2024年4月10日发(作者：邹艳蕙)
V
O
l.18
N
O
.1
第
18
卷第
1
期生 物 学 杂 志
2002
年
2
月
JOURNALOFBIOLOGYFeb,2002
文章编号
:1008
—
9632
(
2002
)
01
—
0015
—
04
人类
GABARAPL2
基因的亚细胞定位
陈 政
1
,
张坚萱
2
,
辛玉蓉
2
,
蒋 滢
1
(
1
1苏州大学生命科学院生化室
,
苏州
215006;2
1复旦大学遗传所
,
上海
200433
)
Ξ
摘 要
:
为了对
GABARAPL2
(
GABA
A
受体相关蛋白相似蛋白
2
)
基因的功能进行初步分析
,
首先通过同源
比较的方法将序列与其同源物进行比较
,
发现
GABARAPL2
的氨基酸序列与
GABARAP
(
GABA
A
受体相关
蛋白
)
高度同源
,
而
GABARAP
已证实通过结合细胞骨架的微管蛋白
,
使
GABA
A
受体聚集、定位在细胞膜
上。本文采用
PCR
法从人脑组织的
cDNA
文库中扩增出
GABARAPL2
的
cDNA,
克隆至
T
质粒载体中进行
测序验证
,
然后以此为模板
,
引物中引入酶切位点再次
PCR,
扩增出
GABARAPL2
的开放阅读框
,
并将其插
入到加强型绿色荧光蛋白融合表达载体
EGFP
中
,
将绿色荧光蛋白标记的
GABARAPL2
和
GABARAP
分别
转染
HLF
细胞株。结果两种蛋白的分布情况基本一致
,
在细胞质内和核内均有分布
,
而且核内的分布较胞
质为多。结构功能域分析表明
,GABARAPL2
含有蛋白激酶
C
磷酸化位点和酪氨酸激酶磷酸化位点
,
可能
通过磷酸化参与细胞骨架的变化。结论
GABARAPL2
和
GABARAP
不仅在胞质中作为受体相关蛋白协助
受体的聚集、定位
,
还参与体内许多其它重要的生理过程。
关键词
:GABARAPL2;
同源比较
;
结构域
;GFP
融合蛋白
;
细胞学定位
中图分类号
:Q343
・
1
文献标识码
:A
γ
-
氨基丁酸
(
GABA
)
在脑组织中广泛存在
,
它具有
神经递质、神经分化剂、代谢中间产物等多项功能。作为
中枢神经系统的抑制性神经递质
,GABA
具有镇痛、抗惊
[1]
厥、调节心血管系统等功能
,
还可以作为一种营养剂
促进神经元轴突的生长、突触的形成以及一些特殊蛋白
的合成
,
并可诱导
GABA
受体不同亚型的发育
[2]
。
GA
2
BA
受体可分为三型
,
两种配体门控离子通道型受体
GABA
A
和
GABA
C
受体
,
此型受体激活后使
Cl
-
通道开
放
;
另一种是
G
蛋白偶联受体
GABA
B
受体
,
受体激活后
通过
G
蛋白和
cAMP
与
K
+
和
Ca
2+
通道相联系。
GABA
A
受体是分布较为广泛的一种
,
由几种不同的亚基
α
组成
,
每种亚基又可分成不同的亚型
(
1-6
β
,1-4
γ
,1-
[3]
γ
亚基有三种亚型
γ
3
δ
,
ρ
,1-2
)
。
,1
γ
,2
γ
,3,
其氨基酸
[4]
序列高度同源
(
一致性达
70
—
80%
)
。最近有实验证
明
,GABA
A
受体
γ
2
亚基的细胞内环结构能与一种
GABA
A
受体相关蛋白
GABARAP
(
GABA
A
-receptor-
associatedprotein
)
结合
,
而
GABARAP
则通过结合细胞
骨架的微管蛋白
,
使
GABA
A
受体聚集、定位在细胞膜
上
[5]
。由于
γ
亚基的三个亚型高度同源
,
推测可能存在
其它的
GABA
A
受体相关蛋白与
γ
1
或
γ
3
相结合。本室
克隆了一种人类
GABA
A
受体相关蛋白相似蛋白
2
(
GABARAPL2,GABA
A
-receptor-associatedprotein
like2
)
基因。为了初步探讨该基因的功能
,
本文进行了
它的同源性比较和结构功能域分析
,
并将其蛋白进行了
细胞学定位。
1
材料和方法
1
1
1
材料
1
1
1
1
1
载体、宿主菌、细胞株和文库
:pGEM-T
质粒载
体购自
mega
公司
;EGFP-C1,EGFP-N1
质粒载体购
Ξ
α
为本室保存
;
肝癌自
CLONTECH
公司
;
大肠杆菌
DH5
细胞株
HLF
由中科院上海细胞所提供
;
人脑组织质粒
SuperScript
TM
cDNA
文库为
GIBCOBRL
公司产品。
1
1
1
1
2
试剂
:
各种限制性内切酶为
Biolab
公司产品
,T4
DNA
酶为
Promega
公司产品。其它常用试剂参照分子
克隆实验指南配制。
PCR
引物由上海生工生物工程有
限公司合成。
1
1
1
1
3
试剂盒
:PCR
产物纯化试剂盒及质粒抽提试剂
盒
:QIAGEN
公司。
DNA
自动测序试剂盒
:PE
公司
BigDyeTerminatorCycleSequencingReadyReaction
。脂
质体转染试剂盒
:LifeTechnology
公司。
1
1
1
1
4
主要仪器设备
:PCR
扩增仪
:MJ-Research
公司
PTC
—
200
型。
AB1377
型全自动
DNA
测序仪。
PE
公
司。
Leica
共聚焦系统
:LeicaMicroscopyandScientific
InstrumentsGroup
。
1
1
2
方法
1
1
2
1
1
PCR
扩增
:
根据
GABARAPL2
开放阅读框附近
序列设计
PCR
扩增引物
A:5
′—
CGTCGTTGCTGT
(
正向
)
;B:5
′
TGTGCTCGGTG-3
′
-GGCTGGCTA
(
反向
)
。以人脑组织
cD
2
TTTACAAGATACAC-3
′
NA
为模板进行
PCR
扩增得到
DNA
片段
AB
。
PCR
扩
μ
增反应体系
:cDNA
模板
1
1
0l,25pM
引物
A
和
B
各
μμμ
1
1
0l,10xBuffer5.0l,20mMdNTP1.0l,25mMMg
2
μμμ
Cl
2
1.5l,Taq
酶
(
5u/
μ
l
)
0.4l,
加
ddH
2
O
补充至
50l.
