2024年3月22日发(作者：敖清)

586

学 报

Journal of China Pharmaceutical University

2023，54（5）：586 - 598

ACE2对乳腺癌预后的影响及其潜在机制

徐灵亚，刘雪，曹潇洋，张馨怡，姚静，王传功

122221，2

*

2

（

1

潍坊医学院基础医学院，潍坊 261053；济宁医学院基础医学院，济宁 272067）

摘 要 研究跨膜蛋白血管紧张素转换酶2（angiotensin converting enzyme 2，ACE2）对乳腺癌预后的影响及其潜在机制。

使用公共数据库分析ACE2表达和与乳腺癌患者临床病理特征、患者预后及免疫微环境的关系；结合体外实验分析ACE2在

乳腺癌中的作用机制。研究结果显示，ACE2在乳腺癌组织中的表达明显低于乳腺正常组织，其表达与乳腺癌患者的年龄、

M分期和N1mi期显著负相关（P < 0.05）。ACE2高表达的Luminal型乳腺癌患者预后不良，而在三阴性乳腺癌（triple-nega⁃

tive breast cancer，TNBC）亚型中，ACE2则展现出不同的预后意义。此外，ACE2还与肿瘤组织的代谢和免疫微环境密切相

BC细胞进展。

关。体外实验表明，ACE2在MDA-MB-231细胞中低表达，并可能通过下调基质金属蛋白酶2（MMP2）来抑制细胞的进展。

研究结果提示，ACE2在乳腺癌中低表达，与患者的预后及代谢和免疫微环境密切相关，其可能是通过MMP2途径抑制TN⁃

关键词 乳腺肿瘤；血管紧张素转换酶2；三阴性乳腺癌；基质金属蛋白酶2

中图分类号 R965 文献标志码 A 文章编号 1000 -5048（2023）05 -0586 -13

doi

：

10.11665/.1000 -5048.2023033102

引用本文 徐灵亚，刘雪，曹潇洋，等.ACE2对乳腺癌预后的影响及其潜在机制［J］.中国药科大学学报，2023，54（5）：586–598.

Cite this article as

：

XU Lingya，LIU Xue，CAO Xiaoyang， et al. Effect of ACE2 on the prognosis of breast cancer and its potential mechanism

［J］.J China Pharm Univ，2023，54（5）：586–598.

XU Lingya

1

, LIU Xue

2

, CAO Xiaoyang

2

, ZHANG Xinyi

2

, YAO Jing

2

, WANG Chuangong

1,2*

1

2

Effect of ACE2 on the prognosis of breast cancer and its potential mecha⁃

nism

School of Basic Medicine, Weifang Medical University, Weifang 261053;

School of Basic Medical, Jining Medical University, Jining 272067, China

Abstract This study aims to investigate the effect of transmembrane protein angiotensin converting enzyme 2

(ACE2) on the prognosis of breast cancer and its potential databases were used to analyze

ACE2 expression and its relationship with clinicopathological features and prognosis of breast cancer patients,

combined with in vitro experiments to analyze the mechanism of action and immune relevance of ACE2 in breast

s showed that the expression of ACE2 in breast cancer tissues was significantly lower than that in

normal breast tissues, and that its expression was negatively correlated with age, M stage and N1mi stage of

breast cancer patients (P < 0.05).Patients with Luminal type breast cancer with high ACE2 expression had poor

prognosis, while in the triple-negative breast cancer (TNBC) subtype, ACE2 showed different prognostic signifi⁃

addition, ACE2 is closely associated with the metabolic and immune microenvironment of tumor tissue.

In vitro experiments have shown that ACE2 is lowly expressed in MDA-MB-231 cells and may inhibit cell prog⁃

ress by downregulating matrix metalloproteinase 2（MMP2）.The results suggest that the low expression of ACE2

in breast cancer is closely associated with patient prognosis as well as metabolic and immune microenvironment,

and that ACE2 may inhibit TNBC cell progress through the MMP2 pathway.

Key words breast cancer; angiotensin converting enzyme 2; triple-negative breast cancer; matrix metallopro⁃

teinase 2

收稿日期 2023-03-31

*

基金项目 国家自然科学基金资助项目（No.81902518）

通信作者 Tel：136****8151 E-mail： wangchg126@

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第 54 卷第 5 期

徐灵亚，等：ACE2对乳腺癌预后的影响及其潜在机制

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This study was supported by the National Natural Science Foundation of China (No.81902518)

乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤之一，病死

率居高不下，严重威胁全世界女性健康

[1]

。美国

癌症协会最新癌症统计资料表明，2023年美国乳

腺癌患者发病率将仍高居女性恶性肿瘤首位，占

所有新发肿瘤的31%，且发病率每年仍持续增

长

[2]

。乳腺癌具有高度异质性，根据基因表达不

同，将乳腺癌分为正常乳腺样型、Luminal A型、

Luminal B型、HER-2阳性型和Basal-like型5种亚

型。根据免疫表型分为Luminal A型、Luminal B

型、HER-2阳性型和三阴性乳腺癌（triple-negative

breast cancer，TNBC）4种临床亚型。其中，Basal-

like型与TNBC型在组织形态、免疫表型及临床表

现等方面大致相似，但不等同。此外，TNBC在基

因表达层面上是一组混合型乳腺癌，又可将其分

为6种分子亚型：基底样-1型（basal-like-1，BL-1）、

基底样-2型（basal-like-2，BL-2）、免疫调节型

（immunomodulatory，IM）、间质型（mesenchymal，M）、

间质干细胞型（mesenchymal stem like，MSL）及雄

[3]

激素受体型（luminal androgen receptor，LAR）。鉴

袭能力较强的TNBC）侵袭转移等生物学行为能力

及调控机制研究鲜有报道。为此，本研究首先通

过The Cancer Genome Atlas (TCGA)等多个数据库

对ACE2在乳腺癌中的表达进行了综合生物信息

学分析，并使用Kaplan Meier数据库评估ACE2的

预后价值。为了进一步了解ACE2在乳腺癌中的

功能及致病机制，本研究进行了体外功能实验及

调控机制验证，以期揭示ACE2对乳腺癌预后的影

响及其潜在机制，为更好地精准治疗乳腺癌提供

理论依据。

1 材 料

1.1　试 剂

RPMI 1640培养基、DMEM培养基和胎牛血清

（美国Gibco公司）；CCK-8试剂（日本同仁公司）；

Lipo8000™转染试剂(上海碧云天公司)；TRIzol试

剂、逆转录试剂和实时荧光定量PCR（real-time

fluorescence quantitative PCR，RT-qPCR）试剂(上海

飞捷生物公司)；ECL曝光液(美国Thermo公司)；

GAPDH抗体（美国Proteintech公司）；ACE2、基质

金属蛋白酶2（MMP2）、Cyclin A2、Cyclin B1、Cyclin

D1和Cyclin E2抗体（美国CST公司）；其他试剂均

为市售分析纯。

1.2　仪 器

于TNBC的高侵袭性及对传统疗法的相对抵

抗

[4-5]

，使得深入探究TNBC发生发展机制及诊治

方案十分必要。

enzyme 2，ACE2）是一种Ⅰ型膜锚定锌羧肽酶，主

将Ang II转化为Ang(1-7)，同时也可作用于Ang I产

生Ang(1-9)

[6-7]

，是肾素-血管紧张素系统（renin-

angiotensin system，RAS）中Ang(1-7)/MasR轴的主

要组成部分

[8-9]

。ACE2除参与协调RAS系统中

ACE/Ang II/AT1R和ACE2/Ang(1-7)/MasR两轴之

间的平衡外

[6,10]

，还可参与调节结肠炎中色氨酸代

谢，抗菌肽的表达以及肠道微生物组的功能

[11-12]

，

并能有效改善人体内SARS-CoV-2感染后的葡萄

糖和脂质代谢

[13]

。另有研究发现，ACE2在多种肿

瘤中扮演着重要的抑癌角色

[14-15]

。在肝细胞癌

[15]

及

肾母细胞瘤

[16]

中，ACE2高表达者提示更好的预后。

此外，ACE2还可以消除肿瘤对VEGFR抑制剂的

耐药性，为肾透明细胞癌的治疗提供了新的思

路

[16]

。在乳腺癌中，虽有文献报道了ACE2对乳腺

癌血管生成的影响

[17]

，但其调控乳腺癌（尤其是侵

血管紧张素转换酶2（angiotensin converting

要位于细胞膜上，其可通过去除C端苯丙氨酸残基

skan FC酶标仪（美国Thermo公司）；电泳仪、转膜

仪（美国Bio-Rad 公司）。

1.3　细 胞

荧光定量PCR仪（美国Millipore公司）；Multi⁃

人乳腺癌细胞均由陆军军医大学附属西南医

院病理科惠赠。所有细胞均已通过短串联重复序

列（STR）分析鉴定。

2 方 法

2.1　基因表达与临床病理特征分析

使用UALCAN数据库评估ACE2在乳腺癌和

正常乳腺样本中的表达（me.

