2024年3月12日发(作者：罕小翠)
广东医学２０１０年８月第３１卷第１６期 Ｇｕａｎｇｄｏｎｇ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｊｏｕｒｎ￣Ａｕｇ．２０１０，Ｖｏ１．３１，Ｎｏ．１６
ＭＬＰＡ和多重ＰＣＲ法检测假肥大性肌营养不良
患者ＤＭＤ基因突变术
王谦 ，汪晶 ，林长坤。，崔婉婷。，麻宏伟 ，武盈玉 ，金春莲
中国医科大学高职学院（沈阳１１０００１）；。中国医科大学附属第一医院著名专家门诊（沈阳ｌ１０００１）；’中国医科
大学遗传教研室（沈阳Ｉ１０００１）； 中国医科大学盛京医院儿科（沈阳Ｉ１０００３）
【摘要】 目的应用多重连接依赖式探针扩增（ＭＬＰＡ）法和多重ＰＣＲ法对临床诊断为假肥大性肌营养不
良患者进行基因诊断，并比较两种方法检测ＤＭＤ基因缺失和重复改变的效果。方法选择２００５年至２００７年在
中国医科大学盛京医院儿科就诊的５ｌ例ＤＭＤ患者和８例ＢＭＤ患者。采用ＭＬＰＡ法对经多重ＰＣＲ法检测过的
患者的ＤＭＤ基因的缺失／重复突变进行突变筛查，同时对先证者的母亲进行基因的缺失／重复突变检测。结果
用多重ＰＣＲ方法在５９例假肥大性肌营养不良症患者中检测到３１例患者有外显子缺失。ＭＬＰＡ检测出３３例外显
子缺失，６例外显子重复和１例点突变，同时检测出２６例患儿的母亲为携带者。ＭＬＰＡ比多重ＰＣＲ多检测出１０
例ＤＭＤ基因突变，两种方法共同检测出的３０例突变中ＭＬＰＡ检测出１６例基因突变范围比多重ＰＣＲ大。结论
与多重ＰＣＲ法相比，ＭＬＰＡ更加简便、快捷、可靠，同时可以对携带者进行诊断，是一种高效的遗传病基因诊断手段。
【关键词】假肥大性肌营养不良症；多重连接依赖式探针扩增；多重ＰＣＲ；缺失／重复突变
假肥大性肌营养不良症是一种严重的神经肌肉疾 度计测定ＤＮＡ纯度和浓度。将ＤＮＡ浓度控制在５０～
病，分为ＤＭＤ（ｄｕｃｈｅｎｎｅ ｍｕｓｃｕｌａｒ ｄｙｓｔｒｏｐｈｙ）和ＢＭＤ
２００ ｒｉｇ／ｔｘＬ。
（ｂｅｃｋｅｒ ｍｕｓｃｕｌａｒ ｄｙｓｔｒｏｐｈｙ），均是由于ＤＭＤ基因
１．２．２ ＭＬＰＡ检测所有反应在标准的盖温为１０５ｃＩ＝
（Ｘｐ２１．２）突变所致 。它是人类已知的最长的基因，
的ＰＣＲ仪上进行。（１）ＤＮＡ变性和ＳＡＬＳＡ ＭＬＰＡ探针
ｃＤＮＡ长达１４ｋｂ，含７９个外显子，编码３６８５个氨基酸。
杂交，反应体系如下：稀释ＤＮＡ样品（５０～２００ ｎｇ）加
ＤＭＤ是最常见的ｘ一连锁隐性致死性遗传病，新生男
ＴＥ至５ Ｌ。９８℃加热５ ｍｉｎ，开盖之前冷却到２５￣Ｃ。
性婴儿中的发病率为１／３ ５００ 。患者一般在３～５岁
分别加入１．５ ｔｘＬ Ｐ０３４／Ｐ０３５探针混合物和１．５ Ｌ
时发病，主要表现为全身骨骼肌进行性无力、萎缩和小
ＭＬＰＡ ｂｕｆｆｅｒ。小心混匀，９５ ｃ【＝孵育１ ｍｉｎ，６０℃杂交
腿腓肠肌假性肥大。随着病情加重，大多数患者在２０
岁左右死于呼吸衰竭。ＢＭＤ是一种较轻的神经肌肉
１６ ｈ。（２）连接反应，反应体系如下：温度降至５４℃，
疾病，发病率约为１／１２ ０００。大约６５％的ＤＭＤ和
加入连接混合物（３ 连接缓冲液Ａ、３ 连接缓冲
８５％的ＢＭＤ患者是由于ＤＭＤ基因的大片段缺失所
液Ｂ、２５ Ｌ水、１ ｔｘＬ连接酶一６５），５４℃孵育１５ ｍｉｎ，
致。有两个基因缺失热区分别位于ＤＭＤ基因外显子
９８℃加热５ ｍｉｎ。（３）ＰＣＲ反应总体积为５０ ，反应体
３～１９和外显子４５～５３。其他的突变包括基因片段重
系如下：１０ ＩＬＬ ＭＬＰＡ连接反应产物，４ Ｌ的ＳＡＬＳＡ
复（５％～１０％）和点突变（２０％一２５％） 。鉴于本病
ＰＣＲ ｂｕｆｆｅｒ，２６ ＩｘＬ水。在ＰＣＲ仪上加温至６Ｏ℃时，加
至今没有有效的治疗方法，因此高效、准确的ＤＭＤ致
入酶混合物（２ Ｌ ＳＡＬＳＡ ＰＣＲ引物，２ ＩｘＬ ＳＡＬＳＡ酶溶
病基因诊断、携带者检测及正确的遗传咨询是预防本
解ｂｕｆｆｅｒ，５．５ Ｌ水，０．５ ＩｘＬ ＳＡＬＳＡ聚合酶）。ＰＣＲ反
病的关键。本研究分别采用多重连接依赖式探针扩增
应条件为：９５℃３０ Ｓ、６０℃３０ Ｓ、７２ｏＣ ６０ Ｓ循环３５
