2024年4月9日发(作者：上官豫)
指标：1、品质指标
硬度、色泽、褐变指数、失重率、腐烂率、可溶性固型物、呼吸强度、乙烯释放
率、可滴定酸、Vc
2、抗性指标
抗氧化衰老的有：SOD CAT APX GSH MDA 原果胶（可溶性果胶）
抗病相关指标有：PPO POD CHT GUL PAL总酚 类黄酮 木质素
3、测定方法：
褐变指数
色泽
失重率
腐烂率
呼吸强度
乙烯释放率
硬度
可溶性固型物
可滴定酸：
试剂：0.1mol/LNaOH(4g纯+1000ml蒸馏水，邻苯二甲酸氢钾标定) 1%酚酞试剂
（1g酚酞加入到100ml50%的乙醇溶液中溶解）
方法：1、NaOH的标定： 准确称取105℃下烘干至恒重的基准邻苯二甲酸氢钾
0.6g ，加入50ml新煮沸过的冷水，振摇，使其尽量溶解，再滴加2滴1%酚酞
指示剂，用配置的NaOH溶液标定，滴定至溶液呈粉红色。每1mlNaOH相当于
20.42mg邻苯二甲酸氢钾，计算出NaOH滴定液的浓度。
2、测定步骤：称10g苹果，研磨，转移到100ml容量瓶中，蒸馏水洗研钵3次
再定容，摇匀，静置30min后过滤。吸取20ml滤液，转入三角瓶中，加入两滴
1%酚酞试剂，用已标定的氢氧化钠溶液进行标定，滴定至溶液初现粉色并30秒
内不退色为终点（PH8.1-8.3）,重复三次，再用蒸馏水作为滤液进行滴定作为空
白对照。可定丁酸含量=【样品提取液总体积*氢氧化钠滴定液浓度*（滴定滤液
消耗的氢氧化钠体积—滴定蒸馏水消耗的氢氧化钠体积）】/（滴定时所取滤液体
积*样品质量）
Vc：
试剂：5%钼酸铵溶液（称取5g钼酸铵溶于蒸馏水中，并定容至100ml）草酸-EDTA
溶液（称取6.3g草酸和0.75gEDTA-Na2溶于蒸馏水中并定容至1000ml）
5%H2SO4(体积分数) 偏磷酸-乙酸溶液（取棒状偏磷酸3g加20%冰醋酸48ml，溶
解后加蒸馏水稀释至100ml,必要时过滤，在冰箱中可保存3天）Vc标准溶液（称
取Vc100mg，置100ml容量瓶中，加适量草酸-EDTA溶液溶解后，在用该溶液定
容到100ml，即成1mg/ml标准液，此溶液随配随用
（如果纯度不够应进行标定）
）
提取及测定：1、制作标准曲线： 7支25ml具塞试管，按下表加入各种试剂
试剂 试管号
1 2 3 4 5 6 7
Vc标准液/ml 0 0.1 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0
草酸EDTA溶液/ml 5.0 4.9 4.8 4.6 4.4 4.2 4.0
偏磷酸-乙酸溶液/ml 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5
1:19H2SO4/ml 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0
5%钼酸铵/ml 2.0 2.0 2.0 2.0 2.0 2.0 2.0
Vc含量/mg 0 10 20 40 60 80 100
加完试剂摇匀后，置30℃水浴中保温15min，用蒸馏水稀释至25ml，混匀，用1
号空白管调零，在760nm波长下比色，记录吸光度，以Vc含量为横坐标，吸光
度为纵坐标，绘制标准曲线。
2、提取及测定：称取5g果蔬组织，加5ml草酸-EDTA溶液研磨成匀浆，并仔细
转入25ml容量瓶中，再用提取介质冲洗研钵，冲洗液一并倒入容量瓶中。取一
部分匀浆液经3000g离心10min后，取1ml上清液与标准管同法测定，若样品显
色液中出现沉淀，可过滤后进行比色，不影响测定结果。
计算公式：Vc含量（mg*100g-1FW）=标准曲线上查的的Vc的量*样品提取液总
体积/(测定时所用样品液体积*样品鲜重)
注意：显色温度和加入显色剂后的时间要一
致。
GSH：
试剂：50g/L三氯乙酸（5g三氯乙酸和蒸馏水溶解稀释至100ml，再加入
186mgEDTA-Na2.2H2O）0.1mol/LPH7.7磷酸钠缓冲液和0.1mol/LPH6.8磷酸钠缓
冲液 4mmol/L二硫代硝基苯甲酸（15.8mgDTNB，用0.1mol/L、PH6.8磷酸缓冲
液溶解，定容至10ml，摇匀，4℃保存）100umol/L还原性谷胱甘肽标准液（3g
还原型谷胱甘肽加入少量无水乙醇用蒸馏水定容至100ml）
实验步骤：1、标准曲线制作：
取六只试管编号，按下表加入各种试剂，混匀，于25℃保温反应10min，以0
号管为参比调零，测定显色液在波长412nm处的吸光度值，以吸光度值为纵坐标，
还原型谷胱甘肽为横坐标，绘制标准曲线。
项目 管号
0 1 2 3 4 5
还原型谷胱甘肽标液/ml 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0
蒸馏水/ml 1.0 0.8 0.6 0.4 0.2 0
PH7.7磷酸缓冲液/ml 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0
DTNB试剂/ml 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5
相当于还原型谷胱甘肽物质的量/umol 0 20 40 60 80 100
2、提取和测定：5g果实加入经预冷的三氯乙酸，在冰浴下研磨匀浆，于4℃、
12000xg离心20min，收集上清液测定。取一只试管，依次加入1ml蒸馏水、
1mlPH7.7磷酸缓冲液和0.5mlDTNB，混匀即为绘制标准曲线的0号管溶液，此液
作为参比调零。另取两支试管，分别加入1ml上清液、1mlPH7.7磷酸缓冲液，
然后向一只管中加入0.5mlDTNB，向另一支管中加入0.5mlPH6.8磷酸缓冲液。
将两只管置于25℃下保温反应10min，迅速测定显色液在波长412nm下的吸光度
值，分别记作ODs和ODc。重复三次。
根据ODs-ODc的差值从标准曲线上查的还原型谷胱甘肽含量，计算每克果实中还
原型谷胱甘肽的含量：还原型谷胱甘肽含量=（标准曲线上查得的值*样品提取液
总体积）/（吸取样品液体积*样品质量）
注意：先做样品本底对照。
MDA：
试剂：100g/L三氯乙酸（称取10g三氯乙酸蒸馏水溶解稀释至100ml）6.7g/L
硫代巴比妥酸（称取0.67g硫代巴比妥酸，用100ml0.05mol/L氢氧化钠溶解）
测定步骤：称取1g果蔬样品，加入5ml三氯乙酸溶液，研磨匀浆于4℃10000g
离心20min，收集上清液低温保存备用。取2ml上清液，对照空白管中加入2ml
三氯乙酸代替提取液，分别加入2ml0.67%硫代巴比妥酸，混合后在沸水浴中煮
沸20min，取出冷却后再离心一次，分别测定上清液在450nm、532nm、600nm波
长处的吸光度值，重复三次。计算：丙二醛含量（umol/L）
=6.45*(OD532-OD600)-0.56*OD450
每克果蔬中丙二醛的含量=丙二醛含量*样品提取液总体积/(测定时所取样品液
体积*样品质量*1000)
注意：出现负值，表明糖的影响很大，需做预实验确定适宜的
条件。
原果胶（可溶性果胶）：
试剂：1.5g/L咔唑-乙醇溶液（称取0.15g咔唑加入无水乙醇溶解并稀释至100ml）
100ug/ml半乳糖醛酸标准液（称取10mg半乳糖醛酸
M=194
,用蒸馏水溶解定容至
100ml） 浓硫酸 95%乙醇 0.5mol/L硫酸溶液
测定步骤：1、制作标准曲线：取6支25ml具塞刻度试管，编号，按下表加入半
乳糖醛酸标准液，然后小心地沿管壁加入6ml浓硫酸，在沸水浴中加热20min，
取出冷却至室温后，各加入0.2ml1.5g/L咔唑-乙醇溶液，摇匀，在暗处放置30min
后，测定反应液在波长530nm处的吸光度值，并以吸光度值为纵坐标，半乳糖醛
酸质量（ug）为横坐标，绘制标准曲线求出方程。
项目 管号
0 1 2 3 4 5
半乳糖醛酸标准液/ml 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0
蒸馏水/ml 1.0 0.8 0.6 0.4 0.2 0
相当于半乳糖醛酸的量/ug 0 20 40 60 80 100
2、提取测定：
（1）可溶性果胶提取：称取1g果蔬组织，研磨成匀浆转入50ml刻度离心管中，
加入25ml95%乙醇，在沸水浴上加热30min，以除去样品中糖分及其他物质，注
意在煮沸过程中要及时补加95%乙醇。取出冷却至室温，于8000r/min离心5min，
弃去上清液，再加入95%乙醇在沸水浴上加热，如此重复3-5次。然后将沉淀放
入试管中，加入20ml蒸馏水，在50℃水浴中保温30min，以溶解果胶。取出冷
却至室温后，于8000r/min下离心15min，将上清液移入100ml容量瓶中，用少
量水洗涤沉淀，离心后一并将上清液移入容量瓶中，加蒸馏水至刻度，此溶液即