PCR
扩增反应条件
:94
℃预变性
3
分钟
;93
℃
1
分钟
,
60
℃
1
分钟
,72
℃
1
分钟共
35
个循环
;72
℃延伸
10
分钟。
1
1
2
1
2
PCR
产物的克隆及序列测定
:
将
DNA
片段
AB
回收纯化后与
pGEM-T
载体连接
,
转化大肠杆菌
α
,
用
α
互补作用进行重组克隆的筛选。扩增重组克
DH5
收稿日期
:2001
—
10
—
24
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隆
,
用
QIAGEN
的
DNA
纯化系统提取重组质粒
,
然后采
用
AB1377
全自动测序仪进行序列分析。
1
1
2
1
3
推导蛋白质的生化性质分析预测
:
利用生物学软
件对
GABARAPL2
推导蛋白的氨基酸序列进行分子量、
等电点、蛋白质二级结构、可能的修饰位点及氨基酸疏水
性等方面的分析预测。
1
1
2
1
4
重组表达载体的制备
:
引入
EooR
Ⅰ和
Sal
Ⅰ酶
切位点
,
设计将
GABARAPL2
读框插入
EGFP-N1
的引
物
:LN1:5
′
CCCGAATTCCCATGAAGTGGATGT
(
正向
)
和
LN2:5
′
TCAAG-3
′
-TATGTCGACCAG
(
反向
)
;
将
GABARA
2
AAGCCAAAAGTGTTCTC-3
′
PL2
插入
EGFP-C1
的引物
:LC1:5
′
-CCCGAATTC
(
正向
)
和
LC2:5
′
CATGAAGTGGATGTTCAAG-3
′
-TATGTCGACCCTCAGAAGCCAAAAGTG-3
′
(
反向
)
。引入
Xho
Ⅰ和
BamH
Ⅰ酶切位点
,
设计将
GABARAP
插入
EGFP-C1
和
EGFP-N1
的引物
:E1:
5
′
-GGTCTCGAGGGATGAAGTTCGTGTACA-
(
正向
)
;E2:5
′
3
′
-TTTGGATCCAACAGACCGTAG
(
反向
)
。以插入
GABARAPL2cDNAACACTTTC-3
′
的
pGEM-T
载体为模板
,LN1/LN2
为引物进行
PCR
扩增
,
扩增出的片段用
EooR
Ⅰ和
Sal
Ⅰ双酶切后插入表
达载体
EGFP-N1
中
;
以
LC1/LC2
为引物
PCR
扩增出
的片段用
EooR
Ⅰ和
Sal
Ⅰ双酶切后插入表达载体
EGFP
-C1
中。以人脑组织
cDNA
为模板
,E1/E2
为引物
PCR
扩增出的片段用
Xho
Ⅰ和
BamH
Ⅰ双酶切后插入表达载
体
EGFP-C1
和
EGFP-N1
中。将重组质粒转化大肠
α
,
筛选出含目的片段的重组子的菌落
,
扩增后杆菌
DH5
提取质粒并再次测序验证。
1
1
2
1
5
重组载体转染
HLF
细胞
:
胰酶消化贴壁
HLF
细
胞
,
计数
10
6
细胞种于内置盖玻片的
60mm
平皿中
,
37
℃
,5%CO
2
下在培养箱中培养
24
小时。插入目的片
段的重组载体
GABARAPL2-EGFPN1,GABARAPL2
-EGFPC1,GABARAP-EGFPN1,GABARAP-EGF
2
PC1
及作为阴性对照的
EGFP-N1,EGFP-C1
用脂质
体转染法分别转染肝癌细胞株
HLF
细胞
,
转染方法参照
试剂盒内说明书。
1
1
2
1
6
共聚焦显微镜下观察转染的
HLF
细胞
:
转染后
36
小时从培养皿中取出载有转染好的贴壁
HLF
细胞的
盖玻片
,1
×
PBS
轻洗
,
置于共聚焦激光扫描显微镜载物
台上
,
在
510nm
激发光波长下观察。
2
结果
2
1
1
GABARAPL2
基因的克隆和鉴定
根据基因的序列设计引物
,
以人脑组织
cDNA
为模
板进行
PCR
扩增
,PCR
产物与预期大小一致。将该
PCR
产物纯化后直接克隆到
pGEM-T
载体中
,
经测序
验证序列正确
,
无错误碱基的掺入及缺失突变的发生。
2
1
2
推导蛋白质的同源性比较及功能域分析
GABARAPL2
的核酸序列含有典型加尾信号
AATAAA
及
polyA
尾
,
用
PCGENE
软件将其推导的氨
基酸序列与
GABARAPcDNA
编码的氨基酸序列进行同
源性比较发现
,
两者氨基酸水平的一致性则可达
57
1
3%
。通过
NCBI
中的同源蛋白检索
(
BLASTP:
/blastp/nr/
)
,
发现在不
同物种
,
如人、小鼠、大鼠、牛中
,
存在一个
GABA
A
受体
相关蛋白家族
(
Fig1
)
。
tiplealignmentofthededucedaminoacidsequenceofhomologsofGABARAPL2
GABARAPL2HUMAN
(
gb|AF087848
)
,GABARAPL2MOUSE
(
gb|AF190644
)
,GABARAPHUMAN
(
gb|AF161586
)
,GABARAP
MOUSE
(
gb|AF161587
)
,GABARAPRAT
(
gb|AF161588
)
,GABARAPL1HUMAN
(
gb|AF087847
)
,MAPLC3BOVIN
(
sp|
O41515
)
,MAPLC3RAT
(
gb|U05784
)
.Theconservedaminoacidresiduesarehighlighted.
