2024年4月9日发(作者：眭君浩)
0.067mol/L pH7.0磷酸缓冲液
分子量 0.067mol PH7.0(1000ml磷酸缓冲液)所需量（ｇ）
Ｎa
2
HPO
4
.2H
2
O 178.05 7.1184g
Ｎa
2
HPO
4
.12H
2
O 358.22 14.4004g
KH
2
PO
4
136.09 3.6292g
Ｎa
2
HPO
4
.2H
2
O 7.1184g (或Ｎa
2
HPO
4
.12H2O 14.4004g)+ KH2PO4 3.6292g定容到1000ml容量瓶中
一 根系活性的测定
1、实验材料、试剂与仪器设备
1.实验试剂
乙酸乙酯(分析纯，次硫酸钠(Na2S2O4，分析纯)，粉末，1%TTC溶液，磷酸缓冲液(1/15mol/L，pH7.0)， 1mol/L
硫酸。
2.仪器设备
小烧杯3个，研钵1个，移液管：0.5mL1支、10mL1支、5mL3支，刻度试管6支，分光光度计，电子天
平，温箱，试管架，药勺，石英砂适量，滤纸。
2、实验内容操作步骤
2、定量测定
(1)TTC 标准曲线的制作 取0.4％TTC溶液0.2ml放入大试管中，加9.8 ml乙酸乙酯，再加少许Na2S2O4粉末摇
匀，则立即产生红色的TTF 。此溶液浓度为每毫升含有TTF80μg。分别取此溶液0.25ml、0.50ml、1.00ml、1.50ml、
2.00ml置10ml刻度试管中，用乙酸乙酯定容至刻度，即得到含TTF20μg、40μg、80μg、120μg、160μg的
系列标准溶液，以乙酸乙酯作参照，在485nm波长下测定吸光度，绘制标准曲线。
（2）称取根尖样品0.5g，放入小烧杯中，加入0.4%TTC溶液和磷酸缓冲液(pH7.0)各5ml，使根充分浸没在溶液
内，在37℃下暗保温1—2h，此后立即加入1mol/L硫酸2ml ，以停止反应。(与此同时做一空白实验，先加硫酸，
再加根样品，37℃下暗保温后不加硫酸，其溶液浓度、操作步骤同上)。
（3）把根取出，用滤纸吸干水分，放入研钵中，加乙酸乙酯3—4mL，充分研磨，以提出TTF。把红色提取液
移入刻度试管，并用少量乙酸乙酯把残渣洗涤2—3次，皆移入刻度试管，最后加乙酸乙酯使总量为10ml，用分
光光度计在波长485nm下比色，以空白试验作参照测出吸光度，查标准曲线，即可求出TTC原量。
2.计算结果
根系活力[mgTTF/（g.h）] =
式中：C ——四氮唑还原量，μg; W——根重，g; h——时间，h 。
二 叶绿素含量测定：
95%乙醇溶液，在665、649、470nm处有最大吸收峰
Ca=13.95D665-6.88D649 Cb=24.96D649-7.32D665 Cx.c=(1000D470-2.05Ca-114Cb)/245
三 抗氧化酶活性的定：
C
W×h×1000
0.05mol/L磷酸缓冲溶液 (PBS)（pH=7.8）溶液的配制：65.5506g Na2HPO4·12H2O + 2.65285g NaH2PO4·2H2O,
定容到4L。（参考陈建勋，王晓峰主编的《植物生理学实验指导》，P134）。
取低温保存的鲜样，称2g左右的叶片（或根）放在50ml的离心管，加入20ml浓度为0.05mol/L磷酸缓冲溶液
（pH=7.8）（最好是较冷的磷酸缓冲溶液，防止研磨时温度过高使酶失活），研磨（用磨碎机磨），8000r/min的冷
冻离心机下离心20分钟，上清液为粗酶液。
2.1丙二醛（MDA）的测定：
20％三氯乙酸（TCA）溶液的配制：称200g三氯乙酸，用蒸馏水定容到1000ml。（参考陈建勋，王晓峰主编的
《植物生理学实验指导》,P124）；
0.5% 硫代巴比妥酸（TBA）溶液的配制：称5g硫代巴比妥酸（TBA）,用20％三氯乙酸（TCA）溶液溶解并定
容到1000ml。（参考陈建勋，王晓峰主编的《植物生理学实验指导》,P124）（先加少量的氢氧化钠1mol/L溶解）；
0.5ml酶液（对照用0.5ml的0.05mol/L pH=7.8的磷酸缓冲液代替酶液）（做三个重复）+ 3mlTBA――振荡――
沸水浴上反应30min――冷却（至少30min）――比色（OD600、OD532、OD450）。（参考陈建勋，王晓峰主编