法（ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｌｉｇａｔｉｏｎ ｐｒｏｂｅ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ，ＭＬＰＡ）和多重
次，７２℃延伸２０ ｍｉｎ。
ＰＣＲ法检测ＤＭＤ基因缺失／重复突变，并对两种方法
１．２．３ 毛细管电泳检测（ＡＢＩ ３１３０ＸＬ） １ ｐ，Ｌ ＰＣＲ产
的检测结果进行了比较。
物与０．５ Ｌ Ｇｅｎｅｓｅａｎ—Ｒｏｘ ５００和８．５ Ｌ去离子甲酰
１资料与方法
胺混合，在３６ｃｍ长的毛细管上电泳１ｈ，温度控制在
１．１ 一般资料５９例假肥大性肌营养不良家系外周
６０￣Ｃ。由于有内标作为参照，每个峰都可以代表一个
血来自２００５－－２００７年在中国医科大学盛京医院儿科
外显子。每次ＭＬＰＡ检测都包括一个正常的对照样
就诊的患者及其父母。其中有５ｌ例ＤＭＤ，８例ＢＭＤ，
本，检测结果都经过两次独立的试验证实。
基因表型正常的父母。诊断标准依赖体格检查、家族
１．２．４多重ＰＣＲ检测设计３组包含ＤＭＤ基因外显
史、肌酸激酶水平、肌电图、发病年龄、疾病的进展情况
子突变热点ＰＣＲ引物 Ｊ。第１组包括外显子１９、４３、４５
等。所有标本的使用均经患者知情并同意。
和３４。第２组包括外显子５１、ｌ２、５０和５３。第３组包
１．２ 方法
括外显子４８、ｌ７、８和５２。ＰＣＲ反应总体系为５０ Ｌ，
１．２．１饱和氯化钠法提取基因组ＤＮＡ紫外分光光
包括２５０～５００ｎｇ基因组ＤＮＡ，１０×ｂｕｆｆｅｒ，０．２￣ｍｏｌ／Ｌ
引物，２００ Ｉｘｍｏｌ／Ｌ ｄＮＴＰ，１ Ｕ Ｔａｑ ＤＮＡ聚合酶。ＰＣＲ反
国家十一五攻关课题（编号：２００６ＢＡ１０５Ａ０８）
应条件为：９５℃变性６ ｍｉｎ，以９４￣Ｃ １ ｍｉｎ、复性温度
△通信作者。Ｅ—ｍａｉｌ：ｊｃｈｌｃｍｕ＠１２６．ｔｏｍ
５８ｏＣ １ ｍｉｎ、７２℃１ ｍｉｎ循环３０次，７２℃延伸１０ ｍｉｎ。
．
２１００． 查垦兰 ！ 篁 旦笙 堂箜 塑 ！ 鲤！ ！ ！ 垒 ： ！ ！ ：！ ！ ！： ！
所有ＰＣＲ产物经１％聚丙烯酰胺凝胶电泳检测确认。
ＭＬＰＡ和多重ＰＣＲ均未检测到突变（图１）。多重ＰｃＲ
１．３ 统计学方法每个探针的相对信号强度的计算
检测出的３１例突变中，只有ｌ４例的检测结果与ＭＬＰＡ
方法是实际测定的峰面积（Ａｓ）与所有４５个峰面积
一
致（图２）。剩余１７例中发现１６例有更多外显子缺失
（∑Ａｓ）之比，然后再用这个值（Ａｓ／∑Ａｓ）与正常对照 和１例假阳性结果。更重要的是在２８例用多重ＰＣＲ未
的相应探针的相对峰面积（Ａｃ／∑Ａｃ）进行比对所得到
检测到突变的患者中，ＭＬＰＡ发现了ｌ０例突变，包括３
的比值。为了自动化的分析这个比值，我们用Ｃｏｆｆａｌｙｓ－ 例外显子缺失，１例单碱基缺失和６例外显子重复（表
ｅｒ软件进行分析。由于ＤＭＤ基因位于ｘ染色体上，男 １，图３）；同时检测到２６例患儿的母亲为携带者。
性患者如果缺失一个或多个外显子，经ＭＬＰＡ检测将
２．２分析断裂点的特点在３３例已知外显子缺失病
导致相应外显子产物缺失，即缺失外显子的信号全部
例中，８１．８％（２７例）的缺失位于中央热区，１５．２％（５
消失，重复区表现出信号成倍增加。女性患者或携带
例）的缺失位于５ 端。其中有１例从外显子１８到外显
者，相应的外显子缺失信号将降低３５％一５５％，而重 子４７的大的缺失。如果把６例重复突变计算在内，内
复突变时相应的信号将升高３０％～５５％。
含子４４是最常见的断裂点（ｎ＝１３，３３．３％），内含子
２结果
５０和４５居第二位（／７，：１１，２８．２％）和第三位（，ｌ＝８，
２．１ 比较ＭＬＰＡ和多重ＰＣＲ在检测基因缺失／重复中
２０．５％）。６例重复突变中的４例突变位点位于外显
的有效性 ５９例ＤＭＤ／ＢＭＤ患者中，有１８例患者用
子１～２０。
…
９９：先证者，外显子４６、４７、４８、４９、５Ｏ缺失；１００：携带者母亲；１０１：正常男性对照
图１ 采用ＭＬＰＡ及多重ＰＣＲ均未检测到突变患者毛细管电泳结果
表１ ＭＬＰＡ检测到而多重ＰＣＲ未检测到的１０例突变
先证者和待检样本都存在外显子４５缺失。１：ＤＩ２０００ ＤＮＡ ｍａｒｋｅｒ；
２－４：分别为先证者、正常对照、待检样品的４８、１７、８、５２外显子检测
结果；５—７：分别为先证者、正常对照、待检样品的１９．４３．４５、３４外显子
