2024年4月25日发(作者：辛天曼)

中国药理学通报

Chieese

Pharmncologicnl

Bulletin

2424

Dcc

；

36(12)

:

1717

〜

24

-

1717

•

网络出版时间

：

2420

-17

-3

13

：

24

网络出版地址

：

https

：

//kxs.

cnkh

xePkcms/Ow/W34.

D86.

R.

2424D42.

1516.428.

html

食管鳞癌多药耐药细胞建立及干性和上皮间质转化表型鉴定

刘其伟

1

,

晁玮霞

2

,

焦叶林

7

,

张月静

1

,

刘瑞敏

5

,

齐义军

2

(0

许昌学院医学院细胞行为学重点实验室

，

河南许昌

491404

；

31

河南科技大学医学院临床医学院

，

第一附属医院

，

肿瘤医院

，

河南省肿瘤表观遗传重点实验室

，

河南洛阳

471443

；

31

洛阳市第一人民医院病理科

，

河南洛阳471443

3

4.

河南大学医学院细胞与分子免疫学重点实验室

，

河南开封

475004

)

Ool

：

D.

1066/j.

issx.

144)

-

1978.

2020.17.

4D

ESCC)

是中国食管癌的主要组织学类型

[]

。

ESCC

文献标志码

：

A

文章编号

：

144)

-1978(2420)19

-1717

-08

中国图书分类号

：

中图分类号：

R329.

24

；R329.

28

；

-735.

142.2

；

R979.)

；

R979.

14

摘要：

目的

建立人食管鳞癌

(

esophageai

spuamoxs

cell

cao-

cixomv,ESCC)多药耐药细胞株

，

探讨

ESCC

化疗耐药的分子

机制

。

方法

采用间歇性反复冲击法筛选建立对紫杉醇

(

paclit/xei

：

PTX

)

、

5-

氟尿嘧啶

(

5

-Buoroprgcii

：

5

-

BU

-和顺钳

(

cispW/o；

CDDP

、、

阿霉素

(

doxoruPicio

；

DOX

-和长春新碱

(

vixcUstixe

,

VCR

)

等药物具有抗性的多药耐药细胞株

EC9746/EDFC,

测定

EC9746/EDFC

耐药指数

(

resistaxce

io-

dex,RI

)

、

增殖和侵袭能力

、

细胞周期

、

干性

、

上皮间质转化

(

epitPeligi

meseochymai

Waxsihox

,

EMT-等表型变化

，

分析

ABCBl

j

ABCCl

j

ABCC9

和

ABCG9

在

EC9746/PDFC

、

EC9746//DDP

和

EC9746/ETX

中的

mRNA

表达

。

结果

EC9746/EDFC

对

PTX

、

5-Fu

、

CDDP

、

DOX

、VCR

等药物的

RI

分别为

25.

8、

16.

85

、15.

2

、

16.

85

和

7.27

。

与亲本细胞

EC9746

相比

,EC9746/PDFC

细胞呈多形性

、

排列松散

，

增殖

减慢

,

S

期细胞数明显减少

，

侵袭和干性成球能力增加

，

干性

和

EMT

相关分子表达异常

。

ABCB)

和ABCC)

在

3

种不同

的耐药细胞中表达升高

，

而

ABCG9

表达却降低

，

ABCC2

升

高不明显

。

结论

ESCC

多药耐药细胞获得了

CSC

和

EMT

表型

，

为ESCC

多药耐药临床评估和耐药逆转提供了细胞模

型和潜在靶向分子

。

关键词

:食管鳞癌;化疗;多药耐药;细胞周期

；

侵袭;上皮间

质转化;肿瘤干细胞

食管鳞癌

(

esophaneai

spuamoxs

cell

carcipomn

,

收稿日期

：

2029

-07

-25,

修回日期

：

2020

-09

-02

基金项目

：

国家自然科学基金资助项目

(

No

81372937

)

作者简介:刘其伟

(1937

-

),

男

，

硕士

，

主治医师

，

研究方向:食管癌

发生发展机制

,

E-m/1

:

@

D3.

am

；

齐义军

(1470-

),

男，

博士

，

教授

，

博士生导师

，

研究方向

：

食管癌发生发展机制

，

通讯作者

,

E-m/1

：

qiqiyhun@

D3.

com

早期症状不典型

，

因此大部分首次确诊的

ESCC

患

者已发展至中晚期

J]

o

化疗是目前

ESCC

综合治疗

方案的重要手段之一

，

但是

,

原发性耐药或获得性耐

药是导致

E62C

治疗失败

、

ESCC

患者死亡的主要原

因

J]

o

更重要的是

，

化疗耐药细胞具有更强侵袭

、

转移能力

，

使

ESCC

进展加速⑷

。

因此

，

防止或逆转

ESCC

多药耐药性对于提高化疗疗效十分重要

。

肿瘤的化疗方案包括多种化疗药物

，

ESCC

患

者对一种化疗方案产生耐药后

，

可再次选择其它化

疗方案继续进行化疗

。

尽管肿瘤细胞对一种化疗药

物产生耐药性后

，

通常也获得了多药耐药性

(

muko

drup

/sktance,MDR

)

，

但这与肿瘤细胞在多种化疗

药物作用后产生的

MDR

并不完全一致

。

因此

，

应

用多种化疗药物建立

E6CC

多药耐药细胞模型

，对

于深入探讨

ESCC

化疗耐药发生的分子机制

，

筛选

鉴定

ESCC

耐药标志物分子

、

耐药分子靶点具有重

要临床价值

。

1

材料与方法

12

试剂

紫杉醇(

puclitaxei

,

PTX

,

Siomu,

货号

SML2017-5MG

)

；

顺铂

(

cispla/z,

CDDP,

Siumn,

货号

P4394E5MG

)

；

5

-

氟尿嘧啶

(

5

-BuomumcP,5-CU

,

Sip-

mu

，

货号

F6667-SG

)

;

阿霉素

(

doxoruViciz

,

DOX

,

Sip-

mn

，

货号

D1610-10MG

-

,长春新碱

(

vincUstinv

,

VCR,S0ma,

货号

V04//0EEA

)。

12

细胞培养和多药耐药细胞株

含

17%

血清的

RPMI

1749

培养基培养人

ESCC

EC9706

细胞

，

对数

生长期细胞用含

6.

5

my

•

L-

c

PTX

培养基培养

3

O

后

，

更换为不含

PTX

培养基继续培养

，

待细胞活力

恢复后

，

再加入含相同浓度

PTX

培养基培养至细胞

能够在含

6-

5

mg

•

L^PTX

培养基中稳定生长

。

用

同样方法将

PTX

浓度依次提高至

5

、

7.

5

、

10

my

•

L

-

,

建立耐

D

my

•

L

N

pTX

耐药细胞株

EC9770/

PTX

。

根据

£(

：

：

9706//0%

对

5-CU

j

CDDP

j

DOX

和

VCR

的化疗药物敏感性

，

依次用

5-CU

和

CDDP

处

理

EC2704/PTX

细胞

，

最终建立

MDR

细胞株

・

1713

•

中国药理学通报

Chinese

Pharmacological

Bulletin

2420

Dec

；

33(

12

)

Tab1

Primers

used

for

quantiOitive

reui

time

PCR

Genu

EC9776/PDFC

o

本实验所用

7-CU

和

CDDP

的药物

浓度梯度分别为

5

、

1

7

、

1

5

、

27

、

25

mg

•

L

-

和

1

、

2

、

3

及

4

mg

•

L

-

。

EC7779/PDDP

和

EC7779/PTX

分别

OcU/P

ALDH1A1

Foruard

p/uer(5

-

/

5

—

GTCCGAGTGTGGTTCTGTA

Reverse

p/mer(5'to5')