为可溶性果胶。
（2）原果胶提取：将上述遗留的沉淀物，保留在刻度离心管仲，再向其中加入
25ml0.5mol/L硫酸溶液，在沸水浴中加热1h以水解原果胶，取出冷却至室温后，
于8000r/min下离心15min,将上清液移入100ml容量瓶中，加蒸馏水至刻度，
此为原果胶测定液。
（3）测定：吸取1ml提取液，加入到25ml刻度试管中，按标准曲线的操作步骤
进行测定，重复三次。计算：根据吸光度值查得半乳糖醛酸质量，计算每克果蔬
中果胶含量，以半乳糖醛酸质量分数表示。
半乳糖醛酸含量=查得的半乳糖醛酸量*样品提取液总体积/(测定时所取样品液
体积*样品质量) 注意：检验糖分是否除尽的方法：取0.5ml提取液置于试管中，
加入2-3滴50g/Lα-萘酚的乙醇溶液，充分混合，此时溶液稍有白色沉淀，然
后使试管稍稍倾斜，用吸管沿管壁加入1ml浓硫酸（注意水层与硫酸层不可混
合）。待试管静置后，若在两层的界面上产生紫红色环，则证明提取液中含有糖
分
总酚：
试剂：钨酸钠(Na2WO4·2H2O)、钼酸钠(Na2MoO4·2H2O)、硫酸锂(Li2SO4)、磷
酸(H3PO4≥85%)、磷钼酸(24MoO3·P2O5·xH2O)、碳酸钠(Na2CO3)、盐酸和溴水
为分析纯。一水合没食子酸标样为Sigma -Aldrich 公司产品。水为蒸馏水。
1.1.2 FC 显色剂:称取50.0 g 钨酸钠和12.5 g 钼酸钠, 用350 mL 蒸馏水溶于1
000 mL 回流瓶中, 加入25 mL 磷酸和50 mL 盐酸, 混匀, 微沸回流2 h, 加入
75.0 g 硫酸锂、25 mL 蒸馏水和数滴溴水, 开口沸腾约15min( 至溴水挥尽为
止) , 冷却, 定容至500mL,过滤, 置棕色瓶中保存备用。使用时加入1 倍蒸馏水
稀释。
1.1.3 FD 显色剂:称取100.0 g 钨酸钠和20.0 g 磷钼酸, 溶于200 mL 蒸馏水,
加入50 mL 磷酸, 加热回流2 h, 冷却, 定容至1 L。
1.1.4 7.5%碳酸钠溶液：称取37.5 g 碳酸钠, 溶于250 mL 温水, 混匀, 冷却,
定容至500 mL。
1.1.5 一水合没食子酸标准溶液:称取0.110 g 一水合没食子酸, 用蒸馏水溶
解、定容至100 mL, 此溶液质量浓度为1 000 mg/L。分别吸取此溶液0.0、1.0、
2.0 、3.0、4.0、5.0 mL 至100 mL 容量瓶中, 用蒸馏水定容至刻度, 所得一水
合没食子酸标准溶液的质量浓度分别为0.0、10、20、30、40、50 mg/L。
取试样适量( 葡萄酒吸取2mL,葡萄和柿子称取2 g 匀浆, 其他水果称取5 g 匀
浆) ,用80 mL 蒸馏水洗入100 mL 容量瓶中, 至100 ℃沸水浴中保温30 min, 取
出, 冷却, 定容, 过滤, 滤液备用。使用5 mL 刻度吸管吸取1.0 mL 滤液( 若多
酚含量过高, 可适当稀释) 或一水合没食子酸标准溶液, 分别用刻度吸管加入
FC 显色剂或FD 显色剂及7.5%碳酸钠溶液, 用蒸馏水定容至10 mL,混匀, 室温
显色( 下同) , 测定765 nm 吸光度, 根据稀释倍数和从标准曲线中查出的浓度,
计算样品多酚含量。
对于FD 法, 最佳的测定条件为分别吸取1 mL 滤液、1 mL FD 显色剂、2 mL 7.5%
碳酸钠溶液和6 mL 蒸馏水, 于10 mL离心管中混匀, 室温下显色30～60 min, 测
定765 nm吸光度。
对于FC 法, 最佳测定条件为分别吸取1 mL 滤液、1 mL FC 显色剂、3 mL 7.5%
碳酸钠溶液和5 mL蒸馏水, 于10 mL 离心管中混匀, 显色30～60 min, 测定765
nm 吸光度。
总酚含量测定:参照王军节：1 g 果皮组织与预冷的5 mL 1 %HCl - 甲醇溶液
充分研磨提取,然后在4 ℃下,8 000 r/ min 离心10 min后,取上清液直接用于比
色,样品重复测3 次,酚类含量以
OD
280 / gFW 表示.
类黄酮:
试剂：1%盐酸-甲醇溶液（取1ml浓盐酸加入到99ml甲醇中，摇匀，于4℃预冷）
提取及测定：称取2g果肉组织，加入少许经预冷的1%盐酸-甲醇溶液，冰浴研
磨匀浆，转入20ml刻度试管中，用1%盐酸-甲醇溶液冲洗研钵，一并转移到试
管中，定容至刻度，混匀，于4℃避光提取20min，期间摇动数次，然后过滤，
收集滤液待用。以1%盐酸-甲醇溶液做参比调零，取滤液分别于波长280nm、325nm
处测定溶液吸光度值，OD280表示总酚含量，OD325表示类黄酮含量。
注意：此测定方法仅能判断样品之间总酚、类黄酮的相对含量，若要准确含量，
可以用不同浓度没食子酸做标准曲线，计算总分物质含量，用芦丁制作标准曲线，
计算类黄酮含量。
木质素：参照Morrison (1972) 法[12 ] 并修改。1 g 果肉组织与预冷的4 mL 体
积分数95 %乙醇研磨,4 ℃下12000 ×g 离心10 min ,沉淀物用体积分数95 %乙
醇冲洗3 次,再用乙醇∶正己烷体积比= 1 ∶2 冲洗3 次,然后加1 mL 2 mol/ L
NaOH 中止反应。再加2mL冰醋酸和0.1 mL 7.5 mol/ L 盐酸羟胺,离心,取上清0.5
mL ,用冰醋酸定容至10 mL ,280 nm 下测定样品吸光值,样品重复测3 次。木质
素含量以
OD
280
/
g(鲜重) 表示。
SOD：
试剂：0.1mol/LPH7.8磷酸钠缓冲液 提取缓冲液（5gPVP和35ulβ-巯基乙醇加
入到0.1mol/LPH7.8磷酸缓冲液定容至100ml,摇匀，低温4℃贮藏备用。）
50mmol/LPH7.8磷酸钠缓冲液 130mmol/L L-蛋氨酸（称取1.94gL-蛋氨酸，用
50mmol/LPH7.8磷酸缓冲液溶解定容至100ml,充分混匀，先用现配，低温避光保
存，可使用1-2天） 750umol/L氮蓝四唑溶液（称取61.3mgNBT,用蒸馏水溶解，
定容至100ml,充分混匀，现用现配，低温避光保存，可用2-3天）
100umol/LEDTA-Na2溶液（称取37.2mgEDTA-Na，用蒸馏水溶解，定容至100ml,
使用时稀释100倍，低温避光保存，可用8-10天）20umol/L核黄素溶液（称取
73.2mg核黄素，蒸馏水溶解，定容至100ml,使用时稀释100倍，低温避光保存，
随配随用（黑纸包好）。
提取及测定：5g果蔬样品，加入5ml提取缓冲液，在冰浴下研磨成匀浆，转入
离心管中，于4℃12000*g离心30min，收集上清液，低温保存备用。取5支试
管，按照下表加入各种溶液，注意最后加入核黄素。其中3支为测定管，其余两
支为对照管，混匀后，将一只对照管置于暗处，其他各管置于4000lx日光灯下
反应15min后立即取出，置于暗处终止反应。以不照光管做空白参比调零，于
560nm处分别测定其它各管的吸光度值。
试剂 用量/ml 终浓度（比色时）
50mmol/LPH7.8磷酸缓冲液 1.7
130mmol/L蛋氨酸溶液 0.3 13mmol/L
750umol/L氮蓝四唑溶液 0.3 75umol/L
100umol/LEDTA-Na2溶液 0.3 10umol/L
20umol/L核黄素溶液 0.3 2umol/L
酶液 0.1 对照两支管以缓冲液代替
总体积 3ml
显色反应后，分别记录样品管反应混合液的吸光度值（ODs）和照光对照管反应
混合液的吸光度值（ODc）,以每分钟每克果蔬的反应体系对氮蓝四唑光化还原的
抑制为50%为一个SOD活性单位（U）表示。
SOD活性=（ODc-ODs）*样品提取液总体积/(0.5*ODc*测定时所取样品液总体积*
光反应时间*样品质量)
注意：需要通过预实验摸索显色反应所需时间，温度以25℃为
宜，低时适当延长时间，高时缩短时间。
CAT ：
试剂：0.1mol/LPH7.5磷酸钠缓冲液 50mmol/LPH7.5磷酸缓冲液 提取缓冲液
（5gPVP 和β-巯基乙醇用0.1mol/L磷酸缓冲液溶解定容至100ml,低温4℃贮藏
备用。）20mmol/LH2O2溶液（227ul的30%H2O2溶液用50mmol/L磷酸缓冲液稀释
至100ml,先用现配，低温避光保存）
测定步骤：称取5g果蔬样品，加入5ml提取缓冲液，冰浴下研磨至匀浆，于4℃、
12000*g离心30min,收集上清液，即为酶提取液。酶促反应体系由
2.9ml20mmol/LH2O2溶液和100ul酶提取液组成。以蒸馏水为参比空白，在反应
15s时开始记录反应体系在波长240nm处吸光度值，作为初始值，然后每隔30s
记录一次，连续测定，至少获取6个点的数据，重复三次。
制作反应体系吸光度值随时间变化的曲线，根据曲线的初始线性部分计算每分钟
吸光度变化值△OD240。然后以每克果蔬样品每分钟吸光度值减少0.01为一个过