org），以及TCGA-BRCA数据库中的公共资料分析

性。Kaplan-Meier Plotter数据库分析ACE2表达与

ACE2与乳腺癌患者临床病理学特征之间的关联

乳腺癌生存率之间的关系（/anal⁃

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第54 卷

ysis/）。

2.2　基因富集分析

2.5　蛋白质印迹（Western blot，WB）检测各细胞

中蛋白表达水平

采用RIPA裂解液提取细胞总蛋白，BCA法测

定蛋白浓度，每个样本上样量为20 µg，通过SDS-

PAGE凝胶电泳分离蛋白质并转移到聚偏氟乙烯

Cyclin抗体（A2、B1、D1和E2）、MMP2抗体和

2.6　RT-qPCR法检测各细胞中RNA表达水平

GAPDH抗体（l∶5 000）4 ℃过夜孵育，加二抗（鼠或

薄膜，室温封闭2 h，分别加ACE2抗体（l∶500），

ACE2皮尔逊相关系数大于0.3的共表达基因。上

使用UALCAN数据库选取了乳腺癌中44个与

传至DAVID()进行KEGG通

路富集和GO功能分析，并根据富集分数（enrich⁃

ment score）和数量（count），使用微生信(

/)进行可视化处理。

2.3　免疫浸润分析

兔源性）室温孵育1 h，洗膜后化学发光显色、拍照。

采用TRIzol试剂盒说明书提取细胞总RNA

基于TCGA-BRCA队列，本研究使用TISIDB

数据库(cis. hku. hk/TISIDB/)评估乳腺癌中

ACE2与组织亚型和免疫亚型的关系，分析ACE2

表达与TIICs、趋化因子、趋化因子受体和免疫抑制

分子的相关性。

2.4　细胞培养、慢病毒感染和siRNA转染

后，逆转录为cDNA，实验重复3次。引物序列

见表2。

Table 2　Primer sequences used for RT-qPCR

全培养基中，置于37 ℃、5% CO

2

恒温恒湿培养箱

中培养。取生长状态良好的细胞计数后，按每孔

约4 × 10

4

个接种至12孔细胞培养板中，待细胞生

长融合至50% ~ 70%时，加入含LV-ACE2或空载

体LV-Vector的慢病毒颗粒转染液，按感染指数

（multiplicity of infection，MOI）为50将慢病毒颗粒

和5 µg/mL聚凝胺与细胞缓慢充分混匀，置于

37 ℃、5% CO

2

恒温恒湿培养箱中进行培养，16 h后

察，采用含10%FBS和2 mg/L嘌呤霉素的DMEM培

养液进行筛选以建立稳定感染LV-ACE2或LV-

Vector的细胞系，并通过Western blot和RT-qPCR

验证感染效率,收集细胞进行后续实验。

采用Lipo8000™将小干扰RNA(siRNA)和阴性

对照转染入MDA-MB-231细胞，转染24 h后采用

续实验。siRNA的序列见表1。

Primer

MDA-MB-231培养于含10%FBS的DMEM完

ACE2-R

ACE2-F

Primer

5′-CGAAGCCGAAGACCTGTTCTA-3′

5′-GGAGCGAGATCCCTCCAAAAT-3′

5′-GGGCAAGTGTGGACTGTTCC-3′

Sequence

GAPDH-R

GAPDH-F

5′-GGCTGTTGTCATACTTCTCATGG-3′

2.7　CCK-8检测细胞增殖活力

收集对数生长期的各组细胞进行实验，将

细胞接种于96孔细胞培养板，每孔100 µL。设

置3个复孔，另设空白组（不含细胞，仅含培养液），

置于37 ℃、5%CO

2

培养箱中培养，细胞贴壁后分别

在第0 ~ 4天，分别使用含10%FBS和10%CCK-8的

培养液培养2 h，检测450 nm处吸收度。

2.8　Transwell 细胞侵袭实验

Matrigel胶与无FBS培养基按照4∶1的比例

更换为新鲜培养液，感染72 h后，荧光显微镜观

稀释后，均匀铺于24孔Transwell小室中。每孔按

RT-qPCR法检测细胞转染效率，收集细胞进行后

Table 1　siRNA sequences used for transfection

4 × 10

4

个细胞（100 µL）加入上室，下室各加无FBS

培养基600 µL。培养结束后，PBS 清洗，4%多聚

取膜显微镜下观察，拍照。

2.9　划痕愈合实验

按每孔5 × 10

5

个细胞均匀铺于6孔板中，细胞

甲醛固定细胞30 min，1%结晶紫染液浸泡60 min。

siACE2-2313-F

siRNA-NC-F

siACE2-579-R

siACE2-579-F5′-GGCCAUUAUAUGAAGAGUATT-3′

5′-UACUCUUCAUAUAAUGGCCTT-3′

5′-GGCAUUGUCAUCCUGAUCUTT-3′

5′-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3′

Sequence

密度达到70% ~ 80%时，每孔的中央划井字，PBS

清洗，倒置显微镜下观察0、24和48 h各组划痕的

愈合情况并拍照记录。

2.10　流式细胞术

细胞周期检测：收集各组细胞，PBS缓冲液洗

siACE2-2313-R

siRNA-NC-R

5′-AGAUCAGGAUGACAAUGCCTT-3′

5′-ACGUGACACGUUCGGAGAATT-3′

ACE2: Angiotensin converting enzyme 2; NC: Negative control

涤后75%乙醇重悬细胞，−20 ℃过夜固定。次日，

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徐灵亚，等：ACE2对乳腺癌预后的影响及其潜在机制

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细胞经冷PBS缓冲液冲洗后，采用碘化丙啶染色

液重悬细胞，37 ℃避光温浴30 min。采用流式细

胞术分析不同细胞周期各组细胞百分率。

细胞凋亡检测：取各组细胞，用预冷的PBS洗

涤3次，每组分为4份（空白组、单染组和双染组），

加入Annexin V-APC和7-AAD染色液，冰上避光，

立即进行细胞凋亡检测。

2.11　统计学分析

采用SPSS 27和GraphPad Prism 7.0软件进行

3 结 果

3.1　乳腺癌组织中ACE2的表达水平

通过UALCAN数据库分析表明，ACE2在乳腺

癌组织中的表达水平显著低于正常对照组织（P <

0.05，图1-A），且在TNBC各亚型中的表达量存在

显著差异性（P < 0.05，图1-B）。为了进一步阐明

结果，本研究收集了TCGA数据库中乳腺癌转录组

和临床组数据，包含正常乳腺组织108例，乳腺肿瘤

组织1 017例，其中，99例为匹配样本。评估TCGA-

BRCA队列中未配对瘤旁乳腺正常组织（44.13 ±

2.28）与乳腺癌肿瘤组织（10.81 ± 0.929 5）（P <

0.05，图1-C）和配对的肿瘤组织与瘤旁组织（P <

0.001，图1-D）之间ACE2的mRNA表达。结果显

的表达明显更低。

示，与正常样本相比，ACE2在乳腺癌肿瘤样本中

统计学分析。各组组织和细胞中mRNA表达水平

ˉ

±s

和P表示，符合正态分布，以

x

多组间样本均数

比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用

LSD-t检验，非正态分布采用秩和检验。P < 0.05

被认为具有统计学意义。

ˉ

±s

)Figure 1　Angiotensin converting enzyme 2 (ACE2) expression levels in breast cancer tissues (

x

A: Expression levels of ACE2 in breast cancer and paraneoplastic tissues (database: UALCAN); B: Expression levels of ACE2 in various subtypes of

TCGA-BRCA); D: mRNA expression of ACE2 in paired breast cancer samples (database: TCGA-BRCA)

P < 0.05,

***

P < 0.001 vs normal group

triple-negative breast cancer (TNBC) (database:UALCAN); C: mRNA expression of ACE2 in unpaired breast cancer and normal samples (database:

*

3.2　ACE2表达与临床特征之间的相关性

与患者年龄（P < 0.05，图2-C）及肿瘤转移状态

（P < 0.05，图2-F ~ G）显著相关，而与种族、临床分

期和分级等参数之间的相关性并不显著（图2-A、

本研究评估了ACE2表达与乳腺癌患者临床

病理特征之间的相关性。结果表明ACE2的表达

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第54 卷

B、D、E）。ACE2在不同年龄段的乳腺癌患者中呈

现差异表达趋势，其在乳腺癌高发的61 ~ 75岁年

龄阶段患者中的表达水平显著低于0 ~ 35岁和

36 ~ 60岁年龄段患者，结果提示ACE2低表达或许

是乳腺癌发生发展的重要驱动因素。此外，ACE2

在肿瘤M1期和N1mi期也呈低表达状态，结果提

示，ACE2可能在乳腺癌转移的早期阶段发挥重要

作用，其有望成为乳腺癌早期诊断的生物标记物。

Figure 2　Correlation between the relative expression of ACE2 and clinicopathological parameters

