2024年3月11日发(作者：但文心)

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N

神经瘸学与神经康复学杂志2008年9月第5卷第3期J

Neum

“mrehabil，september2008，v01．5，No．3

163

基础研究

通心络胶囊对大鼠脑缺血再灌注损伤的保护作用及其机制

曾丽莉，沈帆霞。刘建荣，

梁

梁。徐洁懿，

陈沁。

陈生弟

(上海交通大学医学羧融羼瑞金医浣掉经杰辩，上海2∞025)

【摘要】日曲研究通心络胶囊对大鼠缺舭再灌注损伤的保护作用及其作用机制。方法99只sD大鼠随机分为通心络治疗

组、通心络预防组及朱用药对照缇，线栓法建立缺血2h鞭灌注损伤模型，再灌没后1

h、1

d朔5

d断头取脑。’rrC测定脑梗死体

积；于激法诗算蓬禽承量；毫镶残察海骂捧缀嚣超镦结搀；羟羧法梭溺S0p会鐾；蕈基矗法捡溺鹾D矗含豢；毙色法稔滋Gs嚣．瓤、

钠一钾一ATP酶、NO含量；免痰荧光观察小胶质细胞活化情况。结蒜在通心络药物干预下，大鼠脑梗死惯4和梗死对侧含水量

减少，脑梗死体积减小，缺血性海马神经细胞坏死肿胀减轻，SOD、GSH．Px和钠一钾一ATP酶含量增加，MDA、N0含慧降低(P《

O。嬲)，小胶爱缨魏瓣表达减少。结论遂心络获囊霹能邋过调节耋囊基、减轻锈凌滚纛搀裁炎症反痘戆终耀瓤刳藏辍瑟袋囊霉

灌注损伤。

【关键诩】缺血再灌注；通心络；

【孛圈分类号l

R743。33

自由熬；炎症

【文髹标浚鹨】A【文章编号】1672—7∞l<2∞8)03一0163一05

ProtectiVe

Effectsof

Tongxinluo(TXL)Capsule

on

CerebralIschemia

Reper量hsio魏l蝴珏ry

i魏Ra童sa魏dl垂s

I蛭eeha魏ism

ZengLili，Shenli’anxia，Liu

Jianron鬈，Liang

Liang，Xu

Jieyi，ChenQin，Chen

Shengdi

《o绎8撵粼燃妒舭㈣i。秽，霆黼泓韵黟￡滋，够i泌抛矗据娩蠢泌8；s蘸o。Z，|；s是8猎是反船olo蟮魄泌站毋，S矗娃甥_}18i

2DDD25，I％流8)

