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Stim1在骨肉瘤组织和细胞中的表达水平及与顺铂耐药性的关系

IT圈 admin 2024-04-21 56浏览 0评论

2024年4月21日发(作者：司寇若星)

现代肿瘤医学　２０２１年０４月　第２９卷第０８期　　ＭＯＤＥＲＮＯＮＣＯＬＯＧＹ，Ａｐｒ２０２１，ＶＯＬ２９，Ｎｏ０８

·１２８５·

论　　著

基础研究

Ｓｔｉｍ１在骨肉瘤组织和细胞中的表达水平及与顺铂耐药性的关系

傅　蔷

１

，史纪元

２

，赵　婷

１

，查鹭婷

１

，刘安生

１

，唐　娜

３

Ｓｔｉｍ１ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｉｎｏｓｔｅｏｓａｒｃｏｍａｔｉｓｓｕｅｓａｎｄｃｅｌｌｓａｎｄｉｔｓｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐｗｉｔｈｃｉｓｐｌａｔｉｎｒｅ

ｓｉｓｔａｎｃｅ

１２１１１３

ＦＵＱｉａｎｇ，ＳＨＩＪｉｙｕａｎ，ＺＨＡＯＴｉｎｇ，ＺＨＡＬｕｔｉｎｇ，ＬＩＵＡｎｓｈｅｎｇ，ＴＡＮＧＮａ

１

２

ＤｅｐａｒｔｍｅｎｔｏｆＮｅｏｐｌａｓｔｉｃＨｅｍａｔｏｌｏｇｉｃＤｉｓｏｒｄｅｒ，Ｘｉ＇ａｎＣｈｉｌｄｒｅｎ＇ｓＨｏｓｐｉｔａｌ，ＳｈａａｎｘｉＸｉ＇ａｎ７１０００３，Ｃｈｉｎａ；ＤｅｐａｒｔｍｅｎｔｏｆＯｒｔｈｏｐｅｄｉｃｓ，

３ｎｄ

ＳｈａａｎｘｉＰｒｏｖｉｎｃｉａｌＰｅｏｐｌｅ＇ｓＨｏｓｐｉｔａｌ，ＳｈａａｎｘｉＸｉ＇ａｎ７１００６８，Ｃｈｉｎａ；ＤｅｐａｒｔｍｅｎｔｏｆＰａｔｈｏｌｏｇｙ，ＳｈｅｎｚｈｅｎＰｅｏｐｌｅ＇ｓＨｏｓｐｉｔａｌ，２Ｃｌｉｎｉｃａｌ

ＭｅｄｉｃａｌＣｏｌｌｅｇｅｏｆＪｉｎａｎＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，ＧｕａｎｇｄｏｎｇＳｈｅｎｚｈｅｎ５１８０２０，Ｃｈｉｎａ．

【Ａｂｓｔｒａｃｔ】　Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ：ＴｏｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅｔｈｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｌｅｖｅｌｏｆＳｔｉｍ１ｉｎｏｓｔｅｏｓａｒｃｏｍａｔｉｓｓｕｅｓａｎｄｃｅｌｌｓａｎｄｉｔｓｒｅｌａ

ｔｉｏｎｓｈｉｐｗｉｔｈｃｉｓｐｌａｔｉｎｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ．Ｍｅｔｈｏｄｓ：ＴｈｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆＳｔｉｍ１ｉｎｔｕｍｏｒｔｉｓｓｕｅｓｏｆ５０ｐａｔｉｅｎｔｓｗｉｔｈｏｓｔｅｏｓａｒｃｏｍａ

ｗａｓｄｅｔｅｃｔｅｄｂｙｉｍｍｕｎｏｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｃａｌｓｔａｉｎｉｎｇ．Ｄｒｕｇ－ｒｅｓｉｓｔａｎｔｏｓｔｅｏｓａｒｃｏｍａｃｅｌｌｓ（Ｕ－２ＯＳ／ＤＤＰｃｅｌｌｓ）ｗｅｒｅｅｓｔａｂ

ｌｉｓｈｅｄｂｙｔｒｅａｔｉｎｇｔｈｅｈｕｍａｎｏｓｔｅｏｓａｒｃｏｍａｃｅｌｌｌｉｎｅＵ－２ＯＳｗｉｔｈｈｉｇｈｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓｏｆｃｉｓｐｌａｔｉｎ．Ｔｈｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆ

Ｓｔｉｍ１，ＡＴＦ４，ＣＨＯＰａｎｄＧＲＰ７８ｉｎｔｈｅｃｅｌｌｓｗａｓｄｅｔｅｃｔｅｄｂｙＲＴ－ＰＣＲａｎｄＷｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ．Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎｏｆｈｕｍａｎ

Ｓｔｉｍ１－ｓｉＲＮＡｏｒｐＣＤＮＡ３－ＨＡｐｌａｓｍｉｄｏｖｅｒ－ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇＳｔｉｍ１ｄｏｗｎ－ｒｅｇｕｌａｔｅｄｏｒｕｐ－ｒｅｇｕｌａｔｅｄｔｈｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆ

Ｓｔｉｍ１ｉｎｏｓｔｅｏｓａｒｃｏｍａｃｅｌｌｓ，ａｎｄｔｈｅｃａｌｃｉｕｍｉｎｆｌｕｘｉｎｔｈｅｃｅｌｌｓｗａｓｄｅｔｅｃｔｅｄ．Ｃｅｌｌｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎｗａｓｄｅｔｅｃｔｅｄｂｙｔｈｅ

ＣＣＫ－８ｍｅｔｈｏｄ，ａｎｄａｐｏｐｔｏｓｉｓｗａｓｄｅｔｅｃｔｅｄｂｙｔｈｅＡｎｎｅｘｉｎＶ－ＦＩＴＣ／ＰＩｄｕａｌｓｔａｉｎｉｎｇｍｅｔｈｏｄ．Ｒｅｓｕｌｔｓ：Ｔｈｅｐｏｓｉｔｉｖｅ

ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆＳｔｉｍ１ｗａｓｒｅｌａｔｅｄｔｏＴＮＭｓｔａｇｉｎｇａｎｄｄｉｓｔａｎｔｍｅｔａｓｔａｓｉｓｉｎｐａｔｉｅｎｔｓｗｉｔｈｏｓｔｅｏｓａｒｃｏｍａ．ＡｍｏｎｇＳｔｉｍ１

ｐｏｓｉｔｉｖｅｐａｔｉｅｎｔｓ，７４．１９％（２３ｃａｓｅｓ）ｗｅｒｅＴＮＭｓｔａｇｅＩＩＩ，ａｎｄ８７．１０％（２７ｃａｓｅｓ）ｈａｄｄｉｓｔａｎｔｍｅｔａｓｔａｓｅｓ．Ａｍｏｎｇ

Ｓｔｉｍ１－ｎｅｇａｔｉｖｅｐａｔｉｅｎｔｓ，２６．３１％（５ｃａｓｅｓ）ｗｅｒｅＴＮＭｓｔａｇｅＩＩＩ，ａｎｄ２６．３１％（５ｃａｓｅｓ）ｈａｄｄｉｓｔａｎｔｍｅｔａｓｔａｓｅｓ．

ＴｈｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｌｅｖｅｌｓｏｆＳｔｉｍ１ｍＲＮＡａｎｄｐｒｏｔｅｉｎｉｎｃｉｓｐｌａｔｉｎ－ｒｅｓｉｓｔａｎｔｏｓｔｅｏｓａｒｃｏｍａＵ－２ＯＳ／ＤＤＰｃｅｌｌｓｗｅｒｅｓｉｇ

ｎｉｆｉｃａｎｔｌｙｈｉｇｈｅｒｔｈａｎｔｈｏｓｅｉｎｎｏｎ－ｒｅｓｉｓｔａｎｔＵ－２ＯＳｃｅｌｌｓ（Ｐ＜０．０５）．Ｄｏｗｎ－ｒｅｇｕｌａｔｉｎｇＳｔｉｍ１ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙｒｅ

ｄｕｃｅｄｃａｌｃｉｕｍｉｏｎｉｎｆｌｕｘｉｎＵ－２ＯＳ／ＤＤＰｃｅｌｌｓ（Ｐ＜０．０５）．Ｄｏｗｎ－ｒｅｇｕｌａｔｉｎｇＳｔｉｍ１ｉｎｈｉｂｉｔｅｄｃｅｌｌｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎａｎｄ

（Ｐ＜０．０５）．Ｉｎａｄｄｉｔｉｏｎ，ｄｏｗｎ－ｒｅｇｕｌａｔｉｎｇＳｔｉｍ１ｆｕｒｔｈｅｒｉｎｃｒｅａｓｅｄｔｈｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆｅｎｄｏｐｌａｓｍｉｃｐｒｏｍｏｔｅｄａｐｏｐｔｏｓｉｓ

ｒｅｔｉｃｕｌｕｍｓｔｒｅｓｓｍｏｌｅｃｕｌａｒｍａｒｋｅｒｓＡＴＦ４，ＣＨＯＰａｎｄＧＲＰ７８（Ｐ＜０．０５）．Ｉｎｃｏｎｔｒａｓｔ，ｕｐ－ｒｅｇｕｌａｔｉｎｇｔｈｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ

Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ：Ｓｔｉｍ１ｉｓｈｉｇｈｌｙｅｘｐｒｅｓｓｅｄｉｎｐａｔｉｅｎｔｓｗｉｔｈｏｓｔｅｏｓａｒｃｏｍａａｎｄｉｓａｓｓｏｃｉａｔｏｆＳｔｉｍ１ｐｌａｙｅｄｔｈｅｏｐｐｏｓｉｔｅｒｏｌｅ．

ｅｄｗｉｔｈｐｏｏｒｐｒｏｇｎｏｓｉｓ．ＨｉｇｈｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆＳｔｉｍ１ｃａｎｉｎｃｒｅａｓｅｃｉｓｐｌａｔｉｎｒｅｓｉｓｔａｎｃｅｉｎｏｓｔｅｏｓａｒｃｏｍａｃｅｌｌｓ．Ｄｏｗｎ－ｒｅｇｕ

ｌａｔｉｎｇＳｔｉｍ１ｒｅｄｕｃｅｓｃｉｓｐｌａｔｉｎｒｅｓｉｓｔａｎｃｅｏｆｏｓｔｅｏｓａｒｃｏｍａｃｅｌｌｓｂｙｉｎｈｉｂｉｔｉｎｇｃａｌｃｉｕｍｉｎｆｌｕｘａｎｄｐｒｏｍｏｔｉｎｇｅｎｄｏｐｌａｓｍｉｃ

ｒｅｔｉｃｕｌｕｍｓｔｒｅｓｓ－ｉｎｄｕｃｅｄａｐｏｐｔｏｓｉｓ．

【Ｋｅｙｗｏｒｄｓ】ｏｓｔｅｏｓａｒｃｏｍａ，Ｓｔｉｍ１，ｃｉｓｐｌａｔｉｎｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ，ｅｎｄｏｐｌａｓｍｉｃｒｅｔｉｃｕｌｕｍｓｔｒｅｓｓ，ｃａｌｃｉｕｍｉｎｆｌｕｘ，ａｐｏｐｔｏｓｉｓ