GABARAPL2
基因编码的蛋白由
117
个氨基酸组
成
,
根据
PC-GENE
软件预测
,
其分子量为
13667
道尔
顿
,
等电点为
8
1
56
。具体氨基酸组成如下
:
5Ala
1Cys
2His
4Met
4Thr
6Arg
5Gln
9Ile
7Phe
2Trp
1Asn
9Glu
7Leu
5Pro
5Tyr
8Asp
5Gly
12Lys
9Ser
11Val
对
GABARAPL2
和
GABARAP
蛋白进行疏水性和
碱性氨基酸分布情况分析后发现
,
这两种蛋白的疏水性
16
情况和碱性氨基酸分布情况十分相似
(
Fig2
)
,
尤其是在
氨基端富含碱性氨基酸。由于蛋白质之间的相互作用取
决于它们的结构和生化特征
,
这种相似情况提示了其功
能的相似性。另外
,
根据
PROSITE
程序
(
www.
/prosite
)
分析
,GABARAPL2
编码的蛋白质含
有
2
个蛋白激酶
C
磷酸化位点
(
18
SAK
20
,
72
SEK
74
)
和
1
个酪氨酸激酶磷酸化位点
(
99
KDEDGFLY
106
)
。
2
1
3
重组蛋白的细胞学定位
:
为检测
GABARAPL2
蛋
白的细胞内分布
,
用加强型绿色荧光蛋白
(
EGFP,en
2
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hancedgreenfluorescentprotein
)
标记
GABARAPL2
。在
生物发光的水母中
,
当能量从
Ca
2+
激活的水母发光蛋白
转移到绿色荧光蛋白
GFP
时
,
水母就能发光。因此
,
当
GFP
在真核或原核细胞中表达时
,
如受到蓝光或紫外光
的照射
,
会产生一种明亮的绿色荧光。目前
,GFP
作为
一种新的报告系统
,
在基因表达和蛋白定位的研究中得
到了广泛的应用
[6]
。当
EGFP
蛋白在融合蛋白的氨基
端而插入目的蛋白的多克隆位点在羧基端时
,
该载体为
EGFP-C1;
当
EGFP
蛋白在融合蛋白的羧基端而插入
目的蛋白的多克隆位点在氨基端时
,
该载体为
EGFP-
N1
。构建
GABARAPL2-EGFPN1,GABARAPL2-
EGFPC1
重组子
,
并构建作为阳性对照的
GABARAP-
EGFPN1
和
GABARAP-EGFPC1
重组子
,
将上述两组
重组子及作为阴性对照的未融合任何蛋白的
EGFPN1
和
EGFPC1
分别转染
HLF
细胞株。转染
36
小时后在共
聚焦显微镜下观察发现
,
无论
EGFP
标记在
GABARA
2
PL2
和
GABARAP
蛋白的羧基端还是氨基端
,
两种蛋白
在
HLF
细胞中的分布都是一致的
,
即除了在细胞质中均
匀分布以外
,
细胞核内也有分布
,
而且
,
核内分布的量较
多
(
图
3
)
。
Fig.2ThehydrophobicandbasicfeatureofGABARAPL2GABARAPandMAP1lc3.
ThehydrophobicitycurvesanalyzedbySOAPprogram
(
PC/Gene,Geneva,Switzerland
)
2
isscaleissettopresentthecompleterange
(
-50to50
)
ofpossiblehydro
2
rophobicdomainsareabove
icfeatureofproteinsanalyzedbyPRESIDUEprogram
(
PC/
Gene,Geneva,Switzerland
)
isscaleisset
topresentthecompleterange
(
0to1
)
ofproportionsforsequence.
来的研究表明
,
受体相关蛋白在受体的突触后聚集、定位
方面起着很重要的作用
,
通过受体相关蛋白
,
使受体与细
Fig.3Confocallaser-scanningmicroscopyofHLFcelltransfected
withEGFPfusioncDNA
EGFPexcitation/emissionwasachievedwithafilterset
(
488/510nm
)
forfluoresceindetection.