CTCAGTTTGAATGCATGGGA

GCCTTGTCAACATCCTCCTTAT

TTACCTGTCCTACTCACCGATT

是对单个化疗药物

CDDP

和

PTX

耐药的细胞株

，

用

含

19%

血清的

RPMI

1247

培养基培养

。

BM1

TGGAGAAGGAATGGTCCACTTCGTGAGGAAACTGTGGATGAGGA

ACTGGCAGCAACAGTCTTACC

TGCCCAGAAAATGAAAAAGG

B

—

catexiv

E

—

cadhe/v

N

—

cadhe/v

ACTTGGGAGGTATCCACATCCT

1.3

MTT

法测定细胞活性

对数生长期

EC4779

/

PDFC

细胞消化后

，

以

1

xl9

2

•

L

-

细胞数接种于

94

孔板中

,24

h

后更换为含不同浓度

PTX

、

CDDP

、

5-

GTGTATGTGGCAATGCGTTC

CCGAGATGGGGTTGATAATG

GCTTCCTGTAGGTGGCAATC

TCCCTCGGAACATCAGAAAC

ACAGTGGCCACCTACAAAGG

Vimmex/u

FiVronectiv

GAGAACTTTGCCGTTGAAGC

CAGTGGGAGACCTCAAGAAG

GAGCCTACTTGGTGGCACAT

FU

、

DOX

、

VCR

的培养基

，

每个浓度有

8

个复孔

，

并

设空白对照

。

72

h

后加入

7

a

•

L"

MTT

(22

j

L

ABCB1

CTTCCGTGCTGTAGCTGTCA

TCTTTCCTTGCAGCTAAGAC

ACAAGACGAGCTGAATGAGT

ABCG2

ABCC1

ACCTGAAGGCATTTACTGAA

GAGGAAGGGAGTTCAGTCTT

孔

),2

h

后加入二甲基亚砜,混合均匀后用多功能

酶标仪在

550

vm

处检测各孔吸收度值

。

确定

57%

细胞存活的药物浓度

(

IC

-)

以及耐药指数

(RI

)。

1.2

细胞形态学变化及侵袭实验

对数生长期

EC4779

和

EC4779/PDFC

细胞

，

倒置显微镜下观察

细胞形态并进行拍照

。

MatUgei

包被

Transweli小室

水化

2

U

分别将无血清

RPMI

1247

培养基重悬的

1

xl9

5

个

EC7779

和

EC7779/PDFC

接种于

TunsweU

小室上层

，

小室下层加入含

22%

血清的

1247

培养

基

，

培养箱中继续培养

36

h

终止

。

PBS

清洗

Tran-

swell

小室

，

甲醛固定

，

结晶紫染色

，

镜下计数细胞并

拍照

。

1.2

细胞生长曲线及成球实验

采用

MTT

法测定

EC7779

和

EC9776/PDFC

d

2

至

0

3

等时间点细胞

活性,绘制细胞生长曲线

。

对数生长期

EC7779

和

EC7776/PDFC

细胞

，

胰酶消化后

，

分别将

5

007

细胞

接种于超低吸附

4

孔板内

，

应用干细胞培养基培养

两周后

，

计数成球细胞数

。

1.6

细胞周期测定

对数生长期

EC7779

和

EC7776/PDFC

细胞胰酶消化后各取

2

x

19

6

个细

胞

,4

C

预冷

PBS

洗涤

2

次

，

加入

1

mL

预冷

77%

浓

度乙醇

,4

C

固定

2

h,PBS

清洗

1

次,离心后于细胞

团块中加入

197

j

L

的

RNase

A

,

重悬细胞后

87

C

孵育

36

mih,472

j

L

PI

于

7

C

避光孵育

36

min,

流

式细胞仪检测

。

1.2

Q-PCR

检测干性和

EMT

相关分子表达

收

集对数生长期

EC7779

和

EC7779/PDFC

细胞，

TR-

Rot

法提取

RNA

,

OD

274/287

比值确定

RNA

纯度

，

计算

RNA

浓度后

，

取

2

j

g

RNA,

将

RNA

反转录成

cDNA(ivvitupev,

C28725U2

)o

Q-LCR

检测

OCT3/

4

、

ALDH1A1

、

BM1

和

0

uatenin

等肿瘤干细胞

(

cavc-

ar

stem

cells

,

CSCs

)

及

Euyn02n

、

Nuhn/e/n

、

Vim-

mu/v

、

FiUmvu/n

等上皮

-

间质转化

(

epithelial

mesenchymal

transition

,

EMT

)

分子

mRNA

表达

。

本

实验所用

PCR

引物序列见

Tad

1

o

ABCC2

CTCACTTCAGCGAGACCG

CCAGCCAGTTCAGGGTTT

1.2

Western

bUC

检测干性及

EMT

相关分子表达

50

j

g

EC7779/PDFC

和

EC7779

细胞蛋白进行

19%

SDS-LAGE

电泳分离

，

电转至PVDF

膜

,5%

脱

脂奶粉封闭

1

U

相应一抗

4

C孵育过夜

，

二抗

(

1

:

19

007)

室温孵育

1

h,ECL

显色检测目的条带。

本

实验所用一抗包括

：

OCT3/4

(CST

,

2397

)

、

ALDH1A1

(CST

,

36971

)

、

BM1

(

adcom

,

aL44872

)

、

0-catenm

(CST,8487

)

、

Euadhe/v(CST,3199S)

和

Fikuvec/n

(CST,

26836)

。

1.2

多药耐药性表型稳定性

复苏已冻存

3

年的

EC9776/CDDP

、

EC9776/PXT

和

EC7779/PDFC

等细

胞

，

待细胞生长稳定后

，

分别加入

8

mg

•

L-

1

CDDP

、

2

mg

•

L-

1

PTX

5

CDDP

和

PTX

联合培养

，

收集药物

持续作用两周停药

48

h

及持续作用两周细胞样本

。

提取

RNA

并反转录

，

检测

ABC

家族

ABCB1、

AB-

CG2

、

ABCC1

、

ABCC2

等

4

个分子在

EC7779

和各耐

药细胞中的表达特征

。

1.

10

统计学处理

采用统计学软件

SPSS17.

7

进

行数据处理分析

，

实验数据以

p

±

-

表示

，

组间差异

比较用

)

检验

。

2

结果

2.1

EC4736/PDFC

耐药指数

PTX

、

5-CU

、

CDDP

、

DOX

5

VCR

等不同浓度化疗药物处理

EC7779/PDFC

和

EC7779

细胞

72

h

后,

MTT

法检测各组细胞活性,

获得

EC7779/PDFC

和

EC7779

细胞对各种药物的

V

-

值

，

计算

EC7779/PDFC对各种化疗药物的

-

(Tad

2

)o

结果显示

,

EC7779/PDFC

对

PTX

、

DOX

、

CDDP

产生高度耐药性

，

对

7-CU

和

VCR

产生中度

耐药性

。

2.2

细胞形态及侵袭

倒置显微镜可见

EC7779

细胞大小基本一致

，

成铺路石样

，

部分为圆形

，

而

EC7779/PDFC

细胞大小不一

，

呈梭形或多角形

，

多

有突起

(

Fig

1A

)

o

Transweli

小室检测细胞侵袭能

中国药理学通报

Chieese

Pharmncologicnl

BuPefn

2420

Dec

；

33

(

(

9

)

-

17D

•

力

，

与亲本细胞

EC9700

相比

，

EC9706/PDFC

穿过

TmnswW

i

小室基底膜

M/PyW

的细胞数明显增多

(FiylB,

P<0.

01

)o

Tab

2

The

resistance

index

of

EC9776

and

EC9776/PDFC

to

dinereei

chemotherapy

dregs

IC^/mg

•

L)

Druys

EC9770

EC9770/EDFC

RI

PTX

0.477

±0.

452

12.31

±0.24

25.1

DOX

0.437

±2.079

7.365

±0.591

16

．

85

CDDP0

245

±7.