３讨论
检测结果；８—１Ｏ：分别为５１、ｌ２、５０、５３外显子检测结果。
ＭＬＰＡ方法由荷兰学者Ｓｃｈｏｕｔｅｎ等于２００２年
图２采用多重ＰＣＲ对Ｄｕｃｈｅｎｎｅ肌营养不良症（ＤＭＤ）基因１２个外
建立 。他是利用简单的杂交、连接、ＰＣＲ扩增反应，于
显子进行同步检测的结果
广东医学２０１０年８月第３１卷第ｌ６期 Ｇｕａｎｇｄｏｎｇ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｊｏｕｒｎａｌ Ａｕｇ．２０１０，Ｖｏ１．３１，Ｎｏ．１６
・
２１Ｏ１・
９１３：患者，外显子２重复；８７２：正常男性对照
图３ ＭＬＰＡ检测到突变患者毛细管电泳结果
单一反应管内同时检测最多４０个不同的核苷酸序列
携带者做出基因诊断。ＭＬＰＡ方法除操作简便外，还
的拷贝数变化。原理是针对不同检测序列设计多组专 可以克服其他常用技术的一些缺点。例如，Ｓｏｕｔｈｅｒｎ
一
的探针组，然后对探针组进行扩增，每组探针组长
印迹技术需要同位素，ＤＮＡ用量大。最常用的多重
度不同，可与目标序列杂交黏合。所有探针的５ 端都 ＰＣＲ技术，有报道说可以检测到缺失热点的１８个外显
有通用引物结合区ＰＢＳ（ｐｒｉｍｅｒ ｂｉｎｄｉｎｇ ｓｉｔｅｓ），３ 端都 子，能检测出９８％的突变，但与我们得出的数据有些
有与待扩增目标序列结合区，在ＰＢＳ区与目标序列结
差异。此外，ＤＭＤ患儿中１／３是新生突变，２／３是由遗
合区之间插入不同长度的寡核苷酸，由此形成长度不 传而来，而多重ＰＣＲ和连锁分析法必须有先证者，如
一
的探针组。如果目标序列缺失、突变，则这组探针 果先证者去世或为新生突变所致，就无法利用多重
无法成功连接，也没有相应的扩增反应。如果某组探 ＰＣＲ做产前诊断或携带者检测。而且这种方法与ＭＬ－
针可与目标序列完全黏合，则连接酶会将这组探针连
ＰＡ相比耗时，准确性有限（在检测重复突变方面，多重
接成为一个片段，并通过标记的通用引物对此连接在
ＰＣＲ有局限性，而且灵敏度不高）。ＭＬＰＡ更明确了２６
一
起的探针组进行扩增。最终经过毛细管电泳和激光
例缺失和重复突变的范围。这可能是由于ＭＬＰＡ比多
诱导的荧光标志物来检测扩增产物。ＭＬＰＡ属于一种 重ＰＣＲ检测了更多的外显子，ＭＬＰＡ探针包含ＤＭＤ基
高通量ＤＮＡ拷贝数检测技术。在欧洲已有多家遗传
因所有的７９个外显子结合序列，而我们实验室以前采
医学中心及实验室利用此技术协助进行基因序列的检
用的多重ＰＣＲ方法只能检测到该基因缺失热区的ｌ２
测。
个外显子缺失情况，而一些非热区的缺失突变和其他
ＤＭＤ基因内一个或多个外显子的缺失占所有突 类型的突变包括重复突变、点突变无法检测到。１９例
变的５０％一７０％，大多数缺失位于热点区域，跨越外
患者经多重ＰＣＲ方法和ＭＬＰＡ方法检测后，仍未发现
显子４５～５３，最常见的缺失是外显子４５和外显子４５～
突变。可能是存在一些我们没有发现的小突变，或者
４７ 。单个或多个外显子的重复占５％～１０％，最常见
这些突变位于内含子区域 ；另一种可能也不排除我
的是单个外显子２的重复，占所有重复的６％ Ｊ。与缺
们入选的患者中ＤＭＤ基因并未发生突变。
失相比，重复发生的热点区域较小，从外显子２～
ＭＬＰＡ方法可以检测出ＤＭＤ基因７９个外显子拷
２０ 。ＭＬＰＡ Ｐ０３４／０３５试剂盒可以同时进行ＤＭＤ基
贝数改变（缺失、重复、携带者），与多重ＰＣＲ方法相
因７９个外显子缺失／重复突变的筛查，所有反应在两 比，能够同时检测更多的外显子突变，而且简便、可靠、
个管中进行。并且杂交探针涉及ＤＭＤ基因所有外显
灵敏度高，建议在有条件的研究机构和医院推广使用。
子，不单纯是缺失热点区，这样就避免遗漏新发生缺失
参考文献
或重复突变的区域。ＭＬＰＡ是一种定量和半定量技
［１］ ＭＵＮＴＯＮＩ Ｆ，ＴＯＲＥＬＬＩ Ｓ，ＦＥＲＬＩＮＩ，ｅｔ ａ１．Ａ Ｄｙｓｔｒｏｐｈｉｎ ａｎｄ
术，其融合了ＤＮＡ探针杂交和ＰＣＲ技术的特点，不仅
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能检测缺失和重复突变，也能检测基因拷贝数，可以对
Ｌａｎｃ￣Ｎｅｕｒｏｌ，２００３，２（１２）：７３１—７４０． ’
・