(
a
)
EGFP-C1;
(
b
)
EGFP-C1taggedGABARAP;
(
c
)
EGFP-C1tagged
GABARAPL2;
(
d
)
EGFP-N1;
(
e
)
EGFP-N1tagged
GABARAP;
(
f
)
EGFP-N1taggedGABARAPL2
3
讨论
神经元的突触后位点聚集了许多受体
,
它们将其对
应的突触前膜释放的神经递质信号传递到细胞内。近年
胞骨架连接起来以定位在膜上。某些抑制性神经递质受
体
,
如谷氨酸、甘氨酸受体
,
有关其突触后定位的机制已
经研究得较为深入
[7]
,
但是
GABA
受体的突触后定位机
制仍然不太清楚。最近
,Wang
等人
[5]
发现
,GABARAP
推导蛋白的氨基酸序列与微管结合蛋白
(
microtubule-
associatedproteins,MAPs
)
MAP1A/1B
的轻链
3
(
LC3
)
同
源
,
它既可以和微管蛋白结合
,
也可以和
GABA
A
受体
γ
2
亚基的细胞内环结构相结合。
GABA
A
受体是由不同的
亚基所组成
,
而不同的亚基又有许多不同的亚型。研究
证明
,
体外重组的由不同亚基和亚型组成的
GABA
受
体
,
其功能各不相同
[8,9]
。因此可以推测
,
与特异的
MAPs
相结合是细胞骨架定位抑制性离子通道受体的一
种普遍的方式
,
不同的受体相关蛋白可能直接或间接地
参与了
GABA
受体的定位
[10]
。
GABARAPL2cDNA
序列包含一个长
354bp
的开放
阅读框
,
编码一个含
117
个氨基酸残基的蛋白。氨基酸
同源性比较发现
,
其推导蛋白与
GABARAP
和微管结合
蛋白
MAP1A/1B
的
LC3
同源
,
而
MAPs
调控着细胞骨
架的动力学变化
[11]
。结构分析发现
,GABARAPL2
蛋白
带正电荷
,
氨基端富含碱性氨基酸。
MAPs
多肽链由两
个区段组成
,
一个区段是微管蛋白结合区
,
另一区段以横
17
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桥方式与其他微管纤维连接。
GABARAPL2
可能通过
氨基端的碱性区域与微管蛋白的酸性结合区相结合。另
外
,
尽管
GABARAPL2
序列并不含有
MAPs
的微管蛋白
结合基序
(
KKEE,KKEI/V
)
[12]
,
但根据
GORI
预测
,
GABARAPL2
氨基端的
22
个氨基酸残基可以折叠成一
个
α
螺旋
[13]
,
通过
α
螺旋间的相互作用
,GABARAPL2
也可具有结合微管蛋白的能力。目前认为
,
细胞骨架系
统作为一种信息传递途径
,
可能从细胞膜
,
通过细胞质到
核
(
或者相反
)
传导某些信息
,
影响到一系列有关细胞分
化或分裂事件的起始
[14]
。根据分析
,GABARAPL2
含有
蛋白激酶
V
磷酸化位点和酪氨酸激酶磷酸化位点
,
由于
MAPs
的磷酸化可以调控微管蛋白的变化
,
磷酸化的
GABARAPL2
可能作为
GABA
信号传递通路中的一个
中间分子参与细胞骨架的变化
,
从而影响
GABA
A
受体
的功能。
GABARAPL2
在心
,
脑
,
睾丸
,
前列腺等组织均有不
同程度的表达
,
而
GABARAP
除了在脑中
,
在许多其它
组织中也高量表达
[5]
。尽管
GABARAPL2
、
GABARAP
与微管结合蛋白
MAP1A
和
1B
的轻链
3
同源
,
但是轻链
3
只在脑组织中表达。
Wang
等人
[5]
用免疫学方法证明
,
GABARAP
在神经元的胞体和突起中均有分布
,
但
GABARAP
在其他细胞中的分布情况未见报道。本研究
中将
GABARAPL2
和
GABARAP
用绿色荧光蛋白标记
后转染
HLF
细胞株
,
结果显示
,
它们的分布情况基本一
致
,
胞质内和核内均有分布
,
而且在核内的分布较胞质为
多。因此
,
可以认为
,GABARAPL2
和
GABARAP
不仅
在胞质中作为受体相关蛋白协助受体的聚集、定位
,
还参
与体内许多其它重要的生理过程
,
它们在核内的分布情
况与其功能的确切关系尚需进一步的深入研究。
参考文献
:
[1]ceptors:arecellulardifferencesreflected
infunction?
BrainResBrainResRev
,1989,14
(
3
)
:203-25.
[2]BelhageB,HansenGH,ElsterL,sofgamma
-aminobutyricacid
(
GABA
)
onsynaptogenesisandsynapticfunc
2
tion.
PerspectDevNeurobiol.
1998;5
(
2
)
:235-46.
[3]WhitingPJ,BonnertTP,larand
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family.
AnnNYAcddSci.
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[4]MacdonaldRL,eceptorchannels.
Annu
RevNeurosci.
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[5]WangH,BedfordFK,
(
A
)
-receptor-
associatedproteinlinksGABA
(
A
)
receptorsandthecytoskeleton.
Nature.
1999,397
(
6714
)
:69-72.
[6]ChalfieM,TuY,luorescentproteinas
amarkerforgeneexpression.
Science.
1994,263
(
5148
)
:802-5.
[7]ingglycinereceptorsatsynapses.
Science.
1998,282
(
5392
)
:1277-9.
[8]SieghartW,FuchsK,ureandsubunitcom
2
positionofGABA
(
A
)
receptors.
NeurochemInt.
1999,34
(
5
)
:
379-85.
[9]FisherJL,channelpropertiesofrecombi
2
nantGABAAreceptorscontaininggamma2ordeltasubtypesex
2
pressedwithalpha1andbeta3subtypesinmouseL929cells.
J
Physiol
(
Lond
)
.
1997,505
(
Pt2
)
:283-97.
[10]PassafaroM,ogenesis:TheMAPlocationof
GABAreceptors.
CurrBiol.
1999,9
(
7
)
:R261-3.
[11]MannSS,calizationanddevelopmen
2
talexpressionoflightchain3:acommonsubunitofmicrotubule
-associatedprotein1A
(
MAP1A
)
andMAP1B,
JNeurosciRes.
1996,43
(
5
)
:535-44.
[12]NobleM,LewisSA,rotubulebindingofmi
2
crotubule-associatedproteinMAP1Bcontainsarepeatedse
2
quencemotifunrelatedtothatofMAP2andtau.
JCellBiol.
1989,109
(
6Pt2
)
:3367-76.
[13]GarnierJ,OsguthorpeDJ,isoftheaccuracy
andimplicationssimplemethodsforpredictingthesecondary
structureofglobularproteins.
JMolBiol.
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(
1
)
:97-
120.
