30益的环境下展开,见图3。羚羊角水解液的色谱图在4益与30益下大致一致。注:1天冬氨酸;2谷氨酸;3缬氨酸;4亮氨酸;5赖氨酸;6羚羊角对照药材;7~14自制8批羚羊角水解液。图1摇自制8批羚羊角水解液的薄层色谱图注:1天冬氨酸;2谷氨酸;3缬氨酸;4亮氨酸;5赖氨酸;6~8自制3批羚羊角水解液。A:企业A;B、C、D:青岛海洋化工厂分厂,B:批号为20181205,C:批号为20190322,D:批号为20190802。图2摇羚羊角水解液在不同硅胶G板的薄层色谱图注:1天冬氨酸;2谷氨酸;3缬氨酸;4亮氨酸;5赖氨酸;6~8自制3批羚羊角水解液。A:温度4益;B:温度30益。图3摇羚羊角水解液在不同温度下的薄层色谱图2.对照品溶液按2.3摇不同湿度的分离效果考察2.1.4项下方法点于同一批号薄层摇取供试品溶液、板,分别置于相对湿度为32%、58%、88%的环境下
摇1168环球中医药2022年7月第15卷第7期摇GlobalTraditionalChineseMedicine,July2022,Vol郾15,No郾7展开,结果见图4。羚羊角水解液的色谱图在相对湿度32%、58%、88%环境下基本相同。注:1天冬氨酸;2谷氨酸;3缬氨酸;4亮氨酸;5赖氨酸;6~8自制3批羚羊角水解液。A:相对湿度32%;B:相对湿度58%;C:相对湿度88%。图4摇羚羊角水解液在不同湿度下的薄层色谱图2.液2.、对照品溶液按4摇不同点样量的分离效果考察2.1.4项下方法点于同一薄层板摇取供试品溶上,供试品点样量由左往右依次为0.5滋L、1滋L、1.0.5滋L,结果见图5。羚羊角水解液最佳点样量为明显5滋L,。其次为1滋L,当点样量为1.5滋L时拖尾摇摇摇摇摇摇注6~:18点样量依次为天冬氨酸;2谷氨酸0.5滋L、1;3缬氨酸滋L、1.;45亮氨酸滋L。;5赖氨酸;图5摇羚羊角水解液在不同点样量下的薄层色谱图2.试品溶液2.5摇不同含水量微乳液的分离效果考察、对照品溶液按2.1.4项下方法点于同一摇取供批号薄层板上,在固定SDS、正丁醇、正己烷质量比为1.5颐7.0颐1.0的配比下,分别用含水量为10%、13%、15%、17%、20%的微乳液展开,结果见图6。各含水量图谱基本一致。注:1天冬氨酸;2谷氨酸;3缬氨酸;4亮氨酸;5赖氨酸;6~8自制3批羚羊角水解液。A:含水量10%;B:含水量13%;C:含水量15%;D:含水量17%;E:含水量20%。图6摇羚羊角水解液在不同含水量微乳液下的薄层色谱图2.3摇羚羊角水解液中游离氨基酸的分析2.用柱3.1摇(博纳艾杰尔色谱分析条件,4.6伊250摇Venusilmm,5滋m),AA氨基酸分析专柱温40益,样品室温度为4益,流速1.0mL/分,检测波长254乙酸钠nm,(pH一次进样量6.5)—乙腈10(93滋L。颐流动相7),流动相A:0.B1为mol80%/L乙腈,梯度洗脱:0分钟:0%B;14分钟:9.5%B;22分钟:19.5%B;37分钟:30.6%B;41分钟:31.6%2.B;423.分钟:34.0%B。1.得4;异硫氰酸苯酯乙腈溶液mL2摇的三乙胺加入到衍生化溶液的制备8.摇三乙胺乙腈溶液:将:将6mL25滋L的乙腈中混匀即的异硫氰酸苯酯加入到2mL乙腈中混匀即可。2.酸3.33.3摇28混合对照品溶液的配制mg、谷氨酸36.78mg、丝氨酸摇分别称取天冬氨26.31mg、甘
环球中医药2022年7月第15卷第7期摇GlobalTraditionalChineseMedicine,July2022,Vol郾15,No郾7摇1169氨酸18.70mg、组氨酸38.81mg、精氨酸43.56mg、苏氨酸29.76mg、丙氨酸22.23mg、脯氨酸28.82mg、37郾33mg、异亮氨酸32.75mg、亮氨酸32.86mg、苯丙氨酸41.29mg、赖氨酸36.50mg,加入0.1mol/L盐酸溶液超声溶解并定容至100mL。2.3.4摇供试品溶液的制备摇称取5g羚羊角粉末(过200目筛),第一次加入200mL水回流提取3小时,抽滤;第二次加入200mL水回流提取2小时,抽滤。