ＭｏｄｅｒｎＯｎｃｏｌｏｇｙ２０２１，２９（０８）：１２８５－１２９２

【摘要】　目的：探讨Ｓｔｉｍ１在骨肉瘤组织和细胞中的表达水平及与顺铂耐药性的关系。方法：采用免疫组织

０例骨肉瘤患者的肿瘤组织中Ｓｔｉｍ１的表达。通过用高浓度的顺铂处理人骨肉瘤细胞系Ｕ化学染色检测了５

－２ＯＳ来建立耐药性骨肉瘤细胞（Ｕ－２ＯＳ／ＤＤＰ细胞）。通过ＲＴ－ＰＣＲ和蛋白质印迹检测细胞中Ｓｔｉｍ１、

ＡＴＦ４、ＣＨＯＰ和ＧＲＰ７８的表达。通过转染人Ｓｔｉｍ１－ｓｉＲＮＡ或过表达Ｓｔｉｍ１的ｐＣＤＮＡ３－ＨＡ质粒来下调或上

调骨肉瘤细胞中Ｓｔｉｍ１的表达，并检测了细胞的钙离子内流情况。通过ＣＣＫ－８法检测细胞增殖，通过Ａｎ

双重染色法检测细胞凋亡。结果：Ｓｔｉｍ１的阳性表达与骨肉瘤患者的ＴＮＭ分期和远处转移ｎｅｘｉｎＶ－ＦＩＴＣ／ＰＩ

【收稿日期】　２０２０－０７－０２　　　【修回日期】　２０２０－０９－２０

【基金项目】　国家自然科学基金青年项目（编号：８１７０２３５９）；陕西省重点研发计划项目（编号：２０１７ＳＦ－２５９）；深圳市科技计划项目（编号：

ＪＣＹＪ２０１８０３０１１７００３５５３１）

１

西安市儿童医院血液肿瘤科，陕西　西安　７１０００３【作者单位】

２

３

陕西省人民医院骨科，陕西　西安　７１００６８

暨南大学第二临床医学院，深圳市人民医院病理科，广东　深圳　５１８０２０

【作者简介】　傅蔷（１９８４－），女，陕西西安人，硕士，主治医师，主要从事血液肿瘤基础与临床研究工作。Ｅ－ｍａｉｌ：ｊｅｓｓｉｓｅ１４８８＠１２６．ｃｏｍ

【通讯作者】　史纪元（１９８４－），男，陕西西安人，硕士，副主任医师，主要从事骨及骨肿瘤基础与临床研究工作。Ｅ－ｍａｉｌ：ＳｈｉＪＹｓｙ＠１６３．ｃｏｍ

·１２８６·

傅　蔷，等　　Ｓｔｉｍ１在骨肉瘤组织和细胞中的表达水平及与顺铂耐药性的关系

有关，Ｓｔｉｍ１阳性患者中，７４．１９％（２３例）为ＴＮＭ

Ⅲ

期，８７．１０％（２７例）发生远处转移。而Ｓｔｉｍ１阴性患者中，

２６．３１％（５例）为ＴＮＭ

Ⅲ

期，２６．３１％（５例）发生远处转移。顺铂耐药的骨肉瘤Ｕ－２ＯＳ／ＤＤＰ细胞中的Ｓｔｉｍ１

２ＯＳ细胞（Ｐ＜０．０５）。下调Ｓｔｉｍ１表达明显减少了Ｕ－２ＯＳ／ｍＲＮＡ和蛋白表达水平显著高于非耐药Ｕ－

ＤＤＰ细胞中的钙离子内流（Ｐ＜０．０５）；下调Ｓｔｉｍ１表达抑制了细胞的增殖并促进了细胞凋亡（Ｐ＜０．０５）。此

外，下调Ｓｔｉｍ１进一步提高了内质网应激分子标志物ＡＴＦ４、ＣＨＯＰ和ＧＲＰ７８的表达（Ｐ＜０．０５）。相反，上调

Ｓｔｉｍ１的表达则发挥了相反的作用。结论：Ｓｔｉｍ１在骨肉瘤患者中高表达并与不良预后有关。Ｓｔｉｍ１的高表达

ｔｉｍ１通过抑制钙离子内流并促进内质网应激诱导的细胞凋亡来降可增加骨肉瘤细胞的顺铂耐药性。下调Ｓ

低骨肉瘤细胞的顺铂耐药性。

【关键词】骨肉瘤；Ｓｔｉｍ１；顺铂耐药性；内质网应激；钙离子内流；细胞凋亡

【中图分类号】Ｒ７３８．１　　　【文献标识码】Ａ　　　ＤＯＩ：１０．３９６９／ｊ．ｉｓｓｎ．１６７２－４９９２．２０２１．０８．００１

【文章编号】１６７２－４９９２－（２０２１）０８－１２８５－０８

　　骨肉瘤是儿童和青少年中最常见的原发性恶性骨肿瘤，

约占所有儿科恶性肿瘤的２．４％

［１－３］

。骨肉瘤患者常用的化

疗药物包括顺铂、阿霉素和甲氨蝶呤，但化疗药物耐药情况

也越来越普遍。目前，对于临床治疗中骨肉瘤化学耐药性的

分子机制知之甚少。多项研究报道了Ｃａ

２＋

离子通道调节癌

细胞凋亡的关键作用

［４］

。钙库操纵的钙内流（ｓｔｏｒｅ－ｏｐｅｒａ

ｔｅｄｃａｌｃｉｕｍｅｎｔｒｙ，ＳＯＣＥ）已被确认为Ｃａ

２＋

进入非兴奋性细胞

的主要通道

［５］

。Ｓｔｉｍ１位于内质网（ｅｎｄｏｐｌａｓｍｉｃｒｅｔｉｃｕｌｕｍ，

ＥＲ）膜中，是钙库操纵的钙通道（ｓｔｏｒｅｏｐｅｒａｔｅｄｃａｌｃｉｕｍｃｈａｎ

ｎｅｌ，ＳＯＣＣ）的主要成分，也是内质网Ｃａ

２＋

的传感器

［６－８］

。先

前的研究表明Ｓｔｉｍ１在癌症发生中起着关键作用。在乳腺癌

动物模型中，敲低Ｓｔｉｍ１基因或抑制ＳＯＣＥ可降低肿瘤的转

移性

［９］

。此外，敲低Ｓｔｉｍ１抑制了肝癌细胞的迁移，并增加

了前列腺癌细胞的化疗敏感性

［１０］

。但是，Ｓｔｉｍ１在骨肉瘤中

的可能作用尚未完全解释。

　　内质网是必需的细胞器，在细胞存活和凋亡过程中发挥

重要作用。在多种刺激下，未折叠和未完全折叠的蛋白质会

积聚在内质网中，导致内质网应激。内质网在Ｃａ

２＋

稳态和

Ｃａ

２＋

信号传导中起着至关重要的作用

［１１］

。先前的研究报告

称，顺铂可诱导内质网应激，并激活ＡＴＦ４、ＣＨＯＰ和ＧＲＰ７８

等内质网应激的分子标记物

［１２］

。考虑到Ｓｔｉｍ１在内质网应

激和细胞凋亡中的重要作用，本研究推测Ｓｔｉｍ１可能参与癌

细胞的顺铂耐药性。

因此，本研究旨在探讨Ｓｔｉｍ１在骨肉瘤细胞中的表达水

平及与顺铂耐药性的关系及其可能机制。

１　材料与方法

１．１　材料

１．１．１　细胞与试剂　人成骨细胞系ｈＦＯＢ１．１９和人骨肉瘤

细胞系Ｕ－２ＯＳ购自美国典型培养物保藏中心（ＡＴＣＣ）；

ＲＰＭＩ１６４０培养基购自美国Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ公司；Ｓｔｉｍ１、ＡＴＦ４、

ＣＨＯＰ、ＧＲＰ７８和ＧＡＰＤＨ一抗购自美国ＳａｎｔａＣｒｕｚＢｉｏｔｅｃｈ

ｎｏｌｏｇｙ公司；辣根过氧化物酶标记的二抗购自北京中杉金桥

生物技术有限公司；３，３－二氨基联苯胺四盐酸盐购自美国

ｓｉｇｍａ公司；Ｔｒｉｚｏｌ试剂购自美国Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ公司；ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔＩＩ

ＲＴ试剂盒购自美国Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ公司；ＳＹＢＲＧｒｅｅｎ实时ＰＣＲ

试剂盒购自美国Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ公司；ＲＩＰＡ裂解液购自中科瑞泰

（北京）生物科技有限公司；ＢＣＡ蛋白质测定试剂盒购自上

海碧云天生物技术有限公司；聚偏二氟乙烯（ＰＶＤＦ）膜购自

美国Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ公司；ＥＣＬ检测试剂盒购自上海碧云天生物技

术有限公司；Ｆｕｒａ２－ＡＭ购自美国Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ公司；改良

Ｋｒｅｂｓ－Ｈｅｎｓｅｌｅｉｔ溶液购自北京雷根生物技术有限公司；

Ｓｔｉｍ１－ｓｉＲＮＡ购自上海吉玛制药技术有限公司；Ｈｉｐｅｒｆｅｃｔ

ＴｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎＲｅａｇｅｎｔ购自美国Ｑｉａｇｅｎ公司；ＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅＰｌｕｓ

试剂购自美国Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ公司；Ｏｐｔｉ－ＭＥＭ培养基购自Ｉｎ

ｖｉｔｒｏｇｅｎ；ＣＣＫ－８试剂购自日本ＤｏｊｉｎｄｏＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ公司；Ａｎ

ｎｅｘｉｎＶ－ＦＩＴＣ／ＰＩ双重染色试剂购自江苏凯基生物技术股份

有限公司；ＦＡＣ－Ｓｃａｎ流式细胞仪购自美国ＢＤＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ

公司。

１．１．２　患者和标本收集　５０例骨肉瘤组织及配对的癌旁组

织标本取自我院手术切除的骨肉瘤患者，患者先前均未进行

任何化放疗及药物治疗。所有组织标本均用石蜡包埋进行

免疫组织化学染色，或保存在液氮中进行ＲＴ－ＰＣＲ和Ｗｅｓｔ

ｅｒｎｂｌｏｔ分析。

１．２　方法

１．２．１　细胞培养　将人成骨细胞系ｈＦＯＢ１．１９和人骨肉瘤

细胞系Ｕ－２ＯＳ在含有１０％ＦＢＳ、１００Ｕ／ｍＬ青霉素和１００

ｇ／ｍＬ链霉素的ＲＰＭＩ１６４０中培养，培养条件为３７℃、５％

ＣＯ

２

。顺铂耐药的Ｕ－２ＯＳ（Ｕ－２ＯＳ／ＤＤＰ）细胞通过以高浓

度顺铂培养进行建立，接种后每周两次添加顺铂，每２个月

通过ＭＴＴ分析法分析细胞存活率。顺铂对Ｕ－２ＯＳ的ＩＣ

５０

值为１０

ｇ／ｍＬ。与未处理的Ｕ－２ＯＳ细胞相比，Ｕ－２ＯＳ／

ＤＤＰ细胞对顺铂的耐药性增加了３倍。分别将Ｕ－２ＯＳ细

胞和Ｕ－２ＯＳ／ＤＤＰ细胞用５

ｇ／ｍＬ的顺铂处理２４ｈ。

１．２．２　免疫组织化学　免疫组织化学用于检测Ｓｔｉｍ１在组

织标本中的表达。将石蜡包埋的组织标本切成５

ｍ厚的切

片，并进行脱蜡和再水化。抗原修复后，将切片与３％过氧化

氢孵育１０ｍｉｎ以阻断内切酶过氧化物酶活性，然后与Ｓｔｉｍ１

一抗（１∶５００稀释）在４℃下孵育过夜。用ＰＢＳ冲洗后，将切

片与辣根过氧化物酶标记的二抗孵育１ｈ。然后应用３，３－

二氨基联苯胺四盐酸盐（ＤＡＢ）进行显色。在奥林巴斯光学

显微镜下观察切片。阳性细胞被染为棕色或深棕色，在２００

×放大倍数下随机选择５个视野计算阳性细胞百分比。将

≥

５０％细胞阳性染色的样本定义为阳性。将＜５０％细胞阳

性染色的样本定义为阴性。

１．２．３　ＲＮＡ提取和ＲＴ－ＰＣＲ　根据试剂盒说明书，使用

Ｔｒｉｚｏｌ试剂提取总ＲＮＡ。使用ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔＩＩＲＴ试剂盒对分

离的ＲＮＡ进行反转录。通过ＳＹＢＲＧｒｅｅｎ实时ＰＣＲ试剂盒

在ＡＢＩＰｒｉｓｍ７３００型荧光定量ＰＣＲ仪上进行ＲＴ－ＰＣＲ。设计

引物序列（表１），ＧＡＰＤＨ用作内部对照，根据２

－

△△

Ｃｔ

法计算

Ｓｔｉｍ１ｍＲＮＡ的相对表达量。

现代肿瘤医学　２０２１年０４月　第２９卷第０８期　　ＭＯＤＥＲＮＯＮＣＯＬＯＧＹ，Ａｐｒ２０２１，ＶＯＬ２９，Ｎｏ０８

表１　引物序列信息

Ｔａｂ．１　Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎｏｆｐｒｉｍｅｒｓｅｑｕｅｎｃｅ

ＰｒｉｍｅｒｎａｍｅＰｒｉｍｅｒｓｅｑｕｅｎｃｅ（５＇－３＇）

Ｓｔｉｍ１

ＡＴＦ４

ＣＨＯＰ

ＧＲＰ７８

ＧＡＰＤＨ

Ｆ：ＧＡＡＣＧＣＴＡＴＣＣＡＡＣＴＧＴＧＧＴ

Ｒ：ＡＡＴＴＡＣＴＴＣＴＧＣＣＣＡＴＧＣＣＣ

Ｆ：ＣＴＴＧＡＴＴＧＴＧＡＣＧＣＣＡＡＴＡＴＧＧＡＴＴ

Ｒ：ＧＴＡＣＴＧＧＣＣＡＧＴＧＴＣＡＧＣＡＴＡＴＧＴＧＡ

Ｆ：ＧＧＡＣＧＴＡＣＧＡＴＣＴＡＴＧＴＧＣＣＣＡＣＣＧ

Ｒ：ＧＴＣＴＡＡＣＣＡＴＡＧＧＧＣＴＧＴＡＴＧＣＣＣＡ

Ｆ：ＣＴＡＣＴＡＴＡＴＧＧＣＧＴＡＡＴＴＧＡＣＡＣＡＧＴＴＴＴＴ

Ｒ：ＣＧＣＣＣＣＡＡＴＡＣＧＧＡＧＡＣＡＴＧＴＡＡＴＴＡＴＧＴＧＡ

：ＧＣＡＣＧＣＣＡＣＧＧＴＡＣＣＣＡＴＧＣＴＦ

Ｒ：ＡＧＣＧＧＴＡＣＧＣＡＴＡＧＴＣＧＧＣＣＴ

·１２８７·

表达Ｓｔｉｍ１的骨肉瘤细胞（Ｓｔｉｍ１－ｐＣＤＮＡ３），将空载质粒作

为对照（ＮＣ－ｐＣＤＮＡ３）。根据制造商的说明，将Ｌｉｐｏ

试剂加入Ｏｐｔｉ－ＭＥＭ培养基（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中，ｆｅｃｔａｍｉｎｅＰｌｕｓ

并将Ｓｔｉｍ１质粒瞬时转染细胞２４ｈ。

３

１．２．８　细胞活力测定　将细胞以５×１０个细胞／孔的密度

接种在９６孔板中过夜。然后添加ＣＣＫ－８并在３７℃下孵育

２ｈ。用酶标仪在４５０ｎｍ下测量每个孔的吸光度。

１．２．９　细胞凋亡测定　根据试剂盒说明书，通过ＡｎｎｅｘｉｎＶ

－ＦＩＴＣ／ＰＩ双重染色法测定Ｕ－２ＯＳ细胞或Ｕ－２ＯＳ／ＤＤＰ

细胞凋亡。用ＦＡＣ－Ｓｃａｎ流式细胞仪对凋亡细胞进行计数。

１．３　统计学分析

采用ＳＰＳＳ２２．０统计软件进行数据分析，数据结果表示

为平均值±标准差，通过单因素方差分析（ＡＮＯＶＡ）或ｔ检验

２

比较计量资料的组间差异；通过

检验比较计数资料的组

间差异；Ｐ＜０．０５表示差异具有统计学意义。

１．２．４　蛋白质印迹分析　使用含有蛋白酶抑制剂混合物的

冰ＲＩＰＡ裂解液对组织或细胞进行裂解。通过ＢＣＡ蛋白质

测定试剂盒确定蛋白质含量。通过８％的ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分离

３０

ｇ蛋白质并转移至聚偏二氟乙烯（ＰＶＤＦ）膜。将膜用

５％脱脂牛奶封闭１ｈ，然后与一抗在４℃下孵育过夜。一抗

ｔｉｍ１、ＡＴＦ４、ＣＨＯＰ、ＧＲＰ７８和ＧＡＰＤＨ，均以１∶１０００稀包括Ｓ

释。洗涤后，将膜与辣根过氧化物酶标记的二抗在室温下孵

育１ｈ，然后通过ＥＣＬ检测试剂盒进行显影。

１．２．５　钙离子内流的检测　将２

ｍｏｌ／ＬＦｕｒａ２－ＡＭ装入

２ｍＬ改良Ｋｒｅｂｓ－Ｈｅｎｓｅｌｅｉｔ溶液中，并在３７℃下孵育３０

２＋

ｍｉｎ。用１

ｍｏｌ／Ｌｔｈａｐｓｉｇａｒｇｉｎ（Ｔｇ）耗尽Ｃａ库，然后添加２

２＋

ｍｍｏｌ／ＬＣａ。用带有３４０和３８０ｎｍ波长滤波器的奥林巴

２　结果

２．１　Ｓｔｉｍ１表达与骨肉瘤临床参数的关系

结果显示，Ｓｔｉｍ１阳性细胞被染为棕色或深棕色，阴性细

胞未染色。将

≥

５０％细胞阳性染色的样本定义为阳性（图

１）。在本研究中，癌旁组织标本中共有１４份Ｓｔｉｍ１阳性和

３６份Ｓｔｉｍ１阴性，阳性率为２８．００％；骨肉瘤组织中共有３１

份Ｓｔｉｍ１阳性和１９份Ｓｔｉｍ１阴性，阳性率为６２．００％。癌旁

２

组织和骨肉瘤组织的Ｓｔｉｍ１阳性率有显著差异（１１．６７７，

＝

Ｐ＝０．００１）。此外，Ｓｔｉｍ１的阳性表达与骨肉瘤患者的ＴＮＭ

分期和远处转移有关（Ｐ＜０．０５），Ｓｔｉｍ１阳性患者中，７４．１９％

（２３例）为ＴＮＭ

Ⅲ

期，８７．１０％（２７例）发生远处转移。而

Ｓｔｉｍ１阴性患者中，２６．３１％（５例）为ＴＮＭ

Ⅲ

期，２６．３１％（５

例）发生远处转移。而Ｓｔｉｍ１的阳性表达与骨肉瘤患者的年

Ｐ＞０．０５）（表２）。龄、性别和肿瘤大小无关（

Ｓｔｉｍ１在人成骨细胞系ｈＦＯＢ１．１９和人骨肉瘤细胞系Ｕ

－２ＯＳ中的表达模式与其在癌旁组织和骨肉瘤组织中的表

达模式一致，与ｈＦＯＢ１．１９细胞相比，Ｕ－２ＯＳ细胞中Ｓｔｉｍ１

的ｍＲＮＡ和蛋白表达水平分别显著升高了２．７９倍和３．１４

倍（Ｐ＜０．０５）（图２）。

斯ＩＸ８１倒置荧光显微镜检查钙离子内流情况，并用Ｏｌｙｍｐｕｓ

Ｃｅｌｌ＾Ｒ软件进行分析。随机选择１０个视野评估平均荧光。

１．２．６　ｓｉＲＮＡ转染　通过转染人Ｓｔｉｍ１－ｓｉＲＮＡ敲低骨肉

瘤细胞中Ｓｔｉｍ１。靶向Ｓｔｉｍ１的ｓｉＲＮＡ序列是５＇－ＧＧＣＴＣＴＧ

。非特异性ｓｉＲＮＡ寡核苷酸（ＮＣ－ＧＡＴＡＣＡＧＴＧＣＴＣ－３＇

ｓｉＲＮＡ）用作阴性对照。按照制造商的说明，用Ｈｉｐｅｒｆｅｃｔ

ＴｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎＲｅａｇｅｎｔ转染ｓｉＲＮＡ。

１．２．７　质粒转染　委托上海吉玛制药技术有限公司将人

Ｓｔｉｍ１的全长ｃＤＮＡ克隆到ｐＣＤＮＡ３－ＨＡ质粒载体中构建过

图１　免疫组化检测Ｓｔｉｍ１在骨肉瘤组织中的阳性和阴性表达（×２００）

Ｆｉｇ．１　ＰｏｓｉｔｉｖｅａｎｄｎｅｇａｔｉｖｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆＳｔｉｍ１ｉｎｏｓｔｅｏｓａｒｃｏｍａｔｉｓｓｕｅｂｙｉｍｍｕｎｏｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（×２００）