[14]
薛绍白
,
等1细胞生物学
[M]
1北京
:
北京师范大学出版社
,
1998
1
SubcellularlocalizationofGABARAPL2
CHENZheng
1
,XINYu-rong
2
,ZHANGJian-xuan
2
,JIANGYing
1
(
ofLifeScience,SuzhouUniversity
,Suzhou215006,China;
uteofGenetics,FudanUniversity,Shanghai,China200433
)
Abstract:InordertostudythefunctionofhumanGABARAPL2,homologouscomparisonwasdonebymultiplealign
2
edthatGABARAPL2washighlyhomologytoGABARAP
(
GABA
A
-receptor-asso
2
ciatedprotein
)
,whichwasrecentlyreportedtomediatethelocalizationofGABA
A
receptortocytoskeletonbybindingto
bothGABA
A
PL2waspredicatedtocontaintwoproteinkinaseCphosphorylationsites
orylatedGABARAPL2maybeinvolvedinthecytoskeletonchanges
tructfusionvector,thecDNAofGABARAPL2was
amplifiedbyPCR,idatethesubcellulardistrbu
2
tionofGABARAPL2andGABARAP,theiropenreadingframewereamplifieddyPCRandthensubclonedintoexpression
erwheretheproteinswerefusedto,C-terminusorN-terminusofEGFP,brightgreenfluores
2
centsignalsofthetaggedproteinscouldbevisualizedbyconfocallaser-scanningmicroscopewhentheywereexpressedin
ultsshowedthatGABARAPandGABARAPL2weremostlydistributedinnuclear,andalittleincyto
2
wfindingindicatedthatGABARAPL2mightexertotherfunctionsexceptlocalizingGABA
A
re
2
ceptorincellularmembranebylinkingthereceptortomicrotubules,whichmaybealsotrueforGABARAP.
Keywords:GABA
A
-receptor-associatedprotein;homology;domain;GFPfusionprotein;subcellularlocalization.
18
2024年4月10日发(作者：邹艳蕙)
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18
卷第
1
期生 物 学 杂 志
2002
年
2
月
JOURNALOFBIOLOGYFeb,2002
文章编号
:1008
—
9632
(
2002
)
01
—
0015
—
04
人类
GABARAPL2
基因的亚细胞定位
陈 政
1
,
张坚萱
2
,
辛玉蓉
2
,
蒋 滢
1
(
1
1苏州大学生命科学院生化室
,
苏州
215006;2
1复旦大学遗传所
,
上海
200433
)
Ξ
摘 要
:
为了对
GABARAPL2
(
GABA
A
受体相关蛋白相似蛋白
2
)
基因的功能进行初步分析
,
首先通过同源
比较的方法将序列与其同源物进行比较
,
发现
GABARAPL2
的氨基酸序列与
GABARAP
(
GABA
A
受体相关
蛋白
)
高度同源
,
而
GABARAP
已证实通过结合细胞骨架的微管蛋白
,
使
GABA
A
受体聚集、定位在细胞膜
上。本文采用
PCR
法从人脑组织的
cDNA
文库中扩增出
GABARAPL2
的
cDNA,
克隆至
T
质粒载体中进行
测序验证
,
然后以此为模板
,
引物中引入酶切位点再次
PCR,
扩增出
GABARAPL2
的开放阅读框
,
并将其插
入到加强型绿色荧光蛋白融合表达载体
EGFP
中
,
将绿色荧光蛋白标记的
GABARAPL2
和
GABARAP
分别
转染
HLF
细胞株。结果两种蛋白的分布情况基本一致
,
在细胞质内和核内均有分布
,
而且核内的分布较胞
质为多。结构功能域分析表明
,GABARAPL2
含有蛋白激酶
C
磷酸化位点和酪氨酸激酶磷酸化位点
,
可能
通过磷酸化参与细胞骨架的变化。结论
GABARAPL2
和
GABARAP
不仅在胞质中作为受体相关蛋白协助
受体的聚集、定位
,
还参与体内许多其它重要的生理过程。
关键词
:GABARAPL2;
同源比较
;
结构域
;GFP
融合蛋白
;
细胞学定位
中图分类号
:Q343
・
1
文献标识码
:A
γ
-
氨基丁酸
(
GABA
)
在脑组织中广泛存在
,
它具有
神经递质、神经分化剂、代谢中间产物等多项功能。作为
中枢神经系统的抑制性神经递质
,GABA
具有镇痛、抗惊
[1]
厥、调节心血管系统等功能
,
还可以作为一种营养剂
促进神经元轴突的生长、突触的形成以及一些特殊蛋白
的合成
,
并可诱导
GABA
受体不同亚型的发育
[2]
。
GA
2
BA
受体可分为三型
,
两种配体门控离子通道型受体
GABA
A
和
GABA
C
受体
,
此型受体激活后使
Cl
-
通道开
放
;
另一种是
G
蛋白偶联受体
GABA
B
受体
,
受体激活后
通过
G
蛋白和
cAMP
与
K
+
和
Ca
2+
通道相联系。
GABA
A
受体是分布较为广泛的一种
,
由几种不同的亚基
α
组成
,
每种亚基又可分成不同的亚型
(
1-6
β
,1-4
γ
,1-
[3]
γ
亚基有三种亚型
γ
3
δ
,
ρ
,1-2
)
。
,1
γ
,2
γ
,3,
其氨基酸
[4]
序列高度同源
(
一致性达
70
—
80%
)
。最近有实验证
明
,GABA
A
受体
γ
2
亚基的细胞内环结构能与一种
GABA
A
受体相关蛋白
GABARAP
(
GABA
A
-receptor-
associatedprotein
)
结合
,
而
GABARAP
则通过结合细胞
骨架的微管蛋白
,
使
GABA
A
受体聚集、定位在细胞膜
上
[5]
。由于
γ
亚基的三个亚型高度同源
,
推测可能存在
其它的
GABA
A
受体相关蛋白与
γ
1
或
γ
3
相结合。本室
克隆了一种人类
GABA
A
受体相关蛋白相似蛋白
2
(
GABARAPL2,GABA
A
-receptor-associatedprotein
like2
)
基因。为了初步探讨该基因的功能
,
本文进行了
它的同源性比较和结构功能域分析
,
并将其蛋白进行了
细胞学定位。
1
材料和方法
1
1
1
材料
1
1
1
1
1
载体、宿主菌、细胞株和文库
:pGEM-T
质粒载
体购自
