2024年4月8日发(作者：斯听双)
马铃薯WRKY2基因的克隆和非生物逆境下的表达模式
李立芹;王西瑶
【摘 要】Function of StWRKY2 has not been WRKY proteins
are found as an important class of transcription factors in recent
years,which are widely involved in biotic stress,abiotic stress and growth
development regulation,and they are mainly divided into three
2 was cloned from potato by homology cloning, with length
of the coding region 1 065 bp,encoding 355 amino acids by DNA
the amino acid se-quence of StWRKY2 blasting in
NCBI,19 homology amino acid sequences were selected to analysis
conservative acid analysis showed that the StWRKY2
contained 1 conserved WRKY domain (TTGACC)and be-longed to the
second group of WRKY family members,and its zinc-finger structure was
C-X5-C-X23 -eny tree results showed StWRKY2 was the most
closest to SlWRKY7 (Solanum lycopersicum )with 96%similarity,and the
similarity of a WRKY protein of tobacco was 86%.The protein-GST
(glutathione-S-transferase) complex was obtained in Escherichia coli by
using the method of prokaryotic 2-GST could com-bine
W-box in vivo by Electrophoretic Mobility Shift Assay analysis,but only GST
protein could not combine 2-GST combination with W-box
could be competed by cold probe(unlabeled probe).And the experi-ment
results also showed that StWRKY2-GST could not combine mutation W-
box,this suggested StWRKY2-GST combined W-box with
is of StWRKY2 expression level in the root,stem and leaf
tissue through the real-time fluorescence quantitative PCR,the results
showed that the gene was mainly expressed in the was leaf and
order to further study the possible function of the gene,potato
seeding from tissue culture were treated under 10 μmol/L low
phosphorus,10 μmol/L low potassium,200 mmol/L NaCl,400 mmol/L PEG
solution and 4 ℃ low-temperature treatment for 6 h,real-time fluorescence
quantitative PCR showed that this gene expression level decreased
significantly after low phosphorus treatment,expression of StWRKY2
increased significantly after 200 mmol/L NaCl and 400 mmol/L
sion level of StWRKY2 had no obvious change after low
po-tassium and 4 ℃ low temperature results indicated that
StWRKY2 could in response to low phos-phorus,NaCl and PEG three kinds
of abiotic results would lay a solid foundation for further
study of potato WRKY2 gene function.%马铃薯 WRKY 2基因的功能尚未见有
报道,WRKY 蛋白是近年来发现的一类重要转录因子家族,它们在植物应对生物胁迫、
非生物胁迫和生长发育过程中起到关键的调控作用.该研究采用电子克隆法获得马
铃薯 WRKY 2基因,该基因的编码区长度1065 bp,编码355氨基酸,序列分析表明,
该蛋白属于 WRKY 家族第二组成员,锌指结构为 C-X5-C-X23 H-X-H.构建系统发
育树结果表明它与番茄 WRKY7亲缘关系较近,氨基酸序列相似性达96％,与烟草中
WRKY 蛋白的相似性为86％,利用原核表达法在大肠杆菌中获得该蛋白.通过凝胶
阻滞实验证明,该蛋白在体外能结合 W-box 元件,而且这种结合能被冷探针所竞争,
同时也表明StWRKY2不能结合含有突变 W-box DNA 片段,证明 StWRKY2与
W-box 结合具有特异性.通过实时荧光定量 PCR 技术分析该基因在根、茎和叶中
的表达量,结果表明该基因主要在根中表达,其次是叶和茎.为进一步研究该基因可能
参与的生理功能,对马铃薯组培苗进行10μmol/L 低磷、10μmol/L 低钾、200
mmol/L NaCl、400 mmol/L PEG 溶液和4℃低温处理,处理时间6 h,实时荧光定
量 PCR 的结果表明该基因在低磷处理后表达量明显下降,在200 mmol/L NaCl 和
400 mmol/L PEG 处理6 h 后表达量明显升高,但在10μmol/L低钾和4℃低温处
理后表达量与对照相比无明显变化.说明 StWRKY2能响应低磷、NaCl 和 PEG 这
三种非生物逆境胁迫.研究结果可为进一步深入研究马铃薯 WRKY 2基因的功能奠
定基础.
【期刊名称】《广西植物》
【年(卷),期】2015(000)003
【总页数】7页(P401-407)
【关键词】马铃薯;WRKY;系统发育;EMSA;表达模式
【作 者】李立芹;王西瑶
【作者单位】四川农业大学 农学院，成都 611130;四川农业大学 农学院，成都
611130
【正文语种】中 文
【中图分类】Q943.2;Q812
WRKY转录因子最初是从甘薯中发现的一类蛋白,当时命名为SPF1（Ishiguroet
al.,1994）。这类蛋白的特点是在其N端含有60个高度保守的WRKY结构域,其