【Abs镑ae量】

gfoup；(参the

1

蝴￡蠢矿乎零

o

illvesl运a协氇e囊e麟pe狂￡ie

a珏d

p黼lee|主ve

e莉6ee|s《零。秘gxinl珏o({xL)on

ee羚bra王is．

Ninety-nine

SD

rats

chemia

reperfusion

injury

in

rats．膨露胁口d奢

and(爹the

8

were

dividedintothree

groups：①me

no瑚al

middlecerebral

3l薹，24塞nd

TxL—treated

group

TxL

preventive

group．

Reversible

occlusion

ofthe

right

efe

a珏a|y$es

was

ea痰ed

o疆￡粒sing8琏efy黏r

2h

w

i臻l橼l毛王mi潮lls狂抛re氆e凌。莲奠kng鑫。墨惫e

method．

pe蠢b魏ed

20hoursafterre—eirculation

in

thethree

groups．The

infarct

was

VoIume

wa8

assessed

by

TTC

8t“ning

andthecerebral

watercontent

measured

bydryweight

TheactiVitie8of

SO

a+一K+一ATPaseand

the

D，GSH—Px

andN

eon|e魏￡s菇N0

a糕纛麓D矗we揩measll擀纛主n氇e

eo趱iea|耋主ss糕e蠡《isehe燃ie

he掇isp瓤e糟。

were

轰etivaled璎ic鳓番i8l

eells

detected

by

immunonuorescence

labeling．

震曰譬口函嘧TXL

8ignific臻ntly

reduced

the

volumeofcerebralinfarct

cor．

and

water

content(P

Ltreated

rats，the

activitie8

of

SO

a+一K+-ATPaseinthe

．05)．In

TX

D，CSH．Px

andN

1ex

of

i转ehem

efe

ie魏e辙isphefe

w

elev戤ed《尹<0．◇5)，w囊ile纛e殛DA

alld嚣O

eo魏耄en量was嚣iglli鑫ca珏|每莲ecfeased

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in

rats

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the

oVerproduction

offbe

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ationof

m

(P<0．05)compared

w

-operatedgmup．The

oVeractiV

icro西ial

ceIl$wasinhibited．(知棚：跏s妇弹

TXLhas

neuroprotectiVe

ef＆ct

on

a纛。魏。

豫dic舔转，blocking氇e

in莹拖eelllll氇re蘸ei娃m

ove娃oa纛and遮纛i辍穗唔the

i皲蠢a拯m

【Keywords】

i8chemia

reperfusion；

Tong】【inluo；fberadicals；

innammation

隧着老龄诧的到来，脑梗死的高发病率、高致残

性和高致死率给患者及其家庭乃至整个社会带来沉

重的负担。如何麓减轻脑组织缺蛊损谯，最大程度

地挽救毕暗带的缺血神经元是目前急待解决的闻

【作者简介】曾丽莉(1976一)，女。巍西人，副主任医师，硕士

蘧。中药制翔通心络胶囊被应用于脑缺巍的治疗，

但治疗作用缺少基础研究支持。本文拟通过动物模

燮研究探讨通心络对缺盘再灌注损饶的僳护与治疗

作用。

耱经癍学≮{孛经漾笈学杂志2∞8年9羹第5器笨3蠲j嚣eH瞄拜eum赫盛《，sep主em孙r2潍8，V蠢．s。蓬o。3

材料与方法

实验动物与分组成年雄性SD大鼠99只，体

重220一2sO

g，随楗分势缺塞再灌注霹照缰《l／R，

站=33)、缺血再灌注通心络治疗组(I／R治，n=33)

和缺血再灌注通心络预防组(I／R预，，l=33)三组。

各缓根据薅灌注后不同时闻点l囊、l

d及5

d再平均

分组，每组各11只。

动物模型建立采用Lollga线栓法…建立大鼠

缺盘再灌注损伤模黧，在右侧大脑中动脉拴塞2

h詹

进行再灌注，分别予再灌注后l

h、1

d和5

d断头取

脑检测，遴过神经功麓评分口1秘髑陀染色p’证实遗

模的成功性。对照组在造模詹即刻及观察期每日腹腔

注射生理盐水2mL；通心络治疗组在造模后即刻及观

察裳每基羧腔注射邋心终o。s∥羹∥2m毛；通心络羲防

组在造模前5

d每日腹腔注射通心络O．5∥k妮mL，

造模后即刻及观察期每日腹腔溅射生理盐水2

mL。

脑含承量大飘在各爵鬻点断头取蕊，左右大

脑半球分开，分别经电光分析天平(分度值o．1mg)

精确称重露，放入lOO℃恒温予燥箱烘烤24h至憾

重后，再精确称干脑组织重量，并按Elliot于湿重法

计算脑皮质含水量，以百分率表示。

脑梗死体积大鼠在各时阕点断头取齄，圭熬

至后每隔2mm厚度做冠状面切开，浸予2％TTC中

30

min，TTC被脑组织线粒体内过氧化氢酶还原，可

使歪常齄缀织被染成深红色，援死娃势囊色。按颓

序依次由前向后由扫描仪将图像信息输入计算机，

用Nikon&Spot图像采集分析系统分别测定脑梗死丽

积，输入跨厚参数，计算盘梗死俸积洋‘。

电镜观察

大鼠各时间点断头取脑，分离出海

骂组织，取米粒大小组织浸泡予2％的戊二醛溶液

中，进行透射电镜超微结构观察。

组织匀浆指标检测大鼠在各时间点断头取

藏，取梗歹乏侧大脑半球皮质，冀匀浆缓狰液圭：9零积

放于匀浆器中研磨均匀，4

ooo

r／min离心10min，取

上清液一20℃保存待测。按南京建成生物工程研究

瘊说明书，采震羟胺法测定越氧诧物歧佬酶(S0芬)

含量，TBA法测定丙二醛(MDA)含量，比色法测定谷

胱甘肽过辍化氢酶(GSH-Px)禽量、一氧化氮(NO)含

量、Na+．K+．矗TP酶活性。

免疫荧光观察小胶质细胞各组动物4％多聚

甲醛常趣心脏灌注，叛头取齄，0c零包埋，一?O℃保

存。标本做冰冻切片，常规处理盾，加抗GFAp抗体

(1：l

000，santa

Cruz公司)，37℃孵育1

h，PBS洗涤

3次。热残零C标记的鼠撬羊lgG(购鑫华美生物工

程公司)检测，甘油一PBS液封片，荧光显微镜观察。

统计学方法所有数据采用SAS统计软件进行

统计分析，数据采用均数尘标准差表示，P<◇．os有

统计学意义。多组数据间比较，采用F检验，然后作

Dunean耨检验求譬值，作蕊两比较。

结果

对大鼠脑客水量的影响(表1)大鼠脑挟趣2

h

再灌注损伤后，从1

h、1

d到5

d，脑梗死侧及对侧含

水量呈先上升_}}l；后下降的趋势。遴心终于预(包括

治疗组和预防组)均能降低相应时闻点的脑梗死侧

及对侧含水量，统计学上具有显著性差异。

衰l遂心终对藏梗死援及嚣攒蔻铡窖承耋豹彰晌(i±s，#=11)