氧化氢酶活性单位，单位是0.01△OD240/min*g。
计算公式：△OD240*样品提取液总体积/(0.01*测定时所取样品液体积*样品质
量)
APX：
试剂：0.1mol/LPH7.5磷酸钾缓冲液 50mmol/LPH7.5磷酸钾缓冲液
提取缓冲液（2.9mgEDTA、17.6mg抗环血酸和2gPVPP,用0.1mol/L磷酸钾缓冲液
溶解定容至100ml,4℃预冷保存）
反应缓冲液（2.9mgEDTA和8.8mg抗环血酸，用50mmol/L磷酸钾缓冲液溶解定
容至100ml,4℃预冷保存）2mmol/LH2O2(1.14ml30%H2O2,用蒸馏水稀释至100ml,
混匀，即得2mmol/LH2O2溶液)
提取测定：5g果蔬样品加入5ml经4℃预冷的提取缓冲液，冰浴研磨匀浆后，在
4℃12000*g离心30min，收集上清液，即为酶提取液。取一只试管依次加入2.6ml
反应缓冲液和0.1ml酶提取液，最后加入0.3ml2mmol/LH2O2溶液启动酶反应，
立即混匀，并开始计时。从启动后15s开始记录反应体系在290nm处吸光度值，
每隔30s记录一次，连续测定，至少获取6个点的数据。以蒸馏水为参比调零。
重复三次。计算：制作OD290随时间变化曲线，根据曲线的初始线性部分计算每
分钟吸光度值变化△OD290，然后以每克样品APX酶促反应体系在波长290nm处
吸光度值降低0.01为一个酶活性单位，单位是0.01△OD290/min*gm
F
计算公式：APX活性=△OD290*样品提取液总体积/(0.01*测定时所取样品提取液
体积*样品质量) 注意：预先测试以确定反应条件
PPO：
试剂：0.1mol/LPH5.5乙酸-乙酸钠缓冲液 提取缓冲液（340mgPEG6000、4gPVPP
和1mlTritonX-100用0.1mol/L乙酸-乙酸钠缓冲液稀释至100ml）50mmol/L邻
苯二酚溶液（275mg邻苯二酚，用0.1mol/L乙酸-乙酸钠缓冲液溶解稀释至50ml）
提取测定：5g果蔬样品，加入5ml提取缓冲液，在冰浴下研磨至匀浆，于4℃、
12000*g下离心30min，收集上清液，即为酶提取液，低温保存备用。取一只试
管，加入4ml50mmol/L乙酸-乙酸钠缓冲液和1ml50mmol/L邻苯二酚溶液，最后
加入100ul酶提取液，同时立即开始计时，将反应混合液倒入比色杯中，置于分
管光度计样品室中，以蒸馏水为参比，在反应15s时开始记录反应体系在波长
420nm处吸光度值，作为初始值，然后每隔1min记录一次，连续测定，至少获
取六个点的数据。重复三次。制作吸光度值随时间变化的曲线，根据曲线的初始
线性部分计算每分钟吸光度变化值△OD420，以每克果蔬样品每分钟吸光度变化
值增加1为一个活性单位，单位是OD420/min*g，
计算公式：U=△OD420*样品提取液总体积/测定时所取样品液体积*样品质量)
注意：做预实验，确定酶促反应呈线性变化的时间段，以在以后的测定中只需测完线性变化
阶段以节省时间。
POD ：
试剂：0.1mol/LPH5.5乙酸-乙酸钠缓冲液（母液A为200mmol/L醋酸溶液，量
取11.55ml冰醋酸，加蒸馏水稀释至1000ml;母液B为200mmol/L醋酸钠溶液，
量取16.4g无水醋酸钠或称取27.2g三水合乙酸钠，用蒸馏水溶解定容至1000ml;
取68ml母液A和432ml母液B，混合后调节PH至5.5，加蒸馏水稀释至1000ml）
提取缓冲液（称取340mgPEG6000、4gPVPP和1mlTritonX-100用0.1mol/L乙酸
乙酸钠缓冲液稀释至100ml）25mmol/L愈创木酚溶液（取50mmol/L愈创木酚，
用50mmol/LPH5.5乙酸乙酸钠缓冲液稀释至100ml）0.5mol/LH2O2溶液（取
1.42ml30%H2O2
浓度约为17.6mol/L
溶液,用50mmol/LPH5.5乙酸乙酸钠缓冲液稀释至
50ml,现用现配，避光保存。）
提取及测定：称取5g果蔬组织，加入5ml提取缓冲液，在冰浴条件下研磨成匀
浆，于4℃12000*g离心30min，收集上清液即为酶提取液，低温保存备用。取
一只试管，加入3ml25mmol/L愈创木酚溶液和0.5ml酶液，再加入
200ul0.5mol/LH2O2溶液迅速混合启动反应，同时立即开始计时。将反应混合液
倒入比色杯中，置于分光光度计样品室，以蒸馏水为参比，在反应15s开始记录
反应体系在波长470nm处吸光度值，作为初始值，然后每隔1min记录一次，至
少获取六个点的数据，重复三次。制作吸光度值随时间变化的曲线，根据曲线的
初始线性部分计算每分钟吸光度变化值△OD470，以每克果蔬样品每分钟吸光度
变化值增加1时为一个过氧化物酶活性单位，单位是△OD470/min*g
计算公式：U=△OD470*样品提取液总体积/(测定时所取样品液体积*样品质量)
GLU ：
试剂：0.1mol/LPH5.2乙酸乙酸钠缓冲液，见附录；提取缓冲液（称取29mgEDTA，
吸取35ulβ-巯基乙醇，加入到0.1mol/LPH5.2乙酸乙酸钠缓冲液中，定容至
100ml,低温贮藏备用。）50mmol/LPH5.2乙酸乙酸钠缓冲液 10g/L胶状几丁质（称
取1g几丁质，加入4ml经4℃预冷的丙酮在冰浴通风条件下充分研磨，期间可
适当加入丙酮，应充分研细，然后边研磨边缓缓加入30ml浓盐酸，几分钟后完
全溶解，于4℃8000g离心15min，收集上清液，将上清液缓缓加入到剧烈搅拌
的50%乙醇溶液中
至少是上清液体积5倍以上
，充分搅拌后静置使胶状几丁质沉淀析出，
通过过滤弃去上清液，收集胶状几丁质沉淀。用去离子水反复冲洗至PH=7.0后，
定容至100ml，即配置成10g/L胶状几丁质悬浮液，避光保存于冰箱中。）30g/L
脱盐蜗牛酶（称取0.6g脱盐蜗牛酶，溶解到/LPH5.2乙酸乙酸钠缓冲
液中，低温避光保存）0.6mol/L四硼酸钾溶液（称取9.71g5水四硼酸钾，用蒸
馏水溶解定容至50ml）对二甲氨基苯甲醛储备液（称取10g对二甲氨甲苯甲醛
溶于87.5ml冰醋酸和12.5ml10mol/L盐酸混合液中，于4℃保存，使用前用冰
醋酸稀释5倍）0.1mol/LN-乙酰葡萄糖胺标准液（称取2.2mgN-乙酰葡萄糖胺，
用少量乙醇溶解后，用蒸馏水在稀释，定容至100ml）
提取及测定:1、标准曲线的制作：
取6支具塞试管，按下表加如试剂
项目 管号
0 1 2 3 4 5
0.1mol/LN-乙酰葡萄糖胺/ml 0 0.3 0.6 0.9 1.2 1.5
蒸馏水/ml 1.5 1.2 0.9 0.6 0.3 0
0.6mol/L四硼酸钾/ml 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2
相当于N-乙酰葡萄糖胺物质的量/umol 0 30 60 90 120 150
加入0.2ml0.6mol/L四硼酸钾溶液，将试管置于沸水浴中煮沸5min，然后迅速
冷却，冷却后加入2ml用冰醋酸稀释5倍的对二甲氨基苯甲醛溶液，再在37℃
保温培养20min进行显色反应。以0号管为参比空白，于波长585nm处测定显色
液的吸光度值，以吸光度为纵坐标，N-乙酰葡萄糖胺的量为横坐标，制作标准曲
线，求得方程。
2、提取及测定：称取10g果蔬样品，加入10ml预冷的提取缓冲液，在冰浴条件
下研磨成匀浆，转入离心管中，在4℃12000g下离心30min，收集上清液，低温
保存备用。将上清液盛到透析袋中，置于蒸馏水中，于4℃透析过夜。然后4℃
10000g下离心15min，收集上清液备用，若浓度过低，可通过冷冻干燥进行浓缩。
取两只试管，分别加入0.5ml50mmol/LPH5.2乙酸-乙酸钠缓冲液，0.5ml10g/L
胶状几丁质悬浮液，然后一支反应管中加入0.5ml酶提取液，另一支管中加入
0.5ml经煮沸5min的酶液作为对照，混匀。将反应管置于37℃保温培养1h,后，
加入0.1ml30g/L脱盐蜗牛酶，混合继续在37℃保温培养1h，以释放生成N-乙
酰葡萄糖胺单体，保温后取出，立即加入0.2ml0.6mol/L四硼酸钾溶液，并在沸
水浴中煮沸30分钟，然后迅速冷却，冷却后按制作标准曲线的方法操作。重复
三次。根据样品管反应液与对照管反应液吸光度值的差值，在标准曲线上查出相
应N-乙酰葡萄糖胺的量，记作n，以每秒钟每克样品中酶分解胶状几丁质产生
1*10-9mol/LN-乙酰葡萄糖胺作为一个几丁质酶活性单位，单位是
1*10-9mol/s*gmF,计算公式：U=n*样品提取液总体积*1000/（测定时所取样品液
体积*酶促反应时间*样品质量）
注意：也可以用丙酮沉淀、透析法或凝胶过滤法对样品
提取液进行脱盐处理，也可以直接测定粗提取液中几丁质酶活性。
CHT
：
试剂：0.1mol/LPH5.2乙酸-乙酸钠缓冲液（母液配制方法见附录，取105ml母