２．２　Ｓｔｉｍ１表达与骨肉瘤细胞顺铂耐药性的关系

结果显示，顺铂耐药的骨肉瘤Ｕ－２ＯＳ／ＤＤＰ细胞中的

Ｓｔｉｍ１ｍＲＮＡ和蛋白表达水平显著高于对照Ｕ－２ＯＳ细胞（Ｐ

＜０．０５）。顺铂处理２４ｈ（５

ｇ／ｍＬ）后，Ｕ－２ＯＳ和Ｕ－２

ｔｉｍ１表达水平均显著降低，但顺铂处理后ＯＳ／ＤＤＰ细胞中Ｓ

Ｕ－２ＯＳ／ＤＤＰ细胞中Ｓｔｉｍ１表达水平仍高于Ｕ－２ＯＳ细胞

（Ｐ＜０．０５）（图３）。

·１２８８·

傅　蔷，等　　Ｓｔｉｍ１在骨肉瘤组织和细胞中的表达水平及与顺铂耐药性的关系

表２　Ｓｔｉｍ１表达与骨肉瘤临床参数的关系

细胞。此外，顺铂处理后，Ｕ－２ＯＳ和Ｕ－２ＯＳ／ＤＤＰ－２ＯＳ

细胞中钙离子内流均被抑制，但顺铂处理后Ｕ－２ＯＳ／ＤＤＰ

细胞的钙离子内流仍高于Ｕ－２ＯＳ细胞（Ｐ＜０．０５）（图４）。

２．４　顺铂对骨肉瘤细胞内质网应激的影响

结果显示，Ｕ－２ＯＳ／ＤＤＰ细胞的内质网应激分子标记物

（ＡＴＦ４、ＣＨＯＰ和ＧＲＰ７８）的ｍＲＮＡ和蛋白表达水平显著低

２ＯＳ细胞（Ｐ＜０．０５）。顺铂处理后，Ｕ－２ＯＳ和Ｕ－２于Ｕ－

ＯＳ／ＤＤＰ细胞中ＡＴＦ４、ＣＨＯＰ和ＧＲＰ７８的ｍＲＮＡ和蛋白表

达水平均显著上调（Ｐ＜０．０５），但顺铂处理后Ｕ－２ＯＳ／ＤＤＰ

细胞的ＡＴＦ４、ＣＨＯＰ和ＧＲＰ７８的ｍＲＮＡ和蛋白表达水平低

２ＯＳ细胞（图５）。于Ｕ－

２．５　下调Ｓｔｉｍ１对顺铂耐药的骨肉瘤细胞的增殖、凋亡、钙

离子内流和内质网应激的影响

结果显示，转染ｓｉＲＮＡ敲低了Ｕ－２ＯＳ／ＤＤＰ细胞中

Ｓｔｉｍ１ｍＲＮＡ的表达。下调Ｓｔｉｍ１表达明显减少了Ｕ－２ＯＳ／

Ｔａｂ．２　ＲｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐｂｅｔｗｅｅｎＳｔｉｍ１ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎａｎｄｃｌｉｎｉｃａｌｐａｒａｍｅｔｅｒｓｏｆ

ｏｓｔｅｏｓａｒｃｏｍａ

Ｐａｒａｍｅｔｅｒｓ

Ａｇｅ（ｙｅａｒｓ）

　＜６

≥

６

Ｇｅｎｄｅｒ

　Ｍａｌｅ

　Ｆｅｍａｌｅ

Ｔｕｍｏｒｓｉｚｅ（ｃｍ）

　＜５

≥

５

ＴＮＭｓｔａｇｅ

Ⅰ

Ⅱ

Ⅲ

Ｄｉｓｔａｎｔｍｅｔａｓｔａｓｅｓ

　Ｎｏ

　Ｙｅｓ

ｅｇａｔｉｖｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎＰｏｓｉｔｉｖｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎＮ

（ｎ＝３１）ｏｆＳｔｉｍ１

１６

１５

１６

１５

１７

１４

２

６

２３

４

２７

ｏｆＳｔｉｍ１（ｎ＝１９）

１３

６

０．００５０．９４４

１０

９

０．９０５０．３４４

１３

６

１０．９９５０．００４

３

１１

５

１８．８８９＜０．００１

１４

５

２

Ｐ

１．３６６０．２４２

ＤＤＰ细胞中的钙离子内流（Ｐ＜０．０５）。顺铂处理均抑制了Ｕ

－２ＯＳ／ＤＤＰ细胞的增殖并促进了细胞凋亡（Ｐ＜０．０５）。然

而，下调Ｓｔｉｍ１进一步抑制了细胞的增殖并促进了细胞凋亡。

同时，下调Ｓｔｉｍ１进一步提高了ＡＴＦ４、ＣＨＯＰ和ＧＲＰ７８

ｍＲＮＡ的表达（Ｐ＜０．０５）（图６）。

２．３　顺铂对骨肉瘤细胞钙离子内流的影响

结果显示，Ｕ－２ＯＳ／ＤＤＰ细胞的钙离子内流显著高于Ｕ

图２　Ｓｔｉｍ１在人成骨细胞系ｈＦＯＢ１．１９和人骨肉瘤细胞系Ｕ－２ＯＳ中的表达

Ａ：ＲＴ－ＰＣＲ检测Ｓｔｉｍ１ｍＲＮＡ表达；Ｂ和Ｃ：Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ检测Ｓｔｉｍ１蛋白表达。与ｈＦＯＢ１．１９细胞比较，０．０５。



Ｐ＜

Ｆｉｇ．２　ＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆＳｔｉｍ１ｉｎｈｕｍａｎｏｓｔｅｏｂｌａｓｔｃｅｌｌｌｉｎｅｈＦＯＢ１．１９ａｎｄｈｕｍａｎｏｓｔｅｏｓａｒｃｏｍａｃｅｌｌｌｉｎｅＵ－２ＯＳ

　Ａ：ＲＴ－ＰＣＲｄｅｔｅｃｔｉｏｎｏｆＳｔｉｍ１ｍＲＮＡｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ；ＢａｎｄＣ：ＷｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔｄｅｔｅｃｔｉｏｎｏｆＳｔｉｍ１ｐｒｏｔｅｉｎｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ．ＣｏｍｐａｒｅｄｗｉｔｈｈＦＯＢ１．１９ｃｅｌｌｓ，



Ｐ

＜０．０５．

图３　顺铂处理２４ｈ（５

ｇ／ｍＬ）对Ｕ－２ＯＳ和Ｕ－２ＯＳ／ＤＤＰ细胞中Ｓｔｉｍ１表达的影响

　Ａ：ＲＴ－ＰＣＲ检测Ｓｔｉｍ１ｍＲＮＡ表达；Ｂ：Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ检测Ｓｔｉｍ１蛋白表达。与Ｕ－２ＯＳ细胞比较，０．０５；与Ｕ－２ＯＳ＋ＤＤＰ细胞比较，＃Ｐ



Ｐ＜

＜０．０５；与Ｕ－２ＯＳ／ＤＤＰ细胞比较，＆Ｐ＜０．０５。

Ｆｉｇ．３　Ｅｆｆｅｃｔｏｆｃｉｓｐｌａｔｉｎｔｒｅａｔｍｅｎｔｆｏｒ２４ｈ（５

ｇ／ｍＬ）ｏｎｔｈｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆＳｔｉｍ１ｉｎＵ－２ＯＳａｎｄＵ－２ＯＳ／ＤＤＰｃｅｌｌｓ

　Ａ：Ｓｔｉｍ１ｍＲＮＡｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｄｅｔｅｃｔｅｄｂｙＲＴ－ＰＣＲ；Ｂ：Ｓｔｉｍ１ｐｒｏｔｅｉｎｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｄｅｔｅｃｔｅｄｂｙＷｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ．ＣｏｍｐａｒｅｄｗｉｔｈＵ－２ＯＳｃｅｌｌｓ，０．０５；



Ｐ＜

ＣｏｍｐａｒｅｄｗｉｔｈＵ－２ＯＳ＋ＤＤＰｃｅｌｌｓ，＃Ｐ＜０．０５；ＣｏｍｐａｒｅｄｗｉｔｈＵ－２ＯＳ／ＤＤＰｃｅｌｌｓ，＆Ｐ＜０．０５．

现代肿瘤医学　２０２１年０４月　第２９卷第０８期　　ＭＯＤＥＲＮＯＮＣＯＬＯＧＹ，Ａｐｒ２０２１，ＶＯＬ２９，Ｎｏ０８

·１２８９·

ＤＤＰ细胞中Ｓｔｉｍ１ｍＲＮＡ的表达显著上调（Ｐ＜０．０５）。与下

ｔｉｍ１表达对骨肉瘤细胞行为的影响效果相反，上调Ｓｔｉｍ１调Ｓ

表达显著促进了Ｕ－２ＯＳ／ＤＤＰ细胞中的钙离子内流（Ｐ＜

０．０５）。并且上调Ｓｔｉｍ１表达降低了顺铂对细胞增殖的抑制

作用和对细胞凋亡的促进作用。同时，上调Ｓｔｉｍ１表达抑制

ＴＦ４、ＣＨＯＰ和ＧＲＰ７８ｍＲＮＡ的表达（图７）。了Ａ

３　讨论

Ｓｔｉｍ１位于内质网膜中，是钙库操纵的钙通道（ＳＯＣＥ）的

２＋６－８］

主要成分，也是内质网Ｃａ的传感器

［

。Ｓｔｉｍ１在癌症发

ｔｉｍ１在大多数骨肉瘤患者生中起着关键作用。本研究发现Ｓ

图４　顺铂处理２４ｈ（５

ｇ／ｍＬ）对Ｕ－２ＯＳ和Ｕ－２ＯＳ／ＤＤＰ细胞钙

离子内流的影响

　与Ｕ－２ＯＳ细胞比较，０．０５；与Ｕ－２ＯＳ＋ＤＤＰ细胞比较，＃Ｐ



Ｐ＜

＜０．０５；与Ｕ－２ＯＳ／ＤＤＰ细胞比较，＆Ｐ＜０．０５。

Ｆｉｇ．４　Ｅｆｆｅｃｔｏｆｃｉｓｐｌａｔｉｎｔｒｅａｔｍｅｎｔｆｏｒ２４ｈ（５

ｇ／ｍＬ）ｏｎｃａｌｃｉｕｍｉｎ

ｆｌｕｘｉｎＵ－２ＯＳａｎｄＵ－２ＯＳ／ＤＤＰｃｅｌｌｓ

　ＣｏｍｐａｒｅｄｗｉｔｈＵ－２ＯＳｃｅｌｌｓ，０．０５；ＣｏｍｐａｒｅｄｗｉｔｈＵ－２ＯＳ＋



Ｐ＜

，＃Ｐ＜０．０５；ＣｏｍｐａｒｅｄｗｉｔｈＵ－２ＯＳ／ＤＤＰｃｅｌｌｓ，＆Ｐ＜ＤＤＰｃｅｌｌｓ

０．０５．

中高表达，并且Ｓｔｉｍ１的阳性表达与骨肉瘤患者的ＴＮＭ分期

和远处转移有关。其他研究中报道，在乳腺癌动物模型中，

９］

敲低Ｓｔｉｍ１基因可降低肿瘤的转移性

［

。与非肿瘤组织相

比，Ｓｔｉｍ１在肝癌组织中过表达，敲低Ｓｔｉｍ１抑制了肝癌细胞

１０］

的迁移，并增加了前列腺癌细胞的化疗敏感性

［

。此外，

Ｓｔｉｍ１的下调促进了非小细胞肺癌细胞中顺铂诱导的细胞凋

１３］

亡

［

。基于上述研究结果，可知Ｓｔｉｍ１在大多数癌症中扮演

癌基因的角色，并且可能参与调控癌细胞的生物学功能及化

疗耐药性。本研究还显示顺铂耐药的骨肉瘤Ｕ－２ＯＳ／ＤＤＰ

细胞中的Ｓｔｉｍ１表达水平明显上调，说明Ｓｔｉｍ１不仅参与骨

肉瘤的发病过程，而且与骨肉瘤细胞化疗耐药性有关，Ｓｔｉｍ１

可作为骨肉瘤预后的检测指标。

２．６　上调Ｓｔｉｍ１表达对顺铂耐药的骨肉瘤细胞增殖、凋亡、

钙离子内流和内质网应激的影响

本研究将顺铂耐药的Ｕ－２ＯＳ／ＤＤＰ细胞用过表达

Ｓｔｉｍ１的ｐＣＤＮＡ３－ＨＡ质粒进行转染，结果显示Ｕ－２ＯＳ／

图５　顺铂处理２４ｈ（５

ｇ／ｍＬ）对Ｕ－２ＯＳ和Ｕ－２ＯＳ／ＤＤＰ细胞中内质网应激标志物ＡＴＦ４、ＣＨＯＰ和ＧＲＰ７８表达的影响

　Ａ：ＲＴ－ＰＣＲ检测ｍＲＮＡ表达；Ｂ：Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ检测蛋白表达。与Ｕ－２ＯＳ细胞比较，０．０５；与Ｕ－２ＯＳ＋ＤＤＰ细胞比较，＃Ｐ＜０．０５；与



Ｐ＜

Ｕ－２ＯＳ／ＤＤＰ细胞比较，＆Ｐ＜０．０５。

Ｆｉｇ．５　Ｅｆｆｅｃｔｏｆｃｉｓｐｌａｔｉｎｔｒｅａｔｍｅｎｔｆｏｒ２４ｈ（５

ｇ／ｍＬ）ｏｎｔｈｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆｅｎｄｏｐｌａｓｍｉｃｒｅｔｉｃｕｌｕｍｓｔｒｅｓｓｍａｒｋｅｒｓＡＴＦ４，ＣＨＯＰａｎｄＧＲＰ７８ｉｎＵ－２ＯＳ

ａｎｄＵ－２ＯＳ／ＤＤＰｃｅｌｌｓ

　Ａ：ｍＲＮＡｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｄｅｔｅｃｔｅｄｂｙＲＴ－ＰＣＲ；Ｂ：ＰｒｏｔｅｉｎｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｄｅｔｅｃｔｅｄｂｙＷｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ．ＣｏｍｐａｒｅｄｗｉｔｈＵ－２ＯＳｃｅｌｌｓ，０．０５；Ｃｏｍｐａｒｅｄｗｉｔｈ