中包括一个十分保守的七肽WRKYGQK,该结构域中还含有一类类似锌指的结构域。
后来相继从其它植物例如欧芹、水稻、烟草、大麦和紫花苜蓿中也鉴定出了这种蛋
白（Cormacket al., 2002；郭泽建等, 2004；Haraet al., 2000；Sunet al., 2003；
陈婷婷等,2012）。WRKY蛋白参与植物的抗病性（Liet al.,2006）、代谢调控
（Xuet al., 2004）、衰老（Robatzeket al.,2002）和非生物逆境等生理过程
（Mareet al., 2004；江文波等,2009）。拟南芥中AtWRKY22和AtWRKY29已
被鉴定是MAPK信号途径的下游组分,参与细菌和真菌病原物的信号传导
（Wanget al.,2004）。一些WRKY蛋白参与植物生长发育过程,例如拟南芥中
TTG2编码一个WRKY转录因子（即At WRKY44）,该蛋白在表皮毛中高水平表
达,该基因突变体叶表面毛状体的数量减少且没有分支（Jonsonet al.,2002）。拟
南芥WRKY6对低硼胁迫表现出敏感表型（Ichiroet al.,2010）,说明该转录因子在
硼胁迫生理过程中起到正调控作用。
马铃薯（Solanum tuberosum）是目前世界上继水稻、玉米和小麦之后的第四大
粮食作物,现已在世界各地广泛种植,马铃薯的适应性强,经济价值高,既可粮菜兼用,
又能作为工业原料,因此马铃薯在我国乃至全球工农业生产中占有举足轻重地位。
本研究首次报道克隆出马铃薯品种米拉WRKY2基因,序列分析表明该蛋白属于
WRKY家族第二组成员,锌指结构为C-X5-C-X23H-X-H,通过凝胶阻滞实验证明该
蛋白在体外具有结合DNA的活性,同时利用实时荧光定量PCR研究其在低磷、低
钾、高盐、PEG和4℃低温处理共五种非生物逆境胁迫下的表达情况,这为今后深
入研究该基因的功能奠定了坚实基础。
1.1 材料
供试马铃薯品种米拉,由四川农业大学马铃薯研究中心提供。植物材料的处理是把
在MS培养基上生长1个月马铃薯组培苗置于相应处理的溶液和4℃低温中处理6
h。大肠杆菌DH5α和BL21、DNA凝胶回收纯化试剂盒购于天根科技（北京）有
限公司；p MD19-T克隆载体、Ex Taq DNA聚合酶、T4DNA连接酶购于Ta
KaRa公司（大连）。
1.2 方法
1.2.1 提取马铃薯米拉总RNA和反转录 以组培苗的幼嫩叶片为材料,采用Trizol法
提取总RNA,然后反转录为cDNA。反转录的反应体系为10 μL,在DEPC水处理过
的小管中依次加入下列组分：Oligo d T 0.5μL；d NTP（20 mmol/L）1μL；
RNA 3μg；补水至6.5μL。65℃变性5 min,迅速在冰上冷却至少1 min,稍微离心,
然后加入5× First-Strand buffer 2μL、0.1 mol/L DTT 1μL；Super ScriptTMII
RT 0.5μL。反应条件是42℃反应60 min,70℃处理15 min。反转录产物在-20℃
保存备用。
1.2.2 扩增WRKY2基因 用同源序列克隆方法,利用Primer Premier 5.0设计同源
引物,引物序列为WRKY2-F（5′-GGATCCATGGCTGTAGACTTAATGACCA-3′下
划线处表示酶切位点,以下同）和WRKY2-R引物（5′-
CCCGGGTTAAGAAGATTCAAGAACAT-3′）。PCR反应体系以0.5μL cDNA为
模板,加入10×Ex Taq缓冲液2.5μL（含Mg2＋）,WRKY2-F和WRKY2-R各
0.5μL（10 μmol/L）,20 mmol/L d NTP 0.5μL,Ex Taq DNA聚合酶0.25μL（5
U/μL）,加水至25μL。PCR反应的条件：94℃预变性5 min；94℃变性30 s,55℃
退火30 s,72℃延伸1 min 10 s,共35个循环；最后72℃延伸10 min。PCR产物
于1%琼脂糖凝胶电泳检测。
1.2.3 基因克隆及测序 扩增产物经电泳检测后,回收目的片段,然后与p MD19-T载
体16℃连接过夜,连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态,然后在涂有氨苄青霉素的
LB平板上进行培养过夜,第二天挑取单克隆,进行菌落PCR检测,然后随机选取3个
独立的阳性克隆进行测序（上海Invitrogen生物工程技术服务有限公司）。
1.2.4 序列分析 基因的编码框用NCBI提供的在线ORF Finder寻找（http：
///gorf/）；核苷酸及氨基酸序列的同源序列搜
索由NCBI提供的在线BLAST进行（http：//）；系统演
化树用MEGA4软件进行。
1.2.5 原核表达载体构建、目的蛋白诱导和纯化 利用引物WRKY2-F和WRKY2-R
对测序正确的质粒进行PCR扩增并回收目的基因。通过双酶切和连接的方法把目
的基因连接到p GEX-4T-2载体上,然后利用原核表达方法进行目的蛋白表达,采用
谷胱甘肽-Sepharose 4B珠子对目的蛋白进行纯化。采用Bradford法测定蛋白浓
度,纯化后蛋白冷冻干燥保存于冰箱待用。
1.2.6 凝胶阻滞实验（EMSA） 将含有W-box DNA序
（CATAAGAGTTGACCTTGACCACTA）和突变序列
（CATAAGAGTTCTCCTTCTCCACTA）串联重复3次,用化学合成的方法合成双链。
凝胶阻滞实验按照Light Shift Chemiluminescent EMSA Kit（Pierce）试剂盒标
准步骤进行。
1.2.7 马铃薯WRKY2基因的定量分析 对正常生长和五种胁迫处理的马铃薯幼苗采
用Trizol法提取总RNA,逆转录后获得cDNA。采用同样的方法获得马铃薯幼苗根、
叶和茎的cDNA。然后利用荧光实时定量PCR技术对目的基因进行扩增,检测
StWRKY2在不同器官和不同处理后的表达情况。扩增正向引物为（5′-
TTCTCCGTCGCCGGCGAC-3′）和反向引物为（5′-
TCATGCTAATAGCAGGGACT-3′）。以EF1ɑ作为内标基因,扩增引物为EF1ɑF
（5′-CCAGATTGGAAAACGGATAT-3′）和EF1ɑR（5′-
CACCAGTTGGGTCCTTCTTG-3′）。反应体系为20μL,反应条件为95℃5 min,然
后95℃15 s；60℃60 s,40个循环。
2.1 目的基因的PCR扩增及克隆
以马铃薯组培苗cDNA为模板,进行PCR扩增,扩增产物用1%琼脂糖凝胶电泳检测
后,可见1条约为1 kb的条带（图1）。该条带回收纯化后,与p MD19-T载体连
接,转化产物经过菌落PCR筛选后,将获得阳性克隆送到生物公司进行测序。
2.2 序列分析及系统进化树构建
序列分析结果表明,该基因的开发阅读框为1 065 bp,编码355氨基酸。用St
WRKY2的氨基酸序列在NCBI网站中的Blast进行在线比对,从中选出同源性较高
的19条氨基酸序列进行保守域分析,并通过比对从中选择同源性较高的WRKY结
构域进行作图,结果表明克隆的WRKY2含有1个保守WRKY结构域,其锌指结构模
式为C-X5-CX23H-X-H,属于WRKY家族的第二组（图2）。同时根据这20个蛋
白的氨基酸序列（包括St WRKY2）构建系统发育树（图3）。分析发现,该蛋白
与来自番茄的WRKY7（XP_004238130.1）和烟草WRKY EIG-D48
（BAB16432.1）聚为紧密一枝,说明它们的亲缘关系较近,它们的相似性依次为96%