A: ACE2 expression in different races; B: ACE2 expression in different tumor stages; C: ACE2 expression in different age groups; D: ACE2 expression

in different T-stages; E: ACE2 expression in different N-stages; F: ACE2 expression in different M-stages; G: ACE2 expression in N0 and N1mi phases

3.3　ACE2表达与乳腺癌的预后相关

ACE2在乳腺癌4种主要亚型中的预后价值。结果

同的预后角色：在Luminal A型乳腺癌中，ACE2高

本研究采用Kaplan-Meier Plotter数据库评估

3.4　基因富集分析

一般而言，共表达基因具有相似的功能和作

用。本研究利用UALCAN数据库筛选TCGA-

BRCA队列中的ACE2共表达基因，进行KEGG通

路富集分析和GO功能分析。KEGG通路富集主

要是色氨酸代谢和花生四烯酸代谢相关通路等

（图4-A）。GO功能分析中关键生物学过程（BP）包

含脂多糖代谢、细胞周期、电子传递和免疫调节

等。关键细胞组分（CC）为线粒体和细胞外泌体的

组成部分。分子功能（MF）包括谷胱甘肽水解酶活

性、肽基转移酶活性、长链脂肪酸-CoA连接酶活

表明，在不同分子亚型乳腺癌中，ACE2扮演着不

表达者预后更差（P < 0.05，图3-A）；在TNBC中，

ACE2高表达者则提示更好的预后（P < 0.05，图3-

C）。而在Luminal B型（图3-B）和HER2阳性型乳

果表明，ACE2在乳腺癌预后中有重要的意义，是

TNBC良好预后的重要分子。

腺癌（图3-D）中并未发现显著预后意义。这些结

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第 54 卷第 5 期

徐灵亚，等：ACE2对乳腺癌预后的影响及其潜在机制

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Figure 3　Correlation between ACE2 expression and prognosis

A: Prognosis in Luminal A breast cancer; B: Prognosis in Luminal B breast cancer; C: Prognosis in Basal-like breast cancer; D: Prognosis in HER2-

positive breast cancer

性、氧化还原酶活性和脂质合成等（图4-B）。以上

结果表明ACE2主要与乳腺癌中代谢酶活性、免疫

调节、细胞周期，以及色氨酸和花生四烯酸代谢过

程有关，这些过程对乳腺癌的发生发展至关

重要。

3.5　乳腺癌中ACE2的表达与免疫微环境的关系

免疫微环境中的免疫细胞在抑制或促进肿瘤

生长方面发挥着重要作用，趋化因子和趋化因子

受体在免疫调节过程中起着非常关键的作用，它

们可以将免疫细胞招募到TME中，并影响肿瘤进

展。随后使用TISIDB数据库评估ACE2与乳腺癌

TIICs以及趋化因子的关系。结果表明，ACE2表达

与乳腺癌中ACT-B、Th1、NKT、Tfh、Th17、Th2和肿瘤微环境（tumor microenvironment，TME）是

由肿瘤细胞、基质和内皮细胞组成的异质性复杂

组织，其中免疫浸润细胞、趋化因子、趋化因子受

体和免疫因子等构成免疫微环境。肿瘤免疫集群

分为6种免疫亚型，分别为C1：伤口愈合型，C2：

C5：免疫静默型和C6：TGF-β主导型。在TISIDB

数据库中，ACE2与乳腺癌患者组织学亚型和免疫

学亚型显著相关（图5-A）。

IFN-γ主导型，C3：炎症型，C4：淋巴细胞消减型，

Tem-CD8等细胞呈正相关（图5-B）。ACE2与乳腺

癌趋化因子CX3CL1、CXCL1和CXCL6等表达呈正

相关，与CXCL14表达呈负相关。ACE2与乳腺癌趋

化因子受体分子CXCR6、CXCR4、CXCR5和CXCR3

等表达呈正相关，与CXCR1和CX3CR1表达呈负

相关。目前，肿瘤免疫检查点抑制剂（immune

checkpoint inhibitors，ICIs）的使用改变了肿瘤治疗

的格局。ICIs是通过阻断免疫检查点来诱导抗肿

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第54 卷

Figure 4　Gene enrichment analysis

A: KEGG pathway enrichment analysis; B: GO functional analysis

瘤免疫反应。本研究使用TISIDB数据库分析乳腺

癌中，ACE2与免疫抑制因子之间的相关性。结果

显示，ACE2与免疫抑制因子IDO1（rho = 0.367，

P < 0.05）、PDCD1（PD-1）（rho = 0.271，P < 0.05）

和CTLA4（rho = 0.323，P < 0.05）等表达水平呈正

相关（图5-C）。

验证

3.6　过表达和敲低ACE2细胞系的构建和效果

为了阐明ACE2在乳腺癌进展中的作用，本研

究首先检测了ACE2在不同乳腺癌细胞系中蛋白

表达水平（图6-A）。结果显示，在TNBC细胞系

而前文结果表明，ACE2高表达的TNBC患者预后

带来新思路。为了进一步验证ACE2在TNBC细胞

系中的功能作用，本研究建立了ACE2稳定过表达

和敲低细胞系。过表达ACE2后，ACE2的蛋白水

平（P < 0.05，图6-B）和RNA水平（P < 0.05，图6-

MDA-MB-231中，ACE2的表达水平呈低表达状态。

更好，这将为TNBC这一难治性亚型乳腺癌的探索

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徐灵亚，等：ACE2对乳腺癌预后的影响及其潜在机制

593

Figure 5　Relationship between ACE2 and the immune microenvironment

A: Association of ACE2 with breast cancer histological and immunological subtypes; B: Association between ACE2 and TIICs in breast cancer;

C: Association of ACE2 with immunosuppressive factors in breast cancer

D）均有显著的增加；反之，敲低ACE2后，ACE2的

蛋白水平（P < 0.05，图6-C）和RNA水平（P <

0.05，图6-E）均呈现显著的下调。

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594

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第54 卷

ˉ

±s, n=3

)Figure 6　Identification of ACE2 expression level (

x

A: ACE2 protein expression in breast cancer cell lines; B: Identification of ACE2 protein expression levels in constructs of stable overexpression cell

lines; C: Identification of ACE2 protein expression levels in siRNA knockdown cell lines; D: mRNA expression of ACE2 in constructs of stable overex⁃

*

pression cell lines; E: mRNA expression of ACE2 in siRNA knockdown cell lines

P < 0.05,

**

P < 0.01,

***

P < 0.001

3.7　ACE2抑制TNBC细胞的增殖、侵袭和迁移

表明，ACE2并非通过细胞凋亡和周期停滞途径抑

制TNBC细胞增殖。前文结果表明，ACE2与乳腺

癌的早期转移有关。而基质金属蛋白酶（MMP）是

锌依赖性蛋白水解金属酶，在肿瘤侵袭和转移中

发挥重要作用。文献报道，抑癌基因miR-526b-3p

的表达可通过下调MMP家族中重要成员MMP2的

表达，进而抑制HeLa细胞侵袭和转移

[18]

。本研究

也发现，ACE2过表达后的MDA-MB-231细胞中

ACE2可能通过影响MMP2而抑制TNBC细胞的

转移。

3.8　ACE2通过MMP2途径抑制TNBC细胞的侵袭

MMP2的表达水平显著降低（图8-C）。结果提示，

前期数据库结果表明，ACE2与TNBC患者预

后显著相关，其高表达者患者预后更好。而TNBC

作为侵袭能力较强的乳腺癌亚型，关注ACE2在这

种亚型中的角色和作用十分必要。为此，本研究

选择TNBC细胞系MDA-MB-231进行相关功能实

验。结果表明，与对照组相比，ACE2过表达组细

胞的增殖、迁移和侵袭能力显著减弱（图7）。反

之，敲低ACE2后，MDA-MB-231细胞增殖活力反

而提升（P < 0.05，图7-B）。结果表明ACE2能够抑

制MDA-MB-231细胞的增殖、侵袭和迁移。

为进一步研究ACE2抑制MDA-MB-231细胞

增殖、侵袭和迁移的机制，本研究通过流式细胞术

和WB实验，检测细胞周期停滞情况（图8-A）和凋

亡数量（图8-B）及相关周期蛋白Cyclin A2、Cyclin

B1、Cyclin D1和Cyclin E2的表达（图8-C）。结果

为进一步验证ACE2是否通过MMP2途径抑

制TNBC细胞的侵袭。本研究将siACE2转染到

通过Invasion实验进行检验。结果发现，转染了

231-lenti-ACE2细胞中观察MMP2的表达情况，并

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徐灵亚，等：ACE2对乳腺癌预后的影响及其潜在机制

595

ˉ

±s, n=3

)Figure 7　ACE2 inhibits the proliferation, invasion and migration of TNBC cells (

x

A and B: CCK-8 was used to monitor cells proliferation viability for 4 days; C: Wound healing experiments was applied to evaluate cell migration abili⁃