Ｐ＜

Ｕ－２ＯＳ＋ＤＤＰｃｅｌｌｓ，＃Ｐ＜０．０５；ＣｏｍｐａｒｅｄｗｉｔｈＵ－２ＯＳ／ＤＤＰｃｅｌｌｓ，＆Ｐ＜０．０５．

２＋

　　细胞内Ｃａ在调节多种细胞过程中起着至关重要的作能与细胞内钙离子浓度有关。由于Ｓｔｉｍ１是ＳＯＣＥ的主要成

２＋４－５］

分，而ＳＯＣＥ是Ｃａ进入非兴奋性细胞的主要通道

［

。其用，包括神经兴奋、骨骼肌收缩、内皮细胞增殖和巨噬细胞活

１４］２＋

。此外，Ｃａ离子通道通过调节癌细胞凋亡介导化疗化

［

２＋

耐药性，使用Ｃａ通道抑制剂处理癌细胞可明显促进细胞

ＯＣＥ通过促进自噬和细胞凋亡而增加肝他研究报道，抑制Ｓ

４］

癌细胞对５－氟尿嘧啶的敏感性

［

。因此，本研究推测下调

２ＯＳ／ＤＤＰ细胞的钙离凋亡。本研究发现，顺铂耐药的Ｕ－

子内流显著高于非耐药细胞。说明骨肉瘤的顺铂耐药性可

Ｓｔｉｍ１可能通过关闭ＳＯＣＥ通道进而抑制钙离子内流来诱导

细胞凋亡，从而降低顺铂耐药性。

··１２９０

傅　蔷，等　　Ｓｔｉｍ１在骨肉瘤组织和细胞中的表达水平及与顺铂耐药性的关系

图６　下调Ｓｔｉｍ１对顺铂耐药的骨肉瘤细胞的增殖、凋亡、钙离子内流和内质网应激的影响

　Ａ：转染ｓｉＲＮＡ敲低了Ｕ－２ＯＳ／ＤＤＰ细胞中Ｓｔｉｍ１ｍＲＮＡ的表达；Ｂ：钙离子内流；Ｃ：ＣＣＫ－８法检测细胞增殖；Ｄ：ＡｎｎｅｘｉｎＶ－ＦＩＴＣ／ＰＩ双重染

色法检测细胞凋亡；Ｅ：ＲＴ－ＰＣＲ检测内质网应激标志物ＡＴＦ４、ＣＨＯＰ和ＧＲＰ７８的ｍＲＮＡ表达。与ＮＣ－ｓｉＲＮＡ组比较，０．０５；与ＮＣ－



Ｐ＜

＃Ｐ＜０．０５；与Ｓｔｉｍ１－ｓｉＲＮＡ组比较，＆Ｐ＜０．０５。ｓｉＲＮＡ＋ＤＤＰ组比较，

Ｆｉｇ．６　Ｅｆｆｅｃｔｏｆｄｏｗｎ－ｒｅｇｕｌａｔｉｎｇＳｔｉｍ１ｏｎｔｈｅｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ，ａｐｏｐｔｏｓｉｓ，ｃａｌｃｉｕｍｉｎｆｌｕｘａｎｄｅｎｄｏｐｌａｓｍｉｃｒｅｔｉｃｕｌｕｍｓｔｒｅｓｓｏｆｃｉｓｐｌａｔｉｎ－ｒｅｓｉｓｔａｎｔｏｓｔｅｏｓａｒｃｏ

ｍａｃｅｌｌｓ

　Ａ：ＴｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎｓｉＲＮＡｋｎｏｃｋｓｄｏｗｎＳｔｉｍ１ｍＲＮＡｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｉｎＵ－２ＯＳ／ＤＤＰｃｅｌｌｓ；Ｂ：Ｃａｌｃｉｕｍｉｎｆｌｕｘ；Ｃ：ＣｅｌｌｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎｄｅｔｅｃｔｅｄｂｙＣＣＫ－８ｍｅｔｈ

ｏｄ；Ｄ：ＡｎｎｅｘｉｎＶ－ＦＩＴＣ／ＰＩｄｕａｌｓｔａｉｎｉｎｇＡｐｏｐｔｏｓｉｓｗａｓｄｅｔｅｃｔｅｄｂｙａｓｓａｙ；Ｅ：ＲＴ－ＰＣＲｄｅｔｅｃｔｅｄｍＲＮＡｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆｅｎｄｏｐｌａｓｍｉｃｒｅｔｉｃｕｌｕｍｓｔｒｅｓｓ

，ＣＨＯＰａｎｄＧＲＰ７８．ＣｏｍｐａｒｅｄｗｉｔｈＮＣ－ｓｉＲＮＡｇｒｏｕｐ，０．０５；ＣｏｍｐａｒｅｄｗｉｔｈＮＣ－ｓｉＲＮＡ＋ＤＤＰｇｒｏｕｐ，＃Ｐ＜０．０５；ＣｏｍｐａｒｅｄｍａｒｋｅｒｓＡＴＦ４



Ｐ＜

ｗｉｔｈＳｔｉｍ１－ｓｉＲＮＡｇｒｏｕｐ，＆Ｐ＜０．０５．

２＋２＋

　　另外，内质网应激对Ｃａ稳态和Ｃａ信号传导以及化ＲＰ７８可促高表达可能会增加癌细胞的化疗耐药性，因为Ｇ

１７］

进未折叠蛋白的折叠

［

。但是，如果内质网应激持续存在，疗敏感性具有重要的调节作用

［１１，１５］

。先前的研究报告称，顺

１１－１２］

铂可诱导内质网应激从而促进细胞凋亡

［

。本研究发则ＧＲＰ７８的高表达可促进介导细胞凋亡的ＡＴＦ４和ＣＨＯＰ

的表达，从而促进细胞凋亡，并抵消ＧＲＰ７８的促生存作

１８］

用

［

。上述结果说明下调Ｓｔｉｍ１通过抑制钙离子内流并促

现，顺铂耐药的骨肉瘤细胞中的ＡＴＦ４、ＣＨＯＰ和ＧＲＰ７８的表

达水平显著低于非耐药细胞，顺铂处理可促进上述内质网应

激标志物的表达，但顺铂耐药的细胞中的ＡＴＦ４、ＣＨＯＰ和

ＧＲＰ７８的表达水平始终低于非耐药细胞。上述结果说明骨

肉瘤的顺铂耐药机制涉及内质网应激的抑制。其他研究报

２＋

道，内质网内的Ｃａ耗竭是内质网应激诱导细胞凋亡发生

１６］２＋

的主要原因

［

，由于Ｓｔｉｍ１是Ｃａ感受器，因此，本研究推

２＋

测下调Ｓｔｉｍ１可能通过引起Ｃａ耗竭来诱导内质网应激从

进内质网应激诱导的细胞凋亡来降低骨肉瘤细胞的顺铂耐

药性。而骨肉瘤细胞中Ｓｔｉｍ１的高表达通过相同的机制提高

了顺铂的耐药性。

　　本研究的不足之处在于以下几个方面：首先，在部分骨

肉瘤组织中，Ｓｔｉｍ１仍为低表达模式，因此Ｓｔｉｍ１在骨肉瘤诊

断和预后判断中的作用仍需要进一步分析论证；其次，本研

究未能说明Ｓｔｉｍ１调控钙离子内流及内质网应激的确切分子

及信号传导途径；最后，本研究未能进行体内动物实验验证

本研究的结果及推论。上述几项不足之处也是本课题组接

下来的主要研究方向。总之，本研究表明Ｓｔｉｍ１在骨肉瘤患

者中高表达并与不良预后有关。Ｓｔｉｍ１的高表达可增加骨肉

瘤细胞的顺铂耐药性。下调Ｓｔｉｍ１通过抑制钙离子内流并促

进内质网应激诱导的细胞凋亡来降低骨肉瘤细胞的顺铂耐

药性。

而促进骨肉瘤细胞凋亡。

ｔｉｍ１在骨肉瘤细胞顺铂耐药中的为了验证前文中关于Ｓ

作用假设，本研究通过转染靶向Ｓｔｉｍ１的ｓｉＲＮＡ敲低了顺铂

耐药的Ｕ－２ＯＳ／ＤＤＰ细胞中Ｓｔｉｍ１的表达，并通过转染过表

达Ｓｔｉｍ１的ｐＣＤＮＡ３－ＨＡ质粒来上调Ｓｔｉｍ１的表达。研究发

现，下调Ｓｔｉｍ１抑制了骨肉瘤细胞的钙离子内流和细胞增殖，

并促进了细胞凋亡。此外，下调Ｓｔｉｍ１进一步提高了内质网

应激分子标志物ＡＴＦ４、ＣＨＯＰ和ＧＲＰ７８的表达。然而，上调

Ｓｔｉｍ１表达则可发挥相反的作用。值得注意的是，ＧＲＰ７８的

现代肿瘤医学　２０２１年０４月　第２９卷第０８期　　ＭＯＤＥＲＮＯＮＣＯＬＯＧＹ，Ａｐｒ２０２１，ＶＯＬ２９，Ｎｏ０８

·１２９１·

图７　上调Ｓｔｉｍ１表达对顺铂耐药的骨肉瘤细胞的增殖、凋亡、钙离子内流和内质网应激的影响

　Ａ：转染过表达Ｓｔｉｍ１的ｐＣＤＮＡ３－ＨＡ质粒上调了Ｕ－２ＯＳ／ＤＤＰ细胞中Ｓｔｉｍ１ｍＲＮＡ的表达；Ｂ：钙离子内流；Ｃ：ＣＣＫ－８法检测细胞增殖；

Ｄ：ＡｎｎｅｘｉｎＶ－ＦＩＴＣ／ＰＩ双重染色法检测细胞凋亡；Ｅ：ＲＴ－ＰＣＲ检测内质网应激标志物ＡＴＦ４、ＣＨＯＰ和ＧＲＰ７８的ｍＲＮＡ表达。与ＮＣ－ｐＣＤ

０．０５；与ＮＣ－ｐＣＤＮＡ３＋ＤＤＰ组比较，＃Ｐ＜０．０５；与Ｓｔｉｍ１－ｐＣＤＮＡ３组比较，＆Ｐ＜０．０５。ＮＡ３组比较，



Ｐ＜

Ｆｉｇ．７　Ｅｆｆｅｃｔｏｆｕｐ－ｒｅｇｕｌａｔｉｎｇＳｔｉｍ１ｏｎｔｈｅｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ，ａｐｏｐｔｏｓｉｓ，ｃａｌｃｉｕｍｉｎｆｌｕｘａｎｄｅｎｄｏｐｌａｓｍｉｃｒｅｔｉｃｕｌｕｍｓｔｒｅｓｓｏｆｃｉｓｐｌａｔｉｎ－ｒｅｓｉｓｔａｎｔ

　Ａ：ＴｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎｏｆｐＣＤＮＡ３－ＨＡｐｌａｓｍｉｄｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇＳｔｉｍ１ｕｐ－ｒｅｇｕｌａｔｅｓｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆＳｔｉｍ１ｍＲＮＡｉｎＵ－２ＯＳ／ＤＤＰｃｅｌｌｓ；Ｂ：Ｃａｌｃｉｕｍｉｏｎｉｎ

ｆｌｕｘ；Ｃ：ＣＣＫ－８ａｓｓａｙｆｏｒｃｅｌｌｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ；Ｄ：ＡｎｎｅｘｉｎＶ－ＦＩＴＣ／ＰＩｄｕａｌｓｔａｉｎｉｎｇｔｏｄｅｔｅｃｔａｐｏｐｔｏｓｉｓ；Ｅ：ＲＴ－ＰＣＲｔｏｄｅｔｅｃｔｍＲＮＡｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆｅｎｄｏ

ｐｌａｓｍｉｃｒｅｔｉｃｕｌｕｍｓｔｒｅｓｓｍａｒｋｅｒｓＡＴＦ４，ＣＨＯＰａｎｄＧＲＰ７８．ＣｏｍｐａｒｅｄｗｉｔｈＮＣ－ｐＣＤＮＡ３ｇｒｏｕｐ，０．０５；ＣｏｍｐａｒｅｄｗｉｔｈＮＣ－ｐＣＤＮＡ３＋ＤＤＰ



Ｐ＜

，＃Ｐ＜０．０５；ＣｏｍｐａｒｅｄｗｉｔｈＳｔｉｍ１－ｐＣＤＮＡ３ｇｒｏｕｐ，＆Ｐ＜０．０５．ｇｒｏｕｐ

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ｃｈｉｎ－３－ｇａｌｌａｔｅ（ＥＧＣＧ）ｕｐ－ｒｅｇｕｌａｔｅｓｍｉＲ－１５ｂｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ

（ＳＯＣＥ）ｉｎｔｏｍｕｒｉｎｅｔｈｕｓａｔｔｅｎｕａｔｉｎｇｓｔｏｒｅｏｐｅｒａｔｅｄｃａｌｃｉｕｍｅｎｔｒｙ

＋

ＣＤ４ＴｃｅｌｌｓａｎｄｈｕｍａｎｌｅｕｋａｅｍｉｃＴｃｅｌｌｌｙｍｐｈｏｂｌａｓｔｓ［Ｊ］．Ｏｎｃｏ

２＋

＋

２＋

ａｎｄｃＡＭＰｓｉｇｎａｌｉｎｇｄｕｒｉｎｇｍｅｌａａｄｅｎｙｌｙｌｃｙｃｌａｓｅ６ｃｏｎｎｅｃｔｓＣａ

ｎｏｇｅｎｅｓｉｓ［Ｊ］．ＥｍｂｏＪｏｕｒｎａｌ，２０１８，３７（５）：ｅ９７５９７．

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Ｊ］．中华骨科杂志，２０１８，３８离子释放激活钙通道的调控作用［

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ＦＵＺＬ，ＧＯＮＧＸＹ，ＣＨＥＮＣ，ｅｔａｌ．Ｔｈｅｒｅｇｕｌａｔｏｒｙｅｆｆｅｃｔｓｏｆｓｔｒｏｍａｌ

２＋２＋

ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎａｌｍｏｌｅｃｕｌｅ－２ｏｎＣａｒｅｌｅａｓｅａｃｔｉｖａｔｅｄＣａｃｈａｎｎｅｌ

Ｊ］．ＣｈｉｎｅｓｅＪｏｕｒｎａｌｏｆＯｒｔｈｏｐａｅｄｉｃｓ，２０１８，３８ｏｆｃｈｏｎｄｒｏｃｙｔｅｓ［

（２３）：１４５８－１４６５．

［８］　王腊梅，钟华，唐娜，等．钙敏感受体介导的人脐静脉内皮细胞

ＲＰＣ１与ＳＴＩＭ１的相互作用钙内流及一氧化氮生成过程中Ｔ

［Ｊ］．中华心血管病杂志，２０１７，４５（１１）：９７８－９８４．

ＷＡＮＧＬＭ，ＺＨＯＮＧＨ，ＴＡＮＧＮ，ｅｔａｌ．ＩｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｂｅｔｗｅｅｎＴＲＰＣ１

ａｎｄＳＴＩＭ１ｉｎｃａｌｃｉｕｍｓｅｎｓｉｎｇｒｅｃｅｐｔｏｒｍｅｄｉａｔｅｄｃａｌｃｉｕｍｉｎｆｌｕｘａｎｄ

ｎｉｔｒｉｃｏｘｉｄｅｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎｉｎｈｕｍａｎｕｍｂｉｌｉｃａｌｖｅｉｎｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌｃｅｌｌｓ

［Ｊ］．ＣｈｉｎｅｓｅＪｏｕｒｎａｌｏｆＣａｒｄｉｏｌｏｇｙ，２０１７，４５（１１）：９７８－９８４．

［９］　ＹＡＮＧＳ，ＺＨＡＮＧＪＪ，ＨＵＡＮＧＸＹ．Ｏｒａｉ１ａｎｄＳＴＩＭ１ａｒｅｃｒｉｔｉｃａｌ

［Ｊ］．ＣａｎｃｅｒＣｅｌｌ，ｆｏｒｂｒｅａｓｔｔｕｍｏｒｃｅｌｌｍｉｇｒａｔｉｏｎａｎｄｍｅｔａｓｔａｓｉｓ

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［１０］　ＹＡＮＧＮ，ＴＡＮＧＹ，ＷＡＮＧＦ，ｅｔａｌ．Ｂｌｏｃｋａｄｅｏｆｓｔｏｒｅ－ｏｐｅｒａｔｅｄ