注：缀F检验lh项下，三组经，梭验，=3．85，P=0．03，再缀Duncan

蔟检验gl一2=3．Ol，g=l一3=3．65，与l—R2h缀魄较‘尹

对大鼠脑梗死体积的影响(表2)大鼠脑缺血

2

h再灌注后，从l

h、l

d到5d，脑梗死体积鐾逐步

增大的趋势。通心络予预(包括治疗组和预防组)

后，其脑梗死体积明显小于未用药对照组，差异具有

统计攀意义。

裹2道心络对脑梗觉体积的影响(i±I，n=11)

注：缀，检验与I．R2h组比较’P《0．05

对大鼠缺斑海马神缀元超徽结构的影响

大鼠

脑缺血2h再灌注未焉药对照组可见海马神经元细

神经病学与神经索笈学杂志2()08年9月第5卷第3期J

Neuml

Neumreh8bil+september

2008，V

01．5，No．3

胞核核膜不完熬，核仁溶解消失，染色质固缩边聚，

细胞浆中核糖体减少，高尔基体散在，粗面内质网肿

对犬鼠梗死侧皮质匀浆SoD含爨的影晌(袭3)

大鼠脑缺血2

ll荐灌注焉，从l

h、l

d翻5d，通心

络预防组的梗死侧皮质匀浆SOD含量明显高予朱用

药对照组，差异具有统计誉意义，恧通心络治疗缰

SOD含量较对照组无明显变化。

通心络对大鼠梗死侧皮质匀浆MDA含量的影

晌(表矮)

大鼠艟缺盘2ll褥灌注惹，麸王蠡到5

d，

通心络预防组的梗死侧皮腋匀浆MDA含量明显低

于未用药对照组，治疗组在I／R后5

d

MDA禽量较

对照组氇有所降低，差异吴有统计学意义。

裹3浦心络对梗耗侧皮质匀浆SOD含量的影响(彳±j，n；11)

分翅

lhldSd

1．R对照维

111．3±4．30105．6±4+02101．5士3．79

通心络治疗组

112．2±3．75107．3±3．9898．5士4．58

通心络预防组

126．9±4．12。

114．6±4．15+

109。3土3．54’

尹(尹)

57．1(

15。3≤

注：与I-妣h组比较‘p《O．05，与治疗组比较+P《O．05

襄4濮心终对梗死铡虚质匀浆MDA含量的彰螭(i±；。n—11)

注：与l-R2h组比较+户

对大鼠梗死黼皮质匀浆GSll-PX含量的彩晌

(表5)大鼠脑缺血2h再灌注后，从1

d到5

d，通

心络预防组的梗死侧瘦质匀浆eSH一双含量骥显高

于未用药对照组，差异具有统计学意义。治疗维与

对照组比较含量无变化。

对大氯梗死撰受凌匀浆Na+-X+-舂零P魏瀵性

的影响(表6)犬鼠脑缺做2h再灌注后lh、ld，通

心络预防组和治疗组的梗死侧皮质匀浆Na+一K+。A即

胀。线粒体肿胀或空泡化(图lA)。而通心络干预

组较对照组细胞坏死肿胀明显减轻(图lB)。

酶活性明显离于未用药对照组，差异具有统计学意义，

但汐R后5天两组与对照组相比无明显差异。

对大鼠梗死侧皮质匀浆N0含量的影响(表7)

大鼠脑软盘2}l再灌注嚣，从l

d到5

d，遗心终预

防组的梗死侧皮质匀浆NO含鬣明显低予未用药对

照组，治疗组在I／R腐5

d

N0含量较对照组也有所

降低，差异共有统计掌意义。

袭5通心络对梗死侧皮质匀浆GsH-Px含量的影响(虿±l，Jl=11)

洗：与l-融h缎比较’P

疲6遗心终对攫茏翱瘦质糍浆N叠+-x+穗蕈P蔫诿拽的彰骟《i士j，

注：与1．R2h维眈较+P‘O．05，与治疗缀院较‘P

袭7通，厶络对梗死侧皮质匀浆NO禽量的影响(i盘l，n=11)