**

ty; D: Cell invasion ability was detected by transwell assay (scale bar = 1 cm)

P < 0.01,

***

P < 0.001

ˉ

±s, n=3

)Figure 8　Effect of ACE2 on cell cycle, apoptosis and matrix metalloproteinase 2 (MMP2) (

x

A: Flow cytometry was used to detect cell cycle changes; B: Flow cytometry was used to detect apoptosis; C: Western blot was used to detect Cyclin

**

and MMP2 protein expression

P < 0.01

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596

学 报 Journal of China Pharmaceutical University 2023，54（5）：586 - 598

第54 卷

siACE2的231-lenti-ACE2细胞的侵袭能力较231-

lenti-ACE2组显著增强（图9）。以上结果说明

ACE2可以通过MMP2途径抑制MDA-MB-231细胞

的侵袭能力。

ˉ

±s, n=3

)Figure 9　ACE2 affects cell invasion through MMP2 (

x

A: Effect of ACE2 on MMP2 protein levels; B: ACE2 affects cell invasion through MMP2; C: Statistical analysis of invasion assay of MDA-MB-231

**

cells

P < 0.01,

***

P < 0.001

4 讨 论

在本研究中，首先进行了综合生物信息学分

析，以研究ACE2在乳腺癌中的表达量、预后价值、

生物学功能和潜在的调控途径。这些生物信息学

分析和基础研究将为进一步了解乳腺癌患者的预

后和治疗奠定基础。基于生物信息学分析，发现

ACE2在乳腺癌中表达低于正常组织，并与患者年

龄、M分期和N1mi期相关。同时发现，ACE2与乳

腺癌的分子亚型密切相关，ACE2高表达预示着

Luminal 型乳腺癌的生存时间更短，而TNBC的生

存时间更长。近期研究发现，ACE2通过与新冠病

毒表面S蛋白结合诱导人体细胞发生病毒感染

[19]

，

ACE2靶向药物的研制成为治疗新冠的关键。其

中，靶向ACE2的雾化吸入剂临床试验显示了良好

的安全性和耐受性。另有文献报道

[20]

，转移性TN⁃

BC患者感染新冠的可能性更高，其主要原因是该

类患者的癌细胞更易发生病毒感染，以上结果提

示新冠相关分子ACE2在乳腺癌进展中扮演重要

角色。为此提出大胆的设想，是否ACE2靶向药物

也能使部分乳腺癌患者从中获益？尤其是ACE2

表达高而预后差的Luminal 型乳腺癌患者以及

ACE2表达低预后差的TNBC患者这类亚群能否从

为乳腺癌的精准治疗提供新的思路。

Xiao等

[21]

通过构建TNBC新型代谢组学，将TNBC

分为3个不同的代谢组学亚组：C1，其特征在于神

和糖基转移相关的代谢物的上调；C3，具有最低水

平的代谢失调。而在TNBC转录组亚型中，LAR亚

型与代谢组学C1亚型几乎重叠；BLIS、IM和MES

亚型主要分为代谢组学C2亚型和C3亚型。本研

究发现，与其他TNBC亚型相比，ACE2在LAR亚型

中高表达，这提示ACE2可能与C1亚型的神经酰

经酰胺和脂肪酸的富集；C2，特征在于与氧化反应

代谢重编程是肿瘤的关键标志。2022年，

中获益值得深入思考和探索。以上结果及推论将

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第 54 卷第 5 期

徐灵亚，等：ACE2对乳腺癌预后的影响及其潜在机制

[J]. CA Cancer J Clin, 2023, 73(1): 17-48.

597

胺和脂肪酸代谢有关。而且通过基因富集分析，

也发现ACE2参与脂肪酸代谢途径。并且ACE2高

表达的TNBC患者的预后较好。由此推测，在不同

代谢组学的TNBC亚型中，针对ACE2的治疗可能

会有不同的疗效。

为进一步明确ACE2在TNBC中的功能作用，

本研究首先进行了细胞增殖实验。结果发现，

ACE2可以有效抑制MDA-MB-231细胞的增殖能

力，但并未发现其对细胞凋亡能力的影响。数据

[3]Liu X, Li YQ, Mu FC, et al. New progress in molecular typing of

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tenance therapy using lower dosage and higher frequency vs

stage triple-negative breast cancer who had received standard

2021, 325(1): 50-58.

库资料分析发现ACE2与乳腺癌的远处转移和早

期淋巴结转移有关，而又有文献证明了ACE2可以

抑制肿瘤转移，这些结果均提示ACE2在乳腺癌转

移中起着关键作用，但具体机制尚不清楚。肿瘤

的侵袭和转移在很大程度上取决于多种MMPs的

蛋白水解活性，这些酶通过降解细胞外基质

（ECM）成分和释放基质因子、细胞表面结合的细

胞因子、生长因子或其受体，参与基质破坏、新生

血管形成和转移

[22]

。MMPs家族含有许多成员，其

中MMP2是一种Zn

-依赖性金属蛋白酶

。众所

周知，MMP2在肿瘤侵袭和转移中发挥着重要作

用。而本研究也发现，在MDA-MB-231细胞中过

表达ACE2后，MMP2的表达显著下调。结果提示

癌的增殖和转移，ACE2是如何调控MMP2的具体

ACE2可能通过下调MMP2的表达，进而抑制乳腺

机制有待进一步深入探索。以上发现，为深入研

究ACE2调控乳腺癌侵袭转移作用机制提供了重

要依据。

综上所述，ACE2可能是TNBC的潜在预后生

物标志物，并可能参与了氨基酸和脂肪酸代谢，以

及肿瘤免疫微环境的调控。同时，ACE2可能通过

下调MMP2的表达而非依赖细胞凋亡和细胞周期

停滞途径抑制TNBC细胞的增殖和转移。以上结

果表明，ACE2在调节TNBC细胞的恶性行为中发挥

着重要作用，这将为TNBC的诊治提供新的思路。

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anticancer MMP2 inhibitors: a review[J]. Future Med Chem,

·本 刊 讯·

“药用材料研究前沿进展及其与制剂质量/性能相关性”

专刊/专栏征稿

为了促进学术交流，为药学及相关学科研究人员构建展示最新研究成果的平台，展示国内外中青年药学专家的学

专刊/专栏（专栏主编：孙春萌教授），现特向在国内外从事药学及相关领域研究中有造诣科学工作者征集研究性论文或

综述，约请国内外中青年药学专家为本次活动撰稿。

征文要求和注意事项

1. 撰稿要求

请结合您课题组所从事的研究工作，紧密围绕药用辅料和药用新材料研究前沿，展望该领域发展前景，具有创新

性、学术型、科学性、规范性和可读性。征文范围包括但不限于：

1）药用辅料/药用新材料的构效关系研究与评价技术；

2）药用辅料/药用新材料的功能性相关指标评价技术；

术风采，《中国药科大学学报》编辑部拟定于2024年第2期出版“药用材料研究前沿进展及其与制剂质量/性能相关性”

3）基于功能性相关指标差异的药用辅料规格划分策略；

4）基于药用辅料功能性相关指标的处方筛选与制剂性能评价；

7）药用辅料监管技术；

5）不同规格药用辅料的应用特性及其适用性研究（制剂开发、辅料变更等）；

6）复杂组分药用辅料/药用新材料结构和组分剖析与控制技术；

8）药用新材料的转化应用。

2. 全文要求10 000～12 000字，引用文献中以近5年发表的为主。

3. 征文需要按照编辑部“三审制”进行评审，经过同行专家评审后决定最终是否录用。编辑部对征文开设绿色通

道，优先处理，以最快的方式编辑出版，在中国知网网络首发，供读者免费阅读下载。

注明“2024药用材料专栏”字样。

5. 其他注意事项

4. 投稿方式：采用“《中国药科大学学报》在线投稿系统”（ http：///jcpu/home） 投稿。请在投稿时

本次征文以《中国药科大学学报》正刊形式出版，收稿截止日期为2023年12月31日。

样刊2本。

本期专栏投稿文章不收审稿费，录用论文不收取版面费。发表后将按《中国药科大学学报》标准支付稿酬，并赠送

（本刊编辑部）

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2024年3月22日发(作者：敖清)