２＋

Ｃａｅｎｔｒｙｉｎｈｉｂｉｔｓｈｅｐａｔｏｃａｒｃｉｎｏｍａｃｅｌｌｍｉｇｒａｔｉｏｎａｎｄｉｎｖａｓｉｏｎ

［Ｊ］．ＣａｎｃｅｒＬｅｔｔｅｒｓ，２０１３，ｂｙｒｅｇｕｌａｔｉｎｇｆｏｃａｌａｄｈｅｓｉｏｎｔｕｒｎｏｖｅｒ

３３０（２）：１６３－１６９．

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ｔｉｏｎｓ［Ｊ］．ＢｉｏｃｈｉｍＢｉｏｐｈｙｓＡｃｔａ，２０１４，１８４０（３）：９６４－９６９．

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·１２９２·

胡　彬，等　　ＡＤＡＲ１ｓｈＲＮＡ对人白血病细胞株Ｋ５６２细胞增殖的影响

２２６８－２２７４．

［１６］　ＤＵＢＯＩＳＣ，ＡＢＥＥＬＥＦＶ，ＳＥＨＧＡＬＰ，ｅｔａｌ．Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌｅｆｆｅｃｔｓｏｆ

ｔｈａｐｓｉｇａｒｇｉｎａｎａｌｏｇｕｅｓｏｎａｐｏｐｔｏｓｉｓｏｆｐｒｏｓｔａｔｅｃａｎｃｅｒｃｅｌｌｓ：ｃｏｍ

ｐｌｅｘｒｅｇｕｌａｔｉｏｎｂｙｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｃａｌｃｉｕｍ［Ｊ］．ＦｅｂｓＪｏｕｒｎａｌ，２０１３，

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ＧＲＰ７８／ＢｉＰｉｎｔｕｍｏｒｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ，ｓｕｒｖｉｖａｌ，ａｎｄｔｕｍｏｒａｎｇｉｏｇｅｎｅ

ｓｉｓｉｎｔｒａｎｓｇｅｎｅ－ｉｎｄｕｃｅｄｍａｍｍａｒｙｔｕｍｏｒｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ［Ｊ］．

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ｕｌｕｍｓｔｒｅｓｓｓｉｇｎａｌｉｎｇｉｎｃａｎｃｅｒ［Ｊ］．ＢｉｏｃｈｅｍｉｃａｌＰｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ，

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（编校：闫沛）

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ｍｉｃｒｅｔｉｃｕｌｕｍｒｅｇｕｌａｔｅｓｃｉｓｐｌａｔｉｎ－ｉｎｄｕｃｅｄａｐｏｐｔｏｓｉｓｉｎｈｕｍａｎ

ｃｅｒｖｉｃａｌｃａｎｃｅｒＨｅＬａｃｅｌｌｓ［Ｊ］．ＯｎｃｏｌｏｇｙＬｅｔｔｅｒｓ，２０１６，１１（４）：

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［１３］　ＬＩＷ，ＺＨＡＮＧＭ，ＸＵＬ，ｅｔａｌ．Ｔｈｅａｐｏｐｔｏｓｉｓｏｆｎｏｎ－ｓｍａｌｌｃｅｌｌ

ｌｕｎｇｃａｎｃｅｒｉｎｄｕｃｅｄｂｙｃｉｓｐｌａｔｉｎｔｈｒｏｕｇｈｍｏｄｕｌａｔｉｏｎｏｆＳＴＩＭ１

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ｏｐｅｒａｔｅｄｃａｌｃｉｕｍｃｈａｎｎｅｌｐｒｅｖｅｎｔｓｆｏａｍｃｅｌｌｆｏｒｍａｔｉｏｎａｎｄａｔｈｅｒｏ

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［１５］　ＫＵＭＡＲＡＭＨＳＲ，ＰＩＡＯＭＪ，ＫＡＮＧＫＡ，ｅｔａｌ．Ｎｏｎ－ｔｈｅｒｍａｌｇａｓ

ｐｌａｓｍａ－ｉｎｄｕｃｅｄｅｎｄｏｐｌａｓｍｉｃｒｅｔｉｃｕｌｕｍｓｔｒｅｓｓｍｅｄｉａｔｅｓａｐｏｐｔｏｓｉｓ

ｉｎｈｕｍａｎｃｏｌｏｎｃａｎｃｅｒｃｅｌｌｓ［Ｊ］．ＯｎｃｏｌｏｇｙＲｅｐｏｒｔｓ，２０１６，３６（４）：

ＡＤＡＲ１ｓｈＲＮＡ对人白血病细胞株Ｋ５６２细胞增殖的影响

胡　彬，张　蓉，刘小五，刘　赞，王刚峰，梁英民

ＥｆｆｅｃｔｓｏｆｓｈＲＮＡ－ＡＤＡＲＩｏｎｔｈｅｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎｏｆＫ５６２ｃｅｌｌｌｉｎｅ

ＨＵＢｉｎ，ＺＨＡＮＧＲｏｎｇ，ＬＩＵＸｉａｏｗｕ，ＬＩＵＺａｎ，ＷＡＮＧＧａｎｇｆｅｎｇ，ＬＩＡＮＧＹｉｎｇｍｉｎ

ＤｅｐａｒｔｍｅｎｔｏｆＨｅｍａｔｏｌｏｇｙ，Ｘｉ＇ａｎＧａｏｘｉｎＨｏｓｐｉｔａｌ，ＳｈａａｎｘｉＸｉ＇ａｎ７１００７５，Ｃｈｉｎａ．

【Ａｂｓｔｒａｃｔ】　Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ：ＴｏｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅｔｈｅｅｆｆｅｃｔｓｏｆｓｈＲＮＡ－ＡＤＡＲ１ｏｎｔｈｅｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎｏｆｈｕｍａｎＫ５６２ｃｅｌｌｌｉｎｅ．

Ｍｅｔｈｏｄｓ：ＴｈｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆＡＤＡＲ１ｉｎｐａｔｉｅｎｔｓｗｉｔｈｃｈｒｏｎｉｃｍｙｅｌｏｉｄｌｅｕｋｅｍｉａ（ＢＰ）ａｎｄｎｏｒｍａｌａｄｕｌｔｓｗａｓｄｅｔｅｃｔｅｄ

ｂｙｒｅａｌ－ｔｉｍｅｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅｐｏｌｙｍｅｒａｓｅｃｈａｉｎｒｅａｃｔｉｏｎａｎｄＷｅｓｔｅｒｎ－ｂｌｏｔ．ＡｓｔａｂｌｅＫ５６２ｃｅｌｌｌｉｎｅ

（ｓｈＡＤＡＲ１）ｗｉｔｈｋｎｏｃｋｄｏｗｎＡＤＡＲ１ｗａｓｅｓｔａｂｌｉｓｈｅｄｂｙｃｕｌｔｕｒｉｎｇｈｕｍａｎｌｅｕｋｅｍｉａｃｅｌｌｌｉｎｅＫ５６２ｃｅｌｌｓｗｉｔｈｌｅｎｔｉｖｉｒ

ｕｓｍｅｄｉａｔｅｄｓｉＲＮＡ．ＴｈｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆｍＲＮＡａｎｄｐｒｏｔｅｉｎｏｆＡＤＡＲ１ｉｎＫ５６２ｃｅｌｌｓａｎｄｓｈＡＤＡＲ１ｃｅｌｌｓｗａｓｄｅｔｅｃｔｅｄ

，ａｎｄｔｈｅｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎｏｆＫ５６２ｃｅｌｌｓｗａｓｄｅｔｅｃｔｅｄｂｙＭＴＴａｓｓａｙ．Ｒｅｓｕｌｔｓ：ＴｈｅｅｘｂｙｑＲＴ－ＰＣＲａｎｄＷｅｓｔｅｒｎ－ｂｌｏｔ

（ＢＰ）ｗａｓｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙｈｉｇｈｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆｍＲＮＡａｎｄｐｒｏｔｅｉｎｌｅｖｅｌｏｆＡＤＡＲ１ｉｎｐａｔｉｅｎｔｓｗｉｔｈｃｈｒｏｎｉｃｍｙｅｌｏｉｄｌｅｕｋｅｍｉａ

ｅｒｔｈａｎｔｈａｔｉｎｎｏｒｍａｌａｄｕｌｔｓ（Ｐ＜０．０５）．ＴｈｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆｍＲＮＡａｎｄｐｒｏｔｅｉｎｉｎＡＤＡＲ１ｉｎｓｈＡＤＡＲ１ｃｅｌｌｓｗａｓｓｉｇ

ｎｉｆｉｃａｎｔｌｙｌｏｗｅｒｔｈａｎｔｈａｔｉｎＫ５６２ｃｅｌｌｓ（Ｐ＜０．０５）．Ｄｏｗｎ－ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎｏｆＡＤＡＲ１ｃｏｕｌｄｉｎｈｉｂｉｔｃｅｌｌｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ（Ｐ

＜０．０５）．Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ：ＴｈｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆＡＤＡＲ１ｉｓｉｎｃｒｅａｓｅｄｉｎｐａｔｉｅｎｔｓｗｉｔｈｃｈｒｏｎｉｃｍｙｅｌｏｉｄｌｅｕｋｅｍｉａ（ＢＰ）．Ｉｎｈｉｂｉ

ｔｉｏｎｏｆＡＤＡＲ１ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｂｙｓｉＲＮＡｃａｎｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙｉｎｈｉｂｉｔｔｈｅｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎｏｆｈｕｍａｎｌｅｕｋｅｍｉａｃｅｌｌｌｉｎｅＫ５６２．Ａ

ＤＡＲ１ｇｅｎｅｍａｙｂｅａｎｅｗｔａｒｇｅｔｆｏｒｔｈｅｔｒｅａｔｍｅｎｔｏｆｃｈｒｏｎｉｃｍｙｅｌｏｉｄｌｅｕｋｅｍｉａ．

【Ｋｅｙｗｏｒｄｓ】ＡＤＡＲ１，ＣＭＬ，Ｋ５６２

ＭｏｄｅｒｎＯｎｃｏｌｏｇｙ２０２１，２９（０８）：１２９２－１２９５

【摘要】　目的：探讨ＡＤＡＲ１ｓｈＲＮＡ对人白血病细胞株Ｋ５６２细胞增殖的影响。方法：利用实时荧光定量聚合

ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅｒｅａｌｔｉｍｅＰＣＲ，ｑＲＴ－ＰＣＲ）和蛋白质印记法（Ｗｅｓｔｅｒｎ－ｂｌｏｔ）检测ＡＤＡＲ１在慢性粒细胞酶联反应（

白血病（急变期）患者和正常成人中的表达。培养人白血病细胞株Ｋ５６２细胞，用慢病毒介导的ｓｉＲＮＡ转染

Ｋ５６２细胞，建立稳定的敲减ＡＤＡＲ１的Ｋ５６２细胞株（ｓｈＡＤＡＲ１），ｑＲＴ－ＰＣＲ和Ｗｅｓｔｅｒｎ－ｂｌｏｔ方法检测Ｋ５６２

【收稿日期】　２０１９－１０－０８

【修回日期】　２０２０－０１－１８

【基金项目】　西安市科技计划项目［编号：２０１８０５０９５ＹＸ３ＳＦ２９（５）］

　西安高新医院血液科，陕西　西安　７１００７５【作者单位】

【作者简介】　胡彬（１９８８－），女，陕西人，主治医师，主要从事慢性白血病及造血干细胞移植相关研究。Ｅ－ｍａｉｌ：ｄｒｈｕｂｉｎ＠１６３．ｃｏｍ

【通讯作者】　梁英民（１９５７－），男，陕西人，主任医师，博士生导师，主要从事白血病及造血干细胞移植相关研究。Ｅ－ｍａｉｌ：ＬｉａｎｇＹｉｎｇｍｉｎ＠

ｆｍｍｕ．ｅｄｕ．ｃｎ

2024年4月21日发(作者：司寇若星)

现代肿瘤医学　２０２１年０４月　第２９卷第０８期　　ＭＯＤＥＲＮＯＮＣＯＬＯＧＹ，Ａｐｒ２０２１，ＶＯＬ２９，Ｎｏ０８

·１２８５·

论　　著

基础研究

Ｓｔｉｍ１在骨肉瘤组织和细胞中的表达水平及与顺铂耐药性的关系

傅　蔷

１

，史纪元

２

，赵　婷

１

，查鹭婷

１

，刘安生

１

，唐　娜

３

ｓｉｓｔａｎｃｅ

１２１１１３

ＦＵＱｉａｎｇ，ＳＨＩＪｉｙｕａｎ，ＺＨＡＯＴｉｎｇ，ＺＨＡＬｕｔｉｎｇ，ＬＩＵＡｎｓｈｅｎｇ，ＴＡＮＧＮａ

１

２

３ｎｄ

ＭｅｄｉｃａｌＣｏｌｌｅｇｅｏｆＪｉｎａｎＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，ＧｕａｎｇｄｏｎｇＳｈｅｎｚｈｅｎ５１８０２０，Ｃｈｉｎａ．