和86%。
2.3 凝胶阻滞实验（EMSA）
凝胶阻滞实验（EMSA）能证明转录因子与DNA结合的情况,本研究采用凝胶阻滞
实验（EMSA）分析了St WRKY2与W-box结合的情况,第1泳道加入GST蛋白
和DNA片段,第2泳道加入DNA片段,前两个泳道未见阻滞条带；第3泳道加入
St WRKY2和DNA片段,出现阻滞条带,结果表明St WRKY2能与W-box结合；
第4泳道是在加入St WRKY2和DNA片段同时,加入100倍冷探针,结果表明St
WRKY2与W-box结合能被冷探针所竞争,第5泳道加入St WRKY2和含有突变
W-box DNA片段,未见阻滞条带,说明该St WRKY2不能与突变的W-box结合,证
明St WRKY2与W-box结合的特异性（图4）。
2.4 基因的表达模式分析
通过实时荧光定量PCR实验表明,StWRKY2在根、叶和茎器官中的表达量依此下
降（图5）。说明该基因在根中的表达量最高,这可能与该基因的的生物学功能相
关。为了进一步研究该基因可能参与的生理功能,对马铃薯组培苗进行了
10μmol/L低磷、10μmol/L低钾、200 mmol/L NaCl、400 mmol/L PEG溶液
和4℃低温处理,处理的时间为6 h。然后对处理后基因的表达情况进行分析,结果
表明与正常对照相比,该基因在10μmol/L低磷处理6 h后表达量明显下降,与此相
反,该基因在200 mmol/L NaCl和400 mmol/L PEG处理6 h后表达量明显升高,
但是该基因在10μmol/L低钾和4℃低温处理6 h后表达量与对照相比没有明显变
化（图6）,初步判断它不响应这两种胁迫反应,或者该基因对于这两种胁迫响应可
能需要更长的时间。
植物中WRKY蛋白根据所含有的结构域和锌指结构可以分成三组：第一组含2个
WRKY结构域,锌指结构模式为C-X4-5-C-X22-23H-X-H；第二组和第三组均含1
个WRKY结构域,第二组锌指结构模式与第一组相同；第三组仅在组成锌指的氨基
酸有变化,C-X7-C-X22-23-H-X-C（Eulgemet al., 2000）。通过氨基酸序列分析
比对,本研究所克隆的St WRKY2蛋白属于第二组,系统发育树的结果表明St
WRKY2和番茄WRKY7亲缘关系最近,氨基酸序列相似性达96%,其次与烟草
WRKY EIGD48相似性达86%。番茄WRKY7的功能至今未见报道,烟草WRKY
EIG-D48被报道是受到病原菌的诱导表达（Takemotoet al.,2003）。因此推测
St WRKY2可能与马铃薯的抗病性相关,但这还需要通过进一步相关实验证明。
转录因子通过结合到靶基因启动子上的顺式作用元件从而调节基因的转录,WRKY
转录因子中的WRKY结构域主要是结合顺式作用元件W-box部位（Eulgemet
al.,2000）。EMSA实验是目前研究蛋白与DNA互作时应有最广,而且具有简单、
快速和灵敏的特点。Ciolkowskiet al.（2008）研究了不同W-box侧翼序列对拟
南芥中5个WRKY转录因子结合W-box的影响；Verket al.（2011）研究证明
At WRKY28能结合到可能靶基因ICS1（参与SA途径的基因）启动子上,从而调
节该基因表达。本研究采用EMSA实验证明St WRKY2能够结合W-box,而不能
结合突变的W-box,说明该蛋白具有转录因子的DNA结合活性。
本研究通过RT-PCR对StWRKY2的表达部位进行分析,发现其主要在根中表达,推
测其可能参与马铃薯对非生物逆境的响应。实验结果表明该基因在在低磷处理6 h
后表达量明显降低,说明St WRKY2参与低磷胁迫反应。拟南芥中At WRKY6通过
抑制下游靶基因pho1的表达参与低磷胁迫反应,在拟南芥中过量表达At WRKY6
的植株表现出低磷敏感的表型,因此At WRKY6在这样的信号通路中作为一个负调
控因子（Chenet al., 2009）。StWRKY2在200 mmol/L NaCl和400 mmol/L
PEG处理后表达量明显升高,表明它响应这两种渗透胁迫。与病菌防御反应相关的
At-WRKY70和At WRKY54能够通过调节气孔开度进而参与拟南芥的渗透胁迫反
应,这两个基因的双突变体能够增强对PEG胁迫的抗性（Liet al., 2013）。与此类
似的是与病原菌防御反应相关的小麦WRKY10表达水平在PEG、NaCl、冷和
H2O2处理后迅速升高,在烟草中过量表达TaWRKY10可以提高转基因烟草对干旱
和盐胁迫的抗性,说明TaWRKY10在这两种胁迫反应中起到正调控的作用
（Wanget al.,2013）。
马铃薯作为一种世界范围内重要的经济作物,相对于水稻、玉米和小麦比较而
言,WRKY转录因子的研究较少,第一个报道的StWRKY1在转录水平上是受到软腐
病诱导表达（Dellagiet al.,2000）；马铃薯WRKY6基因已被克隆,该蛋白在大肠
杆菌中已成功表达（Liet al.,2011）；马铃薯DNA芯片数据表明WRKY转录因子
参与菌根早期形成的过程,进一步研究表明该转录因子家族通过调节植物防卫相关
的基因控制菌根的形成（Gallouet al., 2012）。相信随着基因组学与分子生物学
发展,越来越多马铃薯中WRKY转录因子功能将被阐述,这对于马铃薯中重要功能基
因的鉴定和遗传育种工作具有重要意义。
Chen TT（陈婷婷）,Yang QC（杨青川）,Ding W（丁旺）,et g
and subcellular localization of a WRKY transcription factor gene
ofMedicago sativa（紫花苜蓿WRKY转录因子基因的克隆与亚细胞定位）
[J].Acta Pratac Sin（草业学报）,21（4）：159－167
Chen YF,Li LQ,Xu Q,et WRKY6 transcription factor modulates
PHOSPHATE1 expression in response to low Pi stress inArabidopsis[J].Plant
Cell,21（11）：3 554－3 566
Ciolkowski I,Wanke D,Birkenbihl RP,et s on DNA-binding
selectivity of WRKY transcription factors lend structural clues into WRKY-
domain function[J].Plant Mol Biol,68（2）：81－92
Cormack RS,Eulgem T,Rushton PJ,et e zippercontaining
WRKY proteins widen the spectrum of immediate early elicitor-induced
WRKY transcription factors in parsley [J].Biochim Biophys Acta,1 576（1-
2）：92－100
Dellagi A,Helibronn J,Avrova AO,et al.2000.A potato gene encoding a
WRKY-like transcription factor is induced in interactions with Erwinia
carotovora ptica and Phytophthora infestans and is