液A和395ml母液B混合后，调节PH值到5.2，稀释至1000ml）提取缓冲液（称
取29mgEDTA、0.1gL-抗坏血酸，吸取35ulβ-巯基乙醇，加入到0.1mol/L乙酸
钠缓冲液中，定容至100ml，摇溶，低温4℃保存）4g/L昆布多糖溶液（称取100mg
昆布多糖加入到25ml0.1mol/L醋酸缓冲液中，溶解后低温储备备用）3,5-二硝
基水杨酸试剂（1、配制500ml含有185g酒石酸钾钠的热水溶液，2、配制262ml
的2mol/LNaOH溶液 3、称取6.3g的3,5-二硝基水杨酸 4、称取5g结晶酚 5、
称取5g亚硫酸钠，最后，将上述2、3、4、5各成分加入到1中，搅拌使之溶解，
待冷却后转入到1000ml容量瓶中，并用蒸馏水定容至刻度，贮于棕色瓶中备用，
切勿使二氧化碳进入，若溶液浑浊可过滤后使用）1mg/ml葡萄糖标准液（准确
称取100mg分析纯葡萄糖预先在80℃烘干至恒重，用少量蒸馏水溶解后，转移
到100ml容量瓶中，以蒸馏水定容至刻度，摇匀，冰箱中保存备用。）
提取及测定：1、标准曲线的制作：取7支具塞刻度试管25ml,按下表加入试剂
项目 管号
0 1 2 3 4 5 6
1mg/ml葡萄糖标准液/ml 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 1.2
蒸馏水/ml 2.0 1.8 1.6 1.4 1.2 1.0 0.8
3,5-二硝基水杨酸/ml 1.5 1.5 1.5 1.5 1.5 1.5 1.5
相当于葡萄糖的质量/mg 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 1.2
精确加完各种试剂后，将各管摇匀，在沸水浴中加热5min，取出后立即放入盛
有冷水的烧杯中冷却至室温，在用蒸馏水稀释至25ml，混匀，在540nm处，用0
号管做参比调零，测定显色液的吸光度值，以吸光度为纵坐标，葡萄糖质量为横
坐标，绘制标准曲线，求得方程。
提取及测定：称取10g果蔬样品组织，加入10ml经预冷的提取缓冲液，在冰浴
条件下研磨成匀浆，转入离心管，在4℃12000g下离心30min。收集上清液，低
温保存备用。取两只试管，分别加入100ul4g/L的昆布多糖溶液，然后像一支试
管中加入100ul酶液，向另一支试管中加入100ul经煮沸5min的酶液作对照，
混匀，将反应管置于37℃保温反应40min，保温后向各管中加入1.8ml蒸馏水和
1.5mlDNS试剂，在沸水浴中加热3min，在用蒸馏水将反应液稀释至25ml，混匀
测定混合液在540nm处吸光度值，重复三次。根据样品管反应液和对照管反应液
的吸光度值的差值，在标准曲线上查的葡萄糖质量m，以每秒每克样品中酶分解
昆布多糖产生1*10-9mol葡萄糖为一个β-1,3葡聚糖酶活性单位，单位是
1*10-9mol/s*g
计算公式：m*样品提取液总体积*106/(测定时所取样品液体积*酶促反应时间*
样品质量)
注意：在制备酶液时加入的L-抗坏血酸可作为还原剂保护酶的活性，也可以使
用5mmol/L还原型谷胱甘肽保护酶活性。
PAL：
试剂：0.1mol/LPH8.8硼酸硼砂缓冲液（母液配制方法见附录，取66.67ml母液
A和33.33ml母液B，混匀，调节PH至8.8，稀释至200ml）50mmol/LPH8.8硼
酸硼砂缓冲液 提取缓冲液（取4gPVP、58mgEDTA、35ulβ-巯基乙醇加入到
0.1mol/L硼酸缓冲液中溶解定容至100ml，低温4℃保存备用）20mmol/L L-苯
丙氨酸溶液（称取330mgL-苯丙氨酸，用50mmol/L硼酸缓冲液溶解定容至100ml）
6mol/L盐酸溶液（取10ml浓盐酸，稀释到20ml）
提取及测定：称取5克果蔬样品，加入5ml提取缓冲液，冰浴研磨成匀浆，转入
离心管，于4℃12000*g下离心30min，收集上清液，低温保存备用。取两只试
管，都分别加入3ml50mmol/L硼酸缓冲液，0.5ml20mmol/LL-苯丙氨酸溶液。向
一支试管中加入0.5ml酶提取液，向另一支试管中加入0.5ml经煮沸5min的失
活酶作为对照。然后将两只管置于37℃保温60min，保温结束时，立即向两支试
管中分别加入0.1ml6mol/L盐酸溶液以终止反应。以蒸馏水为参比调零，分别测
定样品反应管和对照反应管中溶液在波长290nm处的吸光度值，重复三次。根据
反应液的吸光度值差，计算苯丙氨酸解氨酶活性，以每小时每克果蔬酶促反应体
系吸光度增加0.01为一个PAL活性单位（U），表示为0.01△OD290/h*gmF
计算公式：PAL活性=（样品管反应液吸光度值-对照管反应液吸光度值）*样品
提取液总体积/(0.01*测定时所取样品提取液体积*酶促反应时间*样品质量)
注意：原装的β-巯基乙醇的浓度大约为14.3mmol/L，EDTA的相对分子质量为292.25，L-
苯丙氨酸为165.19，浓盐酸为浓度为12mmol/L
缓冲液的配制：
1、乙酸-乙酸钠缓冲液（0.1mol/L）：将两种母液混合后，用蒸馏水稀释至200ml。
母液A（0.2mol/L乙酸溶液）:量取11.55ml冰醋酸，稀释至1000ml
母液B(0.2mol/L乙酸钠溶液)：称取16.4g无水碳酸钠（M=82.04）或称取27.22g
三水合乙酸钠（M=136.09）,溶解，稀释至1000ml
PH 0.2mol/L乙酸溶液/ml 0.2mol/L乙酸钠溶液/ml
5.2 21.0 79.0
5.4 14.0 86.0
5.6 9.0 91.0
5.8 6.0 94.0
2、磷酸钠缓冲液（0.1mol/L）: 将两种母液混合后，用蒸馏水稀释至200ml。
母液A(0.2mol/L磷酸氢二钠溶液)：称取35.61gNa2HPO4.2H2O（M=178.05）或
53.65gNa2HPO4.7H2O（M=268.25）或71.64gNa2HPO4.12H2O(M=358.22)，溶解，
稀释至1000ml
母液B(0.2mol/L磷酸二氢钠溶液)：称取27.60gNaH2PO4.H2O(M=138.01)或
31.21gNaH2PO4.2H2O(M=156.03),溶解，稀释至1000ml
PH 0.2mol/L磷酸氢二钠/ml 0.2mol/L磷酸二氢钠/ml
5.8 8.0 92.0
6.8 49.0 51.0
7.5 84.0 16.0
7.7 89.5 10.5
7.8 91.5 8.5
7.0 61.0 39.0
3、磷酸钾缓冲液（0.1mol/L）: 将两种母液混合后，用蒸馏水稀释至200ml。
母液A(0.2mol/L磷酸氢二钾溶液)：称取34.84gK2HPO4(M=174.18)溶解，稀释
至1000ml
母液B(0.2mol/L磷酸二氢钾溶液)：称取27.22gKH2PO4(M=136.09)溶解，稀释
至1000ml
PH 0.2mol/L磷酸氢二钾/ml 0.2mol/L磷酸二氢钾/ml
7.5 84 16
5.8 8.5 91.5
6.8 49.7 50.3
7.0 61.5 38.5
7.8 90.8 9.2
4、硼酸-硼砂缓冲液（0,.1mol/L硼酸根）：将两种母液混合后，用蒸馏水稀释
至200ml。
母液A(0.05mol/L硼砂溶液)：称取19.07gNa2B4O7.10H2O(M=381.43)溶解稀释
至1000ml,硼砂易失水，必须在带塞得瓶中保存。
母液B(0.2mol/L硼酸溶液)：称取12.37gH2BO3(M=61.84)溶解，稀释至1000ml
各种缓冲液的优缺点：
磷酸缓冲液：PH缓冲范围最广，缓冲稀释后PH变化小，但易与Ca、Mg及重金
属离子结合，抑制某些酶促反应，钾盐比钠盐在低温下易溶，但会与凝胶电泳中
的SDS反应生成难溶物。
Tris（三羟甲基氨基甲烷）缓冲液：在电泳中用的的多。PH在中性范围7.5~8.5
Tris碱性较强，可以与HCl配制从酸性到碱性大范围的PH缓冲液，Tris-HCl
缓冲液对生化反应干扰很小，不与金属离子发生沉淀。但其PH受浓度变化很大，
稀释10倍，PH变化大于0.1，还受温度影响，易吸收CO2，对某些PH电极发生
干扰作用，要选用与Tris溶液具有兼容性的电极。
有机酸缓冲液：PH范围为酸性，羧酸是天然的代谢产物，会对反应产生干扰
硼酸缓冲液：碱性范围内最常用的缓冲液，易与很多代谢产物反应，尤其是和糖
的羟基反应生成稳定的复合物使缓冲液受到干扰。
一些常用缓冲液添加剂：
EDTA:金属离子螯合剂
β-巯基乙醇：还原剂，保护蛋白的巯基不被氧化，24h内被氧化，其后可加速
蛋白质的失活。DDT（二硫苏糖醇，一般保存在-20℃）氧化后可形成稳定的分子
内二硫键，并不危及蛋白质的巯基，长期储存时可用DDT。
TritonX-100:非离子型去污剂，膜蛋白的提取过程中，使蛋白膜溶解。