ｒｅｔｉｃｕｌｕｍｓｔｒｅｓｓ－ｉｎｄｕｃｅｄａｐｏｐｔｏｓｉｓ．

ＭｏｄｅｒｎＯｎｃｏｌｏｇｙ２０２１，２９（０８）：１２８５－１２９２

【摘要】　目的：探讨Ｓｔｉｍ１在骨肉瘤组织和细胞中的表达水平及与顺铂耐药性的关系。方法：采用免疫组织

０例骨肉瘤患者的肿瘤组织中Ｓｔｉｍ１的表达。通过用高浓度的顺铂处理人骨肉瘤细胞系Ｕ化学染色检测了５

－２ＯＳ来建立耐药性骨肉瘤细胞（Ｕ－２ＯＳ／ＤＤＰ细胞）。通过ＲＴ－ＰＣＲ和蛋白质印迹检测细胞中Ｓｔｉｍ１、

ＡＴＦ４、ＣＨＯＰ和ＧＲＰ７８的表达。通过转染人Ｓｔｉｍ１－ｓｉＲＮＡ或过表达Ｓｔｉｍ１的ｐＣＤＮＡ３－ＨＡ质粒来下调或上

调骨肉瘤细胞中Ｓｔｉｍ１的表达，并检测了细胞的钙离子内流情况。通过ＣＣＫ－８法检测细胞增殖，通过Ａｎ

双重染色法检测细胞凋亡。结果：Ｓｔｉｍ１的阳性表达与骨肉瘤患者的ＴＮＭ分期和远处转移ｎｅｘｉｎＶ－ＦＩＴＣ／ＰＩ

【收稿日期】　２０２０－０７－０２　　　【修回日期】　２０２０－０９－２０

ＪＣＹＪ２０１８０３０１１７００３５５３１）

１

西安市儿童医院血液肿瘤科，陕西　西安　７１０００３【作者单位】

２

３

陕西省人民医院骨科，陕西　西安　７１００６８

暨南大学第二临床医学院，深圳市人民医院病理科，广东　深圳　５１８０２０

·１２８６·

傅　蔷，等　　Ｓｔｉｍ１在骨肉瘤组织和细胞中的表达水平及与顺铂耐药性的关系

有关，Ｓｔｉｍ１阳性患者中，７４．１９％（２３例）为ＴＮＭ

Ⅲ

期，８７．１０％（２７例）发生远处转移。而Ｓｔｉｍ１阴性患者中，

２６．３１％（５例）为ＴＮＭ

Ⅲ

期，２６．３１％（５例）发生远处转移。顺铂耐药的骨肉瘤Ｕ－２ＯＳ／ＤＤＰ细胞中的Ｓｔｉｍ１

２ＯＳ细胞（Ｐ＜０．０５）。下调Ｓｔｉｍ１表达明显减少了Ｕ－２ＯＳ／ｍＲＮＡ和蛋白表达水平显著高于非耐药Ｕ－

ＤＤＰ细胞中的钙离子内流（Ｐ＜０．０５）；下调Ｓｔｉｍ１表达抑制了细胞的增殖并促进了细胞凋亡（Ｐ＜０．０５）。此

外，下调Ｓｔｉｍ１进一步提高了内质网应激分子标志物ＡＴＦ４、ＣＨＯＰ和ＧＲＰ７８的表达（Ｐ＜０．０５）。相反，上调

Ｓｔｉｍ１的表达则发挥了相反的作用。结论：Ｓｔｉｍ１在骨肉瘤患者中高表达并与不良预后有关。Ｓｔｉｍ１的高表达

ｔｉｍ１通过抑制钙离子内流并促进内质网应激诱导的细胞凋亡来降可增加骨肉瘤细胞的顺铂耐药性。下调Ｓ

低骨肉瘤细胞的顺铂耐药性。

【关键词】骨肉瘤；Ｓｔｉｍ１；顺铂耐药性；内质网应激；钙离子内流；细胞凋亡

【文章编号】１６７２－４９９２－（２０２１）０８－１２８５－０８

　　骨肉瘤是儿童和青少年中最常见的原发性恶性骨肿瘤，

约占所有儿科恶性肿瘤的２．４％

［１－３］

。骨肉瘤患者常用的化

疗药物包括顺铂、阿霉素和甲氨蝶呤，但化疗药物耐药情况

也越来越普遍。目前，对于临床治疗中骨肉瘤化学耐药性的

分子机制知之甚少。多项研究报道了Ｃａ

２＋

离子通道调节癌

细胞凋亡的关键作用

［４］

。钙库操纵的钙内流（ｓｔｏｒｅ－ｏｐｅｒａ

ｔｅｄｃａｌｃｉｕｍｅｎｔｒｙ，ＳＯＣＥ）已被确认为Ｃａ

２＋

进入非兴奋性细胞

的主要通道

［５］

。Ｓｔｉｍ１位于内质网（ｅｎｄｏｐｌａｓｍｉｃｒｅｔｉｃｕｌｕｍ，

ＥＲ）膜中，是钙库操纵的钙通道（ｓｔｏｒｅｏｐｅｒａｔｅｄｃａｌｃｉｕｍｃｈａｎ

ｎｅｌ，ＳＯＣＣ）的主要成分，也是内质网Ｃａ

２＋

的传感器

［６－８］

。先

前的研究表明Ｓｔｉｍ１在癌症发生中起着关键作用。在乳腺癌

动物模型中，敲低Ｓｔｉｍ１基因或抑制ＳＯＣＥ可降低肿瘤的转

移性

［９］

。此外，敲低Ｓｔｉｍ１抑制了肝癌细胞的迁移，并增加

了前列腺癌细胞的化疗敏感性

［１０］

。但是，Ｓｔｉｍ１在骨肉瘤中

的可能作用尚未完全解释。

　　内质网是必需的细胞器，在细胞存活和凋亡过程中发挥

重要作用。在多种刺激下，未折叠和未完全折叠的蛋白质会

积聚在内质网中，导致内质网应激。内质网在Ｃａ

２＋

稳态和

Ｃａ

２＋

信号传导中起着至关重要的作用

［１１］

。先前的研究报告

称，顺铂可诱导内质网应激，并激活ＡＴＦ４、ＣＨＯＰ和ＧＲＰ７８

等内质网应激的分子标记物

［１２］

。考虑到Ｓｔｉｍ１在内质网应

激和细胞凋亡中的重要作用，本研究推测Ｓｔｉｍ１可能参与癌

细胞的顺铂耐药性。

因此，本研究旨在探讨Ｓｔｉｍ１在骨肉瘤细胞中的表达水

平及与顺铂耐药性的关系及其可能机制。

１　材料与方法

１．１　材料

１．１．１　细胞与试剂　人成骨细胞系ｈＦＯＢ１．１９和人骨肉瘤

细胞系Ｕ－２ＯＳ购自美国典型培养物保藏中心（ＡＴＣＣ）；

ＲＰＭＩ１６４０培养基购自美国Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ公司；Ｓｔｉｍ１、ＡＴＦ４、

ＣＨＯＰ、ＧＲＰ７８和ＧＡＰＤＨ一抗购自美国ＳａｎｔａＣｒｕｚＢｉｏｔｅｃｈ

ｎｏｌｏｇｙ公司；辣根过氧化物酶标记的二抗购自北京中杉金桥

生物技术有限公司；３，３－二氨基联苯胺四盐酸盐购自美国

ｓｉｇｍａ公司；Ｔｒｉｚｏｌ试剂购自美国Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ公司；ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔＩＩ

ＲＴ试剂盒购自美国Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ公司；ＳＹＢＲＧｒｅｅｎ实时ＰＣＲ

试剂盒购自美国Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ公司；ＲＩＰＡ裂解液购自中科瑞泰

（北京）生物科技有限公司；ＢＣＡ蛋白质测定试剂盒购自上

海碧云天生物技术有限公司；聚偏二氟乙烯（ＰＶＤＦ）膜购自

美国Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ公司；ＥＣＬ检测试剂盒购自上海碧云天生物技

术有限公司；Ｆｕｒａ２－ＡＭ购自美国Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ公司；改良

Ｋｒｅｂｓ－Ｈｅｎｓｅｌｅｉｔ溶液购自北京雷根生物技术有限公司；

Ｓｔｉｍ１－ｓｉＲＮＡ购自上海吉玛制药技术有限公司；Ｈｉｐｅｒｆｅｃｔ

ＴｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎＲｅａｇｅｎｔ购自美国Ｑｉａｇｅｎ公司；ＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅＰｌｕｓ

试剂购自美国Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ公司；Ｏｐｔｉ－ＭＥＭ培养基购自Ｉｎ

ｖｉｔｒｏｇｅｎ；ＣＣＫ－８试剂购自日本ＤｏｊｉｎｄｏＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ公司；Ａｎ

ｎｅｘｉｎＶ－ＦＩＴＣ／ＰＩ双重染色试剂购自江苏凯基生物技术股份

有限公司；ＦＡＣ－Ｓｃａｎ流式细胞仪购自美国ＢＤＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ

公司。

１．１．２　患者和标本收集　５０例骨肉瘤组织及配对的癌旁组

织标本取自我院手术切除的骨肉瘤患者，患者先前均未进行

任何化放疗及药物治疗。所有组织标本均用石蜡包埋进行

免疫组织化学染色，或保存在液氮中进行ＲＴ－ＰＣＲ和Ｗｅｓｔ

ｅｒｎｂｌｏｔ分析。

１．２　方法

１．２．１　细胞培养　将人成骨细胞系ｈＦＯＢ１．１９和人骨肉瘤

细胞系Ｕ－２ＯＳ在含有１０％ＦＢＳ、１００Ｕ／ｍＬ青霉素和１００

ｇ／ｍＬ链霉素的ＲＰＭＩ１６４０中培养，培养条件为３７℃、５％

ＣＯ

２

。顺铂耐药的Ｕ－２ＯＳ（Ｕ－２ＯＳ／ＤＤＰ）细胞通过以高浓

度顺铂培养进行建立，接种后每周两次添加顺铂，每２个月

通过ＭＴＴ分析法分析细胞存活率。顺铂对Ｕ－２ＯＳ的ＩＣ

５０

值为１０

ｇ／ｍＬ。与未处理的Ｕ－２ＯＳ细胞相比，Ｕ－２ＯＳ／

ＤＤＰ细胞对顺铂的耐药性增加了３倍。分别将Ｕ－２ＯＳ细

胞和Ｕ－２ＯＳ／ＤＤＰ细胞用５

ｇ／ｍＬ的顺铂处理２４ｈ。

１．２．２　免疫组织化学　免疫组织化学用于检测Ｓｔｉｍ１在组

织标本中的表达。将石蜡包埋的组织标本切成５

ｍ厚的切

片，并进行脱蜡和再水化。抗原修复后，将切片与３％过氧化

氢孵育１０ｍｉｎ以阻断内切酶过氧化物酶活性，然后与Ｓｔｉｍ１

一抗（１∶５００稀释）在４℃下孵育过夜。用ＰＢＳ冲洗后，将切

片与辣根过氧化物酶标记的二抗孵育１ｈ。然后应用３，３－

二氨基联苯胺四盐酸盐（ＤＡＢ）进行显色。在奥林巴斯光学

显微镜下观察切片。阳性细胞被染为棕色或深棕色，在２００

×放大倍数下随机选择５个视野计算阳性细胞百分比。将

≥

５０％细胞阳性染色的样本定义为阳性。将＜５０％细胞阳

性染色的样本定义为阴性。

１．２．３　ＲＮＡ提取和ＲＴ－ＰＣＲ　根据试剂盒说明书，使用

Ｔｒｉｚｏｌ试剂提取总ＲＮＡ。使用ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔＩＩＲＴ试剂盒对分

离的ＲＮＡ进行反转录。通过ＳＹＢＲＧｒｅｅｎ实时ＰＣＲ试剂盒

在ＡＢＩＰｒｉｓｍ７３００型荧光定量ＰＣＲ仪上进行ＲＴ－ＰＣＲ。设计

引物序列（表１），ＧＡＰＤＨ用作内部对照，根据２

－

△△

Ｃｔ

法计算

Ｓｔｉｍ１ｍＲＮＡ的相对表达量。

现代肿瘤医学　２０２１年０４月　第２９卷第０８期　　ＭＯＤＥＲＮＯＮＣＯＬＯＧＹ，Ａｐｒ２０２１，ＶＯＬ２９，Ｎｏ０８

表１　引物序列信息

Ｔａｂ．１　Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎｏｆｐｒｉｍｅｒｓｅｑｕｅｎｃｅ

ＰｒｉｍｅｒｎａｍｅＰｒｉｍｅｒｓｅｑｕｅｎｃｅ（５＇－３＇）

Ｓｔｉｍ１

ＡＴＦ４

ＣＨＯＰ

ＧＲＰ７８

ＧＡＰＤＨ

Ｆ：ＧＡＡＣＧＣＴＡＴＣＣＡＡＣＴＧＴＧＧＴ

Ｒ：ＡＡＴＴＡＣＴＴＣＴＧＣＣＣＡＴＧＣＣＣ

Ｆ：ＣＴＴＧＡＴＴＧＴＧＡＣＧＣＣＡＡＴＡＴＧＧＡＴＴ

Ｒ：ＧＴＡＣＴＧＧＣＣＡＧＴＧＴＣＡＧＣＡＴＡＴＧＴＧＡ

Ｆ：ＧＧＡＣＧＴＡＣＧＡＴＣＴＡＴＧＴＧＣＣＣＡＣＣＧ

Ｒ：ＧＴＣＴＡＡＣＣＡＴＡＧＧＧＣＴＧＴＡＴＧＣＣＣＡ

Ｆ：ＣＴＡＣＴＡＴＡＴＧＧＣＧＴＡＡＴＴＧＡＣＡＣＡＧＴＴＴＴＴ

Ｒ：ＣＧＣＣＣＣＡＡＴＡＣＧＧＡＧＡＣＡＴＧＴＡＡＴＴＡＴＧＴＧＡ

：ＧＣＡＣＧＣＣＡＣＧＧＴＡＣＣＣＡＴＧＣＴＦ

Ｒ：ＡＧＣＧＧＴＡＣＧＣＡＴＡＧＴＣＧＧＣＣＴ

·１２８７·

表达Ｓｔｉｍ１的骨肉瘤细胞（Ｓｔｉｍ１－ｐＣＤＮＡ３），将空载质粒作

为对照（ＮＣ－ｐＣＤＮＡ３）。根据制造商的说明，将Ｌｉｐｏ

试剂加入Ｏｐｔｉ－ＭＥＭ培养基（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中，ｆｅｃｔａｍｉｎｅＰｌｕｓ