586

学 报

Journal of China Pharmaceutical University

2023，54（5）：586 - 598

ACE2对乳腺癌预后的影响及其潜在机制

徐灵亚，刘雪，曹潇洋，张馨怡，姚静，王传功

122221，2

*

2

（

1

潍坊医学院基础医学院，潍坊 261053；济宁医学院基础医学院，济宁 272067）

摘 要 研究跨膜蛋白血管紧张素转换酶2（angiotensin converting enzyme 2，ACE2）对乳腺癌预后的影响及其潜在机制。

使用公共数据库分析ACE2表达和与乳腺癌患者临床病理特征、患者预后及免疫微环境的关系；结合体外实验分析ACE2在

乳腺癌中的作用机制。研究结果显示，ACE2在乳腺癌组织中的表达明显低于乳腺正常组织，其表达与乳腺癌患者的年龄、

M分期和N1mi期显著负相关（P < 0.05）。ACE2高表达的Luminal型乳腺癌患者预后不良，而在三阴性乳腺癌（triple-nega⁃

tive breast cancer，TNBC）亚型中，ACE2则展现出不同的预后意义。此外，ACE2还与肿瘤组织的代谢和免疫微环境密切相

BC细胞进展。

关。体外实验表明，ACE2在MDA-MB-231细胞中低表达，并可能通过下调基质金属蛋白酶2（MMP2）来抑制细胞的进展。

研究结果提示，ACE2在乳腺癌中低表达，与患者的预后及代谢和免疫微环境密切相关，其可能是通过MMP2途径抑制TN⁃

关键词 乳腺肿瘤；血管紧张素转换酶2；三阴性乳腺癌；基质金属蛋白酶2

中图分类号 R965 文献标志码 A 文章编号 1000 -5048（2023）05 -0586 -13

doi

：

10.11665/.1000 -5048.2023033102

引用本文 徐灵亚，刘雪，曹潇洋，等.ACE2对乳腺癌预后的影响及其潜在机制［J］.中国药科大学学报，2023，54（5）：586–598.

Cite this article as

：

XU Lingya，LIU Xue，CAO Xiaoyang， et al. Effect of ACE2 on the prognosis of breast cancer and its potential mechanism

［J］.J China Pharm Univ，2023，54（5）：586–598.

XU Lingya

1

, LIU Xue

2

, CAO Xiaoyang

2

, ZHANG Xinyi

2

, YAO Jing

2

, WANG Chuangong

1,2*

1

2

Effect of ACE2 on the prognosis of breast cancer and its potential mecha⁃

nism

School of Basic Medicine, Weifang Medical University, Weifang 261053;

School of Basic Medical, Jining Medical University, Jining 272067, China

Abstract This study aims to investigate the effect of transmembrane protein angiotensin converting enzyme 2

(ACE2) on the prognosis of breast cancer and its potential databases were used to analyze

ACE2 expression and its relationship with clinicopathological features and prognosis of breast cancer patients,

combined with in vitro experiments to analyze the mechanism of action and immune relevance of ACE2 in breast

s showed that the expression of ACE2 in breast cancer tissues was significantly lower than that in

normal breast tissues, and that its expression was negatively correlated with age, M stage and N1mi stage of

breast cancer patients (P < 0.05).Patients with Luminal type breast cancer with high ACE2 expression had poor

prognosis, while in the triple-negative breast cancer (TNBC) subtype, ACE2 showed different prognostic signifi⁃

addition, ACE2 is closely associated with the metabolic and immune microenvironment of tumor tissue.

In vitro experiments have shown that ACE2 is lowly expressed in MDA-MB-231 cells and may inhibit cell prog⁃

ress by downregulating matrix metalloproteinase 2（MMP2）.The results suggest that the low expression of ACE2

in breast cancer is closely associated with patient prognosis as well as metabolic and immune microenvironment,

and that ACE2 may inhibit TNBC cell progress through the MMP2 pathway.

Key words breast cancer; angiotensin converting enzyme 2; triple-negative breast cancer; matrix metallopro⁃

teinase 2

收稿日期 2023-03-31

*

基金项目 国家自然科学基金资助项目（No.81902518）

通信作者 Tel：136****8151 E-mail： wangchg126@

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第 54 卷第 5 期

徐灵亚，等：ACE2对乳腺癌预后的影响及其潜在机制

587

This study was supported by the National Natural Science Foundation of China (No.81902518)

乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤之一，病死

率居高不下，严重威胁全世界女性健康

[1]

。美国

癌症协会最新癌症统计资料表明，2023年美国乳

腺癌患者发病率将仍高居女性恶性肿瘤首位，占

所有新发肿瘤的31%，且发病率每年仍持续增

长

[2]

。乳腺癌具有高度异质性，根据基因表达不

同，将乳腺癌分为正常乳腺样型、Luminal A型、

Luminal B型、HER-2阳性型和Basal-like型5种亚

型。根据免疫表型分为Luminal A型、Luminal B

型、HER-2阳性型和三阴性乳腺癌（triple-negative

breast cancer，TNBC）4种临床亚型。其中，Basal-

like型与TNBC型在组织形态、免疫表型及临床表

现等方面大致相似，但不等同。此外，TNBC在基

因表达层面上是一组混合型乳腺癌，又可将其分

为6种分子亚型：基底样-1型（basal-like-1，BL-1）、

基底样-2型（basal-like-2，BL-2）、免疫调节型

（immunomodulatory，IM）、间质型（mesenchymal，M）、

间质干细胞型（mesenchymal stem like，MSL）及雄

[3]

激素受体型（luminal androgen receptor，LAR）。鉴

袭能力较强的TNBC）侵袭转移等生物学行为能力

及调控机制研究鲜有报道。为此，本研究首先通

过The Cancer Genome Atlas (TCGA)等多个数据库

对ACE2在乳腺癌中的表达进行了综合生物信息

学分析，并使用Kaplan Meier数据库评估ACE2的

预后价值。为了进一步了解ACE2在乳腺癌中的

功能及致病机制，本研究进行了体外功能实验及

调控机制验证，以期揭示ACE2对乳腺癌预后的影

响及其潜在机制，为更好地精准治疗乳腺癌提供

理论依据。

1 材 料

1.1　试 剂

RPMI 1640培养基、DMEM培养基和胎牛血清

（美国Gibco公司）；CCK-8试剂（日本同仁公司）；

Lipo8000™转染试剂(上海碧云天公司)；TRIzol试

剂、逆转录试剂和实时荧光定量PCR（real-time

fluorescence quantitative PCR，RT-qPCR）试剂(上海

飞捷生物公司)；ECL曝光液(美国Thermo公司)；

GAPDH抗体（美国Proteintech公司）；ACE2、基质

金属蛋白酶2（MMP2）、Cyclin A2、Cyclin B1、Cyclin

D1和Cyclin E2抗体（美国CST公司）；其他试剂均

为市售分析纯。

1.2　仪 器

于TNBC的高侵袭性及对传统疗法的相对抵

抗

[4-5]

，使得深入探究TNBC发生发展机制及诊治

方案十分必要。

enzyme 2，ACE2）是一种Ⅰ型膜锚定锌羧肽酶，主

将Ang II转化为Ang(1-7)，同时也可作用于Ang I产

生Ang(1-9)

[6-7]

，是肾素-血管紧张素系统（renin-

angiotensin system，RAS）中Ang(1-7)/MasR轴的主

要组成部分

[8-9]

。ACE2除参与协调RAS系统中

ACE/Ang II/AT1R和ACE2/Ang(1-7)/MasR两轴之

间的平衡外

[6,10]

，还可参与调节结肠炎中色氨酸代

谢，抗菌肽的表达以及肠道微生物组的功能

[11-12]

，

并能有效改善人体内SARS-CoV-2感染后的葡萄

糖和脂质代谢

[13]

。另有研究发现，ACE2在多种肿

瘤中扮演着重要的抑癌角色

[14-15]

。在肝细胞癌

[15]

及

肾母细胞瘤

[16]

中，ACE2高表达者提示更好的预后。

此外，ACE2还可以消除肿瘤对VEGFR抑制剂的

耐药性，为肾透明细胞癌的治疗提供了新的思

路

[16]

。在乳腺癌中，虽有文献报道了ACE2对乳腺

癌血管生成的影响

[17]

，但其调控乳腺癌（尤其是侵

血管紧张素转换酶2（angiotensin converting

要位于细胞膜上，其可通过去除C端苯丙氨酸残基

skan FC酶标仪（美国Thermo公司）；电泳仪、转膜

仪（美国Bio-Rad 公司）。

1.3　细 胞

荧光定量PCR仪（美国Millipore公司）；Multi⁃

人乳腺癌细胞均由陆军军医大学附属西南医

院病理科惠赠。所有细胞均已通过短串联重复序

列（STR）分析鉴定。

2 方 法

2.1　基因表达与临床病理特征分析

使用UALCAN数据库评估ACE2在乳腺癌和

正常乳腺样本中的表达（me.