mega
公司
;EGFP-C1,EGFP-N1
质粒载体购
Ξ
α
为本室保存
;
肝癌自
CLONTECH
公司
;
大肠杆菌
DH5
细胞株
HLF
由中科院上海细胞所提供
;
人脑组织质粒
SuperScript
TM
cDNA
文库为
GIBCOBRL
公司产品。
1
1
1
1
2
试剂
:
各种限制性内切酶为
Biolab
公司产品
,T4
DNA
酶为
Promega
公司产品。其它常用试剂参照分子
克隆实验指南配制。
PCR
引物由上海生工生物工程有
限公司合成。
1
1
1
1
3
试剂盒
:PCR
产物纯化试剂盒及质粒抽提试剂
盒
:QIAGEN
公司。
DNA
自动测序试剂盒
:PE
公司
BigDyeTerminatorCycleSequencingReadyReaction
。脂
质体转染试剂盒
:LifeTechnology
公司。
1
1
1
1
4
主要仪器设备
:PCR
扩增仪
:MJ-Research
公司
PTC
—
200
型。
AB1377
型全自动
DNA
测序仪。
PE
公
司。
Leica
共聚焦系统
:LeicaMicroscopyandScientific
InstrumentsGroup
。
1
1
2
方法
1
1
2
1
1
PCR
扩增
:
根据
GABARAPL2
开放阅读框附近
序列设计
PCR
扩增引物
A:5
′—
CGTCGTTGCTGT
(
正向
)
;B:5
′
TGTGCTCGGTG-3
′
-GGCTGGCTA
(
反向
)
。以人脑组织
cD
2
TTTACAAGATACAC-3
′
NA
为模板进行
PCR
扩增得到
DNA
片段
AB
。
PCR
扩
μ
增反应体系
:cDNA
模板
1
1
0l,25pM
引物
A
和
B
各
μμμ
1
1
0l,10xBuffer5.0l,20mMdNTP1.0l,25mMMg
2
μμμ
Cl
2
1.5l,Taq
酶
(
5u/
μ
l
)
0.4l,
加
ddH
2
O
补充至
50l.
PCR
扩增反应条件
:94
℃预变性
3
分钟
;93
℃
1
分钟
,
60
℃
1
分钟
,72
℃
1
分钟共
35
个循环
;72
℃延伸
10
分钟。
1
1
2
1
2
PCR
产物的克隆及序列测定
:
将
DNA
片段
AB
回收纯化后与
pGEM-T
载体连接
,
转化大肠杆菌
α
,
用
α
互补作用进行重组克隆的筛选。扩增重组克
DH5
收稿日期
:2001
—
10
—
24
15
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隆
,
用
QIAGEN
的
DNA
纯化系统提取重组质粒
,
然后采
用
AB1377
全自动测序仪进行序列分析。
1
1
2
1
3
推导蛋白质的生化性质分析预测
:
利用生物学软
件对
GABARAPL2
推导蛋白的氨基酸序列进行分子量、
等电点、蛋白质二级结构、可能的修饰位点及氨基酸疏水
性等方面的分析预测。
1
1
2
1
4
重组表达载体的制备
:
引入
EooR
Ⅰ和
Sal
Ⅰ酶
切位点
,
设计将
GABARAPL2
读框插入
EGFP-N1
的引
物
:LN1:5
′
CCCGAATTCCCATGAAGTGGATGT
(
正向
)
和
LN2:5
′
TCAAG-3
′
-TATGTCGACCAG
(
反向
)
;
将
GABARA
2
AAGCCAAAAGTGTTCTC-3
′
PL2
插入
EGFP-C1
的引物
:LC1:5
′
-CCCGAATTC
(
正向
)
和
LC2:5
′
CATGAAGTGGATGTTCAAG-3
′
-TATGTCGACCCTCAGAAGCCAAAAGTG-3
′
(
反向
)
。引入
Xho
Ⅰ和
BamH
Ⅰ酶切位点
,
设计将
GABARAP
插入
EGFP-C1
和
EGFP-N1
的引物
:E1:
5
′
-GGTCTCGAGGGATGAAGTTCGTGTACA-
(
正向
)
;E2:5
′
3
′
-TTTGGATCCAACAGACCGTAG
(
反向
)
。以插入
GABARAPL2cDNAACACTTTC-3
′
的
pGEM-T
载体为模板
,LN1/LN2
为引物进行
PCR
扩增
,
扩增出的片段用
EooR
Ⅰ和
Sal
Ⅰ双酶切后插入表
达载体
EGFP-N1
中
;
以
LC1/LC2
为引物
PCR
扩增出
的片段用
EooR
Ⅰ和
Sal
Ⅰ双酶切后插入表达载体
EGFP
-C1
中。以人脑组织
cDNA
为模板
,E1/E2
为引物
PCR
扩增出的片段用
Xho
Ⅰ和
BamH
Ⅰ双酶切后插入表达载
体
EGFP-C1
和
EGFP-N1
中。将重组质粒转化大肠
α
,
筛选出含目的片段的重组子的菌落
,
扩增后杆菌
DH5
提取质粒并再次测序验证。
1
1
2
1
5
重组载体转染
HLF
细胞
:
胰酶消化贴壁
HLF
细
胞
,
计数
10
6
细胞种于内置盖玻片的
60mm
平皿中
,
37
℃
,5%CO
2
下在培养箱中培养
24
小时。插入目的片
段的重组载体
GABARAPL2-EGFPN1,GABARAPL2
-EGFPC1,GABARAP-EGFPN1,GABARAP-EGF
2
PC1
及作为阴性对照的
EGFP-N1,EGFP-C1
用脂质
体转染法分别转染肝癌细胞株
HLF
细胞
,
转染方法参照
试剂盒内说明书。
1
1
2
1
6
共聚焦显微镜下观察转染的
HLF
细胞
:
转染后
36
小时从培养皿中取出载有转染好的贴壁
HLF
细胞的
盖玻片
,1
×
PBS
轻洗
,
置于共聚焦激光扫描显微镜载物
台上
,
在
510nm
激发光波长下观察。
2
结果
2
1
1
GABARAPL2
基因的克隆和鉴定
根据基因的序列设计引物
,
以人脑组织
cDNA
为模
板进行
PCR
扩增
,PCR
产物与预期大小一致。将该
PCR
产物纯化后直接克隆到
pGEM-T
载体中
,
经测序
验证序列正确
,
无错误碱基的掺入及缺失突变的发生。
2
1
2
推导蛋白质的同源性比较及功能域分析
GABARAPL2
的核酸序列含有典型加尾信号
AATAAA
及
polyA
尾
,
用
PCGENE
软件将其推导的氨
基酸序列与
GABARAPcDNA
编码的氨基酸序列进行同
源性比较发现
,
两者氨基酸水平的一致性则可达
57
1
3%
。通过
NCBI
中的同源蛋白检索
(
BLASTP:
/blastp/nr/
)
,
发现在不
同物种
,
如人、小鼠、大鼠、牛中
,
存在一个
GABA
A
受体
相关蛋白家族
(
Fig1
)
。
tiplealignmentofthededucedaminoacidsequenceofhomologsofGABARAPL2
GABARAPL2HUMAN
(
gb|AF087848
)
,GABARAPL2MOUSE
(
gb|AF190644
)
,GABARAPHUMAN
(
gb|AF161586
)
,GABARAP
MOUSE
(
gb|AF161587
)
,GABARAPRAT
(
gb|AF161588
)
,GABARAPL1HUMAN
(
gb|AF087847
)
,MAPLC3BOVIN
(
sp|
O41515
)
,MAPLC3RAT
(
gb|U05784
)
.Theconservedaminoacidresiduesarehighlighted.
