大黄素联合甲磺酸阿帕替尼通过上调ACE2-Ang(1-7)-Mas受体轴抑制胰腺癌细-USB迷|专注于互联网分享

2024年3月22日发(作者：宣菲)

王　婧

∗

,马　晓,尚　昆,林海珊,曹邦伟

(首都医科大学附属北京友谊医院肿瘤科,北京　100050)

中图分类号　R979.1文献标志码　A文章编号　1672

2124(2021)03

0269

DOI　10.14009/.1672-2124.2021.03.003

大黄素联合甲磺酸阿帕替尼通过上调ACE2-Ang(1-7)-

Mas受体轴抑制胰腺癌细胞增殖的研究

摘　要　目的:验证大黄素联合甲磺酸阿帕替尼通过上调血管紧张素转换酶2(ACE2)-血管紧张素(1-7)[Ang(1-7)]-Mas受体轴

抑制胰腺癌细胞增殖的作用及机制。方法:采用四甲基偶氮唑盐(methyl

thiazolyltetrazolium,MTT)比色法检测大黄素、甲磺酸阿

帕替尼以及联合用药(大黄素

甲磺酸阿帕替尼)对胰腺癌PANC-1细胞增殖能力的影响,以空白处理作为对照。采用酶联免疫

吸附试验测定细胞上清液白细胞介素6(IL-6)、Ang(1-7)水平。采用Western

blot法和免疫荧光方法检测各实验组细胞ACE2、

Mas受体蛋白表达情况。结果:加药干预细胞后,大黄素组细胞抑制率为11.72%,甲磺酸阿帕替尼组的抑制率为15.94%,联合用

药组的抑制率为28.84%,联合用药组显著高于单药组,差异均有统计学意义(P<0.05)。甲磺酸阿帕替尼组IL-6水平明显低于

大黄素组,联合用药组明显低于大黄素组及甲磺酸阿帕替尼组;与IL-6相反,大黄素组、甲磺酸阿帕替尼组及联合用药组的

Ang(1-7)水平明显高于对照组,其中联合用药组最高,上述差异均有统计学意义(P<0.01)。Westernblot法及免疫荧光方法检测

结果表明,大黄素组及甲磺酸阿帕替尼组ACE2及Mas受体蛋白表达水平高于对照组,联合用药组表达最高。结论:大黄素及甲

磺酸阿帕替尼单药通过上调ACE2-Ang(1-7)-Mas受体轴抑制胰腺癌细胞增殖,两药联合应用具有协同效应。

关键词　大黄素;

甲磺酸阿帕替尼;胰腺癌;血管紧张素转换酶2;血管紧张素(1-7)

InhibitionofEmodinCombinedwithApatinibMesylateonProliferationofPancreaticCancer

CellsbyUp-RegulatingtheACE2-Ang(1-7)-MasReceptorAxis

WANGJing,MaXiao,SHANGKun,LINHaishan,CAOBangwei(logy,Beijing

FriendshipHospital,CapitalMedicalUniversity,Beijing100050,China)

ABSTRACT　OBJECTIVE:

Toverifytheeffectandmechanismofemodincombinedwithapatinibmesylatein

inhibitingtheproliferationofpancreaticcancercellsbyup-regulatingtheangiotensinconvertingenzyme2(ACE2)-

Angiotensin(1-7)[Ang(1-7)]-S:MethylThiazolylTetrazolium(MTT)wasusedtodetect

theeffectsofemodin,apatinibmesylateanddrugcombination(emodin

apatinibmesylate)ontheproliferationof

-linkedimmunosorbentassaywasusedtodetermine

thelevelsofinterleukin6(IL-6)andAng(1-7)nblotmethodandimmunofluorescence

methodwereusedtodetectS:

Afterintervention,thecellinhibitionrateoftheemodingroup,apatinibmesylategroupanddrugcombinationgroup

wasrespectively11.72%,15.94%and28.84%,thedrugcombinationgroupwassignificantlyhigherthanthesingle

druggroup,thedifferenceswerestatisticallysignificant(P<0.05).ThelevelofIL-6intheapatinibmesylategroup

wassignificantlylowerthanthatintheemodingroup,andthatinthedrugcombinationgroupwassignificantlylower

rasttothelevelofIL-6,Ang(1-7)inthe

emodingroup,apatinibmesylategroupandcombinationgroupwassignificantlyhigherthanthatinthecontrolgroup,

andthedrugcombinationgrouphadthehighestAng(1-7),withstatisticallysignificantdifference(P<0.01).The

resultsofWesternblotandimmunofluorescenceshowedthattheexpressionlevelsofACE2andMasreceptorproteinin

theemodingroupandapatinibmesylategroupwerehigherthanthoseinthecontrolgroup,andtheexpressionlevelsof

ASIONS:Themonotherapyof

emodinandapatinibmesylateinhibitstheproliferationofpancreaticcancercellsbyup-regulatingtheACE2-Ang(1-7)-

Masreceptoraxis,andthecombinationoftwodrugshasasynergisticeffect.

KEYWORDS　Emodin;

Apatinibmesylate;Pancreaticcancer;Angiotensinconvertingenzyme2;Angiotensin(1-7)

Δ基金项目:北京市临床重点专科(2018-2020);北京市医院管理中心消化内科学科协同发展中心专项经费资助(01);首都卫生发展

科研专项基金资助(No.2018-2-2022);首都医科大学科研培育基金(20148)

∗副主任医师,博士。研究方向:消化系统肿瘤的临床及基础研究。Email:wangjing@

#通信作者:主任医师,博士。研究方向:恶性肿瘤的综合诊治。E-mail:oncology@

中国医院用药评价与分析　2021年第21卷第3期　Evaluation

andanalysisofdrug-useinhospitalsofChina2021Vol.21No.3·　269·

　　胰腺癌是恶性度较高的恶性肿瘤之一,2018年全球范围

355317例新病例

[1]

。尽管在胰腺癌的检测和治疗方面取得

内报告了458

918例胰腺癌新病例,预计至2040年将出现

蛋白电泳,电转移到PVDF膜上,封闭后顺序加ACE2、Mas、

GAPDH一抗(1∶1000)及二抗(1∶5000),到达反应时间后,检

了进展,但患者5年生存率仍然只有9%。甲磺酸阿帕替尼是

我国独立研发的抑制肿瘤新生血管形成的靶向治疗药物,其

不仅具有抑制肿瘤新生血管形成的作用,还有抑制肿瘤细胞

增殖的作用

[2]

。本研究拟通过观察大黄素、甲磺酸阿帕替尼

以及上述2种药物联合应用对胰腺癌细胞增殖能力的影响,

2.5　免疫荧光细胞化学法测定ACE2、Mas受体蛋白表达情况

时,更换为无血清培养基继续培养24

h,然后进行免疫荧光细

测杂交信号,计算蛋白含量

[5]

。

将胰腺癌细胞接种至6孔板中,待其生长融合度达85%

胞化学染色,观察ACE2、Mas受体蛋白表达情况,用激光共聚

2.6　统计学方法

焦显微镜观察并摄取荧光图像

[5]

。

1　材料

探讨其作用机制。

1.1　细胞株

胰腺癌PANC-1细胞株购自江苏凯基生物技术股份有限

公司,于含10%胎牛血清的1640培养基传代培养,当细胞处

于对数生长期时开始进行实验。

1.2　药物与试剂

实验所用大黄素购于美国Sigma公司;甲磺酸阿帕替尼购

自江苏恒瑞公司;胎牛血清购自ExCell公司;1640培养基购自

1.3　仪器

Hyclone公司。

过两独立样本t检验,偏态分布者采用秩和检验;各测定值结

数据均采用SPSS

17.0统计软件进行分析,正态分布者通

3　结果

果以均数±标准差表示,P<0.05认为有统计学意义。

3.1　大黄素、甲磺酸阿帕替尼以及联合用药对PANC-1细胞

增殖能力的影响

分别用不同浓度的大黄素(12.5、25、50、100及200

μmol/L)

