2024年4月4日发(作者：鄂藉)
综合研究性实验三：
脲酶的制备及其生物学性质的研究
一.实验目的
1.学习大豆脲酶的提取方法；
2.掌握脲酶米氏常数Km的测定方法；
3.测定脲酶的活力单位及此活力；
4.测定温度、PH、抑制剂对酶活性的影响。
二.脲酶提取液的制备
脲酶提取液的制备方法
锥形瓶内加入大豆粉2g和30%的乙醇20mL
方
30min充分摇匀，放置于冰箱
法
次日离心15min（3000rpm），取上清液即为脲酶提取液
大豆粉中含脲酶不均一，酶浓度需作预实验稀释或酌情加量，原则上要求
尿素浓度最大的一管的光吸收值在0.5-0.7为宜。另外，脲酶需新鲜配制，本
说
明
实验脲酶提取液的制备最好在0-5℃下进行，在室温下放置不应超过12h，在
冰箱内放置不应超过24h，否则会影响实验结果。
三.脲酶Km的测定
[一]实验原理
K
m
值一般可看作是酶促反应中间产物的解离常数。测定K
m
在研究酶的作用机制、观察酶
与底物间的亲和力大小、鉴定酶的种类及纯度、区分竞争性抑制与非竞争性抑制作用等研究
中均具有重要的意义。
当环境温度、pH值和酶的浓度等条件相对恒定时，酶促反应的初速度v随底物浓度[S]
增大而增大，直至酶全部被底物所饱和达到最大速度V。反应初速度与底物浓度之间的关系
经推导可用下式来表示，即米氏方程式：
对于K
m
值的测定，我们通常采用Lineweaver-Burk作图法，即双倒数作图法。具体做
法为：取米氏方程式倒数形式。
若以1/v对1/[S]作图，即可得下图中的曲线，通过计算横轴截距的负倒数，就可以很
方便地求得K
m
值。
本实验从大豆中提取脲酶，脲酶催化尿素分解产生碳酸铵，碳酸铵在碱性溶液中与纳氏
试剂作用，产生橙黄色的碘化双汞铵。在一定范围内，呈色深浅与碳酸铵的产量成正比。通
过分光光度计所得到的光吸收值可代表酶促反应的初速度（单位时间所产生的碳酸铵含量与
光吸收值成正比）。具体反应如下：
（1）酶促反应
2024年4月4日发(作者：鄂藉)
综合研究性实验三：
脲酶的制备及其生物学性质的研究
一.实验目的
1.学习大豆脲酶的提取方法；
2.掌握脲酶米氏常数Km的测定方法；
3.测定脲酶的活力单位及此活力；
4.测定温度、PH、抑制剂对酶活性的影响。
二.脲酶提取液的制备
脲酶提取液的制备方法
锥形瓶内加入大豆粉2g和30%的乙醇20mL
方
30min充分摇匀，放置于冰箱
法
次日离心15min（3000rpm），取上清液即为脲酶提取液
大豆粉中含脲酶不均一，酶浓度需作预实验稀释或酌情加量，原则上要求
尿素浓度最大的一管的光吸收值在0.5-0.7为宜。另外，脲酶需新鲜配制，本
说
明
实验脲酶提取液的制备最好在0-5℃下进行，在室温下放置不应超过12h，在
冰箱内放置不应超过24h，否则会影响实验结果。
三.脲酶Km的测定
[一]实验原理
K
m
值一般可看作是酶促反应中间产物的解离常数。测定K
m
在研究酶的作用机制、观察酶
与底物间的亲和力大小、鉴定酶的种类及纯度、区分竞争性抑制与非竞争性抑制作用等研究
中均具有重要的意义。
当环境温度、pH值和酶的浓度等条件相对恒定时，酶促反应的初速度v随底物浓度[S]
增大而增大，直至酶全部被底物所饱和达到最大速度V。反应初速度与底物浓度之间的关系
经推导可用下式来表示，即米氏方程式：
对于K
m
值的测定，我们通常采用Lineweaver-Burk作图法，即双倒数作图法。具体做
法为：取米氏方程式倒数形式。
若以1/v对1/[S]作图，即可得下图中的曲线，通过计算横轴截距的负倒数，就可以很
方便地求得K
m
值。
本实验从大豆中提取脲酶，脲酶催化尿素分解产生碳酸铵，碳酸铵在碱性溶液中与纳氏
试剂作用，产生橙黄色的碘化双汞铵。在一定范围内，呈色深浅与碳酸铵的产量成正比。通
过分光光度计所得到的光吸收值可代表酶促反应的初速度（单位时间所产生的碳酸铵含量与
光吸收值成正比）。具体反应如下：
（1）酶促反应