D4

15.23

±

0

454

15.29

5EFU

3.

089

±2.504

23.

78

±3.

20

7.20

VCR

0.874

±7.

323

6.556

±1.

m

7.47

A

EC9706

EC9706/PDFC

Fin

1

Micresccpic

mcruhology

of

EC9776

and

EC9776/PDFC

cells

(A

)

and

iuvvsive

poteetiai

of

EC9776

and

EC9706/PDFC

cells

(B)(

4

±

s,n

-3

)

*

*

P<

7.

01

cs

EC9770

22

细胞增殖及干性成球能力

MTT

法检测

EC9700

和

EC9706/PDFC

的细胞活性

，

绘制细胞生

长曲线

，

发现

EC9706/PDFC

增殖能力显著低于

EC9706(Fip

6A

,

P

<

0.

05

)

o

EC9700

和

EC9700/

PDFC

细胞于超低吸附状态下培养两周

，

发现

EC9706/PDFC

形成的干性细胞球数目明显多于

EC9700

细胞

。

Clutivation

time/d

B

Fin

2

CXi

grewth

chrves(

A

)

and

spherciUization

experimeei

(

B

-

of

EC9776/PDFC

and

EC9776

((

±

s,n

-3

)

*

P

<0.

03,

**

P

<0.

01

cs

EC9700

22

EC9776

和

EC9776/PDFC

细胞周期分析

EC9700/PDFC

的

S

期细胞明显低于

EC9700

,

两个

细胞株中

S

期细胞分别为

17.

50%

和

78.

29%

(P

<

0.

05

)

:

G0-G

)

期细胞分别为

60.

4%

和

02.

04%

忌-

M

期细胞分别为

16-

84%

和

19.

07%

o

见

Fiy

3

。

22

干性和

EMT

相关分子表达

与

EC9706

细胞

相比,

MDR

细胞

EC9706/PDFC

中

OCT3/4

、

AL-

DH1A1

、

BM1

和

0

Gatenip

等分子

mRNA

表达水平

明显升高

,

而上皮相关分子

E-cuUdeUz

表达降低

,

间

质相关分子

N-cadhe/z

和

Fidmuectiz

表达升高,

Vimmex/z

表达无显著变化

，

见

Fiy

4

。

与

q-PCR

检

测结果一致

，

Western

blol

结果表明

，

EC9706/PDFC

中

OCT3/4

、

ALDHlA1

、

BM1

、

0Eatenip

等干性分子

-

1722

•

中国药理学通报

CCOese

PhopncologicO

Bulletin

2420

Dec

；

3

3

(19)

A

蛋白表达明显咼于

EC7779

细胞

，

EuWh2n

表达下

调而

Fnbeoeehn

表达上调,见

Fna5

。

EC9706

EC9706/PDFC

Fio

3

The

ced

cacie

distriOutions

of

EC9736

(A

)

and

EC9736

6

PDFC

(B)(

3±

pn

=

3

)

P

<0205

ee

EC7706

U

O

I

S

S

J

d

x

**

GM1

p-catenin

B

UOISSuJdxu

UADERK

**

Fio

4

mRNA

expression

leveis

of

molecules

related

O

stem

ced

(A)

and

exitaedal

-

mesenchymai

trunsition

(B)

io

EC9736

and

EC9736/PDFC

quantdien

by

Q-PCR

(

x

±

r,o

=

3

)

…

P<9.

01

er

EC7777

EC9706

EC9706/PDFC

45

ku

55

ku

42

ku

92

ku

135

ku

70

ku

GAPDH

36

KD

Fio

5

DiOerentiai

prrteio

expression

leveis

io

EC9736/PDFC

and

EC9736

celis

by

Western

bUC

2.6

多药耐药性表型稳定性

ABC

转运蛋白家族

介导的药物外排是

MDR

产生的关键机制

，

因此

，

本

实验检测了

ABC

家族

ABCB1

、

ABCG2

、

ABCC1

、

AB-

CC2

等

4

个分子在已冻存

8

年的

EC9776/PDFC

、

中国药理学通报

COioese

Pharmacologic

al

Bulletin

2020

Doe

；

3

3

(16

)

-

6776

•

EC9726//TX

、

EC9726/CDDP

中的表达

。

与母本

EC9726

细胞相比

，

ABCB6

在

3

个耐药细胞中表达

44%

[]

o

与单纯手术治疗相比

，

新辅助放化疗联合

手术治疗能够明显提高局部晚期

ECSS

患者的完全

切除率和总体生存期

。

失去手术治疗机会的中晚期

均增高

，

药物持续两周后停药

45

U

或持续

7

周作用

使

EC9726/PDFC

和

EC9726//TX

细胞中

ABCB6

表

ESCC

患者

，

同步放化疗能够有效缓解局部症状

，

防

达进一步升高

，

但使

EC7700//DDP

细胞中

ABCB6

表达降低至

EC9726

细胞中的表达水平

。

3

个耐药

止远处转移和肿瘤复发

，

放化疗效果良好的患者可

达到与手术治疗相似的生存率

。

然而

，

对放化疗产

细胞中

ABCC6

与

ABCB6

表达模式类似

，

但表达增

生抗性是临床

ESCC

治疗失败的主要原因之一⑷

。

高幅度低于

ABCB1

。

与

ABCB6

和

ABCC

6

表达模式

完全不同

,

ABCG2

在

EC9726/PDFC

、

EC9726//TX

、

EC6704//DDP

细胞中表达均低于

EC6724

细胞

,2

化疗是

ESCC

综合治疗的重要手段之一

，

目前

常用的化疗药物包括

CDDP

、

5

AU

、PTX

、DOX

、

VCR

等

，

同时或序贯性联合应用多种化疗药物是目前肿

瘤治疗常用策略之一

。

CDDP

是

ESCC

联合化疗方

种不同的药物处理方式均使

ABCG2

表达升高

。

EC6704//DDP

细胞中

ABCC2

表达增高显著

（

比

EC6704

增高

4.

0

倍

）

，

2

种不同给药方式使其表达

明显降低

，

但

EC9726/PDFC

和

EC9726//TX

中增高

不明显

，

持续的药物处理方式使

ABCC6

稍微增加

。

案的首选基础药物

,

铂类和氟尿嘧啶类药物联合是

ESCC

的标准治疗方案之一

。这些细胞毒性药物具

有不同抗肿瘤机制

，

例如

，

CDDP

与

DNA

分子内和

分子间交联形成加合物

，

抑制

DNA

复制

，

引起细胞

凋亡

[]

;5AU

通过抑制胸腺嘧啶核苷酸合成酶而抑

见

Fng6

。

6

讨论

虽然根治性手术治疗是早期

ESCC

的首选治疗

手段

，

但治疗效果仍然不理想

,

年总体生存率仅为

A

140

000

-

IKHSSaldxQ

<

^

2

6

制

DNA

的合成

；

PTX

靶向微管

，

促进微管蛋白聚合

抑制解聚

,

保持微管蛋白稳定

,

使有丝分裂异常或停

止而导致细胞死亡

。

显然

，

ESCC

临床治疗过程中

B

8

「

ABCC1

**

ABCB1

UOISSoJdx

。

V

M

^

U

I

Q

A

I

J

E

R

H

击

6

-

120

000

-

60

000

4

击

**

[-S-1

**

40

000

**

4

-

20

000

8

4

n

r^~i

**

n

**

**

壬

C

5

4

respective

drugs

for

4O

U

Ster

2

weeds

of

drug

treatmext

before

cell

harvest

:

+

+

indicates

respective

drug

treatmext

for

2

weeds

before

cell

harvest

(

c

土

e,n

-3

)

；

*

P

<0.

05

,

*

*

P

<0.