对PANC-1细胞进行处理,检测结果显示,大黄素及甲磺酸阿帕

替尼单药刺激PANC-1细胞,其抑制增殖能力均呈现剂量依赖

性,见图1。根据半数抑制浓度(IC

),选择大黄素实验浓度

为100

μmol/L,甲磺酸阿帕替尼实验浓度为40μmol/L。加药

倒置显微镜(日本OLYMPUS公司);80-2型台式低速离心机

(上海医疗器械股份有限公司医疗设备厂);WH-2型振荡器

(上海沪西分析仪器厂);UV-2450型紫外光度仪(日本

XD-101型CO

培养箱(日本SANYO公司);IX51型生物

干预细胞后,大黄素组细胞抑制率为11.72%,甲磺酸阿帕替

尼组的抑制率为15.94%,联合用药组的抑制率为28.84%,联

合用药组显著高于单药组,差异有统计学意义(P<0.05),见

图2。

2　方法

SHIMADZU公司);ELx800型酶标仪(美国BioTek公司)。

2.1　分组

本研究共分为对照组、甲磺酸阿帕替尼组、大黄素组及联

合用药组(大黄素

甲磺酸阿帕替尼)。实验药物按照特定浓

度分别溶于含10%胎牛血清的1640培养基,对照组为不含药

物的培养基。

2.2　四甲基偶氮唑盐(methylthiazolyltetrazolium,MTT)法

检测细胞活力

液50

μl(约含1

个细胞),加入1640培养液50

μl。待细

将胰腺癌PANC-1细胞铺于96孔板内,每孔注入细胞悬

20μl,37℃孵育4h后吸出上清液,每孔加入二甲基亚砜

胞充分贴壁后进行分组实验。作用72

h后,每孔加入MTT

计算细胞增殖率

[3]

。

150μl震荡约10min,测量波长为490nm处的吸光度(OD),

2.3　酶联免疫吸附(enzymelinkedimmunosorbentassay,

ELISA)方法测定白细胞介素6(IL-6)、血管紧张素(1-7)

[Ang(1-7)]的表达

Bio公司ELISA试剂盒,按照试剂盒使用说明书检测IL-6、

2.4　Westernblot法检测胰腺癌细胞内血管紧张素转换酶2

分别收集四组细胞的上清液进行检测,选取美国Rapid

Ang(1-7)水平

[4]

。

(ACE2)、Mas受体蛋白表达水平

药处理,置于37

℃温箱孵育24h。按照经典Westernblot检测

图1　不同浓度大黄素、甲磺酸阿帕替尼对PANC-1

细胞的增殖抑制作用

Fig1　Inhibitionproliferationeffectofemodincombined

withapatinibmesylateonPANC-1cellatdifferent

concentrations

A.大黄素;B.甲磺酸阿帕替尼

;ibmesylate

将细胞接种于6孔板,待细胞贴壁后,按照不同干预组给

3.2　大黄素、甲磺酸阿帕替尼以及联合用药组细胞上清液中

IL-6、Ang(1-7)水平的差异

取各组细胞上清液进行检测IL-6、Ang(1-7)水平,对照

方法,提取细胞总蛋白,测定蛋白浓度,每样品上样30

g,进行

·　270·Evaluationandanalysisofdrug-useinhospitalsofChina2021Vol.21No.3中国医院用药评价与分析　2021年第21卷第3期

3.4　免疫荧光检测ACE2、Mas受体蛋白表达水平

表达部位在胰腺癌细胞的胞浆中;Mas表达部位在胰腺癌细胞

膜。大黄素组及甲磺酸阿帕替尼单药组ACE2及Mas受体表

达高于对照组,联合用药组表达明显最高,见图4—5。

Mas受体阳性表达呈绿色荧光,细胞核呈蓝色荧光;ACE2

图2　不同药物干预对PANC-1细胞的增殖抑制作用

Fig2　Inhibitionproliferationeffectofdifferentdrug

interventionsonPANC-1cell

组、大黄素组、甲磺酸阿帕替尼组及联合用药组的IL-6水平明

显低于对照组,差异均有统计学意义(P<0.01),甲磺酸阿帕

替尼组显著低于大黄素组,联合用药组显著低于大黄素组及

甲磺酸阿帕替尼组;与IL-6相反,大黄素组、甲磺酸阿帕替尼

组及联合用药组的Ang(1-7)水平高于对照组,其中联合用药

组最高,与对照组比较,差异有统计学意义(P<0.01),见表1。

表1　四组PANC-1细胞上清液中IL-6、Ang(1-7)水平

比较(x±s)