滤渣用80mL2mol/L的硫酸溶液回流水解6小时,抽滤后用调成糊状的氢氧化钙调至pH值为4,沉淀24小时,滤过后将酸水解滤液与水提取滤液合并浓缩进行60%醇沉,4益沉淀24小时。滤过后回收乙醇定容至20mL,即得羚羊角水解液,5000r/min离心20分钟。精密吸取离心后的上清液2mL,加入6mL乙腈,摇匀过滤,用乙腈—水溶液(3颐1)清洗沉淀,旋转蒸发浓缩至干,2.3.5摇标准品与供试品的衍生摇精密吸取200滋L用0.1mol/L盐酸定容至5mL。酪氨酸45.26mg、缬氨酸29.24mg、甲硫氨酸取滤液200滋L,加800滋L纯净水稀释,摇匀制得空白衍生化溶液、氨基酸对照衍生化溶液和供试品衍生化溶液。图谱如图7所示。2.4摇方法学考察2.4.1摇线性关系考察摇精密称取对照品天冬氨酸、谷氨酸、丝氨酸、组氨酸、精氨酸、苏氨酸、丙氨酸、甲硫氨酸适量,用0.1mol/L盐酸溶液逐级稀释,将对照品溶液配制成0.0125滋mol/mL、0.0625滋mol/mL、0.125滋mol/mL、0.25滋mol/mL、0.625滋mol/mL、1.25滋mol/mL、2.5滋mol/mL;精密称取对照品甘氨酸、脯氨酸、酪氨酸、缬氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、赖氨酸适量,用0.1mol/L盐酸溶液0.0625滋mol/mL、0.125滋mol/mL、0.25滋mol/mL、0.625滋mol/mL、1.25滋mol/mL、2.5滋mol/mL。按2.3.5项下分别衍生化,再按2.3.1项下色谱条件进样。以各氨基酸的浓度(滋mol/mL)为横坐标,相应色谱峰峰面积为纵坐标制作线性回归方程。回2.4.2摇检测限和定量限摇将氨基酸对照品溶液依3颐1和10颐1时确定检测限和定量限,具体见表1。次稀释衍生进样,分别以16种氨基酸的信噪比为归方程具体见表1。逐级稀释,将对照品溶液配制成0.0069滋mol/mL、0.1mol/L盐酸溶液、氨基酸混合对照品溶液及供试品溶液于1.5mL离心管中,加入100滋L三乙胺乙腈溶液和100滋L异硫氰酸苯酯乙腈溶液,混匀,于室温下放置1小时。接着加入400滋L正己烷,振摇后放置10分钟,取下层溶液,过0.22滋m滤膜,注:1天冬氨酸;2谷氨酸;3丝氨酸;4甘氨酸;5组氨酸;6精氨酸;7苏氨酸;8丙氨酸;9脯氨酸;10酪氨酸;11缬氨酸;12甲硫氨酸;13异亮氨酸;14亮氨酸;15苯丙氨酸;16赖氨酸。A空白衍生化溶液;B氨基酸对照衍生化溶液;C供试品衍生化溶液。图7摇空白溶液、氨基酸对照品溶液、供试品溶液衍生化后的高效液相色谱图
摇1170环球中医药2022年7月第15卷第7期摇GlobalTraditionalChineseMedicine,July2022,Vol郾15,No郾7表1摇16种氨基酸的相关参数峰号氨基酸天冬氨酸谷氨酸丝氨酸甘氨酸组氨酸精氨酸苏氨酸丙氨酸脯氨酸酪氨酸甲硫氨酸异亮氨酸苯丙氨酸赖氨酸亮氨酸缬氨酸线性回归方程y=590731x+5791.8y=611640x+4812.7y=733817x+551.95y=810744x-4052.5y=652626x-338.62y=742383x-1693.3y=806505x-5397.1y=838993x-9109.1y=909075x-9627.1y=843207x+6599.6y=880929x-4050.7y=899921x-6243.4y=870184x-4411.8y=902245x-8056.2y=1000000x-14073y=850557x-21355r0.99920.99920.99970.99920.99940.99980.99970.99940.99980.99930.99950.99990.9998111线性范围(滋g/mL)1.66~332.751.84~367.831.31~262.730.52~187.681.94~387.902.18~435.501.49~297.801.11~222.730.80~287.831.26~452.980.81~292.881.87~373.030.91~327.930.91~327.931.15~412.981.02~365.48检测限(滋g/mL)0.500.560.400.170.590.660.450.340.270.420.270.570.300.300.380.34定量限(滋g/mL)1.661.841.310.521.942.181.491.110.801.260.811.870.910.911.151.022.4.3摇精密度试验摇将同一瓶供试品溶液,按2.3.1项下色谱条件连续进样6次,记录各氨基酸的峰面积。