2024年4月9日发(作者：上官豫)
指标：1、品质指标
硬度、色泽、褐变指数、失重率、腐烂率、可溶性固型物、呼吸强度、乙烯释放
率、可滴定酸、Vc
2、抗性指标
抗氧化衰老的有：SOD CAT APX GSH MDA 原果胶（可溶性果胶）
抗病相关指标有：PPO POD CHT GUL PAL总酚 类黄酮 木质素
3、测定方法：
褐变指数
色泽
失重率
腐烂率
呼吸强度
乙烯释放率
硬度
可溶性固型物
可滴定酸：
试剂：0.1mol/LNaOH(4g纯+1000ml蒸馏水，邻苯二甲酸氢钾标定) 1%酚酞试剂
（1g酚酞加入到100ml50%的乙醇溶液中溶解）
方法：1、NaOH的标定： 准确称取105℃下烘干至恒重的基准邻苯二甲酸氢钾
0.6g ，加入50ml新煮沸过的冷水，振摇，使其尽量溶解，再滴加2滴1%酚酞
指示剂，用配置的NaOH溶液标定，滴定至溶液呈粉红色。每1mlNaOH相当于
20.42mg邻苯二甲酸氢钾，计算出NaOH滴定液的浓度。
2、测定步骤：称10g苹果，研磨，转移到100ml容量瓶中，蒸馏水洗研钵3次
再定容，摇匀，静置30min后过滤。吸取20ml滤液，转入三角瓶中，加入两滴
1%酚酞试剂，用已标定的氢氧化钠溶液进行标定，滴定至溶液初现粉色并30秒
内不退色为终点（PH8.1-8.3）,重复三次，再用蒸馏水作为滤液进行滴定作为空
白对照。可定丁酸含量=【样品提取液总体积*氢氧化钠滴定液浓度*（滴定滤液
消耗的氢氧化钠体积—滴定蒸馏水消耗的氢氧化钠体积）】/（滴定时所取滤液体
积*样品质量）
Vc：
试剂：5%钼酸铵溶液（称取5g钼酸铵溶于蒸馏水中，并定容至100ml）草酸-EDTA
溶液（称取6.3g草酸和0.75gEDTA-Na2溶于蒸馏水中并定容至1000ml）
5%H2SO4(体积分数) 偏磷酸-乙酸溶液（取棒状偏磷酸3g加20%冰醋酸48ml，溶
解后加蒸馏水稀释至100ml,必要时过滤，在冰箱中可保存3天）Vc标准溶液（称
取Vc100mg，置100ml容量瓶中，加适量草酸-EDTA溶液溶解后，在用该溶液定
容到100ml，即成1mg/ml标准液，此溶液随配随用
（如果纯度不够应进行标定）
）
提取及测定：1、制作标准曲线： 7支25ml具塞试管，按下表加入各种试剂
试剂 试管号
1 2 3 4 5 6 7
Vc标准液/ml 0 0.1 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0
草酸EDTA溶液/ml 5.0 4.9 4.8 4.6 4.4 4.2 4.0
偏磷酸-乙酸溶液/ml 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5
1:19H2SO4/ml 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0
5%钼酸铵/ml 2.0 2.0 2.0 2.0 2.0 2.0 2.0
Vc含量/mg 0 10 20 40 60 80 100
加完试剂摇匀后，置30℃水浴中保温15min，用蒸馏水稀释至25ml，混匀，用1
号空白管调零，在760nm波长下比色，记录吸光度，以Vc含量为横坐标，吸光
度为纵坐标，绘制标准曲线。
2、提取及测定：称取5g果蔬组织，加5ml草酸-EDTA溶液研磨成匀浆，并仔细
转入25ml容量瓶中，再用提取介质冲洗研钵，冲洗液一并倒入容量瓶中。取一
部分匀浆液经3000g离心10min后，取1ml上清液与标准管同法测定，若样品显
色液中出现沉淀，可过滤后进行比色，不影响测定结果。
计算公式：Vc含量（mg*100g-1FW）=标准曲线上查的的Vc的量*样品提取液总
体积/(测定时所用样品液体积*样品鲜重)
注意：显色温度和加入显色剂后的时间要一
致。
GSH：
试剂：50g/L三氯乙酸（5g三氯乙酸和蒸馏水溶解稀释至100ml，再加入
186mgEDTA-Na2.2H2O）0.1mol/LPH7.7磷酸钠缓冲液和0.1mol/LPH6.8磷酸钠缓
冲液 4mmol/L二硫代硝基苯甲酸（15.8mgDTNB，用0.1mol/L、PH6.8磷酸缓冲
液溶解，定容至10ml，摇匀，4℃保存）100umol/L还原性谷胱甘肽标准液（3g
还原型谷胱甘肽加入少量无水乙醇用蒸馏水定容至100ml）
实验步骤：1、标准曲线制作：
取六只试管编号，按下表加入各种试剂，混匀，于25℃保温反应10min，以0
号管为参比调零，测定显色液在波长412nm处的吸光度值，以吸光度值为纵坐标，
还原型谷胱甘肽为横坐标，绘制标准曲线。
项目 管号
0 1 2 3 4 5
还原型谷胱甘肽标液/ml 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0
蒸馏水/ml 1.0 0.8 0.6 0.4 0.2 0
PH7.7磷酸缓冲液/ml 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0
DTNB试剂/ml 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5
相当于还原型谷胱甘肽物质的量/umol 0 20 40 60 80 100
2、提取和测定：5g果实加入经预冷的三氯乙酸，在冰浴下研磨匀浆，于4℃、
12000xg离心20min，收集上清液测定。取一只试管，依次加入1ml蒸馏水、
1mlPH7.7磷酸缓冲液和0.5mlDTNB，混匀即为绘制标准曲线的0号管溶液，此液
作为参比调零。另取两支试管，分别加入1ml上清液、1mlPH7.7磷酸缓冲液，
然后向一只管中加入0.5mlDTNB，向另一支管中加入0.5mlPH6.8磷酸缓冲液。
将两只管置于25℃下保温反应10min，迅速测定显色液在波长412nm下的吸光度
值，分别记作ODs和ODc。重复三次。
根据ODs-ODc的差值从标准曲线上查的还原型谷胱甘肽含量，计算每克果实中还
原型谷胱甘肽的含量：还原型谷胱甘肽含量=（标准曲线上查得的值*样品提取液
总体积）/（吸取样品液体积*样品质量）
注意：先做样品本底对照。
MDA：
试剂：100g/L三氯乙酸（称取10g三氯乙酸蒸馏水溶解稀释至100ml）6.7g/L
硫代巴比妥酸（称取0.67g硫代巴比妥酸，用100ml0.05mol/L氢氧化钠溶解）
测定步骤：称取1g果蔬样品，加入5ml三氯乙酸溶液，研磨匀浆于4℃10000g
离心20min，收集上清液低温保存备用。取2ml上清液，对照空白管中加入2ml
三氯乙酸代替提取液，分别加入2ml0.67%硫代巴比妥酸，混合后在沸水浴中煮
沸20min，取出冷却后再离心一次，分别测定上清液在450nm、532nm、600nm波
长处的吸光度值，重复三次。计算：丙二醛含量（umol/L）
=6.45*(OD532-OD600)-0.56*OD450
每克果蔬中丙二醛的含量=丙二醛含量*样品提取液总体积/(测定时所取样品液
体积*样品质量*1000)
注意：出现负值，表明糖的影响很大，需做预实验确定适宜的
条件。
原果胶（可溶性果胶）：
试剂：1.5g/L咔唑-乙醇溶液（称取0.15g咔唑加入无水乙醇溶解并稀释至100ml）
100ug/ml半乳糖醛酸标准液（称取10mg半乳糖醛酸
M=194
,用蒸馏水溶解定容至
100ml） 浓硫酸 95%乙醇 0.5mol/L硫酸溶液
测定步骤：1、制作标准曲线：取6支25ml具塞刻度试管，编号，按下表加入半
乳糖醛酸标准液，然后小心地沿管壁加入6ml浓硫酸，在沸水浴中加热20min，
取出冷却至室温后，各加入0.2ml1.5g/L咔唑-乙醇溶液，摇匀，在暗处放置30min
后，测定反应液在波长530nm处的吸光度值，并以吸光度值为纵坐标，半乳糖醛
酸质量（ug）为横坐标，绘制标准曲线求出方程。
项目 管号
0 1 2 3 4 5
半乳糖醛酸标准液/ml 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0
蒸馏水/ml 1.0 0.8 0.6 0.4 0.2 0
相当于半乳糖醛酸的量/ug 0 20 40 60 80 100
2、提取测定：
（1）可溶性果胶提取：称取1g果蔬组织，研磨成匀浆转入50ml刻度离心管中，
加入25ml95%乙醇，在沸水浴上加热30min，以除去样品中糖分及其他物质，注
意在煮沸过程中要及时补加95%乙醇。取出冷却至室温，于8000r/min离心5min，
弃去上清液，再加入95%乙醇在沸水浴上加热，如此重复3-5次。然后将沉淀放
入试管中，加入20ml蒸馏水，在50℃水浴中保温30min，以溶解果胶。取出冷
却至室温后，于8000r/min下离心15min，将上清液移入100ml容量瓶中，用少
量水洗涤沉淀，离心后一并将上清液移入容量瓶中，加蒸馏水至刻度，此溶液即