coregulated with class I endochitinase expression [J].Mol Plant Microb
Interact,13（10）：1 092－1 101
Eulgem T,Rushton PJ,Robatzek S,et WRKY superfamily of plant
transcriptional factors[J].Trends Plant Sci, 5（5）：199－206
Gallou A,Declerck S,Cranenbrouck riptional regulation of
defence genes and involvement of the WRKY transcription factor
inArbuscular mycorrhizalpotato root colonization [J].Funct Integr
Genom,12（1）：183－198
Guo ZJ（郭泽建）,Kan YC（阚云超）,Chen XJ（陈旭君）,et
terization of a rice WRKY gene whose expression is induced
upon pathogen attack and mechanical wounding（一种转录受病原物接种和
机械创伤诱导的水稻WRKY基因的鉴定）[J].Acta Bot Sin（植物学报）,46（8）：
955－964
Hara K,Yaq M,Kusano T,et systemic accumulation of
transcripts encoding a tobacco WRKY transcription factor upon
wounding[J].Mol Genet Genomics,263（1）：30－37
Ichiro K,Yoko ID,Masami YH,et 6 is involved in the response
to boron deficiency inArabidopsis thaliana[J].Physiol Plant,139（1）：80－
92
Ishiguro S,Nakamura terization of a cDNA encoding a novel
DNA-binding protein,SPF1,that recognizes SP8 sequences in the 50
upstream regions of genes coding for sporamin and beta-amylase from
sweet potato[J].Mol Genet Genomics,244（6）：563－571
Jang WB（江文波）,Yu DQ（余迪求）.opsisWRKY2transcription
factor may be involved in osmotic stress redponse （拟南芥WRKY2转录调
控因子可能参与调控渗透胁迫反应）[J].Acta Bot Yunnan（云南植物研究）,31
（5）：427－432
Jonson CS,Kolevski B,Smyth ARENT TESTA GLA-BRA2,a
trichome and seed coat development gene ofArabidopsis,encode a WRKY
transcription factor [J].Plant Cell,14（6）：1 359－1 375
Li J,Besseau S,Toronen P,et e-related transcription factors
WRKY70 and WRKY54 modulate osmotic stress tolerance by regulating
stomatal aperture inArabidopsis[J].New Phytol,7（1）：1－16
Li J,Brader G,Kariola T,et 70 modulates the selection of
signaling pathways in plant defence[J].Plant J,46 （3）：477－491
Li LQ（李立芹）,Huang YB（黄玉碧）,Wang XY（王西
瑶）.g,sequence analysis and prokaryotic expression of the
WRKY6 of potato（马铃薯WRKY6基因的克隆、序列分析与原核表达研究）
[J].Acta Pratac Sin（草业学报）,20（2）： 177－183
Robatzek,Somssich s ofAtWRKY6 regulation during plant
senescence and pathogen defense[J].Genes Dev,16 （9）：1 139－1 149
Sun CX,Palmqvist S,Olsson H,et al.2003.A novel WRKY transcription
factor,SUSIBA2,participates in sugar signaling in barley by binding to the
sugar-responsive elements of the iso 1 promoter[J].Plant Cell,15（9）：2
076－2 092
Takemoto D,Yoshioka H,Doke N,et e stress-inducible genes
of tobacco expression profile of elicitor-responsive genes isolated by
subtractive hybridization[J].Physiol Plant, 118（4）：545－553
Mare C,Mazzucotelli E,Crosatti C,et -WRKY38：a new
transcription factor involved in cold and drought response in
barley[J].Plant Mol Biol,55（3）：399－416
Verk MC,Bol JF,Linthost transcription factors involved in
activation of SA biosynthesis genes[J].BMC Plant Biol,19（11）：89－111
Xu YH,Wang JW,Wang S,et terization of GaWRKY1,a cotton
transcription factor that regulates the sesquiterpene synthase gene（＋）-
δ-cadinene synthase-A[J].Plant Physiol,135（1）：507－515
Wang C,Deng P,Chen L,et al.2013.A Wheat WRKY transcription factor
TaWRKY 10 confers tolerance to multiple abiotic stresses in transgenic
tobacco[J].PLos One,8（6）：1－13
Wang J,Zhang S,Stacey tion of a mitogen-activated protein
kinase pathway inArabidopsisby chitin[J].Mol Plant Pathol,5（2）：125－
135