01

ee

EC9776

；

(1

：

9776

；

2

：

CDDP

；

3

：

CDDP

+

；

4

：

CDDP+

+

；

5

：

PTX

；

6：

PTX+

；

7

：

PTX+

+

；

8

：

PDFC

；

9

：

PDFC

+

；

16

：

PDFC

+

+

-

OAIIBIOH

2

-

•

□

0

I

Z

刊

2

3

1

4

5

678

9

10

D

2.5

u

123456789

10

ABCC2

_

ABCG2

**

i-^-i

2.0

1

:

EC9776

；

:

CDDP

；

:

CDDP

+

；

:

CDDP

+

+

；

:

PTX

；

:

PTX+

；

:

PTX+

+

,

8

：

PDFC

；

：

PDFC

+

；

17

：

PDFC

+

+

；

+

indicates

wPUdrasal

of

U

O

I

S

S

a

l

d

x

Q

U

A

I

I

E

H

3

_

**

nFl

.2

s

s

J

d

x

(D

1.5

V

K

H

®

2

_

*

T

m

**

壬

1

舌

_

£

10

1.0

0.5

**

**

1

**

**

**

n

5

6

Q

A

g

E

I

d

a

123456789

0.0

2

3

4

Fig

6

Q-PCR

useP

to

qschfy

mRNA

expression

leveis

of

molechles

for

ABCB1

(A

)

:

ABCC1

(B

)

,

ABCC2

(

C

)

and

ABCG2

(D

)

in

EC9726

:

EC9776/CDDP

:

EC9776/PTX

and

EC9776/PDFC

:

which

were

exposeP

to

3

mg

•

L"

1

of

CDDP

:

1

mg

•

L

_

1

ot

PTX

:

and

chmbinahof

of

CDDP

and

PTX

:

resdectively.

-

1722

•

中国药理学通报

CCOese

Pharmacological

Bulletin

2420

Dec

；

33(

12

)

ESCC

细胞产生耐药性

，

是在多种化疗药物的作用

干细胞;体外诱导乳腺上皮永生化细胞发生

EMT

下形成的

。

然而

，

目前

ESCC

耐药细胞系多由单一化疗药

物诱导而建立

J]

o

虽然这些耐药细胞系也具有部

后

，

这些上皮细胞呈现间质表型并获得了自我更新

和肿瘤形成能力,并且表达乳腺癌干细胞分子标志

CD44

n/n

/CD24

aw

J

0

]

。

肿瘤细胞在获得

MDR

能力的

过程中表现出

EMT,

并且诱导

EMT

发生能够增加肿

分

MDR

特征

，

但并不能完全模拟

ESCC

患者临床治

疗过程中癌细胞耐药性的获得过程

。

本研究首先应

用间歇性反复冲击法建立了对

PTX

耐药亚细胞株

瘤对放化疗的耐受能力

；

而本身具有间质分化状态

的肿瘤细胞也常表现为原发性耐药的特点

[

5

]

。

EMT

转录因子

Twist

可结合于肿瘤抑制基因

Pnr-7

的启动子而使

Pnr-7

沉默,从而促进肿瘤的复发

，

产

生化学耐药性

J

/

]

o

此外

，

化疗后产生耐药性的乳腺

EC9776/PTX(RI

=25.8

),

继而应用敏感化疗药物

7-CU

建立对

PTX

和

7-CU

耐药的亚细胞株

EC7779

/

PTX/5-CU

。

采用同样的方法

，

建立了对

CDDP

耐药

的

EC9776/PTX/5-CU

亚细胞系

。

尽管本研究仅应

用了

8

种化疗药物反复作用于

EC7779

细胞

，

但由

于交叉耐药性的存在

，

最终获得的

EC7779/PDFC

细

胞对目前临床常用的

5

种化疗药物均产生了不同程

度的抵抗能力

。

与亲本细胞

EC9776

相比

,

EC9776/

PDFC

表现了完全不同的生物学性状,如增殖减慢

、

细胞形态间质化

5

侵袭能力和干性成球能力增加

O

此外

，

EC7776/PDFC

细胞的干细胞

(

OCT3/4

、

AL-

DH1A1

、

BM1

和

p-catepin

)

和

EMT

(

Nuyc4u/n

、

Fi-

bupec/n

)

标志物分子的表达明显上调

，

表明

EC7776/PDFC

细胞发生了干性富集和部分

EMT

转

化

。

肿瘤干细胞

S

chvcvf

stem

cells,

CSCs)

是一类具

有自我更新

、

无限增殖和多向分化潜能的细胞亚群

。

目前各种治疗手段主要靶向快速增殖的癌细胞

，而

非

CSCs

,

即使治疗能使肿瘤完全消退

，

残余的

CSCs

仍然能够导致肿瘤复发和转移

，

是肿瘤化疗失败的

主要原因

。

靶向抑制

CSCs

特异性标志物分子

，

可

逆转耐药表型

。

通过抑制

IGF2

介导的

CD188

分子

表达

,IGF2

中和抗体能够增加

ESCC

来源的裸鼠皮

下荷瘤对

7-CU

的敏感性

J]

o

塞来昔布通过靶向

C0X2

而抑制食管癌细胞

CSC

标志物表达,导致癌

细胞对

5-CU

重新致敏

[10]

o

由此可见

，

本研究结果

提示

，

OCT3/4

、

ALDH1A1

、

BM1

和

/

或

p-catenin

等干

性分子可能介导了

EC7776/PDFC

的

MDR

的产生

，

这些分子可能是逆转

EC7776/PDFC

多重耐药的重

要靶点分子

。

EMT

是指上皮细胞在特定的生理或病理情况

下向间质细胞转化的生物学过程

。

EMT

的发生涉

及多种细胞外基质

、

细胞因子和转录因子

，

是由多个

信号通路参与调控的复杂

、

动态过程

J

1

]

o

EMT

不仅

使表皮样的肿瘤细胞可以转化为间质样细胞以利于

转移和侵袭

，

并且还能获得干细胞样的特性

。

正常

乳腺上皮细胞通过

EMT

关键分子过表达可转化为

癌细胞获得

EMT

特性

，

循环或分散的癌细胞中

EMT

标志物的表达与预后不良密切相关

J

5

]

o

这些研究

表明,

EMT

及干性可以导致

MDR

,

因此,

EMT

相关

的信号分子及通路是逆转

MDR

的潜在分子靶点

。

ABC

转运蛋白家族包括

47

个成员分子

，

位于

胞膜

，

参与多种分子的跨膜运输

，

并与化疗药物胞外

排出有关

J

4

]

o

本实验通过分析与

MDR

表型密切相

关的

ABCB1

S

又称作多药耐药基因或

-

糖蛋白

)

、

ABCG2(

乳腺耐药蛋白

)

、

ABCC1

、

ABCC2

等

4

个分

子在

EC9776/PDFC

、

EC9776/CDDP

和

EC7776/PTX

中的表达

[2]

，

发现本实验建立的多药耐药

EC9776/

PDFC

细胞

，

与由单药诱导耐药细胞

(

EC9776/CD-

DP

、

EC9776/PTX)

相比

,

具有不完全相同的表达模

式

。

8

种不同耐药细胞中

,ABCB1

和

ABCC1

的表达

模式类似

，

但

ABCB1

的表达增加程度显著高于

AB-

CC1

,

尤其是

EC7776/PDFC

和

EC7776/PTX

细胞;

EC7776/PDFC

和

EC7776/PTX

细胞中

ABCC2

表达

与

EC7776

中该分子表达差异不明显

，

而

ABCG2

在

8

种不同的耐药细胞中表达却降低

。

上述结果表明

EC7774/PDFC

耐药性的获得方式与耐药机制相关,

需进一步研究阐明

。

本研究建立的人

ESCC

多药耐药细胞

EC7774

/

PDFC

更接近

ESCC

患者的临床化疗过程

，

是深入研

究

ESCC

耐药分子机制的理想细胞模型

。

EC7774

/

PDFC

发生了

EMT

和

CSC

富集

，

进一步分析鉴定

EMT

和

CSC

关键分子

，

将为逆转

ESCC

化疗耐药提

供重要的分子靶点

。

参考文献

：

[1

]

Song

Y

,

Li

L

, Ou

Y

,

et

》

/

IUenti/catiov

of

aenomic

alterations

in

esophaaeal

squamous

cell

cavces

[

J

].