浇：与IR2h组比较’P

小胶震绸匏活{l：情提逶心络于预组(匿2嚣、

2C)免疫荧光显示小胶质细施表达明显少子未用药

对照组(图2A)。

神经病学与神经康复学杂志2008年9月第5卷第3期J

Neurol

Neurorehabil．s8ptPmber2008，v01．5．No．3

讨

论

缺血性脑损伤是一个多因素、多机制、多环节的

恶性级联过程，兴奋性氨基酸毒性、钙超载、自由基

反应、梗死周围除极化、炎症和细胞凋亡是造成缺血

性脑损伤的中心环节。

脑缺血再灌注发生时，自由基的连锁级联反应

触发，大量的氧自由基产生释放，攻击膜蛋白质，核

酸及生物膜上的不饱和脂肪酸，参与脂质过氧化过

程，产生脂质过氧化物如MDA，造成细胞损伤，因此

清除自由基，对于减轻脑损伤，阻断缺血后级联损伤

反应有着十分重要的意义。而SOD、GSH—PX是两种

能有效清除体内单线态氧、超氧阴离子、羟自由基等

多种自由基的抗氧化酶，能减轻缺血缺氧时脂质过

氧化的损伤¨1。本研究显示随着缺血再灌注后时间

的推移(从1h到5d)，大鼠梗死侧脑的MDA含量

呈进行性升高，同时自由基清除剂sOD和GSH．Px

的活性降低，提示氧自由基参与了缺血损伤机制。

而腹腔注射通心络后，无论预防组还是治疗组，MDA

含量均有所下降，SOD和GSH．Px表达均有所增加，

提示通心络可能通过调节自由基作用达到对缺血神

经元的保护作用。

缺血再灌注可造成钙稳态失衡，一方面是由于

钠平衡障碍所致：缺血引起细胞膜Na+．K+泵功能障

碍，从而使钠、水在细胞内潴留，细胞肿胀，然后又依

Na+一Ca2+交换机制使细胞外钙大量内流造成细胞内

钙超载。另一方面，再灌注时氧自由基的大量产生，

其引发细胞膜脂质过氧化，使膜受损，通透性增高，

故在灌注时细胞外钙顺着浓度梯度而大量内流细胞

内钙超载，细胞功能紊乱，出现细胞生物膜损害，线

粒体肿胀，氧化磷酸化过程发生障碍，能量代谢受

阻，导致神经元不可逆性死亡。我们的研究显示随

着缺血损伤的加重，Na+．K+．ATP酶的活性降低，脂

质过氧化物含量增高。而通心络的使用，能减少脂

质过氧化物的含量，增强Na+一K+一ATP酶的活性，可

能通过此抑制钙超载内流减轻脑缺血再灌注损伤。

当脑缺血再灌注损伤发生时，会引发一系列细

胞及分子变化，其中一个重要现象就是胶质细胞活

化，即反应性胶化过程。胶质细胞在缺血早期即被

活化，释放大量的免疫介质、NO、氧自由基和其他毒

性物质，有些物质可能直接具有神经毒性，或间接吸

引各类炎性细胞，再次释放毒性物质，造成二度神经

损伤№。7J。本实验免疫荧光结果也显示在大鼠缺血

2

h再灌注后lh，梗死侧海马区及皮质区可见较多

量的小胶质细胞表达，同时伴有梗死侧大脑匀浆氧

自由基和N0含量的升高，提示缺血再灌注早期小胶

质细胞的活化及其释放氧自由基和NO所造成的神

经毒性可能是缺血损伤发生的机制之一。在通心络

治疗组和预防组，小胶质细胞的表达极少量，提示通

心络可能通过抑制缺血早期小胶质细胞的活化，从

而减少神经毒性物质的释放，达到神经保护的作用。

同时，本文形态学研究提示，脑缺血再灌注损伤

后，在通心络干预下，无论脑梗死侧或对侧脑组织的

含水量随着时间推移均有所下降，脑水肿减轻，脑梗

死的体积也随之减小，电镜下缺血神经元的超微结

构破坏程度亦有所改善，从大体和微观上都证实通

心络对缺血脑损伤的保护作用。

总之，通心络胶囊可能通过清除自由基、减轻钙

超载和抑制炎症反应诸通路减轻缺血脑损伤，具有

一定的神经保护作用。

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(下转第176页)

‘176’