2024年4月8日发(作者：斯听双)
马铃薯WRKY2基因的克隆和非生物逆境下的表达模式
李立芹;王西瑶
【摘 要】Function of StWRKY2 has not been WRKY proteins
are found as an important class of transcription factors in recent
years,which are widely involved in biotic stress,abiotic stress and growth
development regulation,and they are mainly divided into three
2 was cloned from potato by homology cloning, with length
of the coding region 1 065 bp,encoding 355 amino acids by DNA
the amino acid se-quence of StWRKY2 blasting in
NCBI,19 homology amino acid sequences were selected to analysis
conservative acid analysis showed that the StWRKY2
contained 1 conserved WRKY domain (TTGACC)and be-longed to the
second group of WRKY family members,and its zinc-finger structure was
C-X5-C-X23 -eny tree results showed StWRKY2 was the most
closest to SlWRKY7 (Solanum lycopersicum )with 96%similarity,and the
similarity of a WRKY protein of tobacco was 86%.The protein-GST
(glutathione-S-transferase) complex was obtained in Escherichia coli by
using the method of prokaryotic 2-GST could com-bine
W-box in vivo by Electrophoretic Mobility Shift Assay analysis,but only GST
protein could not combine 2-GST combination with W-box
could be competed by cold probe(unlabeled probe).And the experi-ment
results also showed that StWRKY2-GST could not combine mutation W-
box,this suggested StWRKY2-GST combined W-box with
is of StWRKY2 expression level in the root,stem and leaf
tissue through the real-time fluorescence quantitative PCR,the results
showed that the gene was mainly expressed in the was leaf and
order to further study the possible function of the gene,potato
seeding from tissue culture were treated under 10 μmol/L low
phosphorus,10 μmol/L low potassium,200 mmol/L NaCl,400 mmol/L PEG
solution and 4 ℃ low-temperature treatment for 6 h,real-time fluorescence
quantitative PCR showed that this gene expression level decreased
significantly after low phosphorus treatment,expression of StWRKY2
increased significantly after 200 mmol/L NaCl and 400 mmol/L
sion level of StWRKY2 had no obvious change after low
po-tassium and 4 ℃ low temperature results indicated that
StWRKY2 could in response to low phos-phorus,NaCl and PEG three kinds
of abiotic results would lay a solid foundation for further
study of potato WRKY2 gene function.%马铃薯 WRKY 2基因的功能尚未见有
报道,WRKY 蛋白是近年来发现的一类重要转录因子家族,它们在植物应对生物胁迫、
非生物胁迫和生长发育过程中起到关键的调控作用.该研究采用电子克隆法获得马
铃薯 WRKY 2基因,该基因的编码区长度1065 bp,编码355氨基酸,序列分析表明,
该蛋白属于 WRKY 家族第二组成员,锌指结构为 C-X5-C-X23 H-X-H.构建系统发
育树结果表明它与番茄 WRKY7亲缘关系较近,氨基酸序列相似性达96％,与烟草中
WRKY 蛋白的相似性为86％,利用原核表达法在大肠杆菌中获得该蛋白.通过凝胶
阻滞实验证明,该蛋白在体外能结合 W-box 元件,而且这种结合能被冷探针所竞争,
同时也表明StWRKY2不能结合含有突变 W-box DNA 片段,证明 StWRKY2与
W-box 结合具有特异性.通过实时荧光定量 PCR 技术分析该基因在根、茎和叶中
的表达量,结果表明该基因主要在根中表达,其次是叶和茎.为进一步研究该基因可能
参与的生理功能,对马铃薯组培苗进行10μmol/L 低磷、10μmol/L 低钾、200
mmol/L NaCl、400 mmol/L PEG 溶液和4℃低温处理,处理时间6 h,实时荧光定
量 PCR 的结果表明该基因在低磷处理后表达量明显下降,在200 mmol/L NaCl 和
400 mmol/L PEG 处理6 h 后表达量明显升高,但在10μmol/L低钾和4℃低温处
理后表达量与对照相比无明显变化.说明 StWRKY2能响应低磷、NaCl 和 PEG 这
三种非生物逆境胁迫.研究结果可为进一步深入研究马铃薯 WRKY 2基因的功能奠
定基础.
【期刊名称】《广西植物》
【年(卷),期】2015(000)003
【总页数】7页(P401-407)
【关键词】马铃薯;WRKY;系统发育;EMSA;表达模式
【作 者】李立芹;王西瑶
【作者单位】四川农业大学 农学院，成都 611130;四川农业大学 农学院，成都
611130
【正文语种】中 文
【中图分类】Q943.2;Q812
WRKY转录因子最初是从甘薯中发现的一类蛋白,当时命名为SPF1（Ishiguroet
al.,1994）。这类蛋白的特点是在其N端含有60个高度保守的WRKY结构域,其