Nature

,

2914

,

569

(7497)

:

71

-3.

[0]

Wang

Q

M

,

Qi

YJ,

Jiang

Q

,

et

》

/

Relevance

of

serum

esUadiol

and

estvaen

receptor

beta

expression

from

a

high-ivcinepce

area

for

esophaaeal

spuamous

cell

carcinoma

in

China

J]

.

MeP

Omol

,

中国药理学通报

Chinese

Pharmacological

Bulletin

2420

Dcc

；

3

3(

12

)

2911,

22(()

:

188

-93.

-

1703

•

[9

]

Xu

W

W

,

Li

B

,

Zhao

J

F

,

et

al.

IKF2

induces

CD153

expression

in

esophaveai

cancer

cells

to

promote

cancer

stemness

J]

.

Cancer

Lett,

2918

,

445

：

88

-170.

[

3

]

Larsen

A

K

,

Escargueil

A

E

,

SklaUanowski

A.

Resistance

mecha

­

nisms

associated

with

altered

intracellular

OistoUutiop

of

an/capces

agexP

J].

Parmacol

Thy

,

2900,

85(

3)

:

217

-29.

[4

]

Zhang

C

,

Ma

Q

,

Shi

Y

,

et

al.

A

novel

V-Tuoropracii-resistapt

hu

­

[17]

JimGnez

P

,

Chueca

E

,

Armedo

M

,

et

al.

CD20

expression

is

in-

cnased

in

5-FWo/u/cil-Tna/P

esophaveai

AaUexoca/Ooma

cells

J]

.

Front,

Pharmacol

,

2917

,

8

:

321.

man

esophaveai

spuamous

cell

ca/inoma

cell

One

Eca-D9/5-FU

with

significant

Omp

resistance-related

cha/cte/stics

[

J

].

Oncol

[11

]

Chang

J

T

,

Mani

S

A.

Sheep

,

wolf,

os

werewolf

：

Cancer

stem

cells

and

the

epitheUaW/-mesepcUymai

Pansitiox

[

J

].

Cancer

Rep,

2017,

37(

5)

：

2942-54.

[5

]

Rouvelas

I

:

Zeng

W

,

Lindblad

M

,

et

al.

Survival

after

surge/

for

oesophaveai

cancer

：

a

populat/x-hased

stuUy[J].

Lancet

Oncol

,

2905

,

6(11

)

:

804

-70.

Led,

2915

,

341(

1)

:

D

-23.

[14]

Mani

S A

,

Guo

W

,

Liao

M

J,

et

al.

The

epitheUaWmesepcUymai

transition

generates

cells

with

propeUies

of

stem

cells

[

J

].

CeU

,

2908,

173

(()

：

704

-

15.

[6

]

WU

P

C

,

Posner

M

C.

The

role

of

su/erp

in

the

management

of

oesophageal

cancer[

J].

L

cocc

S

Oncol

,

2903

,

4(8)

:

481

-

8.

J]

余

乐

，

陈明辉,古春萍

，

等•顺铂降低铜离子转运蛋白

1

表达

[15

]

Pattadiraman

D

R

,

Weinderg

R

A.

Tachkng

the

cancer

stem

ceUs-

whgt

chalWages

do

they

pose

J]

Nat

Rec

Dug

Discoa

,

2914

,

17

(7

)

：

297

-512.

诱导人食管鳞癌细胞耐药

[J

]

中国药理学通报

，

2911

,

27

(7)

：

911

-5.

[

7

]

Yu

L

,

Chea

M

H

,

Gu

CP

,

et

al.

Cisplatin

induces

druy

resist

­

[14

]

Made

N

W

,

Fox

D

B

,

Lupo

R

,

et

al.

EpigexeUo

silencing

of

tumor

suppresses

ParE

promotes

chemo/sistance

in

/cupept

breast

cancer

[J]

.

J

CUn

Invest

,

2918

.172

(10)

：

2415

-

20.

ance

in

hum

an

esophaveai

spuamous

caninom

a

cells

Uy

rePucing

CTR1

expression[

J

].

Chin

Phaunacol

Bli,

2011,

27(

7)

：

911

-

5.

[15]

Shibue

T,

Weinderg

R

A.

EMT,

CSCs

,

and

Omp

resistance

:

The

mechanistic

lind

and

clinical

implications

[

J]

.

Nat

Rec

CUn

On

­

J]

王

攀

，

高小飞

，

卜旺雨

，

等.细胞培养稳定同位素标记定量

col

,

2917,32(10)

：

611

-29.

[17]

Gottesman

M

M,Fojc

T,

Bates

S

E.

MulkUmy

resistance

in

canc-

分析食管癌顺铂耐药相关蛋白

药学学报

0012,

47(

3

)

：

479

-10.

cs

：

role

of

ATP-6epepPept

transporters

[J].

Nat

Rec

Cancer,

2902

, 2(

1

)

：

45

-53.

[8

]

Wang

P

,

Gao

X

F

,

Bu

W

Y,

et

al.

Quantitative

analysis

of

cispla-

Pn

resistance-related

proteins

in

esophaveai

ca/inoma

with

stadle

isotope

ladeling

in

cell

culture

[

J

].

Acta

Pharm

Sin

,

2912

,

47

[17]

Szabacr

G,Annereau

J

P,LaUaUidi

S,

et

al.

PnPictOg

druy

seasi-

Pvity

and

resistance

:

Profiling

ABC

transporter

genes

in

cances

cells[

J

].

Lancer

CeU

,

2904

,

6(2)

：

129 -37.

(3)

:

479

-10.

EstablisPmenS

o

O

multinrug

resistani

cells

o

O

esophageal

squamous

cell

carcinoma

and

iUextincytion

o

O

phenotypes

relateX

to

stem

and

epithelial-mesepcaymal

transition

LIU

Qi-AeO

,

CHAO

Wei-xia

2

,

JIRO

Ye-Cx

7

,

ZHANG

YveCiny

1

,

LID

-^^0

5

0,))

Yi-jun

2

(1.

Ky

Laboratora

—

Cef

Bedavior

,

Medical

S

c

—

oo

)

ef

Xunang

UnWersfa

,

Xunang

Henan

491404,

ChWa

;

2.

Henan

Key

Lab

—aim

0X610

Epieenetics

,

Cancer

Hospital,

tie

First

iffinwed

Hospital

,

CoPefc

cf

Cliwcal

Medicine

,

Medical

Tolleye

cf

Henan

UnWersiti

cf

Science

anO

Technologa

,

Luyang

Henan

471443

,

Thina

；

3.

Departmeoi

ef

Patiologa

,

tie

First

People

，

-

Hospital

cf

Luyang

,

Luyang

Henan

471443

,

Thina

；

4.

Key

Laborator-

pg

Tellular

anO

Molecular

Immuaologa

,

Medical

School

ef

Henan

UnWersiti

,

Kafeng

Henan

475404

,

Thina

-

Abstract

:

Aim

To

wPbksh

n

mul/drup

resistani

cell

Ong

OeUved

f/m

parental

cell

Onv

of

humnp

wophdvg-

ai

spuamoxs

cell

ca/inomu

(

ESCC

-

and

tv

explora

thv

moWculuo

mechanism

of

ckemotherapp

/sisPnca

in

ESCC.

Methods

Bp

Otwmit/ni

insul/np

with

n

Ost

ABCB1

,

BCC1

,

ABCC2

and

ABCG2

wwa

quantified

Up

q-PCR

in

EC9700/PDFC

,

EC9700//DDP

and

EC9700/PTX.