的《植物生理学实验指导》，P124）
2.2超氧化物歧化酶（SOD）的测定：
NBT(400ml)混合反应液:
392mlPBS(Ph=7.8),+0.0206g NBT+ 0.776g甲硫酸铵+8ml核黄素溶液+0.4ml EDTA-Na溶液
（100mlPBS缓冲溶液中含0.01204g核黄素）。
（另配）100ml PBS溶液加EDTA-Na 3.7224gEDTA-Na
测试时：取3ml反应液+0.05ml(根)或0.02 ml(叶)粗酶液，于光照培养箱中6-10分钟，OD650下测定吸光度。
2.3过氧化物酶（POD）的测定：
0.05mol/L磷酸缓冲溶液(PBS)（pH=7.0）溶液的配制：10.9251g Na2HPO4·12H2O + 3.042975g NaH2PO4·2H2O,
定容到1000ml。
0.3%H2O2溶液的配制：吸2.5ml 30%H2O2，用0.05mol/L pH=7.0磷酸缓冲溶液(PBS)定容到250ml。
0.2%愈创木酚溶液的配制：称0.5g愈创木酚，用0.05mol/L pH=7.0磷酸缓冲溶液(PBS)定容到250ml。
2ml 0.3%H2O2溶液 + 0.95ml 0.2%愈创木酚溶液 + 1ml 0.05mol/L pH=7.0磷酸缓冲溶液(PBS) + 0.02ml酶液（原
来为0.01）酶液（根加0.05ml酶液）（对照用0.05mol/L磷酸缓冲溶液代替酶液）（做三个重复），记录470nm处
OD降低速度。将每分钟OD增加0.01定义为1个活力单位。（参考陈建勋，王晓峰主编的《植物生理学实验指
导》P121） 比色时加酶液，混合后即刻计时。
2.4过氧化氢酶（CAT）的测定：
0.3%H2O2溶液的配制：吸5ml 30%H2O2，用0.05mol/L pH=7.0磷酸缓冲溶液(PBS)定容到500ml。
1 ml 0.3%H2O2溶液 + 1.9ml H2O + 0.1 ml 酶液，测定240nm处OD降低速度。将每分钟OD减少0.01定义为1
个活力单位。（参考陈建勋，王晓峰主编的《植物生理学实验指导》P121）
2024年4月9日发(作者：眭君浩)
0.067mol/L pH7.0磷酸缓冲液
分子量 0.067mol PH7.0(1000ml磷酸缓冲液)所需量（ｇ）
Ｎa
2
HPO
4
.2H
2
O 178.05 7.1184g
Ｎa
2
HPO
4
.12H
2
O 358.22 14.4004g
KH
2
PO
4
136.09 3.6292g
Ｎa
2
HPO
4
.2H
2
O 7.1184g (或Ｎa
2
HPO
4
.12H2O 14.4004g)+ KH2PO4 3.6292g定容到1000ml容量瓶中
一 根系活性的测定
1、实验材料、试剂与仪器设备
1.实验试剂
乙酸乙酯(分析纯，次硫酸钠(Na2S2O4，分析纯)，粉末，1%TTC溶液，磷酸缓冲液(1/15mol/L，pH7.0)， 1mol/L
硫酸。
2.仪器设备
小烧杯3个，研钵1个，移液管：0.5mL1支、10mL1支、5mL3支，刻度试管6支，分光光度计，电子天
平，温箱，试管架，药勺，石英砂适量，滤纸。
2、实验内容操作步骤
2、定量测定
(1)TTC 标准曲线的制作 取0.4％TTC溶液0.2ml放入大试管中，加9.8 ml乙酸乙酯，再加少许Na2S2O4粉末摇
匀，则立即产生红色的TTF 。此溶液浓度为每毫升含有TTF80μg。分别取此溶液0.25ml、0.50ml、1.00ml、1.50ml、
2.00ml置10ml刻度试管中，用乙酸乙酯定容至刻度，即得到含TTF20μg、40μg、80μg、120μg、160μg的
系列标准溶液，以乙酸乙酯作参照，在485nm波长下测定吸光度，绘制标准曲线。
（2）称取根尖样品0.5g，放入小烧杯中，加入0.4%TTC溶液和磷酸缓冲液(pH7.0)各5ml，使根充分浸没在溶液
内，在37℃下暗保温1—2h，此后立即加入1mol/L硫酸2ml ，以停止反应。(与此同时做一空白实验，先加硫酸，
再加根样品，37℃下暗保温后不加硫酸，其溶液浓度、操作步骤同上)。
（3）把根取出，用滤纸吸干水分，放入研钵中，加乙酸乙酯3—4mL，充分研磨，以提出TTF。把红色提取液