中包括一个十分保守的七肽WRKYGQK,该结构域中还含有一类类似锌指的结构域。
后来相继从其它植物例如欧芹、水稻、烟草、大麦和紫花苜蓿中也鉴定出了这种蛋
白（Cormacket al., 2002；郭泽建等, 2004；Haraet al., 2000；Sunet al., 2003；
陈婷婷等,2012）。WRKY蛋白参与植物的抗病性（Liet al.,2006）、代谢调控
（Xuet al., 2004）、衰老（Robatzeket al.,2002）和非生物逆境等生理过程
（Mareet al., 2004；江文波等,2009）。拟南芥中AtWRKY22和AtWRKY29已
被鉴定是MAPK信号途径的下游组分,参与细菌和真菌病原物的信号传导
（Wanget al.,2004）。一些WRKY蛋白参与植物生长发育过程,例如拟南芥中
TTG2编码一个WRKY转录因子（即At WRKY44）,该蛋白在表皮毛中高水平表
达,该基因突变体叶表面毛状体的数量减少且没有分支（Jonsonet al.,2002）。拟
南芥WRKY6对低硼胁迫表现出敏感表型（Ichiroet al.,2010）,说明该转录因子在
硼胁迫生理过程中起到正调控作用。
马铃薯（Solanum tuberosum）是目前世界上继水稻、玉米和小麦之后的第四大
粮食作物,现已在世界各地广泛种植,马铃薯的适应性强,经济价值高,既可粮菜兼用,
又能作为工业原料,因此马铃薯在我国乃至全球工农业生产中占有举足轻重地位。
本研究首次报道克隆出马铃薯品种米拉WRKY2基因,序列分析表明该蛋白属于
WRKY家族第二组成员,锌指结构为C-X5-C-X23H-X-H,通过凝胶阻滞实验证明该
蛋白在体外具有结合DNA的活性,同时利用实时荧光定量PCR研究其在低磷、低
钾、高盐、PEG和4℃低温处理共五种非生物逆境胁迫下的表达情况,这为今后深
入研究该基因的功能奠定了坚实基础。
1.1 材料
供试马铃薯品种米拉,由四川农业大学马铃薯研究中心提供。植物材料的处理是把
在MS培养基上生长1个月马铃薯组培苗置于相应处理的溶液和4℃低温中处理6
h。大肠杆菌DH5α和BL21、DNA凝胶回收纯化试剂盒购于天根科技（北京）有
限公司；p MD19-T克隆载体、Ex Taq DNA聚合酶、T4DNA连接酶购于Ta
KaRa公司（大连）。
1.2 方法
1.2.1 提取马铃薯米拉总RNA和反转录 以组培苗的幼嫩叶片为材料,采用Trizol法
提取总RNA,然后反转录为cDNA。反转录的反应体系为10 μL,在DEPC水处理过
的小管中依次加入下列组分：Oligo d T 0.5μL；d NTP（20 mmol/L）1μL；
RNA 3μg；补水至6.5μL。65℃变性5 min,迅速在冰上冷却至少1 min,稍微离心,
然后加入5× First-Strand buffer 2μL、0.1 mol/L DTT 1μL；Super ScriptTMII
RT 0.5μL。反应条件是42℃反应60 min,70℃处理15 min。反转录产物在-20℃
保存备用。
1.2.2 扩增WRKY2基因 用同源序列克隆方法,利用Primer Premier 5.0设计同源
引物,引物序列为WRKY2-F（5′-GGATCCATGGCTGTAGACTTAATGACCA-3′下
划线处表示酶切位点,以下同）和WRKY2-R引物（5′-
CCCGGGTTAAGAAGATTCAAGAACAT-3′）。PCR反应体系以0.5μL cDNA为
模板,加入10×Ex Taq缓冲液2.5μL（含Mg2＋）,WRKY2-F和WRKY2-R各
0.5μL（10 μmol/L）,20 mmol/L d NTP 0.5μL,Ex Taq DNA聚合酶0.25μL（5
U/μL）,加水至25μL。PCR反应的条件：94℃预变性5 min；94℃变性30 s,55℃
退火30 s,72℃延伸1 min 10 s,共35个循环；最后72℃延伸10 min。PCR产物
于1%琼脂糖凝胶电泳检测。
1.2.3 基因克隆及测序 扩增产物经电泳检测后,回收目的片段,然后与p MD19-T载
体16℃连接过夜,连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态,然后在涂有氨苄青霉素的
LB平板上进行培养过夜,第二天挑取单克隆,进行菌落PCR检测,然后随机选取3个
独立的阳性克隆进行测序（上海Invitrogen生物工程技术服务有限公司）。
1.2.4 序列分析 基因的编码框用NCBI提供的在线ORF Finder寻找（http：
///gorf/）；核苷酸及氨基酸序列的同源序列搜
索由NCBI提供的在线BLAST进行（http：//）；系统演
化树用MEGA4软件进行。
1.2.5 原核表达载体构建、目的蛋白诱导和纯化 利用引物WRKY2-F和WRKY2-R
对测序正确的质粒进行PCR扩增并回收目的基因。通过双酶切和连接的方法把目
的基因连接到p GEX-4T-2载体上,然后利用原核表达方法进行目的蛋白表达,采用
谷胱甘肽-Sepharose 4B珠子对目的蛋白进行纯化。采用Bradford法测定蛋白浓
度,纯化后蛋白冷冻干燥保存于冰箱待用。
1.2.6 凝胶阻滞实验（EMSA） 将含有W-box DNA序
（CATAAGAGTTGACCTTGACCACTA）和突变序列
（CATAAGAGTTCTCCTTCTCCACTA）串联重复3次,用化学合成的方法合成双链。
凝胶阻滞实验按照Light Shift Chemiluminescent EMSA Kit（Pierce）试剂盒标
准步骤进行。
1.2.7 马铃薯WRKY2基因的定量分析 对正常生长和五种胁迫处理的马铃薯幼苗采
用Trizol法提取总RNA,逆转录后获得cDNA。采用同样的方法获得马铃薯幼苗根、
叶和茎的cDNA。然后利用荧光实时定量PCR技术对目的基因进行扩增,检测
StWRKY2在不同器官和不同处理后的表达情况。扩增正向引物为（5′-
TTCTCCGTCGCCGGCGAC-3′）和反向引物为（5′-
TCATGCTAATAGCAGGGACT-3′）。以EF1ɑ作为内标基因,扩增引物为EF1ɑF
（5′-CCAGATTGGAAAACGGATAT-3′）和EF1ɑR（5′-
CACCAGTTGGGTCCTTCTTG-3′）。反应体系为20μL,反应条件为95℃5 min,然
后95℃15 s；60℃60 s,40个循环。
2.1 目的基因的PCR扩增及克隆
以马铃薯组培苗cDNA为模板,进行PCR扩增,扩增产物用1%琼脂糖凝胶电泳检测
后,可见1条约为1 kb的条带（图1）。该条带回收纯化后,与p MD19-T载体连
接,转化产物经过菌落PCR筛选后,将获得阳性克隆送到生物公司进行测序。
2.2 序列分析及系统进化树构建
序列分析结果表明,该基因的开发阅读框为1 065 bp,编码355氨基酸。用St
WRKY2的氨基酸序列在NCBI网站中的Blast进行在线比对,从中选出同源性较高
的19条氨基酸序列进行保守域分析,并通过比对从中选择同源性较高的WRKY结
构域进行作图,结果表明克隆的WRKY2含有1个保守WRKY结构域,其锌指结构模
式为C-X5-CX23H-X-H,属于WRKY家族的第二组（图2）。同时根据这20个蛋
白的氨基酸序列（包括St WRKY2）构建系统发育树（图3）。分析发现,该蛋白
与来自番茄的WRKY7（XP_004238130.1）和烟草WRKY EIG-D48
（BAB16432.1）聚为紧密一枝,说明它们的亲缘关系较近,它们的相似性依次为96%