并将Ｓｔｉｍ１质粒瞬时转染细胞２４ｈ。

３

１．２．８　细胞活力测定　将细胞以５×１０个细胞／孔的密度

接种在９６孔板中过夜。然后添加ＣＣＫ－８并在３７℃下孵育

２ｈ。用酶标仪在４５０ｎｍ下测量每个孔的吸光度。

１．２．９　细胞凋亡测定　根据试剂盒说明书，通过ＡｎｎｅｘｉｎＶ

－ＦＩＴＣ／ＰＩ双重染色法测定Ｕ－２ＯＳ细胞或Ｕ－２ＯＳ／ＤＤＰ

细胞凋亡。用ＦＡＣ－Ｓｃａｎ流式细胞仪对凋亡细胞进行计数。

１．３　统计学分析

采用ＳＰＳＳ２２．０统计软件进行数据分析，数据结果表示

为平均值±标准差，通过单因素方差分析（ＡＮＯＶＡ）或ｔ检验

２

比较计量资料的组间差异；通过

检验比较计数资料的组

间差异；Ｐ＜０．０５表示差异具有统计学意义。

１．２．４　蛋白质印迹分析　使用含有蛋白酶抑制剂混合物的

冰ＲＩＰＡ裂解液对组织或细胞进行裂解。通过ＢＣＡ蛋白质

测定试剂盒确定蛋白质含量。通过８％的ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分离

３０

ｇ蛋白质并转移至聚偏二氟乙烯（ＰＶＤＦ）膜。将膜用

５％脱脂牛奶封闭１ｈ，然后与一抗在４℃下孵育过夜。一抗

ｔｉｍ１、ＡＴＦ４、ＣＨＯＰ、ＧＲＰ７８和ＧＡＰＤＨ，均以１∶１０００稀包括Ｓ

释。洗涤后，将膜与辣根过氧化物酶标记的二抗在室温下孵

育１ｈ，然后通过ＥＣＬ检测试剂盒进行显影。

１．２．５　钙离子内流的检测　将２

ｍｏｌ／ＬＦｕｒａ２－ＡＭ装入

２ｍＬ改良Ｋｒｅｂｓ－Ｈｅｎｓｅｌｅｉｔ溶液中，并在３７℃下孵育３０

２＋

ｍｉｎ。用１

ｍｏｌ／Ｌｔｈａｐｓｉｇａｒｇｉｎ（Ｔｇ）耗尽Ｃａ库，然后添加２

２＋

ｍｍｏｌ／ＬＣａ。用带有３４０和３８０ｎｍ波长滤波器的奥林巴

２　结果

２．１　Ｓｔｉｍ１表达与骨肉瘤临床参数的关系

结果显示，Ｓｔｉｍ１阳性细胞被染为棕色或深棕色，阴性细

胞未染色。将

≥

５０％细胞阳性染色的样本定义为阳性（图

１）。在本研究中，癌旁组织标本中共有１４份Ｓｔｉｍ１阳性和

３６份Ｓｔｉｍ１阴性，阳性率为２８．００％；骨肉瘤组织中共有３１

份Ｓｔｉｍ１阳性和１９份Ｓｔｉｍ１阴性，阳性率为６２．００％。癌旁

２

组织和骨肉瘤组织的Ｓｔｉｍ１阳性率有显著差异（１１．６７７，

＝

Ｐ＝０．００１）。此外，Ｓｔｉｍ１的阳性表达与骨肉瘤患者的ＴＮＭ

分期和远处转移有关（Ｐ＜０．０５），Ｓｔｉｍ１阳性患者中，７４．１９％

（２３例）为ＴＮＭ

Ⅲ

期，８７．１０％（２７例）发生远处转移。而

Ｓｔｉｍ１阴性患者中，２６．３１％（５例）为ＴＮＭ

Ⅲ

期，２６．３１％（５

例）发生远处转移。而Ｓｔｉｍ１的阳性表达与骨肉瘤患者的年

Ｐ＞０．０５）（表２）。龄、性别和肿瘤大小无关（

Ｓｔｉｍ１在人成骨细胞系ｈＦＯＢ１．１９和人骨肉瘤细胞系Ｕ

－２ＯＳ中的表达模式与其在癌旁组织和骨肉瘤组织中的表

达模式一致，与ｈＦＯＢ１．１９细胞相比，Ｕ－２ＯＳ细胞中Ｓｔｉｍ１

的ｍＲＮＡ和蛋白表达水平分别显著升高了２．７９倍和３．１４

倍（Ｐ＜０．０５）（图２）。

斯ＩＸ８１倒置荧光显微镜检查钙离子内流情况，并用Ｏｌｙｍｐｕｓ

Ｃｅｌｌ＾Ｒ软件进行分析。随机选择１０个视野评估平均荧光。

１．２．６　ｓｉＲＮＡ转染　通过转染人Ｓｔｉｍ１－ｓｉＲＮＡ敲低骨肉

瘤细胞中Ｓｔｉｍ１。靶向Ｓｔｉｍ１的ｓｉＲＮＡ序列是５＇－ＧＧＣＴＣＴＧ

。非特异性ｓｉＲＮＡ寡核苷酸（ＮＣ－ＧＡＴＡＣＡＧＴＧＣＴＣ－３＇

ｓｉＲＮＡ）用作阴性对照。按照制造商的说明，用Ｈｉｐｅｒｆｅｃｔ

ＴｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎＲｅａｇｅｎｔ转染ｓｉＲＮＡ。

１．２．７　质粒转染　委托上海吉玛制药技术有限公司将人

Ｓｔｉｍ１的全长ｃＤＮＡ克隆到ｐＣＤＮＡ３－ＨＡ质粒载体中构建过

图１　免疫组化检测Ｓｔｉｍ１在骨肉瘤组织中的阳性和阴性表达（×２００）

２．２　Ｓｔｉｍ１表达与骨肉瘤细胞顺铂耐药性的关系

结果显示，顺铂耐药的骨肉瘤Ｕ－２ＯＳ／ＤＤＰ细胞中的

Ｓｔｉｍ１ｍＲＮＡ和蛋白表达水平显著高于对照Ｕ－２ＯＳ细胞（Ｐ

＜０．０５）。顺铂处理２４ｈ（５

ｇ／ｍＬ）后，Ｕ－２ＯＳ和Ｕ－２

ｔｉｍ１表达水平均显著降低，但顺铂处理后ＯＳ／ＤＤＰ细胞中Ｓ

Ｕ－２ＯＳ／ＤＤＰ细胞中Ｓｔｉｍ１表达水平仍高于Ｕ－２ＯＳ细胞

（Ｐ＜０．０５）（图３）。

·１２８８·

傅　蔷，等　　Ｓｔｉｍ１在骨肉瘤组织和细胞中的表达水平及与顺铂耐药性的关系

表２　Ｓｔｉｍ１表达与骨肉瘤临床参数的关系

细胞。此外，顺铂处理后，Ｕ－２ＯＳ和Ｕ－２ＯＳ／ＤＤＰ－２ＯＳ

细胞中钙离子内流均被抑制，但顺铂处理后Ｕ－２ＯＳ／ＤＤＰ

细胞的钙离子内流仍高于Ｕ－２ＯＳ细胞（Ｐ＜０．０５）（图４）。

２．４　顺铂对骨肉瘤细胞内质网应激的影响

结果显示，Ｕ－２ＯＳ／ＤＤＰ细胞的内质网应激分子标记物

（ＡＴＦ４、ＣＨＯＰ和ＧＲＰ７８）的ｍＲＮＡ和蛋白表达水平显著低

２ＯＳ细胞（Ｐ＜０．０５）。顺铂处理后，Ｕ－２ＯＳ和Ｕ－２于Ｕ－

ＯＳ／ＤＤＰ细胞中ＡＴＦ４、ＣＨＯＰ和ＧＲＰ７８的ｍＲＮＡ和蛋白表

达水平均显著上调（Ｐ＜０．０５），但顺铂处理后Ｕ－２ＯＳ／ＤＤＰ

细胞的ＡＴＦ４、ＣＨＯＰ和ＧＲＰ７８的ｍＲＮＡ和蛋白表达水平低

２ＯＳ细胞（图５）。于Ｕ－

２．５　下调Ｓｔｉｍ１对顺铂耐药的骨肉瘤细胞的增殖、凋亡、钙

离子内流和内质网应激的影响

结果显示，转染ｓｉＲＮＡ敲低了Ｕ－２ＯＳ／ＤＤＰ细胞中

Ｓｔｉｍ１ｍＲＮＡ的表达。下调Ｓｔｉｍ１表达明显减少了Ｕ－２ＯＳ／

Ｔａｂ．２　ＲｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐｂｅｔｗｅｅｎＳｔｉｍ１ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎａｎｄｃｌｉｎｉｃａｌｐａｒａｍｅｔｅｒｓｏｆ

ｏｓｔｅｏｓａｒｃｏｍａ

Ｐａｒａｍｅｔｅｒｓ

Ａｇｅ（ｙｅａｒｓ）

　＜６

≥

６

Ｇｅｎｄｅｒ

　Ｍａｌｅ

　Ｆｅｍａｌｅ

Ｔｕｍｏｒｓｉｚｅ（ｃｍ）

　＜５

≥

５

ＴＮＭｓｔａｇｅ

Ⅰ

Ⅱ

Ⅲ

Ｄｉｓｔａｎｔｍｅｔａｓｔａｓｅｓ

　Ｎｏ

　Ｙｅｓ

ｅｇａｔｉｖｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎＰｏｓｉｔｉｖｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎＮ

（ｎ＝３１）ｏｆＳｔｉｍ１

１６

１５

１６

１５

１７

１４

２

６

２３

４

２７

ｏｆＳｔｉｍ１（ｎ＝１９）

１３

６

０．００５０．９４４

１０

９

０．９０５０．３４４

１３

６

１０．９９５０．００４

３

１１

５

１８．８８９＜０．００１

１４

５

２

Ｐ

１．３６６０．２４２

ＤＤＰ细胞中的钙离子内流（Ｐ＜０．０５）。顺铂处理均抑制了Ｕ

－２ＯＳ／ＤＤＰ细胞的增殖并促进了细胞凋亡（Ｐ＜０．０５）。然

而，下调Ｓｔｉｍ１进一步抑制了细胞的增殖并促进了细胞凋亡。

同时，下调Ｓｔｉｍ１进一步提高了ＡＴＦ４、ＣＨＯＰ和ＧＲＰ７８

ｍＲＮＡ的表达（Ｐ＜０．０５）（图６）。

２．３　顺铂对骨肉瘤细胞钙离子内流的影响

结果显示，Ｕ－２ＯＳ／ＤＤＰ细胞的钙离子内流显著高于Ｕ

图２　Ｓｔｉｍ１在人成骨细胞系ｈＦＯＢ１．１９和人骨肉瘤细胞系Ｕ－２ＯＳ中的表达



Ｐ＜



Ｐ

＜０．０５．

图３　顺铂处理２４ｈ（５

ｇ／ｍＬ）对Ｕ－２ＯＳ和Ｕ－２ＯＳ／ＤＤＰ细胞中Ｓｔｉｍ１表达的影响



Ｐ＜

＜０．０５；与Ｕ－２ＯＳ／ＤＤＰ细胞比较，＆Ｐ＜０．０５。

Ｆｉｇ．３　Ｅｆｆｅｃｔｏｆｃｉｓｐｌａｔｉｎｔｒｅａｔｍｅｎｔｆｏｒ２４ｈ（５

ｇ／ｍＬ）ｏｎｔｈｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆＳｔｉｍ１ｉｎＵ－２ＯＳａｎｄＵ－２ＯＳ／ＤＤＰｃｅｌｌｓ