org），以及TCGA-BRCA数据库中的公共资料分析

性。Kaplan-Meier Plotter数据库分析ACE2表达与

ACE2与乳腺癌患者临床病理学特征之间的关联

乳腺癌生存率之间的关系（/anal⁃

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588

学 报 Journal of China Pharmaceutical University 2023，54（5）：586 - 598

第54 卷

ysis/）。

2.2　基因富集分析

2.5　蛋白质印迹（Western blot，WB）检测各细胞

中蛋白表达水平

采用RIPA裂解液提取细胞总蛋白，BCA法测

定蛋白浓度，每个样本上样量为20 µg，通过SDS-

PAGE凝胶电泳分离蛋白质并转移到聚偏氟乙烯

Cyclin抗体（A2、B1、D1和E2）、MMP2抗体和

2.6　RT-qPCR法检测各细胞中RNA表达水平

GAPDH抗体（l∶5 000）4 ℃过夜孵育，加二抗（鼠或

薄膜，室温封闭2 h，分别加ACE2抗体（l∶500），

ACE2皮尔逊相关系数大于0.3的共表达基因。上

使用UALCAN数据库选取了乳腺癌中44个与

传至DAVID()进行KEGG通

路富集和GO功能分析，并根据富集分数（enrich⁃

ment score）和数量（count），使用微生信(

/)进行可视化处理。

2.3　免疫浸润分析

兔源性）室温孵育1 h，洗膜后化学发光显色、拍照。

采用TRIzol试剂盒说明书提取细胞总RNA

基于TCGA-BRCA队列，本研究使用TISIDB

数据库(cis. hku. hk/TISIDB/)评估乳腺癌中

ACE2与组织亚型和免疫亚型的关系，分析ACE2

表达与TIICs、趋化因子、趋化因子受体和免疫抑制

分子的相关性。

2.4　细胞培养、慢病毒感染和siRNA转染

后，逆转录为cDNA，实验重复3次。引物序列

见表2。

Table 2　Primer sequences used for RT-qPCR

全培养基中，置于37 ℃、5% CO

2

恒温恒湿培养箱

中培养。取生长状态良好的细胞计数后，按每孔

约4 × 10

4

个接种至12孔细胞培养板中，待细胞生

长融合至50% ~ 70%时，加入含LV-ACE2或空载

体LV-Vector的慢病毒颗粒转染液，按感染指数

（multiplicity of infection，MOI）为50将慢病毒颗粒

和5 µg/mL聚凝胺与细胞缓慢充分混匀，置于

37 ℃、5% CO

2

恒温恒湿培养箱中进行培养，16 h后

察，采用含10%FBS和2 mg/L嘌呤霉素的DMEM培

养液进行筛选以建立稳定感染LV-ACE2或LV-

Vector的细胞系，并通过Western blot和RT-qPCR

验证感染效率,收集细胞进行后续实验。

采用Lipo8000™将小干扰RNA(siRNA)和阴性

对照转染入MDA-MB-231细胞，转染24 h后采用

续实验。siRNA的序列见表1。

Primer

MDA-MB-231培养于含10%FBS的DMEM完

ACE2-R

ACE2-F

Primer

5′-CGAAGCCGAAGACCTGTTCTA-3′

5′-GGAGCGAGATCCCTCCAAAAT-3′

5′-GGGCAAGTGTGGACTGTTCC-3′

Sequence

GAPDH-R

GAPDH-F

5′-GGCTGTTGTCATACTTCTCATGG-3′

2.7　CCK-8检测细胞增殖活力

收集对数生长期的各组细胞进行实验，将

细胞接种于96孔细胞培养板，每孔100 µL。设

置3个复孔，另设空白组（不含细胞，仅含培养液），

置于37 ℃、5%CO

2

培养箱中培养，细胞贴壁后分别

在第0 ~ 4天，分别使用含10%FBS和10%CCK-8的

培养液培养2 h，检测450 nm处吸收度。

2.8　Transwell 细胞侵袭实验

Matrigel胶与无FBS培养基按照4∶1的比例

更换为新鲜培养液，感染72 h后，荧光显微镜观

稀释后，均匀铺于24孔Transwell小室中。每孔按

RT-qPCR法检测细胞转染效率，收集细胞进行后

Table 1　siRNA sequences used for transfection

4 × 10

4

个细胞（100 µL）加入上室，下室各加无FBS

培养基600 µL。培养结束后，PBS 清洗，4%多聚

取膜显微镜下观察，拍照。

2.9　划痕愈合实验

按每孔5 × 10

5

个细胞均匀铺于6孔板中，细胞

甲醛固定细胞30 min，1%结晶紫染液浸泡60 min。

siACE2-2313-F

siRNA-NC-F

siACE2-579-R

siACE2-579-F5′-GGCCAUUAUAUGAAGAGUATT-3′

5′-UACUCUUCAUAUAAUGGCCTT-3′

5′-GGCAUUGUCAUCCUGAUCUTT-3′

5′-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3′

Sequence

密度达到70% ~ 80%时，每孔的中央划井字，PBS

清洗，倒置显微镜下观察0、24和48 h各组划痕的

愈合情况并拍照记录。

2.10　流式细胞术

细胞周期检测：收集各组细胞，PBS缓冲液洗

siACE2-2313-R

siRNA-NC-R

5′-AGAUCAGGAUGACAAUGCCTT-3′

5′-ACGUGACACGUUCGGAGAATT-3′

ACE2: Angiotensin converting enzyme 2; NC: Negative control

涤后75%乙醇重悬细胞，−20 ℃过夜固定。次日，

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第 54 卷第 5 期

徐灵亚，等：ACE2对乳腺癌预后的影响及其潜在机制

589

细胞经冷PBS缓冲液冲洗后，采用碘化丙啶染色

液重悬细胞，37 ℃避光温浴30 min。采用流式细

胞术分析不同细胞周期各组细胞百分率。

细胞凋亡检测：取各组细胞，用预冷的PBS洗

涤3次，每组分为4份（空白组、单染组和双染组），

加入Annexin V-APC和7-AAD染色液，冰上避光，

立即进行细胞凋亡检测。

2.11　统计学分析

采用SPSS 27和GraphPad Prism 7.0软件进行

3 结 果

3.1　乳腺癌组织中ACE2的表达水平

通过UALCAN数据库分析表明，ACE2在乳腺

癌组织中的表达水平显著低于正常对照组织（P <

0.05，图1-A），且在TNBC各亚型中的表达量存在

显著差异性（P < 0.05，图1-B）。为了进一步阐明

结果，本研究收集了TCGA数据库中乳腺癌转录组

和临床组数据，包含正常乳腺组织108例，乳腺肿瘤

组织1 017例，其中，99例为匹配样本。评估TCGA-

BRCA队列中未配对瘤旁乳腺正常组织（44.13 ±

2.28）与乳腺癌肿瘤组织（10.81 ± 0.929 5）（P <

0.05，图1-C）和配对的肿瘤组织与瘤旁组织（P <

0.001，图1-D）之间ACE2的mRNA表达。结果显

的表达明显更低。

示，与正常样本相比，ACE2在乳腺癌肿瘤样本中

统计学分析。各组组织和细胞中mRNA表达水平

ˉ

±s

和P表示，符合正态分布，以

x

多组间样本均数

比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用

LSD-t检验，非正态分布采用秩和检验。P < 0.05

被认为具有统计学意义。

ˉ

±s

)Figure 1　Angiotensin converting enzyme 2 (ACE2) expression levels in breast cancer tissues (

x

A: Expression levels of ACE2 in breast cancer and paraneoplastic tissues (database: UALCAN); B: Expression levels of ACE2 in various subtypes of

TCGA-BRCA); D: mRNA expression of ACE2 in paired breast cancer samples (database: TCGA-BRCA)

P < 0.05,

***

P < 0.001 vs normal group

triple-negative breast cancer (TNBC) (database:UALCAN); C: mRNA expression of ACE2 in unpaired breast cancer and normal samples (database:

*

3.2　ACE2表达与临床特征之间的相关性

与患者年龄（P < 0.05，图2-C）及肿瘤转移状态

（P < 0.05，图2-F ~ G）显著相关，而与种族、临床分

期和分级等参数之间的相关性并不显著（图2-A、

本研究评估了ACE2表达与乳腺癌患者临床

病理特征之间的相关性。结果表明ACE2的表达

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590

学 报 Journal of China Pharmaceutical University 2023，54（5）：586 - 598

第54 卷

B、D、E）。ACE2在不同年龄段的乳腺癌患者中呈

现差异表达趋势，其在乳腺癌高发的61 ~ 75岁年

龄阶段患者中的表达水平显著低于0 ~ 35岁和

36 ~ 60岁年龄段患者，结果提示ACE2低表达或许

是乳腺癌发生发展的重要驱动因素。此外，ACE2

在肿瘤M1期和N1mi期也呈低表达状态，结果提

示，ACE2可能在乳腺癌转移的早期阶段发挥重要

作用，其有望成为乳腺癌早期诊断的生物标记物。

Figure 2　Correlation between the relative expression of ACE2 and clinicopathological parameters