移入刻度试管，并用少量乙酸乙酯把残渣洗涤2—3次，皆移入刻度试管，最后加乙酸乙酯使总量为10ml，用分
光光度计在波长485nm下比色，以空白试验作参照测出吸光度，查标准曲线，即可求出TTC原量。
2.计算结果
根系活力[mgTTF/（g.h）] =
式中：C ——四氮唑还原量，μg; W——根重，g; h——时间，h 。
二 叶绿素含量测定：
95%乙醇溶液，在665、649、470nm处有最大吸收峰
Ca=13.95D665-6.88D649 Cb=24.96D649-7.32D665 Cx.c=(1000D470-2.05Ca-114Cb)/245
三 抗氧化酶活性的定：
C
W×h×1000
0.05mol/L磷酸缓冲溶液 (PBS)（pH=7.8）溶液的配制：65.5506g Na2HPO4·12H2O + 2.65285g NaH2PO4·2H2O,
定容到4L。（参考陈建勋，王晓峰主编的《植物生理学实验指导》，P134）。
取低温保存的鲜样，称2g左右的叶片（或根）放在50ml的离心管，加入20ml浓度为0.05mol/L磷酸缓冲溶液
（pH=7.8）（最好是较冷的磷酸缓冲溶液，防止研磨时温度过高使酶失活），研磨（用磨碎机磨），8000r/min的冷
冻离心机下离心20分钟，上清液为粗酶液。
2.1丙二醛（MDA）的测定：
20％三氯乙酸（TCA）溶液的配制：称200g三氯乙酸，用蒸馏水定容到1000ml。（参考陈建勋，王晓峰主编的
《植物生理学实验指导》,P124）；
0.5% 硫代巴比妥酸（TBA）溶液的配制：称5g硫代巴比妥酸（TBA）,用20％三氯乙酸（TCA）溶液溶解并定
容到1000ml。（参考陈建勋，王晓峰主编的《植物生理学实验指导》,P124）（先加少量的氢氧化钠1mol/L溶解）；
0.5ml酶液（对照用0.5ml的0.05mol/L pH=7.8的磷酸缓冲液代替酶液）（做三个重复）+ 3mlTBA――振荡――
沸水浴上反应30min――冷却（至少30min）――比色（OD600、OD532、OD450）。（参考陈建勋，王晓峰主编
的《植物生理学实验指导》，P124）
2.2超氧化物歧化酶（SOD）的测定：
NBT(400ml)混合反应液:
392mlPBS(Ph=7.8),+0.0206g NBT+ 0.776g甲硫酸铵+8ml核黄素溶液+0.4ml EDTA-Na溶液
（100mlPBS缓冲溶液中含0.01204g核黄素）。
（另配）100ml PBS溶液加EDTA-Na 3.7224gEDTA-Na
测试时：取3ml反应液+0.05ml(根)或0.02 ml(叶)粗酶液，于光照培养箱中6-10分钟，OD650下测定吸光度。
2.3过氧化物酶（POD）的测定：
0.05mol/L磷酸缓冲溶液(PBS)（pH=7.0）溶液的配制：10.9251g Na2HPO4·12H2O + 3.042975g NaH2PO4·2H2O,
定容到1000ml。
0.3%H2O2溶液的配制：吸2.5ml 30%H2O2，用0.05mol/L pH=7.0磷酸缓冲溶液(PBS)定容到250ml。
0.2%愈创木酚溶液的配制：称0.5g愈创木酚，用0.05mol/L pH=7.0磷酸缓冲溶液(PBS)定容到250ml。
2ml 0.3%H2O2溶液 + 0.95ml 0.2%愈创木酚溶液 + 1ml 0.05mol/L pH=7.0磷酸缓冲溶液(PBS) + 0.02ml酶液（原
来为0.01）酶液（根加0.05ml酶液）（对照用0.05mol/L磷酸缓冲溶液代替酶液）（做三个重复），记录470nm处
OD降低速度。将每分钟OD增加0.01定义为1个活力单位。（参考陈建勋，王晓峰主编的《植物生理学实验指
导》P121） 比色时加酶液，混合后即刻计时。
2.4过氧化氢酶（CAT）的测定：
0.3%H2O2溶液的配制：吸5ml 30%H2O2，用0.05mol/L pH=7.0磷酸缓冲溶液(PBS)定容到500ml。
1 ml 0.3%H2O2溶液 + 1.9ml H2O + 0.1 ml 酶液，测定240nm处OD降低速度。将每分钟OD减少0.01定义为1
个活力单位。（参考陈建勋，王晓峰主编的《植物生理学实验指导》P121）