Reselts

Thv

RI

of

EC9700/PDFC

for

puc/taxei

,

5

-Buoroprncii

,

cispla/x

,

OoxaruUiciu

,

viu-

c/stinv

wus

25.

5

,

16.

55

,

15.

0

,

16.

55

and

7.

27

,

/-

of

currextip

used

cUwnotPwdpw/e

drups,

n

final

suU-

linvs

EC9700/PDFC

wus

estaUlished

sxccessfuUp

,

speckveip.

Compared

with

thv

parental

call

Onv

EC9700

,

EC9700/PDFC

suVlinv

ceUs

dppw/P

polyp-

oxal

and

scattered

with

loose

call-cell

coxtaci.

Thv

manhestiny

n

mu/ipiv

drup

resistanca

(MDR)

featura

gainst

puc/taxei

,

5

-Buo/prncii

,

cispla/x

,

OoxoruUl-

abiOta

of

pmliferatiox

of

EC

97

00/

PDFC

wus

reduced

,

correskoxhiny

tv

diminished

cells

in

S

phase

of

cell

ciu

and

vincUstinv.

Phenotypos

with

regards

to

p/lif-

eratiox

and

invesiox

abiOOvs

；

cell

cyclo

,

stemness

；

cyclo.

Notadip

,

thv

potential

of

invesiox

increased

markedip

in

EC9700/PDFC

cells.

Dysrepulatox

W

epitPeOal-mesePcUymai

transition

and

resistanca

Indev

(RI)

we/

movu/d.

Thv

mRNA

gxpressiop

levels

of

cancer-stempws-

and

EMT-related

markers

wus

odsv-

-

1724

•

中国药理学通报

ChOese

PhopncologicO

Bulletin

2424

Dec

；

33

(

(9

)

:

1720

〜34

网络出版时间

：

2420

-19

-3

11

：

24

网络出版地址

：

htt

p

s

://kus

.

cnkh

uemkcms/0e/il/34.

1086.

R.

04201242.

1317.234.

html

基于

iORAQ

标记联合

IPA

生物信息分析探究

大黄素镇痛作用的机制

陈

鹏

1

，

王

琛

7

，

张

杰吴智兵

2

,吴远华

5

(1

.贵州中医药大学基础医学院

,

贵州贵阳

550425

；

2

.广州中医药大学第一临床

医学院

，

广东广州

310443

；

3.

贵州中医药大学第一附属医院

,

贵州贵阳

550041

)

Vol

：

14.

1665/j.

issn.

1041

-

1978.

2424.12.

417

文献标志码

：

A

文章编号

：

1041

-1978(2424)12

-1724

-47

中国图书分类号

：

R-C36

；

R284.

1

；

R341

；

R364.0

；

R44

1

.

1

；

R777.

2

摘要

：

目的

探究大黄素在神经病理性疼痛慢性压迫性损伤

(

chrovic

covstric/ov

injury,

CCI

)

模型中的镇痛机制

。

方法

神经病理性疼痛是指躯体感觉系统损伤或疾病

所引发的疼痛

J]

o

最新全球范围内流行病学调查

将SD

大鼠随机分为假手术组

、

模型组及大黄素组

。

术后

0

1

开始,大黄素组给予

54

mg

•

kg

-

大黄素溶液灌胃

，

每日

1

次

，

连续

13

d

o

13

0

后取术侧脊髓组织

，

运用蛋白质

组学技术筛选差异表达蛋白

，

并进行

VA

分析

。

结果

模型

组与假手术组筛选岀差异蛋白

192

个。

大黄素组与模型组

研究显示

，

神经病理性疼痛在普通人群中的患病率

高达

17%

，

其可出现在不同性质的临床疾病中

，

包

括糖尿病

、

脑卒中

、

带状疱疹

、

多发性硬化

、

感染

、癌

症

、

腰或颈神经根型神经病变

、

手术及创伤等⑺

2

o

神经病理性疼痛的临床表现主要包括自发性疼痛

、

筛选岀差异蛋白

27

个

，

差异蛋白主要参与的经典通路为

LXR/RXR

激活

、

脊髓背角神经元神经病理性疼痛信号

、

突触

长时程增强信号等

。

上游调控因子分析发现

TCF7I2

及

痛觉过敏及异常性疼痛

，

且常伴有较为显著的睡眠

障碍

、

抑郁和焦虑等心理障碍

，

严重影响着患者的日

常生活及行为功能

，

也给社会造成巨大的经济和医

APP

是大黄素干预下差异蛋白可能的上游调控分子

。

最后

蛋白互作网络分析结果发现

，

大黄素通过干预

及

PP9A

等差异蛋白表达

，

调节

“

细胞间信号与相互作用

、

药

疗负担⑷

。

目前

，

神经病理性疼痛的治疗主要以抗

癫痫

、

抗焦虑及阿片类药物为主

，

但药效有限

，

副作

物代谢

、

神经系统发育和功能

”

蛋白网络

。

结论

大黄素通

用明显

。

因此

，

深入探讨疼痛的发病机制

，

寻找并开

发新的镇痛药物已成为慢性疼痛研究的重要课题

。

过调控神经病理性疼痛多条信号通路发挥镇痛作用

。

关键词:

神经病理性疼痛

；

大黄素;

IRAQ

;

IPA

分析;差异表

达蛋白

；

信号通路

大黄素

(

1,3,8

-

三羟基

U

-甲基蔥醞)是天然蔥

醌类衍生物,分子式

C

/

H

/

O

o

,

为中药大黄的主要活

性成分

。

前期本课题组研究发现大黄素能够显著改

收稿日期

：

2929

-97

-08

,

修回日期

：

2929

-99

-25

善慢性压迫性损伤

(

cUuvic

constUc/ov

injuu,

CCI

)

模型实验大鼠自发性疼痛

,

提高痛觉阈值

，

缓解痛觉

过敏

，

以

50

mg

•

kg"

1

效果最佳

。

然而

，

关于大黄素

基金项目

：

国家自然科学基金资助项目

(

No

81373371

)

；

贵州中医药

大学博士启动基金

[No

(2919)103

]

作者简介:陈

鹏

(1977

-

),

男

，

博士

，

讲师

，

主治医师,研究方向

：

中

医药防治脑病

,

E-mail

：

749466982@

；

吴远华

(1977

-

),

男

，

硕士

，

教授，

研究方向

：

中医药防治

脑病

，通讯作者

，

E-mail

：

637299869@qq.

com

具体镇痛机制和作用靶点尚不清楚

，

有待于进一步

深入研究

。

本研究采用蛋白质组学同位素相对和绝对定量

ued

in

EC7776/PDFC

cells

compared

with

EC7776

wd

will

yuviba

on

ibeal

cell

moPei

and

po/pUU

tof-

getinv

moleculas

far

clinicyl

MDR

evvlua/ov

and

u-

sistanco

reversal

of

ESCC.

cells.

Thu

expression

of

ABCB1

and

ABCC1

wns

up-

repulated

bui

tha

expression

of

ABCG2

Vownrepulated

,

and

only

moPesi

ii/upiPm/v

of

ABCC2

occurred

in

EC7776/PDFC

,

EC9776/CDDP

and

EC7776/PTX

Key

wo

P

s

：

uopPwul

squamous

cell

carcivomo

；

chemoUuupy

；

multi-Pup

usistwca;

cell

cycla

;

invv-

compared

with

EC7776.

Conclusions

Thu

MDR

suP-

Pnv

of

ESCC

estaLPs/ed

in

this

stu/y

ncqiPus

tumar

siov

;

epithelial-mesepchymal

transition

;

cavcvf

stem

cehs

stem

and

epithelial-mesepchymal

transition

phenotypas

2024年4月25日发(作者：辛天曼)

中国药理学通报

Chieese

Pharmncologicnl

Bulletin

2424

Dcc

；

36(12)

:

1717

〜

24

-

1717

•

网络出版时间

：

2420

-17

-3

13

：

24

网络出版地址

：

https

：

//kxs.

cnkh

xePkcms/Ow/W34.