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ropeptide

Yin

aTat

middle

ce把b嘲anery

occlusion

Btmke

reduceB一406．

cerebral

b100d

now肌d

inc嘲脯8in缸ct

volume[J】．Bmin

Re8．

【收稿日期】2008一05—06

2024年3月11日发(作者：但文心)

l

N

神经瘸学与神经康复学杂志2008年9月第5卷第3期J

Neum

“mrehabil，september2008，v01．5，No．3

163

基础研究

通心络胶囊对大鼠脑缺血再灌注损伤的保护作用及其机制

曾丽莉，沈帆霞。刘建荣，

梁

梁。徐洁懿，

陈沁。

陈生弟

(上海交通大学医学羧融羼瑞金医浣掉经杰辩，上海2∞025)

【摘要】日曲研究通心络胶囊对大鼠缺舭再灌注损伤的保护作用及其作用机制。方法99只sD大鼠随机分为通心络治疗

组、通心络预防组及朱用药对照缇，线栓法建立缺血2h鞭灌注损伤模型，再灌没后1

h、1

d朔5

d断头取脑。’rrC测定脑梗死体

积；于激法诗算蓬禽承量；毫镶残察海骂捧缀嚣超镦结搀；羟羧法梭溺S0p会鐾；蕈基矗法捡溺鹾D矗含豢；毙色法稔滋Gs嚣．瓤、

钠一钾一ATP酶、NO含量；免痰荧光观察小胶质细胞活化情况。结蒜在通心络药物干预下，大鼠脑梗死惯4和梗死对侧含水量

减少，脑梗死体积减小，缺血性海马神经细胞坏死肿胀减轻，SOD、GSH．Px和钠一钾一ATP酶含量增加，MDA、N0含慧降低(P《

O。嬲)，小胶爱缨魏瓣表达减少。结论遂心络获囊霹能邋过调节耋囊基、减轻锈凌滚纛搀裁炎症反痘戆终耀瓤刳藏辍瑟袋囊霉

灌注损伤。

【关键诩】缺血再灌注；通心络；

【孛圈分类号l

R743。33

自由熬；炎症

【文髹标浚鹨】A【文章编号】1672—7∞l<2∞8)03一0163一05

ProtectiVe

Effectsof

Tongxinluo(TXL)Capsule

on

CerebralIschemia

Reper量hsio魏l蝴珏ry

i魏Ra童sa魏dl垂s

I蛭eeha魏ism

ZengLili，Shenli’anxia，Liu

Jianron鬈，Liang

Liang，Xu

Jieyi，ChenQin，Chen

Shengdi

《o绎8撵粼燃妒舭㈣i。秽，霆黼泓韵黟￡滋，够i泌抛矗据娩蠢泌8；s蘸o。Z，|；s是8猎是反船olo蟮魄泌站毋，S矗娃甥_}18i

2DDD25，I％流8)