和86%。
2.3 凝胶阻滞实验（EMSA）
凝胶阻滞实验（EMSA）能证明转录因子与DNA结合的情况,本研究采用凝胶阻滞
实验（EMSA）分析了St WRKY2与W-box结合的情况,第1泳道加入GST蛋白
和DNA片段,第2泳道加入DNA片段,前两个泳道未见阻滞条带；第3泳道加入
St WRKY2和DNA片段,出现阻滞条带,结果表明St WRKY2能与W-box结合；
第4泳道是在加入St WRKY2和DNA片段同时,加入100倍冷探针,结果表明St
WRKY2与W-box结合能被冷探针所竞争,第5泳道加入St WRKY2和含有突变
W-box DNA片段,未见阻滞条带,说明该St WRKY2不能与突变的W-box结合,证
明St WRKY2与W-box结合的特异性（图4）。
2.4 基因的表达模式分析
通过实时荧光定量PCR实验表明,StWRKY2在根、叶和茎器官中的表达量依此下
降（图5）。说明该基因在根中的表达量最高,这可能与该基因的的生物学功能相
关。为了进一步研究该基因可能参与的生理功能,对马铃薯组培苗进行了
10μmol/L低磷、10μmol/L低钾、200 mmol/L NaCl、400 mmol/L PEG溶液
和4℃低温处理,处理的时间为6 h。然后对处理后基因的表达情况进行分析,结果
表明与正常对照相比,该基因在10μmol/L低磷处理6 h后表达量明显下降,与此相
反,该基因在200 mmol/L NaCl和400 mmol/L PEG处理6 h后表达量明显升高,
但是该基因在10μmol/L低钾和4℃低温处理6 h后表达量与对照相比没有明显变
化（图6）,初步判断它不响应这两种胁迫反应,或者该基因对于这两种胁迫响应可
能需要更长的时间。
植物中WRKY蛋白根据所含有的结构域和锌指结构可以分成三组：第一组含2个
WRKY结构域,锌指结构模式为C-X4-5-C-X22-23H-X-H；第二组和第三组均含1
个WRKY结构域,第二组锌指结构模式与第一组相同；第三组仅在组成锌指的氨基
酸有变化,C-X7-C-X22-23-H-X-C（Eulgemet al., 2000）。通过氨基酸序列分析
比对,本研究所克隆的St WRKY2蛋白属于第二组,系统发育树的结果表明St
WRKY2和番茄WRKY7亲缘关系最近,氨基酸序列相似性达96%,其次与烟草
WRKY EIGD48相似性达86%。番茄WRKY7的功能至今未见报道,烟草WRKY
EIG-D48被报道是受到病原菌的诱导表达（Takemotoet al.,2003）。因此推测
St WRKY2可能与马铃薯的抗病性相关,但这还需要通过进一步相关实验证明。
转录因子通过结合到靶基因启动子上的顺式作用元件从而调节基因的转录,WRKY
转录因子中的WRKY结构域主要是结合顺式作用元件W-box部位（Eulgemet
al.,2000）。EMSA实验是目前研究蛋白与DNA互作时应有最广,而且具有简单、
快速和灵敏的特点。Ciolkowskiet al.（2008）研究了不同W-box侧翼序列对拟
南芥中5个WRKY转录因子结合W-box的影响；Verket al.（2011）研究证明
At WRKY28能结合到可能靶基因ICS1（参与SA途径的基因）启动子上,从而调
节该基因表达。本研究采用EMSA实验证明St WRKY2能够结合W-box,而不能
结合突变的W-box,说明该蛋白具有转录因子的DNA结合活性。
本研究通过RT-PCR对StWRKY2的表达部位进行分析,发现其主要在根中表达,推
测其可能参与马铃薯对非生物逆境的响应。实验结果表明该基因在在低磷处理6 h
后表达量明显降低,说明St WRKY2参与低磷胁迫反应。拟南芥中At WRKY6通过
抑制下游靶基因pho1的表达参与低磷胁迫反应,在拟南芥中过量表达At WRKY6
的植株表现出低磷敏感的表型,因此At WRKY6在这样的信号通路中作为一个负调
控因子（Chenet al., 2009）。StWRKY2在200 mmol/L NaCl和400 mmol/L
PEG处理后表达量明显升高,表明它响应这两种渗透胁迫。与病菌防御反应相关的
At-WRKY70和At WRKY54能够通过调节气孔开度进而参与拟南芥的渗透胁迫反
应,这两个基因的双突变体能够增强对PEG胁迫的抗性（Liet al., 2013）。与此类
似的是与病原菌防御反应相关的小麦WRKY10表达水平在PEG、NaCl、冷和
H2O2处理后迅速升高,在烟草中过量表达TaWRKY10可以提高转基因烟草对干旱
和盐胁迫的抗性,说明TaWRKY10在这两种胁迫反应中起到正调控的作用
（Wanget al.,2013）。
马铃薯作为一种世界范围内重要的经济作物,相对于水稻、玉米和小麦比较而
言,WRKY转录因子的研究较少,第一个报道的StWRKY1在转录水平上是受到软腐
病诱导表达（Dellagiet al.,2000）；马铃薯WRKY6基因已被克隆,该蛋白在大肠
杆菌中已成功表达（Liet al.,2011）；马铃薯DNA芯片数据表明WRKY转录因子
参与菌根早期形成的过程,进一步研究表明该转录因子家族通过调节植物防卫相关
的基因控制菌根的形成（Gallouet al., 2012）。相信随着基因组学与分子生物学
发展,越来越多马铃薯中WRKY转录因子功能将被阐述,这对于马铃薯中重要功能基
因的鉴定和遗传育种工作具有重要意义。
Chen TT（陈婷婷）,Yang QC（杨青川）,Ding W（丁旺）,et g
and subcellular localization of a WRKY transcription factor gene
ofMedicago sativa（紫花苜蓿WRKY转录因子基因的克隆与亚细胞定位）
[J].Acta Pratac Sin（草业学报）,21（4）：159－167
Chen YF,Li LQ,Xu Q,et WRKY6 transcription factor modulates
PHOSPHATE1 expression in response to low Pi stress inArabidopsis[J].Plant
Cell,21（11）：3 554－3 566
Ciolkowski I,Wanke D,Birkenbihl RP,et s on DNA-binding
selectivity of WRKY transcription factors lend structural clues into WRKY-
domain function[J].Plant Mol Biol,68（2）：81－92
Cormack RS,Eulgem T,Rushton PJ,et e zippercontaining
WRKY proteins widen the spectrum of immediate early elicitor-induced
WRKY transcription factors in parsley [J].Biochim Biophys Acta,1 576（1-
2）：92－100
Dellagi A,Helibronn J,Avrova AO,et al.2000.A potato gene encoding a
WRKY-like transcription factor is induced in interactions with Erwinia
carotovora ptica and Phytophthora infestans and is