A: ACE2 expression in different races; B: ACE2 expression in different tumor stages; C: ACE2 expression in different age groups; D: ACE2 expression

in different T-stages; E: ACE2 expression in different N-stages; F: ACE2 expression in different M-stages; G: ACE2 expression in N0 and N1mi phases

3.3　ACE2表达与乳腺癌的预后相关

ACE2在乳腺癌4种主要亚型中的预后价值。结果

同的预后角色：在Luminal A型乳腺癌中，ACE2高

本研究采用Kaplan-Meier Plotter数据库评估

3.4　基因富集分析

一般而言，共表达基因具有相似的功能和作

用。本研究利用UALCAN数据库筛选TCGA-

BRCA队列中的ACE2共表达基因，进行KEGG通

路富集分析和GO功能分析。KEGG通路富集主

要是色氨酸代谢和花生四烯酸代谢相关通路等

（图4-A）。GO功能分析中关键生物学过程（BP）包

含脂多糖代谢、细胞周期、电子传递和免疫调节

等。关键细胞组分（CC）为线粒体和细胞外泌体的

组成部分。分子功能（MF）包括谷胱甘肽水解酶活

性、肽基转移酶活性、长链脂肪酸-CoA连接酶活

表明，在不同分子亚型乳腺癌中，ACE2扮演着不

表达者预后更差（P < 0.05，图3-A）；在TNBC中，

ACE2高表达者则提示更好的预后（P < 0.05，图3-

C）。而在Luminal B型（图3-B）和HER2阳性型乳

果表明，ACE2在乳腺癌预后中有重要的意义，是

TNBC良好预后的重要分子。

腺癌（图3-D）中并未发现显著预后意义。这些结

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第 54 卷第 5 期

徐灵亚，等：ACE2对乳腺癌预后的影响及其潜在机制

591

Figure 3　Correlation between ACE2 expression and prognosis

A: Prognosis in Luminal A breast cancer; B: Prognosis in Luminal B breast cancer; C: Prognosis in Basal-like breast cancer; D: Prognosis in HER2-

positive breast cancer

性、氧化还原酶活性和脂质合成等（图4-B）。以上

结果表明ACE2主要与乳腺癌中代谢酶活性、免疫

调节、细胞周期，以及色氨酸和花生四烯酸代谢过

程有关，这些过程对乳腺癌的发生发展至关

重要。

3.5　乳腺癌中ACE2的表达与免疫微环境的关系

免疫微环境中的免疫细胞在抑制或促进肿瘤

生长方面发挥着重要作用，趋化因子和趋化因子

受体在免疫调节过程中起着非常关键的作用，它

们可以将免疫细胞招募到TME中，并影响肿瘤进

展。随后使用TISIDB数据库评估ACE2与乳腺癌

TIICs以及趋化因子的关系。结果表明，ACE2表达

与乳腺癌中ACT-B、Th1、NKT、Tfh、Th17、Th2和肿瘤微环境（tumor microenvironment，TME）是

由肿瘤细胞、基质和内皮细胞组成的异质性复杂

组织，其中免疫浸润细胞、趋化因子、趋化因子受

体和免疫因子等构成免疫微环境。肿瘤免疫集群

分为6种免疫亚型，分别为C1：伤口愈合型，C2：

C5：免疫静默型和C6：TGF-β主导型。在TISIDB

数据库中，ACE2与乳腺癌患者组织学亚型和免疫

学亚型显著相关（图5-A）。

IFN-γ主导型，C3：炎症型，C4：淋巴细胞消减型，

Tem-CD8等细胞呈正相关（图5-B）。ACE2与乳腺

癌趋化因子CX3CL1、CXCL1和CXCL6等表达呈正

相关，与CXCL14表达呈负相关。ACE2与乳腺癌趋

化因子受体分子CXCR6、CXCR4、CXCR5和CXCR3

等表达呈正相关，与CXCR1和CX3CR1表达呈负

相关。目前，肿瘤免疫检查点抑制剂（immune

checkpoint inhibitors，ICIs）的使用改变了肿瘤治疗

的格局。ICIs是通过阻断免疫检查点来诱导抗肿

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学 报 Journal of China Pharmaceutical University 2023，54（5）：586 - 598

第54 卷

Figure 4　Gene enrichment analysis

A: KEGG pathway enrichment analysis; B: GO functional analysis

瘤免疫反应。本研究使用TISIDB数据库分析乳腺

癌中，ACE2与免疫抑制因子之间的相关性。结果

显示，ACE2与免疫抑制因子IDO1（rho = 0.367，

P < 0.05）、PDCD1（PD-1）（rho = 0.271，P < 0.05）

和CTLA4（rho = 0.323，P < 0.05）等表达水平呈正

相关（图5-C）。

验证

3.6　过表达和敲低ACE2细胞系的构建和效果

为了阐明ACE2在乳腺癌进展中的作用，本研

究首先检测了ACE2在不同乳腺癌细胞系中蛋白

表达水平（图6-A）。结果显示，在TNBC细胞系

而前文结果表明，ACE2高表达的TNBC患者预后

带来新思路。为了进一步验证ACE2在TNBC细胞

系中的功能作用，本研究建立了ACE2稳定过表达

和敲低细胞系。过表达ACE2后，ACE2的蛋白水

平（P < 0.05，图6-B）和RNA水平（P < 0.05，图6-

MDA-MB-231中，ACE2的表达水平呈低表达状态。

更好，这将为TNBC这一难治性亚型乳腺癌的探索

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第 54 卷第 5 期

徐灵亚，等：ACE2对乳腺癌预后的影响及其潜在机制

593

Figure 5　Relationship between ACE2 and the immune microenvironment

A: Association of ACE2 with breast cancer histological and immunological subtypes; B: Association between ACE2 and TIICs in breast cancer;

C: Association of ACE2 with immunosuppressive factors in breast cancer

D）均有显著的增加；反之，敲低ACE2后，ACE2的

蛋白水平（P < 0.05，图6-C）和RNA水平（P <

0.05，图6-E）均呈现显著的下调。

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594

学 报 Journal of China Pharmaceutical University 2023，54（5）：586 - 598

第54 卷

ˉ

±s, n=3

)Figure 6　Identification of ACE2 expression level (

x

A: ACE2 protein expression in breast cancer cell lines; B: Identification of ACE2 protein expression levels in constructs of stable overexpression cell

lines; C: Identification of ACE2 protein expression levels in siRNA knockdown cell lines; D: mRNA expression of ACE2 in constructs of stable overex⁃

*

pression cell lines; E: mRNA expression of ACE2 in siRNA knockdown cell lines

P < 0.05,

**

P < 0.01,

***

P < 0.001

3.7　ACE2抑制TNBC细胞的增殖、侵袭和迁移

表明，ACE2并非通过细胞凋亡和周期停滞途径抑

制TNBC细胞增殖。前文结果表明，ACE2与乳腺

癌的早期转移有关。而基质金属蛋白酶（MMP）是

锌依赖性蛋白水解金属酶，在肿瘤侵袭和转移中

发挥重要作用。文献报道，抑癌基因miR-526b-3p

的表达可通过下调MMP家族中重要成员MMP2的

表达，进而抑制HeLa细胞侵袭和转移

[18]

。本研究

也发现，ACE2过表达后的MDA-MB-231细胞中

ACE2可能通过影响MMP2而抑制TNBC细胞的

转移。

3.8　ACE2通过MMP2途径抑制TNBC细胞的侵袭

MMP2的表达水平显著降低（图8-C）。结果提示，

前期数据库结果表明，ACE2与TNBC患者预

后显著相关，其高表达者患者预后更好。而TNBC

作为侵袭能力较强的乳腺癌亚型，关注ACE2在这

种亚型中的角色和作用十分必要。为此，本研究

选择TNBC细胞系MDA-MB-231进行相关功能实

验。结果表明，与对照组相比，ACE2过表达组细

胞的增殖、迁移和侵袭能力显著减弱（图7）。反

之，敲低ACE2后，MDA-MB-231细胞增殖活力反

而提升（P < 0.05，图7-B）。结果表明ACE2能够抑

制MDA-MB-231细胞的增殖、侵袭和迁移。

为进一步研究ACE2抑制MDA-MB-231细胞

增殖、侵袭和迁移的机制，本研究通过流式细胞术

和WB实验，检测细胞周期停滞情况（图8-A）和凋

亡数量（图8-B）及相关周期蛋白Cyclin A2、Cyclin

B1、Cyclin D1和Cyclin E2的表达（图8-C）。结果

为进一步验证ACE2是否通过MMP2途径抑

制TNBC细胞的侵袭。本研究将siACE2转染到

通过Invasion实验进行检验。结果发现，转染了

231-lenti-ACE2细胞中观察MMP2的表达情况，并

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第 54 卷第 5 期

徐灵亚，等：ACE2对乳腺癌预后的影响及其潜在机制

595

ˉ

±s, n=3

)Figure 7　ACE2 inhibits the proliferation, invasion and migration of TNBC cells (

x

A and B: CCK-8 was used to monitor cells proliferation viability for 4 days; C: Wound healing experiments was applied to evaluate cell migration abili⁃