２１０２・ 广东医学２０１０年８月第３１卷第１６期 Ｇｕａｎｇｄｏｎｇ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｊｏｕｒｎａｌ Ａｕｇ．２０１０，Ｖｏ１．３１，Ｎｏ．１６
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养不良蛋白基因缺失类型的研究［Ｊ］．中华妇产科杂志，
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ｑｕａｎｔｉｉｆｃａｔｉｏｎ ｏｆ ４０ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｂｙ ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ ｌｉｇａｔｉｏｎ— ｇｅｎｅ ｍｕｔａｔｉｏｎｓ ａｍｏｎｇ Ｃｈｉｎｅｓｅ ｐａｔｉｅｎｔｓ ａｓ ｒｅｖｅａｌｅｄ ｂｙ ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ
ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｐｒｏｂｅ ａｍｐｌｉｉｆｃａｔｉｏｎ［Ｊ］．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ，２００２，３０ ｌｉｇａｔｉｏｎ—ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｐｒｏｂｅ ａｍｐｌｉｉｆｃａｔｉｏｎ［Ｊ］．Ｇｅｎｅｔ Ｔｅｓｔ Ｍｏｌ Ｂｉｏ－
（１２）：ｅ５７．
ｍａｒｋｅｒｓ，２００９，ｌ３（１）：２３—３０．
［６］ ＢＥＧＧＳ Ａ Ｇ，ＫＯＥＮＩＮＧ Ｍ，ＢＯＹＣＥ Ｆ Ｍ，ｅｔ ａ１．Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ （收稿日期：２０１０—０１—２４编辑：王冰）
真菌性鼻窦炎的ＣＴ表现及应用价值
李锋 ，刘克
‘广州亿仁医院影像中心（广州５１０７２５）； 广州医学院第二附属医院放射科（广州５１０２６０）
【摘要】 目的探讨真菌性鼻窦炎的ｃＴ特征性表现及ｃＴ的应用价值。方法 回顾性分析１６例经病理证
实的真茵性鼻窦炎的ＣＴ表现。结果真菌性鼻窦炎主要ｃＴ表现有：病变为单侧性；病变主要位于上颌窦、蝶窦，
累及同侧鼻腔和鼻窦；病变窦腔密度增高，不均匀，内有小团块、沙砾状、短条状钙化样密度区；可有骨质破坏。结
论真菌性鼻窦炎ＣＴ表现具有特异性，ＣＴ是诊断该病有价值的方法。
【关键词】 真菌性鼻窦炎；ＣＴ；诊断
真菌性鼻窦炎是鼻一鼻窦腔的真菌感染性疾病，
及鼻腔，密度不同程度增高，质地不均，ＣＴ值４５—７５
可分为非侵袭型真菌性鼻窦炎和侵袭型真菌性鼻窦
Ｈｕ，较软组织密度高。１２例病变内可见絮状、小团块
炎。近年来，随着鼻内镜技术、病理检查及真菌培养工
状、多发散在沙砾状、小条状钙化灶（图１～２），分别位
作的普遍开展，临床发现真菌性鼻窦炎病例明显增多。
于病灶中央、病灶接近窦口处或病灶鼻腔内部分。
本文回顾性分析２００２年９月至２００８年１１月期间１６
２．２．２ 窦腔及窦壁改变 １６例中１１例有反应性骨增
例经手术、病理证实的真菌性鼻窦炎，以探讨本病的
生，窦壁增厚；３例上颌窦窦腔变小；６例上颌窦口扩大
ＣＴ特征表现及ＣＴ的应用价值。
（图１一Ｃ）。８例窦壁骨质破坏，其中上颌窦内壁骨质
１资料与方法
破坏及（或）顶壁骨质破坏６例，蝶窦底或顶壁骨质破
１．１ 一般资料本组１６例病例中，男ｌ２例，女４例； 坏２例。骨质破坏表现为骨质局限性缺损、消失，边缘
年龄３ｌ～６８岁；病程９个月至３１年。主要症状有：间 硬化、锐利，无虫蚀状改变和残存骨碎片。病变通过扩
隔性脓涕或回抽性涕中带血、耳呜、听力下降、面部肌
大的上颌窦口或窦壁骨缺损区突入鼻腔７例（图１一
肉麻痹、间隔性头痛、患侧面部及额顶部压迫感或隐
Ｂ），突人筛窦６例，突人颅内１例（图２）。表现为局灶
痛。其中糖尿病患者２例，所有病例未见有肿瘤及免
性高密度灶，边缘光整，与周围组织分界清楚。
疫缺陷患者。所有病例行鼻内镜下鼻窦开放窦腔病变
组织清除术，病变组织送病理学检查，ｌ４例找到真菌
丝或孢子，２例经过培养见真菌。
