2024年4月12日发(作者：是晴曦)
引物设计的原则
① 总原则：引物序列应具有高度的特异性，与非扩增区的同源性越低越好。
② 引物的长度：引物中与模板互补的序列应该为15~25个核苷酸长度，上下游引物
长度的差别不宜大于3bp。
③ 引物中四种碱基含量及分布：引物中G+C含量最好在40% ~ 60 % /40% ~ 75%
之间，四种碱基应尽可能随机分布，避免出现多聚嘌呤、多聚嘧啶和二核苷酸重复序列。
引物内部特别是引物末端不能有大于3bp的反向重复序列或自身互补序列，以避免形成发
夹结构。
④ 上下游引物之间的互补性：上下游引物之间特别是3´应避免出现互补序列。作为一
条经验性的规律，一条引物上不应该含有3个连续的与另一条引物互补的核苷酸。
⑤ 解链温度（Tm）：计算出来的两个引物的Tm值相差不能大于5℃。扩增产物的Tm
值与引物的Tm值相差不能大于10℃，以保证扩增产物在每个PCR循环可以有效的变性。
⑥ 引物3´末端的碱基：如果可能的话，每个引物的3´末端碱基应为G或C,然而并不
推荐使用3´端有……NNCG或NNGC序列的引物/一般PCR反应中，引物3´端的碱基最好
不选A。引物3´端应为保守氨基酸序列，即采用简并密码少的氨基酸如Met、Trp，且要
避免三联体密码第3个碱基的摆动位置位于引物的3´端。
⑦ 向引物的5´端添加限制性酶切位点、启动子或GC夹子等序列：
如果要向引物的5´端添加限制性酶切位点，引物应当超出限制性内切酶识别位点至少
3个碱基。另5´端应再加2～4个无关碱基（保护碱基），以确保产物的酶切效果。/ 5´端
最多可加10个碱基而对PCR反应无影响。
⑧ 当针对CDNA模板设计引物时，上游和下游引物最好结合到不同外显子的区域，
这样很容易把来源于CDNA的的扩增产物和来源于污染的基因组DNA的扩增产物区分
开。
酶切位点的选择：应选择载体上有而目标基因内无的酶切位点，两酶切位点在载体上
的距离最好大于6bp。New England Biolabs公司产品目录含各种限制性内切酶的识别顺
序及切割效率的信息。
【附录】
有几个公式可以用来计算寡核苷酸引物与其靶序列形成的杂合分子的熔解温度。
1.“Wallace规律”可用来计算长为15~20个碱基的引物在高离子强度的溶液中（如
1mol/L Nacl）形成完全互补配对时的熔解温度
Tm=2（A+T）+4(G+C)
2.“Baldino算法”能够合理地预测一条长度为14~70个碱基的引物在小于或等于
0.4mol/L的阳离子溶液中的熔解温度
Tm=81.5℃+16.6（lg[K
+
]）+0.41(%[G+C])-(675/n)
2024年4月12日发(作者：是晴曦)
引物设计的原则
① 总原则：引物序列应具有高度的特异性，与非扩增区的同源性越低越好。
② 引物的长度：引物中与模板互补的序列应该为15~25个核苷酸长度，上下游引物
长度的差别不宜大于3bp。
③ 引物中四种碱基含量及分布：引物中G+C含量最好在40% ~ 60 % /40% ~ 75%
之间，四种碱基应尽可能随机分布，避免出现多聚嘌呤、多聚嘧啶和二核苷酸重复序列。
引物内部特别是引物末端不能有大于3bp的反向重复序列或自身互补序列，以避免形成发
夹结构。
④ 上下游引物之间的互补性：上下游引物之间特别是3´应避免出现互补序列。作为一
条经验性的规律，一条引物上不应该含有3个连续的与另一条引物互补的核苷酸。
⑤ 解链温度（Tm）：计算出来的两个引物的Tm值相差不能大于5℃。扩增产物的Tm
值与引物的Tm值相差不能大于10℃，以保证扩增产物在每个PCR循环可以有效的变性。
⑥ 引物3´末端的碱基：如果可能的话，每个引物的3´末端碱基应为G或C,然而并不
推荐使用3´端有……NNCG或NNGC序列的引物/一般PCR反应中，引物3´端的碱基最好
不选A。引物3´端应为保守氨基酸序列，即采用简并密码少的氨基酸如Met、Trp，且要
避免三联体密码第3个碱基的摆动位置位于引物的3´端。
⑦ 向引物的5´端添加限制性酶切位点、启动子或GC夹子等序列：
如果要向引物的5´端添加限制性酶切位点，引物应当超出限制性内切酶识别位点至少
3个碱基。另5´端应再加2～4个无关碱基（保护碱基），以确保产物的酶切效果。/ 5´端
最多可加10个碱基而对PCR反应无影响。
⑧ 当针对CDNA模板设计引物时，上游和下游引物最好结合到不同外显子的区域，
这样很容易把来源于CDNA的的扩增产物和来源于污染的基因组DNA的扩增产物区分
开。
酶切位点的选择：应选择载体上有而目标基因内无的酶切位点，两酶切位点在载体上
的距离最好大于6bp。New England Biolabs公司产品目录含各种限制性内切酶的识别顺
序及切割效率的信息。
【附录】
有几个公式可以用来计算寡核苷酸引物与其靶序列形成的杂合分子的熔解温度。
1.“Wallace规律”可用来计算长为15~20个碱基的引物在高离子强度的溶液中（如
1mol/L Nacl）形成完全互补配对时的熔解温度
Tm=2（A+T）+4(G+C)
2.“Baldino算法”能够合理地预测一条长度为14~70个碱基的引物在小于或等于
0.4mol/L的阳离子溶液中的熔解温度
Tm=81.5℃+16.6（lg[K
+
]）+0.41(%[G+C])-(675/n)