为可溶性果胶。
（2）原果胶提取：将上述遗留的沉淀物，保留在刻度离心管仲，再向其中加入
25ml0.5mol/L硫酸溶液，在沸水浴中加热1h以水解原果胶，取出冷却至室温后，
于8000r/min下离心15min,将上清液移入100ml容量瓶中，加蒸馏水至刻度，
此为原果胶测定液。
（3）测定：吸取1ml提取液，加入到25ml刻度试管中，按标准曲线的操作步骤
进行测定，重复三次。计算：根据吸光度值查得半乳糖醛酸质量，计算每克果蔬
中果胶含量，以半乳糖醛酸质量分数表示。
半乳糖醛酸含量=查得的半乳糖醛酸量*样品提取液总体积/(测定时所取样品液
体积*样品质量) 注意：检验糖分是否除尽的方法：取0.5ml提取液置于试管中，
加入2-3滴50g/Lα-萘酚的乙醇溶液，充分混合，此时溶液稍有白色沉淀，然
后使试管稍稍倾斜，用吸管沿管壁加入1ml浓硫酸（注意水层与硫酸层不可混
合）。待试管静置后，若在两层的界面上产生紫红色环，则证明提取液中含有糖
分
总酚：
试剂：钨酸钠(Na2WO4·2H2O)、钼酸钠(Na2MoO4·2H2O)、硫酸锂(Li2SO4)、磷
酸(H3PO4≥85%)、磷钼酸(24MoO3·P2O5·xH2O)、碳酸钠(Na2CO3)、盐酸和溴水
为分析纯。一水合没食子酸标样为Sigma -Aldrich 公司产品。水为蒸馏水。
1.1.2 FC 显色剂:称取50.0 g 钨酸钠和12.5 g 钼酸钠, 用350 mL 蒸馏水溶于1
000 mL 回流瓶中, 加入25 mL 磷酸和50 mL 盐酸, 混匀, 微沸回流2 h, 加入
75.0 g 硫酸锂、25 mL 蒸馏水和数滴溴水, 开口沸腾约15min( 至溴水挥尽为
止) , 冷却, 定容至500mL,过滤, 置棕色瓶中保存备用。使用时加入1 倍蒸馏水
稀释。
1.1.3 FD 显色剂:称取100.0 g 钨酸钠和20.0 g 磷钼酸, 溶于200 mL 蒸馏水,
加入50 mL 磷酸, 加热回流2 h, 冷却, 定容至1 L。
1.1.4 7.5%碳酸钠溶液：称取37.5 g 碳酸钠, 溶于250 mL 温水, 混匀, 冷却,
定容至500 mL。
1.1.5 一水合没食子酸标准溶液:称取0.110 g 一水合没食子酸, 用蒸馏水溶
解、定容至100 mL, 此溶液质量浓度为1 000 mg/L。分别吸取此溶液0.0、1.0、
2.0 、3.0、4.0、5.0 mL 至100 mL 容量瓶中, 用蒸馏水定容至刻度, 所得一水
合没食子酸标准溶液的质量浓度分别为0.0、10、20、30、40、50 mg/L。
取试样适量( 葡萄酒吸取2mL,葡萄和柿子称取2 g 匀浆, 其他水果称取5 g 匀
浆) ,用80 mL 蒸馏水洗入100 mL 容量瓶中, 至100 ℃沸水浴中保温30 min, 取
出, 冷却, 定容, 过滤, 滤液备用。使用5 mL 刻度吸管吸取1.0 mL 滤液( 若多
酚含量过高, 可适当稀释) 或一水合没食子酸标准溶液, 分别用刻度吸管加入
FC 显色剂或FD 显色剂及7.5%碳酸钠溶液, 用蒸馏水定容至10 mL,混匀, 室温
显色( 下同) , 测定765 nm 吸光度, 根据稀释倍数和从标准曲线中查出的浓度,
计算样品多酚含量。
对于FD 法, 最佳的测定条件为分别吸取1 mL 滤液、1 mL FD 显色剂、2 mL 7.5%
碳酸钠溶液和6 mL 蒸馏水, 于10 mL离心管中混匀, 室温下显色30～60 min, 测
定765 nm吸光度。
对于FC 法, 最佳测定条件为分别吸取1 mL 滤液、1 mL FC 显色剂、3 mL 7.5%
碳酸钠溶液和5 mL蒸馏水, 于10 mL 离心管中混匀, 显色30～60 min, 测定765
nm 吸光度。
总酚含量测定:参照王军节：1 g 果皮组织与预冷的5 mL 1 %HCl - 甲醇溶液
充分研磨提取,然后在4 ℃下,8 000 r/ min 离心10 min后,取上清液直接用于比
色,样品重复测3 次,酚类含量以
OD
280 / gFW 表示.
类黄酮:
试剂：1%盐酸-甲醇溶液（取1ml浓盐酸加入到99ml甲醇中，摇匀，于4℃预冷）
提取及测定：称取2g果肉组织，加入少许经预冷的1%盐酸-甲醇溶液，冰浴研
磨匀浆，转入20ml刻度试管中，用1%盐酸-甲醇溶液冲洗研钵，一并转移到试
管中，定容至刻度，混匀，于4℃避光提取20min，期间摇动数次，然后过滤，
收集滤液待用。以1%盐酸-甲醇溶液做参比调零，取滤液分别于波长280nm、325nm
处测定溶液吸光度值，OD280表示总酚含量，OD325表示类黄酮含量。
注意：此测定方法仅能判断样品之间总酚、类黄酮的相对含量，若要准确含量，
可以用不同浓度没食子酸做标准曲线，计算总分物质含量，用芦丁制作标准曲线，
计算类黄酮含量。
木质素：参照Morrison (1972) 法[12 ] 并修改。1 g 果肉组织与预冷的4 mL 体
积分数95 %乙醇研磨,4 ℃下12000 ×g 离心10 min ,沉淀物用体积分数95 %乙
醇冲洗3 次,再用乙醇∶正己烷体积比= 1 ∶2 冲洗3 次,然后加1 mL 2 mol/ L
NaOH 中止反应。再加2mL冰醋酸和0.1 mL 7.5 mol/ L 盐酸羟胺,离心,取上清0.5
mL ,用冰醋酸定容至10 mL ,280 nm 下测定样品吸光值,样品重复测3 次。木质
素含量以
OD
280
/
g(鲜重) 表示。
SOD：
试剂：0.1mol/LPH7.8磷酸钠缓冲液 提取缓冲液（5gPVP和35ulβ-巯基乙醇加
入到0.1mol/LPH7.8磷酸缓冲液定容至100ml,摇匀，低温4℃贮藏备用。）
50mmol/LPH7.8磷酸钠缓冲液 130mmol/L L-蛋氨酸（称取1.94gL-蛋氨酸，用
50mmol/LPH7.8磷酸缓冲液溶解定容至100ml,充分混匀，先用现配，低温避光保
存，可使用1-2天） 750umol/L氮蓝四唑溶液（称取61.3mgNBT,用蒸馏水溶解，
定容至100ml,充分混匀，现用现配，低温避光保存，可用2-3天）
100umol/LEDTA-Na2溶液（称取37.2mgEDTA-Na，用蒸馏水溶解，定容至100ml,
使用时稀释100倍，低温避光保存，可用8-10天）20umol/L核黄素溶液（称取
73.2mg核黄素，蒸馏水溶解，定容至100ml,使用时稀释100倍，低温避光保存，
随配随用（黑纸包好）。
提取及测定：5g果蔬样品，加入5ml提取缓冲液，在冰浴下研磨成匀浆，转入
离心管中，于4℃12000*g离心30min，收集上清液，低温保存备用。取5支试
管，按照下表加入各种溶液，注意最后加入核黄素。其中3支为测定管，其余两
支为对照管，混匀后，将一只对照管置于暗处，其他各管置于4000lx日光灯下
反应15min后立即取出，置于暗处终止反应。以不照光管做空白参比调零，于
560nm处分别测定其它各管的吸光度值。
试剂 用量/ml 终浓度（比色时）
50mmol/LPH7.8磷酸缓冲液 1.7
130mmol/L蛋氨酸溶液 0.3 13mmol/L
750umol/L氮蓝四唑溶液 0.3 75umol/L
100umol/LEDTA-Na2溶液 0.3 10umol/L
20umol/L核黄素溶液 0.3 2umol/L
酶液 0.1 对照两支管以缓冲液代替
总体积 3ml
显色反应后，分别记录样品管反应混合液的吸光度值（ODs）和照光对照管反应
混合液的吸光度值（ODc）,以每分钟每克果蔬的反应体系对氮蓝四唑光化还原的
抑制为50%为一个SOD活性单位（U）表示。
SOD活性=（ODc-ODs）*样品提取液总体积/(0.5*ODc*测定时所取样品液总体积*
光反应时间*样品质量)
注意：需要通过预实验摸索显色反应所需时间，温度以25℃为
宜，低时适当延长时间，高时缩短时间。
CAT ：
试剂：0.1mol/LPH7.5磷酸钠缓冲液 50mmol/LPH7.5磷酸缓冲液 提取缓冲液
（5gPVP 和β-巯基乙醇用0.1mol/L磷酸缓冲液溶解定容至100ml,低温4℃贮藏
备用。）20mmol/LH2O2溶液（227ul的30%H2O2溶液用50mmol/L磷酸缓冲液稀释
至100ml,先用现配，低温避光保存）
测定步骤：称取5g果蔬样品，加入5ml提取缓冲液，冰浴下研磨至匀浆，于4℃、
12000*g离心30min,收集上清液，即为酶提取液。酶促反应体系由
2.9ml20mmol/LH2O2溶液和100ul酶提取液组成。以蒸馏水为参比空白，在反应
15s时开始记录反应体系在波长240nm处吸光度值，作为初始值，然后每隔30s
记录一次，连续测定，至少获取6个点的数据，重复三次。
制作反应体系吸光度值随时间变化的曲线，根据曲线的初始线性部分计算每分钟
吸光度变化值△OD240。然后以每克果蔬样品每分钟吸光度值减少0.01为一个过