D86.

R.

2424D42.

1516.428.

html

食管鳞癌多药耐药细胞建立及干性和上皮间质转化表型鉴定

刘其伟

1

,

晁玮霞

2

,

焦叶林

7

,

张月静

1

,

刘瑞敏

5

,

齐义军

2

(0

许昌学院医学院细胞行为学重点实验室

，

河南许昌

491404

；

31

河南科技大学医学院临床医学院

，

第一附属医院

，

肿瘤医院

，

河南省肿瘤表观遗传重点实验室

，

河南洛阳

471443

；

31

洛阳市第一人民医院病理科

，

河南洛阳471443

3

4.

河南大学医学院细胞与分子免疫学重点实验室

，

河南开封

475004

)

Ool

：

D.

1066/j.

issx.

144)

-

1978.

2020.17.

4D

ESCC)

是中国食管癌的主要组织学类型

[]

。

ESCC

文献标志码

：

A

文章编号

：

144)

-1978(2420)19

-1717

-08

中国图书分类号

：

中图分类号：

R329.

24

；R329.

28

；

-735.

142.2

；

R979.)

；

R979.

14

摘要：

目的

建立人食管鳞癌

(

esophageai

spuamoxs

cell

cao-

cixomv,ESCC)多药耐药细胞株

，

探讨

ESCC

化疗耐药的分子

机制

。

方法

采用间歇性反复冲击法筛选建立对紫杉醇

(

paclit/xei

：

PTX

)

、

5-

氟尿嘧啶

(

5

-Buoroprgcii

：

5

-

BU

-和顺钳

(

cispW/o；

CDDP

、、

阿霉素

(

doxoruPicio

；

DOX

-和长春新碱

(

vixcUstixe

,

VCR

)

等药物具有抗性的多药耐药细胞株

EC9746/EDFC,

测定

EC9746/EDFC

耐药指数

(

resistaxce

io-

dex,RI

)

、

增殖和侵袭能力

、

细胞周期

、

干性

、

上皮间质转化

(

epitPeligi

meseochymai

Waxsihox

,

EMT-等表型变化

，

分析

ABCBl

j

ABCCl

j

ABCC9

和

ABCG9

在

EC9746/PDFC

、

EC9746//DDP

和

EC9746/ETX

中的

mRNA

表达

。

结果

EC9746/EDFC

对

PTX

、

5-Fu

、

CDDP

、

DOX

、VCR

等药物的

RI

分别为

25.

8、

16.

85

、15.

2

、

16.

85

和

7.27

。

与亲本细胞

EC9746

相比

,EC9746/PDFC

细胞呈多形性

、

排列松散

，

增殖

减慢

,

S

期细胞数明显减少

，

侵袭和干性成球能力增加

，

干性

和

EMT

相关分子表达异常

。

ABCB)

和ABCC)

在

3

种不同

的耐药细胞中表达升高

，

而

ABCG9

表达却降低

，

ABCC2

升

高不明显

。

结论

ESCC

多药耐药细胞获得了

CSC

和

EMT

表型

，

为ESCC

多药耐药临床评估和耐药逆转提供了细胞模

型和潜在靶向分子

。

关键词

:食管鳞癌;化疗;多药耐药;细胞周期

；

侵袭;上皮间

质转化;肿瘤干细胞

食管鳞癌

(

esophaneai

spuamoxs

cell

carcipomn

,

收稿日期

：

2029

-07

-25,

修回日期

：

2020

-09

-02

基金项目

：

国家自然科学基金资助项目

(

No

81372937

)

作者简介:刘其伟

(1937

-

),

男

，

硕士

，

主治医师

，

研究方向:食管癌

发生发展机制

,

E-m/1

:

@

D3.

am

；

齐义军

(1470-

),

男，

博士

，

教授

，

博士生导师

，

研究方向

：

食管癌发生发展机制

，

通讯作者

,

E-m/1

：

qiqiyhun@

D3.

com

早期症状不典型

，

因此大部分首次确诊的

ESCC

患

者已发展至中晚期

J]

o

化疗是目前

ESCC

综合治疗

方案的重要手段之一

，

但是

,

原发性耐药或获得性耐

药是导致

E62C

治疗失败

、

ESCC

患者死亡的主要原

因

J]

o

更重要的是

，

化疗耐药细胞具有更强侵袭

、

转移能力

，

使

ESCC

进展加速⑷

。

因此

，

防止或逆转

ESCC

多药耐药性对于提高化疗疗效十分重要

。

肿瘤的化疗方案包括多种化疗药物

，

ESCC

患

者对一种化疗方案产生耐药后

，

可再次选择其它化

疗方案继续进行化疗

。

尽管肿瘤细胞对一种化疗药

物产生耐药性后

，

通常也获得了多药耐药性

(

muko

drup

/sktance,MDR

)

，

但这与肿瘤细胞在多种化疗

药物作用后产生的

MDR

并不完全一致

。

因此

，

应

用多种化疗药物建立

E6CC

多药耐药细胞模型

，对

于深入探讨

ESCC

化疗耐药发生的分子机制

，

筛选

鉴定

ESCC

耐药标志物分子

、

耐药分子靶点具有重

要临床价值

。

1

材料与方法

12

试剂

紫杉醇(

puclitaxei

,

PTX

,

Siomu,

货号

SML2017-5MG

)

；

顺铂

(

cispla/z,

CDDP,

Siumn,

货号

P4394E5MG

)

；

5

-

氟尿嘧啶

(

5

-BuomumcP,5-CU

,

Sip-

mu

，

货号

F6667-SG

)

;

阿霉素

(

doxoruViciz

,

DOX

,

Sip-

mn

，

货号

D1610-10MG

-

,长春新碱

(

vincUstinv

,

VCR,S0ma,

货号

V04//0EEA

)。

12

细胞培养和多药耐药细胞株

含

17%

血清的

RPMI

1749

培养基培养人

ESCC

EC9706

细胞

，

对数

生长期细胞用含

6.

5

my

•

L-

c

PTX

培养基培养

3

O

后

，

更换为不含

PTX

培养基继续培养

，

待细胞活力

恢复后

，

再加入含相同浓度

PTX

培养基培养至细胞

能够在含

6-

5

mg

•

L^PTX

培养基中稳定生长

。

用

同样方法将

PTX

浓度依次提高至

5

、

7.

5

、

10

my

•

L

-

,

建立耐

D

my

•

L

N

pTX

耐药细胞株

EC9770/

PTX

。

根据

£(

：

：

9706//0%

对

5-CU

j

CDDP

j

DOX

和

VCR

的化疗药物敏感性

，

依次用

5-CU

和

CDDP

处

理

EC2704/PTX

细胞

，

最终建立

MDR

细胞株

・

1713

•

中国药理学通报

Chinese

Pharmacological

Bulletin

2420

Dec

；

33(

12

)

Tab1

Primers

used

for

quantiOitive

reui

time

PCR

Genu

EC9776/PDFC

o

本实验所用

7-CU

和

CDDP

的药物

浓度梯度分别为

5

、

1

7

、

1

5

、

27

、

25

mg

•

L

-

和

1

、

2

、

3

及

4

mg

•

L

-

。

EC7779/PDDP

和

EC7779/PTX

分别

OcU/P

ALDH1A1

Foruard

p/uer(5

-

/

5

—

GTCCGAGTGTGGTTCTGTA

Reverse

p/mer(5'to5')