【Abs镑ae量】

gfoup；(参the

1

蝴￡蠢矿乎零

o

illvesl运a协氇e囊e麟pe狂￡ie

a珏d

p黼lee|主ve

e莉6ee|s《零。秘gxinl珏o({xL)on

ee羚bra王is．

Ninety-nine

SD

rats

chemia

reperfusion

injury

in

rats．膨露胁口d奢

and(爹the

8

were

dividedintothree

groups：①me

no瑚al

middlecerebral

3l薹，24塞nd

TxL—treated

group

TxL

preventive

group．

Reversible

occlusion

ofthe

right

efe

a珏a|y$es

was

ea痰ed

o疆￡粒sing8琏efy黏r

2h

w

i臻l橼l毛王mi潮lls狂抛re氆e凌。莲奠kng鑫。墨惫e

method．

pe蠢b魏ed

20hoursafterre—eirculation

in

thethree

groups．The

infarct

was

VoIume

wa8

assessed

by

TTC

8t“ning

andthecerebral

watercontent

measured

bydryweight

TheactiVitie8of

SO

a+一K+一ATPaseand

the

D，GSH—Px

andN

eon|e魏￡s菇N0

a糕纛麓D矗we揩measll擀纛主n氇e

eo趱iea|耋主ss糕e蠡《isehe燃ie

he掇isp瓤e糟。

were

轰etivaled璎ic鳓番i8l

eells

detected

by

immunonuorescence

labeling．

震曰譬口函嘧TXL

8ignific臻ntly

reduced

the

volumeofcerebralinfarct

cor．

and

water

content(P

Ltreated

rats，the

activitie8

of

SO

a+一K+-ATPaseinthe

．05)．In

TX

D，CSH．Px

andN

1ex

of

i转ehem

efe

ie魏e辙isphefe

w

elev戤ed《尹<0．◇5)，w囊ile纛e殛DA

alld嚣O

eo魏耄en量was嚣iglli鑫ca珏|每莲ecfeased

cerebral

ischemi趣reperl．usion

injury

in

rats

byredueing

the

oVerproduction

offbe

iththe

sham

ationof

m

(P<0．05)compared

w

-operatedgmup．The

oVeractiV

icro西ial

ceIl$wasinhibited．(知棚：跏s妇弹

TXLhas

neuroprotectiVe

ef＆ct

on

a纛。魏。

豫dic舔转，blocking氇e

in莹拖eelllll氇re蘸ei娃m

ove娃oa纛and遮纛i辍穗唔the

i皲蠢a拯m

【Keywords】

i8chemia

reperfusion；

Tong】【inluo；fberadicals；

innammation

隧着老龄诧的到来，脑梗死的高发病率、高致残

性和高致死率给患者及其家庭乃至整个社会带来沉

重的负担。如何麓减轻脑组织缺蛊损谯，最大程度

地挽救毕暗带的缺血神经元是目前急待解决的闻

【作者简介】曾丽莉(1976一)，女。巍西人，副主任医师，硕士

蘧。中药制翔通心络胶囊被应用于脑缺巍的治疗，

但治疗作用缺少基础研究支持。本文拟通过动物模

燮研究探讨通心络对缺盘再灌注损饶的僳护与治疗

作用。

耱经癍学≮{孛经漾笈学杂志2∞8年9羹第5器笨3蠲j嚣eH瞄拜eum赫盛《，sep主em孙r2潍8，V蠢．s。蓬o。3

材料与方法

实验动物与分组成年雄性SD大鼠99只，体

重220一2sO

g，随楗分势缺塞再灌注霹照缰《l／R，

站=33)、缺血再灌注通心络治疗组(I／R治，n=33)

和缺血再灌注通心络预防组(I／R预，，l=33)三组。

各缓根据薅灌注后不同时闻点l囊、l

d及5

d再平均

分组，每组各11只。

动物模型建立采用Lollga线栓法…建立大鼠

缺盘再灌注损伤模黧，在右侧大脑中动脉拴塞2

h詹

进行再灌注，分别予再灌注后l

h、1

d和5

d断头取

脑检测，遴过神经功麓评分口1秘髑陀染色p’证实遗

模的成功性。对照组在造模詹即刻及观察期每日腹腔

注射生理盐水2mL；通心络治疗组在造模后即刻及观

察裳每基羧腔注射邋心终o。s∥羹∥2m毛；通心络羲防

组在造模前5

d每日腹腔注射通心络O．5∥k妮mL，

造模后即刻及观察期每日腹腔溅射生理盐水2

mL。

脑含承量大飘在各爵鬻点断头取蕊，左右大

脑半球分开，分别经电光分析天平(分度值o．1mg)

精确称重露，放入lOO℃恒温予燥箱烘烤24h至憾

重后，再精确称干脑组织重量，并按Elliot于湿重法

计算脑皮质含水量，以百分率表示。

脑梗死体积大鼠在各时阕点断头取齄，圭熬

至后每隔2mm厚度做冠状面切开，浸予2％TTC中

30

min，TTC被脑组织线粒体内过氧化氢酶还原，可

使歪常齄缀织被染成深红色，援死娃势囊色。按颓

序依次由前向后由扫描仪将图像信息输入计算机，

用Nikon&Spot图像采集分析系统分别测定脑梗死丽

积，输入跨厚参数，计算盘梗死俸积洋‘。

电镜观察

大鼠各时间点断头取脑，分离出海

骂组织，取米粒大小组织浸泡予2％的戊二醛溶液

中，进行透射电镜超微结构观察。

组织匀浆指标检测大鼠在各时间点断头取

藏，取梗歹乏侧大脑半球皮质，冀匀浆缓狰液圭：9零积

放于匀浆器中研磨均匀，4

ooo

r／min离心10min，取

上清液一20℃保存待测。按南京建成生物工程研究

瘊说明书，采震羟胺法测定越氧诧物歧佬酶(S0芬)