１．２ ＣＴ检查采用ＳＨ／ＭＡＤＺＵ６８００型或ＧＥ ｈｉｓｐｅｅｄ ｄｕ—
ａｌ型ＣＴ扫描装置，横轴位和（或）冠状位扫描，层厚５ ｉｌｌ／ｎ。
２结果
圈
２．１ 发病部位本组１６例均为单侧发病。其中１４
Ａ：左侧上颌窦内高密度影充填，其中可见团块状、条状钙化影；Ｂ：
左侧上颌窦内侧壁骨质破坏，窦腔内充填高密度影并突人左侧鼻腔，
例主要位于上颌窦，４例累及同侧筛窦；２例主要位于
其中可见絮状、小块状及条状钙化影；Ｃ：左侧上颌窦口扩大，窦腔及
蝶窦，并累及同侧筛窦；６例同时合并细菌性鼻窦炎。
内左侧中鼻道充填以高密度影，其中左侧中鼻道病灶内可见沙砾状
２．２ ＣＴ表现
及条状钙化影
２．２．１病变密度ｌ６例受累上颌窦、筛窦、蝶窦窦腔
图１ 左侧上颌窦真菌性鼻窦炎
2024年3月12日发(作者：罕小翠)
广东医学２０１０年８月第３１卷第１６期 Ｇｕａｎｇｄｏｎｇ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｊｏｕｒｎ￣Ａｕｇ．２０１０，Ｖｏ１．３１，Ｎｏ．１６
ＭＬＰＡ和多重ＰＣＲ法检测假肥大性肌营养不良
患者ＤＭＤ基因突变术
王谦 ，汪晶 ，林长坤。，崔婉婷。，麻宏伟 ，武盈玉 ，金春莲
中国医科大学高职学院（沈阳１１０００１）；。中国医科大学附属第一医院著名专家门诊（沈阳ｌ１０００１）；’中国医科
大学遗传教研室（沈阳Ｉ１０００１）； 中国医科大学盛京医院儿科（沈阳Ｉ１０００３）
【摘要】 目的应用多重连接依赖式探针扩增（ＭＬＰＡ）法和多重ＰＣＲ法对临床诊断为假肥大性肌营养不
良患者进行基因诊断，并比较两种方法检测ＤＭＤ基因缺失和重复改变的效果。方法选择２００５年至２００７年在
中国医科大学盛京医院儿科就诊的５ｌ例ＤＭＤ患者和８例ＢＭＤ患者。采用ＭＬＰＡ法对经多重ＰＣＲ法检测过的
患者的ＤＭＤ基因的缺失／重复突变进行突变筛查，同时对先证者的母亲进行基因的缺失／重复突变检测。结果
用多重ＰＣＲ方法在５９例假肥大性肌营养不良症患者中检测到３１例患者有外显子缺失。ＭＬＰＡ检测出３３例外显
子缺失，６例外显子重复和１例点突变，同时检测出２６例患儿的母亲为携带者。ＭＬＰＡ比多重ＰＣＲ多检测出１０
例ＤＭＤ基因突变，两种方法共同检测出的３０例突变中ＭＬＰＡ检测出１６例基因突变范围比多重ＰＣＲ大。结论
与多重ＰＣＲ法相比，ＭＬＰＡ更加简便、快捷、可靠，同时可以对携带者进行诊断，是一种高效的遗传病基因诊断手段。
【关键词】假肥大性肌营养不良症；多重连接依赖式探针扩增；多重ＰＣＲ；缺失／重复突变
假肥大性肌营养不良症是一种严重的神经肌肉疾 度计测定ＤＮＡ纯度和浓度。将ＤＮＡ浓度控制在５０～
病，分为ＤＭＤ（ｄｕｃｈｅｎｎｅ ｍｕｓｃｕｌａｒ ｄｙｓｔｒｏｐｈｙ）和ＢＭＤ
２００ ｒｉｇ／ｔｘＬ。
（ｂｅｃｋｅｒ ｍｕｓｃｕｌａｒ ｄｙｓｔｒｏｐｈｙ），均是由于ＤＭＤ基因
１．２．２ ＭＬＰＡ检测所有反应在标准的盖温为１０５ｃＩ＝
（Ｘｐ２１．２）突变所致 。它是人类已知的最长的基因，
的ＰＣＲ仪上进行。（１）ＤＮＡ变性和ＳＡＬＳＡ ＭＬＰＡ探针
ｃＤＮＡ长达１４ｋｂ，含７９个外显子，编码３６８５个氨基酸。
杂交，反应体系如下：稀释ＤＮＡ样品（５０～２００ ｎｇ）加
ＤＭＤ是最常见的ｘ一连锁隐性致死性遗传病，新生男
ＴＥ至５ Ｌ。９８℃加热５ ｍｉｎ，开盖之前冷却到２５￣Ｃ。
性婴儿中的发病率为１／３ ５００ 。患者一般在３～５岁
分别加入１．５ ｔｘＬ Ｐ０３４／Ｐ０３５探针混合物和１．５ Ｌ
时发病，主要表现为全身骨骼肌进行性无力、萎缩和小
ＭＬＰＡ ｂｕｆｆｅｒ。小心混匀，９５ ｃ【＝孵育１ ｍｉｎ，６０℃杂交
腿腓肠肌假性肥大。随着病情加重，大多数患者在２０
岁左右死于呼吸衰竭。ＢＭＤ是一种较轻的神经肌肉
１６ ｈ。（２）连接反应，反应体系如下：温度降至５４℃，
疾病，发病率约为１／１２ ０００。大约６５％的ＤＭＤ和
加入连接混合物（３ 连接缓冲液Ａ、３ 连接缓冲
８５％的ＢＭＤ患者是由于ＤＭＤ基因的大片段缺失所
液Ｂ、２５ Ｌ水、１ ｔｘＬ连接酶一６５），５４℃孵育１５ ｍｉｎ，
致。有两个基因缺失热区分别位于ＤＭＤ基因外显子
９８℃加热５ ｍｉｎ。（３）ＰＣＲ反应总体积为５０ ，反应体
３～１９和外显子４５～５３。其他的突变包括基因片段重