羚羊角水解液中16种游离氨基酸峰面积的相对标准偏差(relativestandarddeviation,RSD)为0.75%~2.28%,表明仪器精密度良好。相应氨基酸的线性方程计算各氨基酸含量,结果以羚羊角药材与水解液体积比例为1颐1时表示,具体见表2。3摇讨论用含水量15%的微乳液即SDS—正丁醇—正己烷—水按质量比(1.5颐7.0颐1.0颐1.7)进行配比用于薄层色谱展开时,用恰当适宜的点样量,即便温度、相对湿度发生变化,羚羊角水解液中的天冬氨酸、谷氨酸、缬氨酸、亮氨酸、赖氨酸这5种氨基酸均能实现良好分离,说明所建立的微乳薄层方法可以应对全国各地不同气候对结果的影响。羚羊角水解液中游离氨基酸含缬氨酸、异亮氨酸、7种人体必需氨基酸,也含有对婴儿而言所必需的组氨酸,此外亦有天冬氨酸、谷氨酸、丝氨酸、甘氨酸、精氨酸、丙氨酸、脯氨酸、酪氨酸。曾对液相流速(0.6mL/分钟、0.8mL/分钟、1.0mL/分钟)及0.6mL/分钟时,4号峰甘氨酸与5号峰组氨酸不能完全分离,而流速0.8mL/分钟能使甘氨酸与组氨酸的色谱峰完全分开但较流速为1.0mL/分钟耗费的时间长。固定流速为1.0mL/分钟考察温度,温度为30益时,发现8号峰丙氨酸与9号峰脯温度(30益、35益、40益)进行考察,发现流速为亮氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、苏氨酸、赖氨酸这2.4.4摇稳定性试验摇将供试品衍生化溶液于制备后0小时、4小时、8小时、12小时、16小时、24小时进样分析,结果显示羚羊角水解液中16种游离氨基酸峰面积的RSD为0.72%~2.72%,这表明供试品2.4.5摇重复性试验摇取同一批次水解液平行制样6份,测定氨基酸的峰面积,羚羊角水解液中16种游离氨基酸峰面积的RSD为0.81%~2.59%,说明此法重复性良好。2.4.6摇回收率试验摇取6份同一批已测定含量的羚羊角水解液的上清液1mL,加入3mL乙腈,摇匀过滤,用乙腈颐水溶液(3颐1)清洗沉淀,旋转蒸发浓缩至干,加入与之含量相近的氨基酸混合对照品,用0.1mol/L盐酸定容至5mL。羚羊角水解液96郾70%~103郾02%之间,RSD均<3%,符合要求。中16种游离氨基酸的平均回收率(n=6)在衍生化溶液在4益、24小时内稳定。2.4.7摇样品含量测定摇将自制的8批羚羊角水解液按“2.3.4、2.3.5冶项下制样衍生,随后按“2.3.1冶项下色谱条件进样,记录各氨基酸的峰面积,代入
环球中医药2022年7月第15卷第7期摇GlobalTraditionalChineseMedicine,July2022,Vol郾15,No郾7摇1171表2摇羚羊角水解液中游离氨基酸的含量(mg/mL)编号氨基酸天冬氨酸谷氨酸丝氨酸甘氨酸组氨酸精氨酸苏氨酸丙氨酸脯氨酸酪氨酸缬氨酸甲硫氨酸异亮氨酸亮氨酸苯丙氨酸赖氨酸10.38211.43610.97061.03960.10891.17100.47771.12550.95620.81550.62510.17980.43762.02670.70540.547220.30710.55390.44970.49600.01770.35620.23760.66810.75330.65100.45270.10620.36681.88220.69940.161530.30930.55730.45260.49430.01780.35620.28300.66900.75490.65050.44530.10280.36691.87940