氧化氢酶活性单位，单位是0.01△OD240/min*g。
计算公式：△OD240*样品提取液总体积/(0.01*测定时所取样品液体积*样品质
量)
APX：
试剂：0.1mol/LPH7.5磷酸钾缓冲液 50mmol/LPH7.5磷酸钾缓冲液
提取缓冲液（2.9mgEDTA、17.6mg抗环血酸和2gPVPP,用0.1mol/L磷酸钾缓冲液
溶解定容至100ml,4℃预冷保存）
反应缓冲液（2.9mgEDTA和8.8mg抗环血酸，用50mmol/L磷酸钾缓冲液溶解定
容至100ml,4℃预冷保存）2mmol/LH2O2(1.14ml30%H2O2,用蒸馏水稀释至100ml,
混匀，即得2mmol/LH2O2溶液)
提取测定：5g果蔬样品加入5ml经4℃预冷的提取缓冲液，冰浴研磨匀浆后，在
4℃12000*g离心30min，收集上清液，即为酶提取液。取一只试管依次加入2.6ml
反应缓冲液和0.1ml酶提取液，最后加入0.3ml2mmol/LH2O2溶液启动酶反应，
立即混匀，并开始计时。从启动后15s开始记录反应体系在290nm处吸光度值，
每隔30s记录一次，连续测定，至少获取6个点的数据。以蒸馏水为参比调零。
重复三次。计算：制作OD290随时间变化曲线，根据曲线的初始线性部分计算每
分钟吸光度值变化△OD290，然后以每克样品APX酶促反应体系在波长290nm处
吸光度值降低0.01为一个酶活性单位，单位是0.01△OD290/min*gm
F
计算公式：APX活性=△OD290*样品提取液总体积/(0.01*测定时所取样品提取液
体积*样品质量) 注意：预先测试以确定反应条件
PPO：
试剂：0.1mol/LPH5.5乙酸-乙酸钠缓冲液 提取缓冲液（340mgPEG6000、4gPVPP
和1mlTritonX-100用0.1mol/L乙酸-乙酸钠缓冲液稀释至100ml）50mmol/L邻
苯二酚溶液（275mg邻苯二酚，用0.1mol/L乙酸-乙酸钠缓冲液溶解稀释至50ml）
提取测定：5g果蔬样品，加入5ml提取缓冲液，在冰浴下研磨至匀浆，于4℃、
12000*g下离心30min，收集上清液，即为酶提取液，低温保存备用。取一只试
管，加入4ml50mmol/L乙酸-乙酸钠缓冲液和1ml50mmol/L邻苯二酚溶液，最后
加入100ul酶提取液，同时立即开始计时，将反应混合液倒入比色杯中，置于分
管光度计样品室中，以蒸馏水为参比，在反应15s时开始记录反应体系在波长
420nm处吸光度值，作为初始值，然后每隔1min记录一次，连续测定，至少获
取六个点的数据。重复三次。制作吸光度值随时间变化的曲线，根据曲线的初始
线性部分计算每分钟吸光度变化值△OD420，以每克果蔬样品每分钟吸光度变化
值增加1为一个活性单位，单位是OD420/min*g，
计算公式：U=△OD420*样品提取液总体积/测定时所取样品液体积*样品质量)
注意：做预实验，确定酶促反应呈线性变化的时间段，以在以后的测定中只需测完线性变化
阶段以节省时间。
POD ：
试剂：0.1mol/LPH5.5乙酸-乙酸钠缓冲液（母液A为200mmol/L醋酸溶液，量
取11.55ml冰醋酸，加蒸馏水稀释至1000ml;母液B为200mmol/L醋酸钠溶液，
量取16.4g无水醋酸钠或称取27.2g三水合乙酸钠，用蒸馏水溶解定容至1000ml;
取68ml母液A和432ml母液B，混合后调节PH至5.5，加蒸馏水稀释至1000ml）
提取缓冲液（称取340mgPEG6000、4gPVPP和1mlTritonX-100用0.1mol/L乙酸
乙酸钠缓冲液稀释至100ml）25mmol/L愈创木酚溶液（取50mmol/L愈创木酚，
用50mmol/LPH5.5乙酸乙酸钠缓冲液稀释至100ml）0.5mol/LH2O2溶液（取
1.42ml30%H2O2
浓度约为17.6mol/L
溶液,用50mmol/LPH5.5乙酸乙酸钠缓冲液稀释至
50ml,现用现配，避光保存。）
提取及测定：称取5g果蔬组织，加入5ml提取缓冲液，在冰浴条件下研磨成匀
浆，于4℃12000*g离心30min，收集上清液即为酶提取液，低温保存备用。取
一只试管，加入3ml25mmol/L愈创木酚溶液和0.5ml酶液，再加入
200ul0.5mol/LH2O2溶液迅速混合启动反应，同时立即开始计时。将反应混合液
倒入比色杯中，置于分光光度计样品室，以蒸馏水为参比，在反应15s开始记录
反应体系在波长470nm处吸光度值，作为初始值，然后每隔1min记录一次，至
少获取六个点的数据，重复三次。制作吸光度值随时间变化的曲线，根据曲线的
初始线性部分计算每分钟吸光度变化值△OD470，以每克果蔬样品每分钟吸光度
变化值增加1时为一个过氧化物酶活性单位，单位是△OD470/min*g
计算公式：U=△OD470*样品提取液总体积/(测定时所取样品液体积*样品质量)
GLU ：
试剂：0.1mol/LPH5.2乙酸乙酸钠缓冲液，见附录；提取缓冲液（称取29mgEDTA，
吸取35ulβ-巯基乙醇，加入到0.1mol/LPH5.2乙酸乙酸钠缓冲液中，定容至
100ml,低温贮藏备用。）50mmol/LPH5.2乙酸乙酸钠缓冲液 10g/L胶状几丁质（称
取1g几丁质，加入4ml经4℃预冷的丙酮在冰浴通风条件下充分研磨，期间可
适当加入丙酮，应充分研细，然后边研磨边缓缓加入30ml浓盐酸，几分钟后完
全溶解，于4℃8000g离心15min，收集上清液，将上清液缓缓加入到剧烈搅拌
的50%乙醇溶液中
至少是上清液体积5倍以上
，充分搅拌后静置使胶状几丁质沉淀析出，
通过过滤弃去上清液，收集胶状几丁质沉淀。用去离子水反复冲洗至PH=7.0后，
定容至100ml，即配置成10g/L胶状几丁质悬浮液，避光保存于冰箱中。）30g/L
脱盐蜗牛酶（称取0.6g脱盐蜗牛酶，溶解到/LPH5.2乙酸乙酸钠缓冲
液中，低温避光保存）0.6mol/L四硼酸钾溶液（称取9.71g5水四硼酸钾，用蒸
馏水溶解定容至50ml）对二甲氨基苯甲醛储备液（称取10g对二甲氨甲苯甲醛
溶于87.5ml冰醋酸和12.5ml10mol/L盐酸混合液中，于4℃保存，使用前用冰
醋酸稀释5倍）0.1mol/LN-乙酰葡萄糖胺标准液（称取2.2mgN-乙酰葡萄糖胺，
用少量乙醇溶解后，用蒸馏水在稀释，定容至100ml）
提取及测定:1、标准曲线的制作：
取6支具塞试管，按下表加如试剂
项目 管号
0 1 2 3 4 5
0.1mol/LN-乙酰葡萄糖胺/ml 0 0.3 0.6 0.9 1.2 1.5
蒸馏水/ml 1.5 1.2 0.9 0.6 0.3 0
0.6mol/L四硼酸钾/ml 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2
相当于N-乙酰葡萄糖胺物质的量/umol 0 30 60 90 120 150
加入0.2ml0.6mol/L四硼酸钾溶液，将试管置于沸水浴中煮沸5min，然后迅速
冷却，冷却后加入2ml用冰醋酸稀释5倍的对二甲氨基苯甲醛溶液，再在37℃
保温培养20min进行显色反应。以0号管为参比空白，于波长585nm处测定显色
液的吸光度值，以吸光度为纵坐标，N-乙酰葡萄糖胺的量为横坐标，制作标准曲
线，求得方程。
2、提取及测定：称取10g果蔬样品，加入10ml预冷的提取缓冲液，在冰浴条件
下研磨成匀浆，转入离心管中，在4℃12000g下离心30min，收集上清液，低温
保存备用。将上清液盛到透析袋中，置于蒸馏水中，于4℃透析过夜。然后4℃
10000g下离心15min，收集上清液备用，若浓度过低，可通过冷冻干燥进行浓缩。
取两只试管，分别加入0.5ml50mmol/LPH5.2乙酸-乙酸钠缓冲液，0.5ml10g/L
胶状几丁质悬浮液，然后一支反应管中加入0.5ml酶提取液，另一支管中加入
0.5ml经煮沸5min的酶液作为对照，混匀。将反应管置于37℃保温培养1h,后，
加入0.1ml30g/L脱盐蜗牛酶，混合继续在37℃保温培养1h，以释放生成N-乙
酰葡萄糖胺单体，保温后取出，立即加入0.2ml0.6mol/L四硼酸钾溶液，并在沸
水浴中煮沸30分钟，然后迅速冷却，冷却后按制作标准曲线的方法操作。重复
三次。根据样品管反应液与对照管反应液吸光度值的差值，在标准曲线上查出相
应N-乙酰葡萄糖胺的量，记作n，以每秒钟每克样品中酶分解胶状几丁质产生
1*10-9mol/LN-乙酰葡萄糖胺作为一个几丁质酶活性单位，单位是
1*10-9mol/s*gmF,计算公式：U=n*样品提取液总体积*1000/（测定时所取样品液
体积*酶促反应时间*样品质量）
注意：也可以用丙酮沉淀、透析法或凝胶过滤法对样品
提取液进行脱盐处理，也可以直接测定粗提取液中几丁质酶活性。
CHT
：
试剂：0.1mol/LPH5.2乙酸-乙酸钠缓冲液（母液配制方法见附录，取105ml母