GABARAPL2
基因编码的蛋白由
117
个氨基酸组
成
,
根据
PC-GENE
软件预测
,
其分子量为
13667
道尔
顿
,
等电点为
8
1
56
。具体氨基酸组成如下
:
5Ala
1Cys
2His
4Met
4Thr
6Arg
5Gln
9Ile
7Phe
2Trp
1Asn
9Glu
7Leu
5Pro
5Tyr
8Asp
5Gly
12Lys
9Ser
11Val
对
GABARAPL2
和
GABARAP
蛋白进行疏水性和
碱性氨基酸分布情况分析后发现
,
这两种蛋白的疏水性
16
情况和碱性氨基酸分布情况十分相似
(
Fig2
)
,
尤其是在
氨基端富含碱性氨基酸。由于蛋白质之间的相互作用取
决于它们的结构和生化特征
,
这种相似情况提示了其功
能的相似性。另外
,
根据
PROSITE
程序
(
www.
/prosite
)
分析
,GABARAPL2
编码的蛋白质含
有
2
个蛋白激酶
C
磷酸化位点
(
18
SAK
20
,
72
SEK
74
)
和
1
个酪氨酸激酶磷酸化位点
(
99
KDEDGFLY
106
)
。
2
1
3
重组蛋白的细胞学定位
:
为检测
GABARAPL2
蛋
白的细胞内分布
,
用加强型绿色荧光蛋白
(
EGFP,en
2
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年
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hancedgreenfluorescentprotein
)
标记
GABARAPL2
。在
生物发光的水母中
,
当能量从
Ca
2+
激活的水母发光蛋白
转移到绿色荧光蛋白
GFP
时
,
水母就能发光。因此
,
当
GFP
在真核或原核细胞中表达时
,
如受到蓝光或紫外光
的照射
,
会产生一种明亮的绿色荧光。目前
,GFP
作为
一种新的报告系统
,
在基因表达和蛋白定位的研究中得
到了广泛的应用
[6]
。当
EGFP
蛋白在融合蛋白的氨基
端而插入目的蛋白的多克隆位点在羧基端时
,
该载体为
EGFP-C1;
当
EGFP
蛋白在融合蛋白的羧基端而插入
目的蛋白的多克隆位点在氨基端时
,
该载体为
EGFP-
N1
。构建
GABARAPL2-EGFPN1,GABARAPL2-
EGFPC1
重组子
,
并构建作为阳性对照的
GABARAP-
EGFPN1
和
GABARAP-EGFPC1
重组子
,
将上述两组
重组子及作为阴性对照的未融合任何蛋白的
EGFPN1
和
EGFPC1
分别转染
HLF
细胞株。转染
36
小时后在共
聚焦显微镜下观察发现
,
无论
EGFP
标记在
GABARA
2
PL2
和
GABARAP
蛋白的羧基端还是氨基端
,
两种蛋白
在
HLF
细胞中的分布都是一致的
,
即除了在细胞质中均
匀分布以外
,
细胞核内也有分布
,
而且
,
核内分布的量较
多
(
图
3
)
。
Fig.2ThehydrophobicandbasicfeatureofGABARAPL2GABARAPandMAP1lc3.
ThehydrophobicitycurvesanalyzedbySOAPprogram
(
PC/Gene,Geneva,Switzerland
)
2
isscaleissettopresentthecompleterange
(
-50to50
)
ofpossiblehydro
2
rophobicdomainsareabove
icfeatureofproteinsanalyzedbyPRESIDUEprogram
(
PC/
Gene,Geneva,Switzerland
)
isscaleisset
topresentthecompleterange
(
0to1
)
ofproportionsforsequence.
来的研究表明
,
受体相关蛋白在受体的突触后聚集、定位
方面起着很重要的作用
,
通过受体相关蛋白
,
使受体与细
Fig.3Confocallaser-scanningmicroscopyofHLFcelltransfected
withEGFPfusioncDNA
EGFPexcitation/emissionwasachievedwithafilterset
(
488/510nm
)
forfluoresceindetection.