含量，TBA法测定丙二醛(MDA)含量，比色法测定谷

胱甘肽过辍化氢酶(GSH-Px)禽量、一氧化氮(NO)含

量、Na+．K+．矗TP酶活性。

免疫荧光观察小胶质细胞各组动物4％多聚

甲醛常趣心脏灌注，叛头取齄，0c零包埋，一?O℃保

存。标本做冰冻切片，常规处理盾，加抗GFAp抗体

(1：l

000，santa

Cruz公司)，37℃孵育1

h，PBS洗涤

3次。热残零C标记的鼠撬羊lgG(购鑫华美生物工

程公司)检测，甘油一PBS液封片，荧光显微镜观察。

统计学方法所有数据采用SAS统计软件进行

统计分析，数据采用均数尘标准差表示，P<◇．os有

统计学意义。多组数据间比较，采用F检验，然后作

Dunean耨检验求譬值，作蕊两比较。

结果

对大鼠脑客水量的影响(表1)大鼠脑挟趣2

h

再灌注损伤后，从1

h、1

d到5

d，脑梗死侧及对侧含

水量呈先上升_}}l；后下降的趋势。遴心终于预(包括

治疗组和预防组)均能降低相应时闻点的脑梗死侧

及对侧含水量，统计学上具有显著性差异。

衰l遂心终对藏梗死援及嚣攒蔻铡窖承耋豹彰晌(i±s，#=11)

注：缀F检验lh项下，三组经，梭验，=3．85，P=0．03，再缀Duncan

蔟检验gl一2=3．Ol，g=l一3=3．65，与l—R2h缀魄较‘尹

对大鼠脑梗死体积的影响(表2)大鼠脑缺血

2

h再灌注后，从l

h、l

d到5d，脑梗死体积鐾逐步

增大的趋势。通心络予预(包括治疗组和预防组)

后，其脑梗死体积明显小于未用药对照组，差异具有

统计攀意义。

裹2道心络对脑梗觉体积的影响(i±I，n=11)

注：缀，检验与I．R2h组比较’P《0．05

对大鼠缺斑海马神缀元超徽结构的影响

大鼠

脑缺血2h再灌注未焉药对照组可见海马神经元细

神经病学与神经索笈学杂志2()08年9月第5卷第3期J

Neuml

Neumreh8bil+september

2008，V

01．5，No．3

胞核核膜不完熬，核仁溶解消失，染色质固缩边聚，

细胞浆中核糖体减少，高尔基体散在，粗面内质网肿

对犬鼠梗死侧皮质匀浆SoD含爨的影晌(袭3)

大鼠脑缺血2

ll荐灌注焉，从l

h、l

d翻5d，通心

络预防组的梗死侧皮质匀浆SOD含量明显高予朱用

药对照组，差异具有统计誉意义，恧通心络治疗缰

SOD含量较对照组无明显变化。

通心络对大鼠梗死侧皮质匀浆MDA含量的影

晌(表矮)

大鼠艟缺盘2ll褥灌注惹，麸王蠡到5

d，

通心络预防组的梗死侧皮腋匀浆MDA含量明显低

于未用药对照组，治疗组在I／R后5

d

MDA禽量较

对照组氇有所降低，差异吴有统计学意义。

裹3浦心络对梗耗侧皮质匀浆SOD含量的影响(彳±j，n；11)

分翅

lhldSd

1．R对照维

111．3±4．30105．6±4+02101．5士3．79

通心络治疗组

112．2±3．75107．3±3．9898．5士4．58

通心络预防组

126．9±4．12。

114．6±4．15+

109。3土3．54’

尹(尹)

57．1(

15。3≤

注：与I-妣h组比较‘p《O．05，与治疗组比较+P《O．05

襄4濮心终对梗死铡虚质匀浆MDA含量的彰螭(i±；。n—11)

注：与l-R2h组比较+户

对大鼠梗死黼皮质匀浆GSll-PX含量的彩晌

(表5)大鼠脑缺血2h再灌注后，从1

d到5

d，通

心络预防组的梗死侧瘦质匀浆eSH一双含量骥显高

于未用药对照组，差异具有统计学意义。治疗维与

对照组比较含量无变化。

对大氯梗死撰受凌匀浆Na+-X+-舂零P魏瀵性

的影响(表6)犬鼠脑缺做2h再灌注后lh、ld，通

心络预防组和治疗组的梗死侧皮质匀浆Na+一K+。A即

胀。线粒体肿胀或空泡化(图lA)。而通心络干预

组较对照组细胞坏死肿胀明显减轻(图lB)。

酶活性明显离于未用药对照组，差异具有统计学意义，

但汐R后5天两组与对照组相比无明显差异。

对大鼠梗死侧皮质匀浆N0含量的影响(表7)

大鼠脑软盘2}l再灌注嚣，从l

d到5

d，遗心终预

防组的梗死侧皮质匀浆NO含鬣明显低予未用药对

照组，治疗组在I／R腐5

d

N0含量较对照组也有所

降低，差异共有统计掌意义。

袭5通心络对梗死侧皮质匀浆GsH-Px含量的影响(虿±l，Jl=11)