Ｐ＜

现代肿瘤医学　２０２１年０４月　第２９卷第０８期　　ＭＯＤＥＲＮＯＮＣＯＬＯＧＹ，Ａｐｒ２０２１，ＶＯＬ２９，Ｎｏ０８

·１２８９·

ＤＤＰ细胞中Ｓｔｉｍ１ｍＲＮＡ的表达显著上调（Ｐ＜０．０５）。与下

ｔｉｍ１表达对骨肉瘤细胞行为的影响效果相反，上调Ｓｔｉｍ１调Ｓ

表达显著促进了Ｕ－２ＯＳ／ＤＤＰ细胞中的钙离子内流（Ｐ＜

０．０５）。并且上调Ｓｔｉｍ１表达降低了顺铂对细胞增殖的抑制

作用和对细胞凋亡的促进作用。同时，上调Ｓｔｉｍ１表达抑制

ＴＦ４、ＣＨＯＰ和ＧＲＰ７８ｍＲＮＡ的表达（图７）。了Ａ

３　讨论

Ｓｔｉｍ１位于内质网膜中，是钙库操纵的钙通道（ＳＯＣＥ）的

２＋６－８］

主要成分，也是内质网Ｃａ的传感器

［

。Ｓｔｉｍ１在癌症发

ｔｉｍ１在大多数骨肉瘤患者生中起着关键作用。本研究发现Ｓ

图４　顺铂处理２４ｈ（５

ｇ／ｍＬ）对Ｕ－２ＯＳ和Ｕ－２ＯＳ／ＤＤＰ细胞钙

离子内流的影响

　与Ｕ－２ＯＳ细胞比较，０．０５；与Ｕ－２ＯＳ＋ＤＤＰ细胞比较，＃Ｐ



Ｐ＜

＜０．０５；与Ｕ－２ＯＳ／ＤＤＰ细胞比较，＆Ｐ＜０．０５。

Ｆｉｇ．４　Ｅｆｆｅｃｔｏｆｃｉｓｐｌａｔｉｎｔｒｅａｔｍｅｎｔｆｏｒ２４ｈ（５

ｇ／ｍＬ）ｏｎｃａｌｃｉｕｍｉｎ

ｆｌｕｘｉｎＵ－２ＯＳａｎｄＵ－２ＯＳ／ＤＤＰｃｅｌｌｓ

　ＣｏｍｐａｒｅｄｗｉｔｈＵ－２ＯＳｃｅｌｌｓ，０．０５；ＣｏｍｐａｒｅｄｗｉｔｈＵ－２ＯＳ＋



Ｐ＜

，＃Ｐ＜０．０５；ＣｏｍｐａｒｅｄｗｉｔｈＵ－２ＯＳ／ＤＤＰｃｅｌｌｓ，＆Ｐ＜ＤＤＰｃｅｌｌｓ

０．０５．

中高表达，并且Ｓｔｉｍ１的阳性表达与骨肉瘤患者的ＴＮＭ分期

和远处转移有关。其他研究中报道，在乳腺癌动物模型中，

９］

敲低Ｓｔｉｍ１基因可降低肿瘤的转移性

［

。与非肿瘤组织相

比，Ｓｔｉｍ１在肝癌组织中过表达，敲低Ｓｔｉｍ１抑制了肝癌细胞

１０］

的迁移，并增加了前列腺癌细胞的化疗敏感性

［

。此外，

Ｓｔｉｍ１的下调促进了非小细胞肺癌细胞中顺铂诱导的细胞凋

１３］

亡

［

。基于上述研究结果，可知Ｓｔｉｍ１在大多数癌症中扮演

癌基因的角色，并且可能参与调控癌细胞的生物学功能及化

疗耐药性。本研究还显示顺铂耐药的骨肉瘤Ｕ－２ＯＳ／ＤＤＰ

细胞中的Ｓｔｉｍ１表达水平明显上调，说明Ｓｔｉｍ１不仅参与骨

肉瘤的发病过程，而且与骨肉瘤细胞化疗耐药性有关，Ｓｔｉｍ１

可作为骨肉瘤预后的检测指标。

２．６　上调Ｓｔｉｍ１表达对顺铂耐药的骨肉瘤细胞增殖、凋亡、

钙离子内流和内质网应激的影响

本研究将顺铂耐药的Ｕ－２ＯＳ／ＤＤＰ细胞用过表达

Ｓｔｉｍ１的ｐＣＤＮＡ３－ＨＡ质粒进行转染，结果显示Ｕ－２ＯＳ／

图５　顺铂处理２４ｈ（５

ｇ／ｍＬ）对Ｕ－２ＯＳ和Ｕ－２ＯＳ／ＤＤＰ细胞中内质网应激标志物ＡＴＦ４、ＣＨＯＰ和ＧＲＰ７８表达的影响



Ｐ＜

Ｕ－２ＯＳ／ＤＤＰ细胞比较，＆Ｐ＜０．０５。

Ｆｉｇ．５　Ｅｆｆｅｃｔｏｆｃｉｓｐｌａｔｉｎｔｒｅａｔｍｅｎｔｆｏｒ２４ｈ（５

ａｎｄＵ－２ＯＳ／ＤＤＰｃｅｌｌｓ



Ｐ＜

Ｕ－２ＯＳ＋ＤＤＰｃｅｌｌｓ，＃Ｐ＜０．０５；ＣｏｍｐａｒｅｄｗｉｔｈＵ－２ＯＳ／ＤＤＰｃｅｌｌｓ，＆Ｐ＜０．０５．

２＋

　　细胞内Ｃａ在调节多种细胞过程中起着至关重要的作能与细胞内钙离子浓度有关。由于Ｓｔｉｍ１是ＳＯＣＥ的主要成

２＋４－５］

分，而ＳＯＣＥ是Ｃａ进入非兴奋性细胞的主要通道

［

。其用，包括神经兴奋、骨骼肌收缩、内皮细胞增殖和巨噬细胞活

１４］２＋

。此外，Ｃａ离子通道通过调节癌细胞凋亡介导化疗化

［

２＋

耐药性，使用Ｃａ通道抑制剂处理癌细胞可明显促进细胞

ＯＣＥ通过促进自噬和细胞凋亡而增加肝他研究报道，抑制Ｓ

４］

癌细胞对５－氟尿嘧啶的敏感性

［

。因此，本研究推测下调

２ＯＳ／ＤＤＰ细胞的钙离凋亡。本研究发现，顺铂耐药的Ｕ－

子内流显著高于非耐药细胞。说明骨肉瘤的顺铂耐药性可

Ｓｔｉｍ１可能通过关闭ＳＯＣＥ通道进而抑制钙离子内流来诱导

细胞凋亡，从而降低顺铂耐药性。

··１２９０

傅　蔷，等　　Ｓｔｉｍ１在骨肉瘤组织和细胞中的表达水平及与顺铂耐药性的关系

图６　下调Ｓｔｉｍ１对顺铂耐药的骨肉瘤细胞的增殖、凋亡、钙离子内流和内质网应激的影响



Ｐ＜

＃Ｐ＜０．０５；与Ｓｔｉｍ１－ｓｉＲＮＡ组比较，＆Ｐ＜０．０５。ｓｉＲＮＡ＋ＤＤＰ组比较，

ｍａｃｅｌｌｓ



Ｐ＜

ｗｉｔｈＳｔｉｍ１－ｓｉＲＮＡｇｒｏｕｐ，＆Ｐ＜０．０５．

２＋２＋

　　另外，内质网应激对Ｃａ稳态和Ｃａ信号传导以及化ＲＰ７８可促高表达可能会增加癌细胞的化疗耐药性，因为Ｇ

１７］

进未折叠蛋白的折叠

［

。但是，如果内质网应激持续存在，疗敏感性具有重要的调节作用

［１１，１５］

。先前的研究报告称，顺

１１－１２］

铂可诱导内质网应激从而促进细胞凋亡

［

。本研究发则ＧＲＰ７８的高表达可促进介导细胞凋亡的ＡＴＦ４和ＣＨＯＰ

的表达，从而促进细胞凋亡，并抵消ＧＲＰ７８的促生存作

１８］

用

［

。上述结果说明下调Ｓｔｉｍ１通过抑制钙离子内流并促

现，顺铂耐药的骨肉瘤细胞中的ＡＴＦ４、ＣＨＯＰ和ＧＲＰ７８的表

达水平显著低于非耐药细胞，顺铂处理可促进上述内质网应

激标志物的表达，但顺铂耐药的细胞中的ＡＴＦ４、ＣＨＯＰ和

ＧＲＰ７８的表达水平始终低于非耐药细胞。上述结果说明骨

肉瘤的顺铂耐药机制涉及内质网应激的抑制。其他研究报

２＋

道，内质网内的Ｃａ耗竭是内质网应激诱导细胞凋亡发生

１６］２＋

的主要原因

［

，由于Ｓｔｉｍ１是Ｃａ感受器，因此，本研究推

２＋

测下调Ｓｔｉｍ１可能通过引起Ｃａ耗竭来诱导内质网应激从

进内质网应激诱导的细胞凋亡来降低骨肉瘤细胞的顺铂耐

药性。而骨肉瘤细胞中Ｓｔｉｍ１的高表达通过相同的机制提高

了顺铂的耐药性。

　　本研究的不足之处在于以下几个方面：首先，在部分骨

肉瘤组织中，Ｓｔｉｍ１仍为低表达模式，因此Ｓｔｉｍ１在骨肉瘤诊

断和预后判断中的作用仍需要进一步分析论证；其次，本研

究未能说明Ｓｔｉｍ１调控钙离子内流及内质网应激的确切分子

及信号传导途径；最后，本研究未能进行体内动物实验验证

本研究的结果及推论。上述几项不足之处也是本课题组接

下来的主要研究方向。总之，本研究表明Ｓｔｉｍ１在骨肉瘤患

者中高表达并与不良预后有关。Ｓｔｉｍ１的高表达可增加骨肉

瘤细胞的顺铂耐药性。下调Ｓｔｉｍ１通过抑制钙离子内流并促

进内质网应激诱导的细胞凋亡来降低骨肉瘤细胞的顺铂耐

药性。

而促进骨肉瘤细胞凋亡。

ｔｉｍ１在骨肉瘤细胞顺铂耐药中的为了验证前文中关于Ｓ

作用假设，本研究通过转染靶向Ｓｔｉｍ１的ｓｉＲＮＡ敲低了顺铂

耐药的Ｕ－２ＯＳ／ＤＤＰ细胞中Ｓｔｉｍ１的表达，并通过转染过表

达Ｓｔｉｍ１的ｐＣＤＮＡ３－ＨＡ质粒来上调Ｓｔｉｍ１的表达。研究发

现，下调Ｓｔｉｍ１抑制了骨肉瘤细胞的钙离子内流和细胞增殖，

并促进了细胞凋亡。此外，下调Ｓｔｉｍ１进一步提高了内质网

应激分子标志物ＡＴＦ４、ＣＨＯＰ和ＧＲＰ７８的表达。然而，上调

Ｓｔｉｍ１表达则可发挥相反的作用。值得注意的是，ＧＲＰ７８的

现代肿瘤医学　２０２１年０４月　第２９卷第０８期　　ＭＯＤＥＲＮＯＮＣＯＬＯＧＹ，Ａｐｒ２０２１，ＶＯＬ２９，Ｎｏ０８

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图７　上调Ｓｔｉｍ１表达对顺铂耐药的骨肉瘤细胞的增殖、凋亡、钙离子内流和内质网应激的影响

０．０５；与ＮＣ－ｐＣＤＮＡ３＋ＤＤＰ组比较，＃Ｐ＜０．０５；与Ｓｔｉｍ１－ｐＣＤＮＡ３组比较，＆Ｐ＜０．０５。ＮＡ３组比较，



Ｐ＜



Ｐ＜

，＃Ｐ＜０．０５；ＣｏｍｐａｒｅｄｗｉｔｈＳｔｉｍ１－ｐＣＤＮＡ３ｇｒｏｕｐ，＆Ｐ＜０．０５．ｇｒｏｕｐ

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（ＳＯＣＥ）ｉｎｔｏｍｕｒｉｎｅｔｈｕｓａｔｔｅｎｕａｔｉｎｇｓｔｏｒｅｏｐｅｒａｔｅｄｃａｌｃｉｕｍｅｎｔｒｙ

＋

ＣＤ４ＴｃｅｌｌｓａｎｄｈｕｍａｎｌｅｕｋａｅｍｉｃＴｃｅｌｌｌｙｍｐｈｏｂｌａｓｔｓ［Ｊ］．Ｏｎｃｏ

２＋

＋

２＋

ａｎｄｃＡＭＰｓｉｇｎａｌｉｎｇｄｕｒｉｎｇｍｅｌａａｄｅｎｙｌｙｌｃｙｃｌａｓｅ６ｃｏｎｎｅｃｔｓＣａ

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（２３）：１４５８－１４６５．

ＦＵＺＬ，ＧＯＮＧＸＹ，ＣＨＥＮＣ，ｅｔａｌ．Ｔｈｅｒｅｇｕｌａｔｏｒｙｅｆｆｅｃｔｓｏｆｓｔｒｏｍａｌ

２＋２＋

ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎａｌｍｏｌｅｃｕｌｅ－２ｏｎＣａｒｅｌｅａｓｅａｃｔｉｖａｔｅｄＣａｃｈａｎｎｅｌ

Ｊ］．ＣｈｉｎｅｓｅＪｏｕｒｎａｌｏｆＯｒｔｈｏｐａｅｄｉｃｓ，２０１８，３８ｏｆｃｈｏｎｄｒｏｃｙｔｅｓ［

（２３）：１４５８－１４６５．

［８］　王腊梅，钟华，唐娜，等．钙敏感受体介导的人脐静脉内皮细胞

ＲＰＣ１与ＳＴＩＭ１的相互作用钙内流及一氧化氮生成过程中Ｔ

［Ｊ］．中华心血管病杂志，２０１７，４５（１１）：９７８－９８４．

ＷＡＮＧＬＭ，ＺＨＯＮＧＨ，ＴＡＮＧＮ，ｅｔａｌ．ＩｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｂｅｔｗｅｅｎＴＲＰＣ１

ａｎｄＳＴＩＭ１ｉｎｃａｌｃｉｕｍｓｅｎｓｉｎｇｒｅｃｅｐｔｏｒｍｅｄｉａｔｅｄｃａｌｃｉｕｍｉｎｆｌｕｘａｎｄ

ｎｉｔｒｉｃｏｘｉｄｅｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎｉｎｈｕｍａｎｕｍｂｉｌｉｃａｌｖｅｉｎｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌｃｅｌｌｓ

［Ｊ］．ＣｈｉｎｅｓｅＪｏｕｒｎａｌｏｆＣａｒｄｉｏｌｏｇｙ，２０１７，４５（１１）：９７８－９８４．

［９］　ＹＡＮＧＳ，ＺＨＡＮＧＪＪ，ＨＵＡＮＧＸＹ．Ｏｒａｉ１ａｎｄＳＴＩＭ１ａｒｅｃｒｉｔｉｃａｌ

［Ｊ］．ＣａｎｃｅｒＣｅｌｌ，ｆｏｒｂｒｅａｓｔｔｕｍｏｒｃｅｌｌｍｉｇｒａｔｉｏｎａｎｄｍｅｔａｓｔａｓｉｓ

２００９，１５（２）：１２４－１３４．

［１０］　ＹＡＮＧＮ，ＴＡＮＧＹ，ＷＡＮＧＦ，ｅｔａｌ．Ｂｌｏｃｋａｄｅｏｆｓｔｏｒｅ－ｏｐｅｒａｔｅｄ

２＋

Ｃａｅｎｔｒｙｉｎｈｉｂｉｔｓｈｅｐａｔｏｃａｒｃｉｎｏｍａｃｅｌｌｍｉｇｒａｔｉｏｎａｎｄｉｎｖａｓｉｏｎ

［Ｊ］．ＣａｎｃｅｒＬｅｔｔｅｒｓ，２０１３，ｂｙｒｅｇｕｌａｔｉｎｇｆｏｃａｌａｄｈｅｓｉｏｎｔｕｒｎｏｖｅｒ

３３０（２）：１６３－１６９．

［１１］　ＳＭＥＤＬＥＲＥ，ＵＨＬＥＮＰ．Ｆｒｅｑｕｅｎｃｙｄｅｃｏｄｉｎｇｏｆｃａｌｃｉｕｍｏｓｃｉｌｌａ

ｔｉｏｎｓ［Ｊ］．ＢｉｏｃｈｉｍＢｉｏｐｈｙｓＡｃｔａ，２０１４，１８４０（３）：９６４－９６９．

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［６］　ＭＯＴＩＡＮＩＲＫ，ＴＡＮＷＡＲＪ，ＲＡＪＡＤＡ，ｅｔａｌ．ＳＴＩＭ１ａｃｔｉｖａｔｉｏｎｏｆ

·１２９２·

胡　彬，等　　ＡＤＡＲ１ｓｈＲＮＡ对人白血病细胞株Ｋ５６２细胞增殖的影响

２２６８－２２７４．

［１６］　ＤＵＢＯＩＳＣ，ＡＢＥＥＬＥＦＶ，ＳＥＨＧＡＬＰ，ｅｔａｌ．Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌｅｆｆｅｃｔｓｏｆ

ｔｈａｐｓｉｇａｒｇｉｎａｎａｌｏｇｕｅｓｏｎａｐｏｐｔｏｓｉｓｏｆｐｒｏｓｔａｔｅｃａｎｃｅｒｃｅｌｌｓ：ｃｏｍ

ｐｌｅｘｒｅｇｕｌａｔｉｏｎｂｙｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｃａｌｃｉｕｍ［Ｊ］．ＦｅｂｓＪｏｕｒｎａｌ，２０１３，

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［１７］　ＤＯＮＧＤ，ＮＩＭ，ＬＩＪ，ｅｔａｌ．Ｃｒｉｔｉｃａｌｒｏｌｅｏｆｔｈｅｓｔｒｅｓｓｃｈａｐｅｒｏｎｅ

ＧＲＰ７８／ＢｉＰｉｎｔｕｍｏｒｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ，ｓｕｒｖｉｖａｌ，ａｎｄｔｕｍｏｒａｎｇｉｏｇｅｎｅ

ｓｉｓｉｎｔｒａｎｓｇｅｎｅ－ｉｎｄｕｃｅｄｍａｍｍａｒｙｔｕｍｏｒｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ［Ｊ］．

，２００８，６８（２）：４９８－５０５．ＣａｎｃｅｒＲｅｓｅａｒｃｈ

［１８］　ＳＣＨＯＮＴＨＡＬＡＨ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌｔａｒｇｅｔｉｎｇｏｆｅｎｄｏｐｌａｓｍｉｃｒｅｔｉｃ

ｕｌｕｍｓｔｒｅｓｓｓｉｇｎａｌｉｎｇｉｎｃａｎｃｅｒ［Ｊ］．ＢｉｏｃｈｅｍｉｃａｌＰｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ，

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（编校：闫沛）

［１２］　ＳＨＥＮＬ，ＷＥＮＮ，ＸＩＡＭ，ｅｔａｌ．Ｃａｌｃｉｕｍｅｆｆｌｕｘｆｒｏｍｔｈｅｅｎｄｏｐｌａｓ

ｍｉｃｒｅｔｉｃｕｌｕｍｒｅｇｕｌａｔｅｓｃｉｓｐｌａｔｉｎ－ｉｎｄｕｃｅｄａｐｏｐｔｏｓｉｓｉｎｈｕｍａｎ

ｃｅｒｖｉｃａｌｃａｎｃｅｒＨｅＬａｃｅｌｌｓ［Ｊ］．ＯｎｃｏｌｏｇｙＬｅｔｔｅｒｓ，２０１６，１１（４）：

２４１１－２４１９．

［１３］　ＬＩＷ，ＺＨＡＮＧＭ，ＸＵＬ，ｅｔａｌ．Ｔｈｅａｐｏｐｔｏｓｉｓｏｆｎｏｎ－ｓｍａｌｌｃｅｌｌ

ｌｕｎｇｃａｎｃｅｒｉｎｄｕｃｅｄｂｙｃｉｓｐｌａｔｉｎｔｈｒｏｕｇｈｍｏｄｕｌａｔｉｏｎｏｆＳＴＩＭ１

［Ｊ］．ＥｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌａｎｄＴｏｘｉｃｏｌｏｇｉｃＰａｔｈｏｌｏｇｙ，２０１３，６５（７－８）：

１０７３－１０８１．

［１４］　ＬＩＡＮＧＳＪ，ＺＥＮＧＤＹ，ＭＡＩＸＹ，ｅｔａｌ．Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎｏｆｏｒａｉ１ｓｔｏｒｅ－

ｏｐｅｒａｔｅｄｃａｌｃｉｕｍｃｈａｎｎｅｌｐｒｅｖｅｎｔｓｆｏａｍｃｅｌｌｆｏｒｍａｔｉｏｎａｎｄａｔｈｅｒｏ

ｓｃｌｅｒｏｓｉｓ［Ｊ］．Ａｒｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ，２０１６，３６（４）：６１８－６２８．

［１５］　ＫＵＭＡＲＡＭＨＳＲ，ＰＩＡＯＭＪ，ＫＡＮＧＫＡ，ｅｔａｌ．Ｎｏｎ－ｔｈｅｒｍａｌｇａｓ

ｐｌａｓｍａ－ｉｎｄｕｃｅｄｅｎｄｏｐｌａｓｍｉｃｒｅｔｉｃｕｌｕｍｓｔｒｅｓｓｍｅｄｉａｔｅｓａｐｏｐｔｏｓｉｓ

ｉｎｈｕｍａｎｃｏｌｏｎｃａｎｃｅｒｃｅｌｌｓ［Ｊ］．ＯｎｃｏｌｏｇｙＲｅｐｏｒｔｓ，２０１６，３６（４）：

ＡＤＡＲ１ｓｈＲＮＡ对人白血病细胞株Ｋ５６２细胞增殖的影响

胡　彬，张　蓉，刘小五，刘　赞，王刚峰，梁英民

ＥｆｆｅｃｔｓｏｆｓｈＲＮＡ－ＡＤＡＲＩｏｎｔｈｅｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎｏｆＫ５６２ｃｅｌｌｌｉｎｅ

ＨＵＢｉｎ，ＺＨＡＮＧＲｏｎｇ，ＬＩＵＸｉａｏｗｕ，ＬＩＵＺａｎ，ＷＡＮＧＧａｎｇｆｅｎｇ，ＬＩＡＮＧＹｉｎｇｍｉｎ

ＤＡＲ１ｇｅｎｅｍａｙｂｅａｎｅｗｔａｒｇｅｔｆｏｒｔｈｅｔｒｅａｔｍｅｎｔｏｆｃｈｒｏｎｉｃｍｙｅｌｏｉｄｌｅｕｋｅｍｉａ．

【Ｋｅｙｗｏｒｄｓ】ＡＤＡＲ１，ＣＭＬ，Ｋ５６２

ＭｏｄｅｒｎＯｎｃｏｌｏｇｙ２０２１，２９（０８）：１２９２－１２９５

【摘要】　目的：探讨ＡＤＡＲ１ｓｈＲＮＡ对人白血病细胞株Ｋ５６２细胞增殖的影响。方法：利用实时荧光定量聚合

白血病（急变期）患者和正常成人中的表达。培养人白血病细胞株Ｋ５６２细胞，用慢病毒介导的ｓｉＲＮＡ转染

Ｋ５６２细胞，建立稳定的敲减ＡＤＡＲ１的Ｋ５６２细胞株（ｓｈＡＤＡＲ１），ｑＲＴ－ＰＣＲ和Ｗｅｓｔｅｒｎ－ｂｌｏｔ方法检测Ｋ５６２

【收稿日期】　２０１９－１０－０８

【修回日期】　２０２０－０１－１８

【基金项目】　西安市科技计划项目［编号：２０１８０５０９５ＹＸ３ＳＦ２９（５）］

　西安高新医院血液科，陕西　西安　７１００７５【作者单位】

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