CTCAGTTTGAATGCATGGGA

GCCTTGTCAACATCCTCCTTAT

TTACCTGTCCTACTCACCGATT

是对单个化疗药物

CDDP

和

PTX

耐药的细胞株

，

用

含

19%

血清的

RPMI

1247

培养基培养

。

BM1

TGGAGAAGGAATGGTCCACTTCGTGAGGAAACTGTGGATGAGGA

ACTGGCAGCAACAGTCTTACC

TGCCCAGAAAATGAAAAAGG

B

—

catexiv

E

—

cadhe/v

N

—

cadhe/v

ACTTGGGAGGTATCCACATCCT

1.3

MTT

法测定细胞活性

对数生长期

EC4779

/

PDFC

细胞消化后

，

以

1

xl9

2

•

L

-

细胞数接种于

94

孔板中

,24

h

后更换为含不同浓度

PTX

、

CDDP

、

5-

GTGTATGTGGCAATGCGTTC

CCGAGATGGGGTTGATAATG

GCTTCCTGTAGGTGGCAATC

TCCCTCGGAACATCAGAAAC

ACAGTGGCCACCTACAAAGG

Vimmex/u

FiVronectiv

GAGAACTTTGCCGTTGAAGC

CAGTGGGAGACCTCAAGAAG

GAGCCTACTTGGTGGCACAT

FU

、

DOX

、

VCR

的培养基

，

每个浓度有

8

个复孔

，

并

设空白对照

。

72

h

后加入

7

a

•

L"

MTT

(22

j

L

ABCB1

CTTCCGTGCTGTAGCTGTCA

TCTTTCCTTGCAGCTAAGAC

ACAAGACGAGCTGAATGAGT

ABCG2

ABCC1

ACCTGAAGGCATTTACTGAA

GAGGAAGGGAGTTCAGTCTT

孔

),2

h

后加入二甲基亚砜,混合均匀后用多功能

酶标仪在

550

vm

处检测各孔吸收度值

。

确定

57%

细胞存活的药物浓度

(

IC

-)

以及耐药指数

(RI

)。

1.2

细胞形态学变化及侵袭实验

对数生长期

EC4779

和

EC4779/PDFC

细胞

，

倒置显微镜下观察

细胞形态并进行拍照

。

MatUgei

包被

Transweli小室

水化

2

U

分别将无血清

RPMI

1247

培养基重悬的

1

xl9

5

个

EC7779

和

EC7779/PDFC

接种于

TunsweU

小室上层

，

小室下层加入含

22%

血清的

1247

培养

基

，

培养箱中继续培养

36

h

终止

。

PBS

清洗

Tran-

swell

小室

，

甲醛固定

，

结晶紫染色

，

镜下计数细胞并

拍照

。

1.2

细胞生长曲线及成球实验

采用

MTT

法测定

EC7779

和

EC9776/PDFC

d

2

至

0

3

等时间点细胞

活性,绘制细胞生长曲线

。

对数生长期

EC7779

和

EC7776/PDFC

细胞

，

胰酶消化后

，

分别将

5

007

细胞

接种于超低吸附

4

孔板内

，

应用干细胞培养基培养

两周后

，

计数成球细胞数

。

1.6

细胞周期测定

对数生长期

EC7779

和

EC7776/PDFC

细胞胰酶消化后各取

2

x

19

6

个细

胞

,4

C

预冷

PBS

洗涤

2

次

，

加入

1

mL

预冷

77%

浓

度乙醇

,4

C

固定

2

h,PBS

清洗

1

次,离心后于细胞

团块中加入

197

j

L

的

RNase

A

,

重悬细胞后

87

C

孵育

36

mih,472

j

L

PI

于

7

C

避光孵育

36

min,

流

式细胞仪检测

。

1.2

Q-PCR

检测干性和

EMT

相关分子表达

收

集对数生长期

EC7779

和

EC7779/PDFC

细胞，

TR-

Rot

法提取

RNA

,

OD

274/287

比值确定

RNA

纯度

，

计算

RNA

浓度后

，

取

2

j

g

RNA,

将

RNA

反转录成

cDNA(ivvitupev,

C28725U2

)o

Q-LCR

检测

OCT3/

4

、

ALDH1A1

、

BM1

和

0

uatenin

等肿瘤干细胞

(

cavc-

ar

stem

cells

,

CSCs

)

及

Euyn02n

、

Nuhn/e/n

、

Vim-

mu/v

、

FiUmvu/n

等上皮

-

间质转化

(

epithelial

mesenchymal

transition

,

EMT

)

分子

mRNA

表达

。

本

实验所用

PCR

引物序列见

Tad

1

o

ABCC2

CTCACTTCAGCGAGACCG

CCAGCCAGTTCAGGGTTT

1.2

Western

bUC

检测干性及

EMT

相关分子表达

50

j

g

EC7779/PDFC

和

EC7779

细胞蛋白进行

19%

SDS-LAGE

电泳分离

，

电转至PVDF

膜

,5%

脱

脂奶粉封闭

1

U

相应一抗

4

C孵育过夜

，

二抗

(

1

:

19

007)

室温孵育

1

h,ECL

显色检测目的条带。

本

实验所用一抗包括

：

OCT3/4

(CST

,

2397

)

、

ALDH1A1

(CST

,

36971

)

、

BM1

(

adcom

,

aL44872

)

、

0-catenm

(CST,8487

)

、

Euadhe/v(CST,3199S)

和

Fikuvec/n

(CST,

26836)

。

1.2

多药耐药性表型稳定性

复苏已冻存

3

年的

EC9776/CDDP

、

EC9776/PXT

和

EC7779/PDFC

等细

胞

，

待细胞生长稳定后

，

分别加入

8

mg

•

L-

1

CDDP

、

2

mg

•

L-

1

PTX

5

CDDP

和

PTX

联合培养

，

收集药物

持续作用两周停药

48

h

及持续作用两周细胞样本

。

提取

RNA

并反转录

，

检测

ABC

家族

ABCB1、

AB-

CG2

、

ABCC1

、

ABCC2

等

4

个分子在

EC7779

和各耐

药细胞中的表达特征

。

1.

10

统计学处理

采用统计学软件

SPSS17.

7

进

行数据处理分析

，

实验数据以

p

±

-

表示

，

组间差异

比较用

)

检验

。

2

结果

2.1

EC4736/PDFC

耐药指数

PTX

、

5-CU

、

CDDP

、

DOX

5

VCR

等不同浓度化疗药物处理

EC7779/PDFC

和

EC7779

细胞

72

h

后,

MTT

法检测各组细胞活性,

获得

EC7779/PDFC

和

EC7779

细胞对各种药物的

V

-

值

，

计算

EC7779/PDFC对各种化疗药物的

-

(Tad

2

)o

结果显示

,

EC7779/PDFC

对

PTX

、

DOX

、

CDDP

产生高度耐药性

，

对

7-CU

和

VCR

产生中度

耐药性

。

2.2

细胞形态及侵袭

倒置显微镜可见

EC7779

细胞大小基本一致

，

成铺路石样

，

部分为圆形

，

而

EC7779/PDFC

细胞大小不一

，

呈梭形或多角形

，

多

有突起

(

Fig

1A

)

o

Transweli

小室检测细胞侵袭能

中国药理学通报

Chieese

Pharmncologicnl

BuPefn

2420

Dec

；

33

(

(

9

)

-

17D

•

力

，

与亲本细胞

EC9700

相比

，

EC9706/PDFC

穿过

TmnswW

i

小室基底膜

M/PyW

的细胞数明显增多

(FiylB,

P<0.

01

)o

Tab

2

The

resistance

index

of

EC9776

and

EC9776/PDFC

to

dinereei

chemotherapy

dregs

IC^/mg

•

L)

Druys

EC9770

EC9770/EDFC

RI

PTX

0.477

±0.

452

12.31

±0.24

25.1

DOX

0.437

±2.079

7.365

±0.591

16

．

85

CDDP0

245

±7.

D4

15.23

±

0

454

15.29

5EFU

3.

089

±2.504

23.

78

±3.

20

7.20

VCR

0.874

±7.

323

6.556

±1.

m

7.47

A

EC9706

EC9706/PDFC

Fin

1