(
a
)
EGFP-C1;
(
b
)
EGFP-C1taggedGABARAP;
(
c
)
EGFP-C1tagged
GABARAPL2;
(
d
)
EGFP-N1;
(
e
)
EGFP-N1tagged
GABARAP;
(
f
)
EGFP-N1taggedGABARAPL2
3
讨论
神经元的突触后位点聚集了许多受体
,
它们将其对
应的突触前膜释放的神经递质信号传递到细胞内。近年
胞骨架连接起来以定位在膜上。某些抑制性神经递质受
体
,
如谷氨酸、甘氨酸受体
,
有关其突触后定位的机制已
经研究得较为深入
[7]
,
但是
GABA
受体的突触后定位机
制仍然不太清楚。最近
,Wang
等人
[5]
发现
,GABARAP
推导蛋白的氨基酸序列与微管结合蛋白
(
microtubule-
associatedproteins,MAPs
)
MAP1A/1B
的轻链
3
(
LC3
)
同
源
,
它既可以和微管蛋白结合
,
也可以和
GABA
A
受体
γ
2
亚基的细胞内环结构相结合。
GABA
A
受体是由不同的
亚基所组成
,
而不同的亚基又有许多不同的亚型。研究
证明
,
体外重组的由不同亚基和亚型组成的
GABA
受
体
,
其功能各不相同
[8,9]
。因此可以推测
,
与特异的
MAPs
相结合是细胞骨架定位抑制性离子通道受体的一
种普遍的方式
,
不同的受体相关蛋白可能直接或间接地
参与了
GABA
受体的定位
[10]
。
GABARAPL2cDNA
序列包含一个长
354bp
的开放
阅读框
,
编码一个含
117
个氨基酸残基的蛋白。氨基酸
同源性比较发现
,
其推导蛋白与
GABARAP
和微管结合
蛋白
MAP1A/1B
的
LC3
同源
,
而
MAPs
调控着细胞骨
架的动力学变化
[11]
。结构分析发现
,GABARAPL2
蛋白
带正电荷
,
氨基端富含碱性氨基酸。
MAPs
多肽链由两
个区段组成
,
一个区段是微管蛋白结合区
,
另一区段以横
17
V
O
l.18
N
O
.1
第
18
卷第
1
期生 物 学 杂 志
2002
年
2
月
JOURNALOFBIOLOGYFeb,2002
桥方式与其他微管纤维连接。
GABARAPL2
可能通过
氨基端的碱性区域与微管蛋白的酸性结合区相结合。另
外
,
尽管
GABARAPL2
序列并不含有
MAPs
的微管蛋白
结合基序
(
KKEE,KKEI/V
)
[12]
,
但根据
GORI
预测
,
GABARAPL2
氨基端的
22
个氨基酸残基可以折叠成一
个
α
螺旋
[13]
,
通过
α
螺旋间的相互作用
,GABARAPL2
也可具有结合微管蛋白的能力。目前认为
,
细胞骨架系
统作为一种信息传递途径
,
可能从细胞膜
,
通过细胞质到
核
(
或者相反
)
传导某些信息
,
影响到一系列有关细胞分
化或分裂事件的起始
[14]
。根据分析
,GABARAPL2
含有
蛋白激酶
V
磷酸化位点和酪氨酸激酶磷酸化位点
,
由于
MAPs
的磷酸化可以调控微管蛋白的变化
,
磷酸化的
GABARAPL2
可能作为
GABA
信号传递通路中的一个
中间分子参与细胞骨架的变化
,
从而影响
GABA
A
受体
的功能。
GABARAPL2
在心
,
脑
,
睾丸
,
前列腺等组织均有不
同程度的表达
,
而
GABARAP
除了在脑中
,
在许多其它
组织中也高量表达
[5]
。尽管
GABARAPL2
、
GABARAP
与微管结合蛋白
MAP1A
和
1B
的轻链
3
同源
,
但是轻链
3
只在脑组织中表达。
Wang
等人
[5]
用免疫学方法证明
,
GABARAP
在神经元的胞体和突起中均有分布
,
但
GABARAP
在其他细胞中的分布情况未见报道。本研究
中将
GABARAPL2
和
GABARAP
用绿色荧光蛋白标记
后转染
HLF
细胞株
,
结果显示
,
它们的分布情况基本一
致
,
胞质内和核内均有分布
,
而且在核内的分布较胞质为
多。因此
,
可以认为
,GABARAPL2
和
GABARAP
不仅
在胞质中作为受体相关蛋白协助受体的聚集、定位
,
还参
与体内许多其它重要的生理过程
,
它们在核内的分布情
况与其功能的确切关系尚需进一步的深入研究。
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1
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1
,XINYu-rong
2
,ZHANGJian-xuan
2
,JIANGYing
1
(
ofLifeScience,SuzhouUniversity
,Suzhou215006,China;
uteofGenetics,FudanUniversity,Shanghai,China200433
)
Abstract:InordertostudythefunctionofhumanGABARAPL2,homologouscomparisonwasdonebymultiplealign
2
edthatGABARAPL2washighlyhomologytoGABARAP
(
GABA
A
-receptor-asso
2
ciatedprotein
)
,whichwasrecentlyreportedtomediatethelocalizationofGABA
A
receptortocytoskeletonbybindingto
bothGABA
A
PL2waspredicatedtocontaintwoproteinkinaseCphosphorylationsites
orylatedGABARAPL2maybeinvolvedinthecytoskeletonchanges
tructfusionvector,thecDNAofGABARAPL2was
amplifiedbyPCR,idatethesubcellulardistrbu
2
tionofGABARAPL2andGABARAP,theiropenreadingframewereamplifieddyPCRandthensubclonedintoexpression
erwheretheproteinswerefusedto,C-terminusorN-terminusofEGFP,brightgreenfluores
2
centsignalsofthetaggedproteinscouldbevisualizedbyconfocallaser-scanningmicroscopewhentheywereexpressedin
ultsshowedthatGABARAPandGABARAPL2weremostlydistributedinnuclear,andalittleincyto
2
wfindingindicatedthatGABARAPL2mightexertotherfunctionsexceptlocalizingGABA
A
re
2
ceptorincellularmembranebylinkingthereceptortomicrotubules,whichmaybealsotrueforGABARAP.
Keywords:GABA
A
-receptor-associatedprotein;homology;domain;GFPfusionprotein;subcellularlocalization.
18