**

ty; D: Cell invasion ability was detected by transwell assay (scale bar = 1 cm)

P < 0.01,

***

P < 0.001

ˉ

±s, n=3

)Figure 8　Effect of ACE2 on cell cycle, apoptosis and matrix metalloproteinase 2 (MMP2) (

x

A: Flow cytometry was used to detect cell cycle changes; B: Flow cytometry was used to detect apoptosis; C: Western blot was used to detect Cyclin

**

and MMP2 protein expression

P < 0.01

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学 报 Journal of China Pharmaceutical University 2023，54（5）：586 - 598

第54 卷

siACE2的231-lenti-ACE2细胞的侵袭能力较231-

lenti-ACE2组显著增强（图9）。以上结果说明

ACE2可以通过MMP2途径抑制MDA-MB-231细胞

的侵袭能力。

ˉ

±s, n=3

)Figure 9　ACE2 affects cell invasion through MMP2 (

x

A: Effect of ACE2 on MMP2 protein levels; B: ACE2 affects cell invasion through MMP2; C: Statistical analysis of invasion assay of MDA-MB-231

**

cells

P < 0.01,

***

P < 0.001

4 讨 论

在本研究中，首先进行了综合生物信息学分

析，以研究ACE2在乳腺癌中的表达量、预后价值、

生物学功能和潜在的调控途径。这些生物信息学

分析和基础研究将为进一步了解乳腺癌患者的预

后和治疗奠定基础。基于生物信息学分析，发现

ACE2在乳腺癌中表达低于正常组织，并与患者年

龄、M分期和N1mi期相关。同时发现，ACE2与乳

腺癌的分子亚型密切相关，ACE2高表达预示着

Luminal 型乳腺癌的生存时间更短，而TNBC的生

存时间更长。近期研究发现，ACE2通过与新冠病

毒表面S蛋白结合诱导人体细胞发生病毒感染

[19]

，

ACE2靶向药物的研制成为治疗新冠的关键。其

中，靶向ACE2的雾化吸入剂临床试验显示了良好

的安全性和耐受性。另有文献报道

[20]

，转移性TN⁃

BC患者感染新冠的可能性更高，其主要原因是该

类患者的癌细胞更易发生病毒感染，以上结果提

示新冠相关分子ACE2在乳腺癌进展中扮演重要

角色。为此提出大胆的设想，是否ACE2靶向药物

也能使部分乳腺癌患者从中获益？尤其是ACE2

表达高而预后差的Luminal 型乳腺癌患者以及

ACE2表达低预后差的TNBC患者这类亚群能否从

为乳腺癌的精准治疗提供新的思路。

Xiao等

[21]

通过构建TNBC新型代谢组学，将TNBC

分为3个不同的代谢组学亚组：C1，其特征在于神

和糖基转移相关的代谢物的上调；C3，具有最低水

平的代谢失调。而在TNBC转录组亚型中，LAR亚

型与代谢组学C1亚型几乎重叠；BLIS、IM和MES

亚型主要分为代谢组学C2亚型和C3亚型。本研

究发现，与其他TNBC亚型相比，ACE2在LAR亚型

中高表达，这提示ACE2可能与C1亚型的神经酰

经酰胺和脂肪酸的富集；C2，特征在于与氧化反应

代谢重编程是肿瘤的关键标志。2022年，

中获益值得深入思考和探索。以上结果及推论将

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第 54 卷第 5 期

徐灵亚，等：ACE2对乳腺癌预后的影响及其潜在机制

[J]. CA Cancer J Clin, 2023, 73(1): 17-48.

597

胺和脂肪酸代谢有关。而且通过基因富集分析，

也发现ACE2参与脂肪酸代谢途径。并且ACE2高

表达的TNBC患者的预后较好。由此推测，在不同

代谢组学的TNBC亚型中，针对ACE2的治疗可能

会有不同的疗效。

为进一步明确ACE2在TNBC中的功能作用，

本研究首先进行了细胞增殖实验。结果发现，

ACE2可以有效抑制MDA-MB-231细胞的增殖能

力，但并未发现其对细胞凋亡能力的影响。数据

[3]Liu X, Li YQ, Mu FC, et al. New progress in molecular typing of

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tenance therapy using lower dosage and higher frequency vs

stage triple-negative breast cancer who had received standard

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库资料分析发现ACE2与乳腺癌的远处转移和早

期淋巴结转移有关，而又有文献证明了ACE2可以

抑制肿瘤转移，这些结果均提示ACE2在乳腺癌转

移中起着关键作用，但具体机制尚不清楚。肿瘤

的侵袭和转移在很大程度上取决于多种MMPs的

蛋白水解活性，这些酶通过降解细胞外基质

（ECM）成分和释放基质因子、细胞表面结合的细

胞因子、生长因子或其受体，参与基质破坏、新生

血管形成和转移

[22]

。MMPs家族含有许多成员，其

中MMP2是一种Zn

-依赖性金属蛋白酶

。众所

周知，MMP2在肿瘤侵袭和转移中发挥着重要作

用。而本研究也发现，在MDA-MB-231细胞中过

表达ACE2后，MMP2的表达显著下调。结果提示

癌的增殖和转移，ACE2是如何调控MMP2的具体

ACE2可能通过下调MMP2的表达，进而抑制乳腺

机制有待进一步深入探索。以上发现，为深入研

究ACE2调控乳腺癌侵袭转移作用机制提供了重

要依据。

综上所述，ACE2可能是TNBC的潜在预后生

物标志物，并可能参与了氨基酸和脂肪酸代谢，以

及肿瘤免疫微环境的调控。同时，ACE2可能通过

下调MMP2的表达而非依赖细胞凋亡和细胞周期

停滞途径抑制TNBC细胞的增殖和转移。以上结

果表明，ACE2在调节TNBC细胞的恶性行为中发挥

着重要作用，这将为TNBC的诊治提供新的思路。

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anticancer MMP2 inhibitors: a review[J]. Future Med Chem,

·本 刊 讯·

“药用材料研究前沿进展及其与制剂质量/性能相关性”

专刊/专栏征稿

为了促进学术交流，为药学及相关学科研究人员构建展示最新研究成果的平台，展示国内外中青年药学专家的学

专刊/专栏（专栏主编：孙春萌教授），现特向在国内外从事药学及相关领域研究中有造诣科学工作者征集研究性论文或

综述，约请国内外中青年药学专家为本次活动撰稿。

征文要求和注意事项

1. 撰稿要求

请结合您课题组所从事的研究工作，紧密围绕药用辅料和药用新材料研究前沿，展望该领域发展前景，具有创新

性、学术型、科学性、规范性和可读性。征文范围包括但不限于：

1）药用辅料/药用新材料的构效关系研究与评价技术；

2）药用辅料/药用新材料的功能性相关指标评价技术；

术风采，《中国药科大学学报》编辑部拟定于2024年第2期出版“药用材料研究前沿进展及其与制剂质量/性能相关性”

3）基于功能性相关指标差异的药用辅料规格划分策略；

4）基于药用辅料功能性相关指标的处方筛选与制剂性能评价；

7）药用辅料监管技术；

5）不同规格药用辅料的应用特性及其适用性研究（制剂开发、辅料变更等）；

6）复杂组分药用辅料/药用新材料结构和组分剖析与控制技术；

8）药用新材料的转化应用。

2. 全文要求10 000～12 000字，引用文献中以近5年发表的为主。

3. 征文需要按照编辑部“三审制”进行评审，经过同行专家评审后决定最终是否录用。编辑部对征文开设绿色通

道，优先处理，以最快的方式编辑出版，在中国知网网络首发，供读者免费阅读下载。

注明“2024药用材料专栏”字样。

5. 其他注意事项

4. 投稿方式：采用“《中国药科大学学报》在线投稿系统”（ http：///jcpu/home） 投稿。请在投稿时

本次征文以《中国药科大学学报》正刊形式出版，收稿截止日期为2023年12月31日。

样刊2本。

本期专栏投稿文章不收审稿费，录用论文不收取版面费。发表后将按《中国药科大学学报》标准支付稿酬，并赠送

（本刊编辑部）

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