系如下：１０ ＩＬＬ ＭＬＰＡ连接反应产物，４ Ｌ的ＳＡＬＳＡ
复（５％～１０％）和点突变（２０％一２５％） 。鉴于本病
ＰＣＲ ｂｕｆｆｅｒ，２６ ＩｘＬ水。在ＰＣＲ仪上加温至６Ｏ℃时，加
至今没有有效的治疗方法，因此高效、准确的ＤＭＤ致
入酶混合物（２ Ｌ ＳＡＬＳＡ ＰＣＲ引物，２ ＩｘＬ ＳＡＬＳＡ酶溶
病基因诊断、携带者检测及正确的遗传咨询是预防本
解ｂｕｆｆｅｒ，５．５ Ｌ水，０．５ ＩｘＬ ＳＡＬＳＡ聚合酶）。ＰＣＲ反
病的关键。本研究分别采用多重连接依赖式探针扩增
应条件为：９５℃３０ Ｓ、６０℃３０ Ｓ、７２ｏＣ ６０ Ｓ循环３５
法（ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｌｉｇａｔｉｏｎ ｐｒｏｂｅ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ，ＭＬＰＡ）和多重
次，７２℃延伸２０ ｍｉｎ。
ＰＣＲ法检测ＤＭＤ基因缺失／重复突变，并对两种方法
１．２．３ 毛细管电泳检测（ＡＢＩ ３１３０ＸＬ） １ ｐ，Ｌ ＰＣＲ产
的检测结果进行了比较。
物与０．５ Ｌ Ｇｅｎｅｓｅａｎ—Ｒｏｘ ５００和８．５ Ｌ去离子甲酰
１资料与方法
胺混合，在３６ｃｍ长的毛细管上电泳１ｈ，温度控制在
１．１ 一般资料５９例假肥大性肌营养不良家系外周
６０￣Ｃ。由于有内标作为参照，每个峰都可以代表一个
血来自２００５－－２００７年在中国医科大学盛京医院儿科
外显子。每次ＭＬＰＡ检测都包括一个正常的对照样
就诊的患者及其父母。其中有５ｌ例ＤＭＤ，８例ＢＭＤ，
本，检测结果都经过两次独立的试验证实。
基因表型正常的父母。诊断标准依赖体格检查、家族
１．２．４多重ＰＣＲ检测设计３组包含ＤＭＤ基因外显
史、肌酸激酶水平、肌电图、发病年龄、疾病的进展情况
子突变热点ＰＣＲ引物 Ｊ。第１组包括外显子１９、４３、４５
等。所有标本的使用均经患者知情并同意。
和３４。第２组包括外显子５１、ｌ２、５０和５３。第３组包
１．２ 方法
括外显子４８、ｌ７、８和５２。ＰＣＲ反应总体系为５０ Ｌ，
１．２．１饱和氯化钠法提取基因组ＤＮＡ紫外分光光
包括２５０～５００ｎｇ基因组ＤＮＡ，１０×ｂｕｆｆｅｒ，０．２￣ｍｏｌ／Ｌ
引物，２００ Ｉｘｍｏｌ／Ｌ ｄＮＴＰ，１ Ｕ Ｔａｑ ＤＮＡ聚合酶。ＰＣＲ反
国家十一五攻关课题（编号：２００６ＢＡ１０５Ａ０８）
应条件为：９５℃变性６ ｍｉｎ，以９４￣Ｃ １ ｍｉｎ、复性温度
△通信作者。Ｅ—ｍａｉｌ：ｊｃｈｌｃｍｕ＠１２６．ｔｏｍ
５８ｏＣ １ ｍｉｎ、７２℃１ ｍｉｎ循环３０次，７２℃延伸１０ ｍｉｎ。
．
２１００． 查垦兰 ！ 篁 旦笙 堂箜 塑 ！ 鲤！ ！ ！ 垒 ： ！ ！ ：！ ！ ！： ！
所有ＰＣＲ产物经１％聚丙烯酰胺凝胶电泳检测确认。
ＭＬＰＡ和多重ＰＣＲ均未检测到突变（图１）。多重ＰｃＲ
１．３ 统计学方法每个探针的相对信号强度的计算
检测出的３１例突变中，只有ｌ４例的检测结果与ＭＬＰＡ
方法是实际测定的峰面积（Ａｓ）与所有４５个峰面积
一
致（图２）。剩余１７例中发现１６例有更多外显子缺失
（∑Ａｓ）之比，然后再用这个值（Ａｓ／∑Ａｓ）与正常对照 和１例假阳性结果。更重要的是在２８例用多重ＰＣＲ未
的相应探针的相对峰面积（Ａｃ／∑Ａｃ）进行比对所得到
检测到突变的患者中，ＭＬＰＡ发现了ｌ０例突变，包括３
的比值。为了自动化的分析这个比值，我们用Ｃｏｆｆａｌｙｓ－ 例外显子缺失，１例单碱基缺失和６例外显子重复（表
ｅｒ软件进行分析。由于ＤＭＤ基因位于ｘ染色体上，男 １，图３）；同时检测到２６例患儿的母亲为携带者。
性患者如果缺失一个或多个外显子，经ＭＬＰＡ检测将
２．２分析断裂点的特点在３３例已知外显子缺失病
导致相应外显子产物缺失，即缺失外显子的信号全部
例中，８１．８％（２７例）的缺失位于中央热区，１５．２％（５
消失，重复区表现出信号成倍增加。女性患者或携带
例）的缺失位于５ 端。其中有１例从外显子１８到外显
者，相应的外显子缺失信号将降低３５％一５５％，而重 子４７的大的缺失。如果把６例重复突变计算在内，内
复突变时相应的信号将升高３０％～５５％。
含子４４是最常见的断裂点（ｎ＝１３，３３．３％），内含子
２结果