洗：与l-融h缎比较’P

疲6遗心终对攫茏翱瘦质糍浆N叠+-x+穗蕈P蔫诿拽的彰骟《i士j，

注：与1．R2h维眈较+P‘O．05，与治疗缀院较‘P

袭7通，厶络对梗死侧皮质匀浆NO禽量的影响(i盘l，n=11)

浇：与IR2h组比较’P

小胶震绸匏活{l：情提逶心络于预组(匿2嚣、

2C)免疫荧光显示小胶质细施表达明显少子未用药

对照组(图2A)。

神经病学与神经康复学杂志2008年9月第5卷第3期J

Neurol

Neurorehabil．s8ptPmber2008，v01．5．No．3

讨

论

缺血性脑损伤是一个多因素、多机制、多环节的

恶性级联过程，兴奋性氨基酸毒性、钙超载、自由基

反应、梗死周围除极化、炎症和细胞凋亡是造成缺血

性脑损伤的中心环节。

脑缺血再灌注发生时，自由基的连锁级联反应

触发，大量的氧自由基产生释放，攻击膜蛋白质，核

酸及生物膜上的不饱和脂肪酸，参与脂质过氧化过

程，产生脂质过氧化物如MDA，造成细胞损伤，因此

清除自由基，对于减轻脑损伤，阻断缺血后级联损伤

反应有着十分重要的意义。而SOD、GSH—PX是两种

能有效清除体内单线态氧、超氧阴离子、羟自由基等

多种自由基的抗氧化酶，能减轻缺血缺氧时脂质过

氧化的损伤¨1。本研究显示随着缺血再灌注后时间

的推移(从1h到5d)，大鼠梗死侧脑的MDA含量

呈进行性升高，同时自由基清除剂sOD和GSH．Px

的活性降低，提示氧自由基参与了缺血损伤机制。

而腹腔注射通心络后，无论预防组还是治疗组，MDA

含量均有所下降，SOD和GSH．Px表达均有所增加，

提示通心络可能通过调节自由基作用达到对缺血神

经元的保护作用。

缺血再灌注可造成钙稳态失衡，一方面是由于

钠平衡障碍所致：缺血引起细胞膜Na+．K+泵功能障

碍，从而使钠、水在细胞内潴留，细胞肿胀，然后又依

Na+一Ca2+交换机制使细胞外钙大量内流造成细胞内

钙超载。另一方面，再灌注时氧自由基的大量产生，

其引发细胞膜脂质过氧化，使膜受损，通透性增高，

故在灌注时细胞外钙顺着浓度梯度而大量内流细胞

内钙超载，细胞功能紊乱，出现细胞生物膜损害，线

粒体肿胀，氧化磷酸化过程发生障碍，能量代谢受

阻，导致神经元不可逆性死亡。我们的研究显示随

着缺血损伤的加重，Na+．K+．ATP酶的活性降低，脂

质过氧化物含量增高。而通心络的使用，能减少脂

质过氧化物的含量，增强Na+一K+一ATP酶的活性，可

能通过此抑制钙超载内流减轻脑缺血再灌注损伤。

当脑缺血再灌注损伤发生时，会引发一系列细

胞及分子变化，其中一个重要现象就是胶质细胞活

化，即反应性胶化过程。胶质细胞在缺血早期即被

活化，释放大量的免疫介质、NO、氧自由基和其他毒

性物质，有些物质可能直接具有神经毒性，或间接吸

引各类炎性细胞，再次释放毒性物质，造成二度神经

损伤№。7J。本实验免疫荧光结果也显示在大鼠缺血

2

h再灌注后lh，梗死侧海马区及皮质区可见较多

量的小胶质细胞表达，同时伴有梗死侧大脑匀浆氧

自由基和N0含量的升高，提示缺血再灌注早期小胶

质细胞的活化及其释放氧自由基和NO所造成的神

经毒性可能是缺血损伤发生的机制之一。在通心络

治疗组和预防组，小胶质细胞的表达极少量，提示通

心络可能通过抑制缺血早期小胶质细胞的活化，从

而减少神经毒性物质的释放，达到神经保护的作用。

同时，本文形态学研究提示，脑缺血再灌注损伤

后，在通心络干预下，无论脑梗死侧或对侧脑组织的

含水量随着时间推移均有所下降，脑水肿减轻，脑梗

死的体积也随之减小，电镜下缺血神经元的超微结

构破坏程度亦有所改善，从大体和微观上都证实通

心络对缺血脑损伤的保护作用。

总之，通心络胶囊可能通过清除自由基、减轻钙

超载和抑制炎症反应诸通路减轻缺血脑损伤，具有

一定的神经保护作用。

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(下转第176页)

‘176’

神经病学与神经康复学杂志2008年9月第5卷第3期J

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【收稿日期】2008一05—06