coregulated with class I endochitinase expression [J].Mol Plant Microb
Interact,13（10）：1 092－1 101
Eulgem T,Rushton PJ,Robatzek S,et WRKY superfamily of plant
transcriptional factors[J].Trends Plant Sci, 5（5）：199－206
Gallou A,Declerck S,Cranenbrouck riptional regulation of
defence genes and involvement of the WRKY transcription factor
inArbuscular mycorrhizalpotato root colonization [J].Funct Integr
Genom,12（1）：183－198
Guo ZJ（郭泽建）,Kan YC（阚云超）,Chen XJ（陈旭君）,et
terization of a rice WRKY gene whose expression is induced
upon pathogen attack and mechanical wounding（一种转录受病原物接种和
机械创伤诱导的水稻WRKY基因的鉴定）[J].Acta Bot Sin（植物学报）,46（8）：
955－964
Hara K,Yaq M,Kusano T,et systemic accumulation of
transcripts encoding a tobacco WRKY transcription factor upon
wounding[J].Mol Genet Genomics,263（1）：30－37
Ichiro K,Yoko ID,Masami YH,et 6 is involved in the response
to boron deficiency inArabidopsis thaliana[J].Physiol Plant,139（1）：80－
92
Ishiguro S,Nakamura terization of a cDNA encoding a novel
DNA-binding protein,SPF1,that recognizes SP8 sequences in the 50
upstream regions of genes coding for sporamin and beta-amylase from
sweet potato[J].Mol Genet Genomics,244（6）：563－571
Jang WB（江文波）,Yu DQ（余迪求）.opsisWRKY2transcription
factor may be involved in osmotic stress redponse （拟南芥WRKY2转录调
控因子可能参与调控渗透胁迫反应）[J].Acta Bot Yunnan（云南植物研究）,31
（5）：427－432
Jonson CS,Kolevski B,Smyth ARENT TESTA GLA-BRA2,a
trichome and seed coat development gene ofArabidopsis,encode a WRKY
transcription factor [J].Plant Cell,14（6）：1 359－1 375
Li J,Besseau S,Toronen P,et e-related transcription factors
WRKY70 and WRKY54 modulate osmotic stress tolerance by regulating
stomatal aperture inArabidopsis[J].New Phytol,7（1）：1－16
Li J,Brader G,Kariola T,et 70 modulates the selection of
signaling pathways in plant defence[J].Plant J,46 （3）：477－491
Li LQ（李立芹）,Huang YB（黄玉碧）,Wang XY（王西
瑶）.g,sequence analysis and prokaryotic expression of the
WRKY6 of potato（马铃薯WRKY6基因的克隆、序列分析与原核表达研究）
[J].Acta Pratac Sin（草业学报）,20（2）： 177－183
Robatzek,Somssich s ofAtWRKY6 regulation during plant
senescence and pathogen defense[J].Genes Dev,16 （9）：1 139－1 149
Sun CX,Palmqvist S,Olsson H,et al.2003.A novel WRKY transcription
factor,SUSIBA2,participates in sugar signaling in barley by binding to the
sugar-responsive elements of the iso 1 promoter[J].Plant Cell,15（9）：2
076－2 092
Takemoto D,Yoshioka H,Doke N,et e stress-inducible genes
of tobacco expression profile of elicitor-responsive genes isolated by
subtractive hybridization[J].Physiol Plant, 118（4）：545－553
Mare C,Mazzucotelli E,Crosatti C,et -WRKY38：a new
transcription factor involved in cold and drought response in
barley[J].Plant Mol Biol,55（3）：399－416
Verk MC,Bol JF,Linthost transcription factors involved in
activation of SA biosynthesis genes[J].BMC Plant Biol,19（11）：89－111
Xu YH,Wang JW,Wang S,et terization of GaWRKY1,a cotton
transcription factor that regulates the sesquiterpene synthase gene（＋）-
δ-cadinene synthase-A[J].Plant Physiol,135（1）：507－515
Wang C,Deng P,Chen L,et al.2013.A Wheat WRKY transcription factor
TaWRKY 10 confers tolerance to multiple abiotic stresses in transgenic
tobacco[J].PLos One,8（6）：1－13
Wang J,Zhang S,Stacey tion of a mitogen-activated protein
kinase pathway inArabidopsisby chitin[J].Mol Plant Pathol,5（2）：125－
135