５０和４５居第二位（／７，：１１，２８．２％）和第三位（，ｌ＝８，
２．１ 比较ＭＬＰＡ和多重ＰＣＲ在检测基因缺失／重复中
２０．５％）。６例重复突变中的４例突变位点位于外显
的有效性 ５９例ＤＭＤ／ＢＭＤ患者中，有１８例患者用
子１～２０。
…
９９：先证者，外显子４６、４７、４８、４９、５Ｏ缺失；１００：携带者母亲；１０１：正常男性对照
图１ 采用ＭＬＰＡ及多重ＰＣＲ均未检测到突变患者毛细管电泳结果
表１ ＭＬＰＡ检测到而多重ＰＣＲ未检测到的１０例突变
先证者和待检样本都存在外显子４５缺失。１：ＤＩ２０００ ＤＮＡ ｍａｒｋｅｒ；
２－４：分别为先证者、正常对照、待检样品的４８、１７、８、５２外显子检测
结果；５—７：分别为先证者、正常对照、待检样品的１９．４３．４５、３４外显子
３讨论
检测结果；８—１Ｏ：分别为５１、ｌ２、５０、５３外显子检测结果。
ＭＬＰＡ方法由荷兰学者Ｓｃｈｏｕｔｅｎ等于２００２年
图２采用多重ＰＣＲ对Ｄｕｃｈｅｎｎｅ肌营养不良症（ＤＭＤ）基因１２个外
建立 。他是利用简单的杂交、连接、ＰＣＲ扩增反应，于
显子进行同步检测的结果
广东医学２０１０年８月第３１卷第ｌ６期 Ｇｕａｎｇｄｏｎｇ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｊｏｕｒｎａｌ Ａｕｇ．２０１０，Ｖｏ１．３１，Ｎｏ．１６
・
２１Ｏ１・
９１３：患者，外显子２重复；８７２：正常男性对照
图３ ＭＬＰＡ检测到突变患者毛细管电泳结果
单一反应管内同时检测最多４０个不同的核苷酸序列
携带者做出基因诊断。ＭＬＰＡ方法除操作简便外，还
的拷贝数变化。原理是针对不同检测序列设计多组专 可以克服其他常用技术的一些缺点。例如，Ｓｏｕｔｈｅｒｎ
一
的探针组，然后对探针组进行扩增，每组探针组长
印迹技术需要同位素，ＤＮＡ用量大。最常用的多重
度不同，可与目标序列杂交黏合。所有探针的５ 端都 ＰＣＲ技术，有报道说可以检测到缺失热点的１８个外显
有通用引物结合区ＰＢＳ（ｐｒｉｍｅｒ ｂｉｎｄｉｎｇ ｓｉｔｅｓ），３ 端都 子，能检测出９８％的突变，但与我们得出的数据有些
有与待扩增目标序列结合区，在ＰＢＳ区与目标序列结
差异。此外，ＤＭＤ患儿中１／３是新生突变，２／３是由遗
合区之间插入不同长度的寡核苷酸，由此形成长度不 传而来，而多重ＰＣＲ和连锁分析法必须有先证者，如
一
的探针组。如果目标序列缺失、突变，则这组探针 果先证者去世或为新生突变所致，就无法利用多重
无法成功连接，也没有相应的扩增反应。如果某组探 ＰＣＲ做产前诊断或携带者检测。而且这种方法与ＭＬ－
针可与目标序列完全黏合，则连接酶会将这组探针连
ＰＡ相比耗时，准确性有限（在检测重复突变方面，多重
接成为一个片段，并通过标记的通用引物对此连接在
ＰＣＲ有局限性，而且灵敏度不高）。ＭＬＰＡ更明确了２６
一
起的探针组进行扩增。最终经过毛细管电泳和激光
例缺失和重复突变的范围。这可能是由于ＭＬＰＡ比多
诱导的荧光标志物来检测扩增产物。ＭＬＰＡ属于一种 重ＰＣＲ检测了更多的外显子，ＭＬＰＡ探针包含ＤＭＤ基
高通量ＤＮＡ拷贝数检测技术。在欧洲已有多家遗传
因所有的７９个外显子结合序列，而我们实验室以前采
医学中心及实验室利用此技术协助进行基因序列的检
用的多重ＰＣＲ方法只能检测到该基因缺失热区的ｌ２
测。
个外显子缺失情况，而一些非热区的缺失突变和其他
ＤＭＤ基因内一个或多个外显子的缺失占所有突 类型的突变包括重复突变、点突变无法检测到。１９例
变的５０％一７０％，大多数缺失位于热点区域，跨越外
患者经多重ＰＣＲ方法和ＭＬＰＡ方法检测后，仍未发现
显子４５～５３，最常见的缺失是外显子４５和外显子４５～
突变。可能是存在一些我们没有发现的小突变，或者
４７ 。单个或多个外显子的重复占５％～１０％，最常见
这些突变位于内含子区域 ；另一种可能也不排除我
的是单个外显子２的重复，占所有重复的６％ Ｊ。与缺
们入选的患者中ＤＭＤ基因并未发生突变。
失相比，重复发生的热点区域较小，从外显子２～
ＭＬＰＡ方法可以检测出ＤＭＤ基因７９个外显子拷
２０ 。ＭＬＰＡ Ｐ０３４／０３５试剂盒可以同时进行ＤＭＤ基
贝数改变（缺失、重复、携带者），与多重ＰＣＲ方法相
因７９个外显子缺失／重复突变的筛查，所有反应在两 比，能够同时检测更多的外显子突变，而且简便、可靠、