液A和395ml母液B混合后，调节PH值到5.2，稀释至1000ml）提取缓冲液（称
取29mgEDTA、0.1gL-抗坏血酸，吸取35ulβ-巯基乙醇，加入到0.1mol/L乙酸
钠缓冲液中，定容至100ml，摇溶，低温4℃保存）4g/L昆布多糖溶液（称取100mg
昆布多糖加入到25ml0.1mol/L醋酸缓冲液中，溶解后低温储备备用）3,5-二硝
基水杨酸试剂（1、配制500ml含有185g酒石酸钾钠的热水溶液，2、配制262ml
的2mol/LNaOH溶液 3、称取6.3g的3,5-二硝基水杨酸 4、称取5g结晶酚 5、
称取5g亚硫酸钠，最后，将上述2、3、4、5各成分加入到1中，搅拌使之溶解，
待冷却后转入到1000ml容量瓶中，并用蒸馏水定容至刻度，贮于棕色瓶中备用，
切勿使二氧化碳进入，若溶液浑浊可过滤后使用）1mg/ml葡萄糖标准液（准确
称取100mg分析纯葡萄糖预先在80℃烘干至恒重，用少量蒸馏水溶解后，转移
到100ml容量瓶中，以蒸馏水定容至刻度，摇匀，冰箱中保存备用。）
提取及测定：1、标准曲线的制作：取7支具塞刻度试管25ml,按下表加入试剂
项目 管号
0 1 2 3 4 5 6
1mg/ml葡萄糖标准液/ml 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 1.2
蒸馏水/ml 2.0 1.8 1.6 1.4 1.2 1.0 0.8
3,5-二硝基水杨酸/ml 1.5 1.5 1.5 1.5 1.5 1.5 1.5
相当于葡萄糖的质量/mg 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 1.2
精确加完各种试剂后，将各管摇匀，在沸水浴中加热5min，取出后立即放入盛
有冷水的烧杯中冷却至室温，在用蒸馏水稀释至25ml，混匀，在540nm处，用0
号管做参比调零，测定显色液的吸光度值，以吸光度为纵坐标，葡萄糖质量为横
坐标，绘制标准曲线，求得方程。
提取及测定：称取10g果蔬样品组织，加入10ml经预冷的提取缓冲液，在冰浴
条件下研磨成匀浆，转入离心管，在4℃12000g下离心30min。收集上清液，低
温保存备用。取两只试管，分别加入100ul4g/L的昆布多糖溶液，然后像一支试
管中加入100ul酶液，向另一支试管中加入100ul经煮沸5min的酶液作对照，
混匀，将反应管置于37℃保温反应40min，保温后向各管中加入1.8ml蒸馏水和
1.5mlDNS试剂，在沸水浴中加热3min，在用蒸馏水将反应液稀释至25ml，混匀
测定混合液在540nm处吸光度值，重复三次。根据样品管反应液和对照管反应液
的吸光度值的差值，在标准曲线上查的葡萄糖质量m，以每秒每克样品中酶分解
昆布多糖产生1*10-9mol葡萄糖为一个β-1,3葡聚糖酶活性单位，单位是
1*10-9mol/s*g
计算公式：m*样品提取液总体积*106/(测定时所取样品液体积*酶促反应时间*
样品质量)
注意：在制备酶液时加入的L-抗坏血酸可作为还原剂保护酶的活性，也可以使
用5mmol/L还原型谷胱甘肽保护酶活性。
PAL：
试剂：0.1mol/LPH8.8硼酸硼砂缓冲液（母液配制方法见附录，取66.67ml母液
A和33.33ml母液B，混匀，调节PH至8.8，稀释至200ml）50mmol/LPH8.8硼
酸硼砂缓冲液 提取缓冲液（取4gPVP、58mgEDTA、35ulβ-巯基乙醇加入到
0.1mol/L硼酸缓冲液中溶解定容至100ml，低温4℃保存备用）20mmol/L L-苯
丙氨酸溶液（称取330mgL-苯丙氨酸，用50mmol/L硼酸缓冲液溶解定容至100ml）
6mol/L盐酸溶液（取10ml浓盐酸，稀释到20ml）
提取及测定：称取5克果蔬样品，加入5ml提取缓冲液，冰浴研磨成匀浆，转入
离心管，于4℃12000*g下离心30min，收集上清液，低温保存备用。取两只试
管，都分别加入3ml50mmol/L硼酸缓冲液，0.5ml20mmol/LL-苯丙氨酸溶液。向
一支试管中加入0.5ml酶提取液，向另一支试管中加入0.5ml经煮沸5min的失
活酶作为对照。然后将两只管置于37℃保温60min，保温结束时，立即向两支试
管中分别加入0.1ml6mol/L盐酸溶液以终止反应。以蒸馏水为参比调零，分别测
定样品反应管和对照反应管中溶液在波长290nm处的吸光度值，重复三次。根据
反应液的吸光度值差，计算苯丙氨酸解氨酶活性，以每小时每克果蔬酶促反应体
系吸光度增加0.01为一个PAL活性单位（U），表示为0.01△OD290/h*gmF
计算公式：PAL活性=（样品管反应液吸光度值-对照管反应液吸光度值）*样品
提取液总体积/(0.01*测定时所取样品提取液体积*酶促反应时间*样品质量)
注意：原装的β-巯基乙醇的浓度大约为14.3mmol/L，EDTA的相对分子质量为292.25，L-
苯丙氨酸为165.19，浓盐酸为浓度为12mmol/L
缓冲液的配制：
1、乙酸-乙酸钠缓冲液（0.1mol/L）：将两种母液混合后，用蒸馏水稀释至200ml。
母液A（0.2mol/L乙酸溶液）:量取11.55ml冰醋酸，稀释至1000ml
母液B(0.2mol/L乙酸钠溶液)：称取16.4g无水碳酸钠（M=82.04）或称取27.22g
三水合乙酸钠（M=136.09）,溶解，稀释至1000ml
PH 0.2mol/L乙酸溶液/ml 0.2mol/L乙酸钠溶液/ml
5.2 21.0 79.0
5.4 14.0 86.0
5.6 9.0 91.0
5.8 6.0 94.0
2、磷酸钠缓冲液（0.1mol/L）: 将两种母液混合后，用蒸馏水稀释至200ml。
母液A(0.2mol/L磷酸氢二钠溶液)：称取35.61gNa2HPO4.2H2O（M=178.05）或
53.65gNa2HPO4.7H2O（M=268.25）或71.64gNa2HPO4.12H2O(M=358.22)，溶解，
稀释至1000ml
母液B(0.2mol/L磷酸二氢钠溶液)：称取27.60gNaH2PO4.H2O(M=138.01)或
31.21gNaH2PO4.2H2O(M=156.03),溶解，稀释至1000ml
PH 0.2mol/L磷酸氢二钠/ml 0.2mol/L磷酸二氢钠/ml
5.8 8.0 92.0
6.8 49.0 51.0
7.5 84.0 16.0
7.7 89.5 10.5
7.8 91.5 8.5
7.0 61.0 39.0
3、磷酸钾缓冲液（0.1mol/L）: 将两种母液混合后，用蒸馏水稀释至200ml。
母液A(0.2mol/L磷酸氢二钾溶液)：称取34.84gK2HPO4(M=174.18)溶解，稀释
至1000ml
母液B(0.2mol/L磷酸二氢钾溶液)：称取27.22gKH2PO4(M=136.09)溶解，稀释
至1000ml
PH 0.2mol/L磷酸氢二钾/ml 0.2mol/L磷酸二氢钾/ml
7.5 84 16
5.8 8.5 91.5
6.8 49.7 50.3
7.0 61.5 38.5
7.8 90.8 9.2
4、硼酸-硼砂缓冲液（0,.1mol/L硼酸根）：将两种母液混合后，用蒸馏水稀释
至200ml。
母液A(0.05mol/L硼砂溶液)：称取19.07gNa2B4O7.10H2O(M=381.43)溶解稀释
至1000ml,硼砂易失水，必须在带塞得瓶中保存。
母液B(0.2mol/L硼酸溶液)：称取12.37gH2BO3(M=61.84)溶解，稀释至1000ml
各种缓冲液的优缺点：
磷酸缓冲液：PH缓冲范围最广，缓冲稀释后PH变化小，但易与Ca、Mg及重金
属离子结合，抑制某些酶促反应，钾盐比钠盐在低温下易溶，但会与凝胶电泳中
的SDS反应生成难溶物。
Tris（三羟甲基氨基甲烷）缓冲液：在电泳中用的的多。PH在中性范围7.5~8.5
Tris碱性较强，可以与HCl配制从酸性到碱性大范围的PH缓冲液，Tris-HCl
缓冲液对生化反应干扰很小，不与金属离子发生沉淀。但其PH受浓度变化很大，
稀释10倍，PH变化大于0.1，还受温度影响，易吸收CO2，对某些PH电极发生
干扰作用，要选用与Tris溶液具有兼容性的电极。
有机酸缓冲液：PH范围为酸性，羧酸是天然的代谢产物，会对反应产生干扰
硼酸缓冲液：碱性范围内最常用的缓冲液，易与很多代谢产物反应，尤其是和糖
的羟基反应生成稳定的复合物使缓冲液受到干扰。
一些常用缓冲液添加剂：
EDTA:金属离子螯合剂
β-巯基乙醇：还原剂，保护蛋白的巯基不被氧化，24h内被氧化，其后可加速
蛋白质的失活。DDT（二硫苏糖醇，一般保存在-20℃）氧化后可形成稳定的分子
内二硫键，并不危及蛋白质的巯基，长期储存时可用DDT。
TritonX-100:非离子型去污剂，膜蛋白的提取过程中，使蛋白膜溶解。