.68770.164540.30710.55390.44970.49600.01770.35620.23760.66810.75330.65050.45270.10620.36681.86890.69940.161550.30930.55730.45260.49430.01780.35620.23880.66900.75490.65050.44530.10280.36691.87940.68770.164560.31270.55190.44540.48680.01820.35540.23700.66220.74490.64120.43920.09980.36061.85290.68740.165070.31730.55350.44780.48630.01820.35450.23750.66170.74500.63580.43860.10070.37381.87320.68110.168480.31460.54950.44540.48560.01890.34810.23410.65660.74290.63720.43900.10070.35671.84320.67930.1693注:结果以羚羊角药材与水解液体积比例为1颐1时表示。氨酸无法分离,35益时这两个色谱峰可以分离,由于在其他条件一定时,柱温上升会使容量因子变小,使色谱峰流出加快,综合考虑在保证分离度的前提下,为省时选择流速为1.0mL/分钟、柱温为40益。本次实验没有考察微乳液中表面活性剂、助表面活性剂、油相的种类与占比对羚羊角水解液的薄层色谱图的影响,期待后续研究能完善这部分。“BAW系统冶进行展开,无论怎样调试比例亦或是增加甲醇、丙酮、二氯甲烷使展开系统变成五元乃至六元皆无法让羚羊角水解液中的5种氨基酸获得良好分离,而采用W/O型微乳液作为展开剂却能达到分离的目的,这可能是因为微乳色谱中,溶质在固定相、油或水连续相及内核和介面膜等数相之间进行分配,层析过程是集吸附、分配、静电、疏水、立体、萃取与反萃取等多效应于一体,从而使各物质迁移速率不同而使Rf值有差异[17鄄20]。与传统薄分离的成分增多、斑点圆而集中、重现性好、点样量少等优势[21鄄22],在中药有效成分的分析应用中也越来越广泛。笔者将微乳薄层色谱应用于羚羊角水解液的氨基酸分离鉴别中,进一步丰富了W/O型微乳用于氨基酸薄层分离分析的研究,亦为羚羊角笔者也曾用经典的正丁醇—冰醋酸—水即药材的质量控制提供科学依据。参考文献[1]摇国家药典委员会.中华人民共和国药典(一部)[S].北京:中国医药科技出版社,2020:339.医药,2019,26(18):190鄄191.药,2007,39(12):75鄄77.[2]摇赵小伟,宋飞滨,毛克臣.羚羊角的临床应用[J].首都食品与[3]摇李友宾,彭蕴茹,段金廒.羚羊角的研究概况[J].江苏中医[4]摇刘朝亮,程轩轩.微乳色谱在药物分析中的应用[J].中药材,[5]摇魏红,王唯红,吕健华,等.胶束色谱和微乳色谱在药物分析1390鄄1394.2010,33(1):143鄄146.中的研究与进展[J].药物分析杂志,2008,28(8):[6]摇房德敏,高颖,严震,等.微乳薄层色谱在中药成分分析中的应用[J].中草药,2011,42(9):1852鄄1856.[7]摇闫鱼青,赵惠茹,麻妍,等.微乳在天然药物提取和分离鉴定中的应用[J].广州化工,2018,46(22):21鄄22,27.[8]摇赵惠茹,郭德喜,李娜,等.槐米中黄酮类成分的微乳薄层色谱分离鉴定[J].化工科技,2016,24(4):27鄄30,40.[9]摇夏提古丽·塔西买买提,胡曙晨,热娜·卡斯木.欧矢车菊根不同极性萃取部位体外抗氧化活性及其总黄酮的微乳薄层研究[J].新疆医科大学学报,2016,39(3):277鄄282.[10]摇高颖,房德敏,周波,等.基于微乳薄层色谱技术分离鉴定22015,21(12):58鄄61.种医院制剂中的黄酮类成分[J].中国实验方剂学杂志,层色谱相较,微乳薄层色谱有分离效果显著提高、
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