个管中进行。并且杂交探针涉及ＤＭＤ基因所有外显
灵敏度高，建议在有条件的研究机构和医院推广使用。
子，不单纯是缺失热点区，这样就避免遗漏新发生缺失
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ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｐｒｏｂｅ ａｍｐｌｉｉｆｃａｔｉｏｎ［Ｊ］．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ，２００２，３０ ｌｉｇａｔｉｏｎ—ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｐｒｏｂｅ ａｍｐｌｉｉｆｃａｔｉｏｎ［Ｊ］．Ｇｅｎｅｔ Ｔｅｓｔ Ｍｏｌ Ｂｉｏ－
（１２）：ｅ５７．
ｍａｒｋｅｒｓ，２００９，ｌ３（１）：２３—３０．
［６］ ＢＥＧＧＳ Ａ Ｇ，ＫＯＥＮＩＮＧ Ｍ，ＢＯＹＣＥ Ｆ Ｍ，ｅｔ ａ１．Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ （收稿日期：２０１０—０１—２４编辑：王冰）
真菌性鼻窦炎的ＣＴ表现及应用价值
李锋 ，刘克
‘广州亿仁医院影像中心（广州５１０７２５）； 广州医学院第二附属医院放射科（广州５１０２６０）
【摘要】 目的探讨真菌性鼻窦炎的ｃＴ特征性表现及ｃＴ的应用价值。方法 回顾性分析１６例经病理证
实的真茵性鼻窦炎的ＣＴ表现。结果真菌性鼻窦炎主要ｃＴ表现有：病变为单侧性；病变主要位于上颌窦、蝶窦，
累及同侧鼻腔和鼻窦；病变窦腔密度增高，不均匀，内有小团块、沙砾状、短条状钙化样密度区；可有骨质破坏。结
论真菌性鼻窦炎ＣＴ表现具有特异性，ＣＴ是诊断该病有价值的方法。
【关键词】 真菌性鼻窦炎；ＣＴ；诊断
真菌性鼻窦炎是鼻一鼻窦腔的真菌感染性疾病，
及鼻腔，密度不同程度增高，质地不均，ＣＴ值４５—７５
可分为非侵袭型真菌性鼻窦炎和侵袭型真菌性鼻窦
Ｈｕ，较软组织密度高。１２例病变内可见絮状、小团块
炎。近年来，随着鼻内镜技术、病理检查及真菌培养工
状、多发散在沙砾状、小条状钙化灶（图１～２），分别位
作的普遍开展，临床发现真菌性鼻窦炎病例明显增多。
于病灶中央、病灶接近窦口处或病灶鼻腔内部分。
本文回顾性分析２００２年９月至２００８年１１月期间１６
２．２．２ 窦腔及窦壁改变 １６例中１１例有反应性骨增
例经手术、病理证实的真菌性鼻窦炎，以探讨本病的
生，窦壁增厚；３例上颌窦窦腔变小；６例上颌窦口扩大
ＣＴ特征表现及ＣＴ的应用价值。
（图１一Ｃ）。８例窦壁骨质破坏，其中上颌窦内壁骨质
１资料与方法
破坏及（或）顶壁骨质破坏６例，蝶窦底或顶壁骨质破
１．１ 一般资料本组１６例病例中，男ｌ２例，女４例； 坏２例。骨质破坏表现为骨质局限性缺损、消失，边缘
年龄３ｌ～６８岁；病程９个月至３１年。主要症状有：间 硬化、锐利，无虫蚀状改变和残存骨碎片。病变通过扩
隔性脓涕或回抽性涕中带血、耳呜、听力下降、面部肌
大的上颌窦口或窦壁骨缺损区突入鼻腔７例（图１一
肉麻痹、间隔性头痛、患侧面部及额顶部压迫感或隐
Ｂ），突人筛窦６例，突人颅内１例（图２）。表现为局灶
痛。其中糖尿病患者２例，所有病例未见有肿瘤及免
性高密度灶，边缘光整，与周围组织分界清楚。
疫缺陷患者。所有病例行鼻内镜下鼻窦开放窦腔病变
组织清除术，病变组织送病理学检查，ｌ４例找到真菌
丝或孢子，２例经过培养见真菌。
１．２ ＣＴ检查采用ＳＨ／ＭＡＤＺＵ６８００型或ＧＥ ｈｉｓｐｅｅｄ ｄｕ—
ａｌ型ＣＴ扫描装置，横轴位和（或）冠状位扫描，层厚５ ｉｌｌ／ｎ。
２结果
圈
２．１ 发病部位本组１６例均为单侧发病。其中１４
Ａ：左侧上颌窦内高密度影充填，其中可见团块状、条状钙化影；Ｂ：
左侧上颌窦内侧壁骨质破坏，窦腔内充填高密度影并突人左侧鼻腔，
例主要位于上颌窦，４例累及同侧筛窦；２例主要位于
其中可见絮状、小块状及条状钙化影；Ｃ：左侧上颌窦口扩大，窦腔及
蝶窦，并累及同侧筛窦；６例同时合并细菌性鼻窦炎。
内左侧中鼻道充填以高密度影，其中左侧中鼻道病灶内可见沙砾状
２．２ ＣＴ表现
及条状钙化影
２．２．１病变密度ｌ６例受累上颌窦、筛窦、蝶窦窦腔
图１ 左侧上颌窦真菌性鼻窦炎