2024年4月25日发(作者：席阳华)
(19)中华人民共和国国家知识产权局
(12)发明专利说明书
(21)申请号 CN96193437.9
(22)申请日 1996.03.01
(71)申请人 耶达研究及发展有限公司;宾-古里安尼格夫大学研究及发展部
地址 以色列雷霍沃特
(72)发明人 D·瓦拉赫 J·科斯特 艾利尔兹
(74)专利代理机构 中国专利代理(香港)有限公司
代理人 吴玉和
(51)
A61K38/19
权利要求说明书 说明书 幅图
(10)申请公布号 CN 1182369 A
(43)申请公布日 1998.05.20
(54)发明名称
控制释放可溶性受体的药物组合物
(57)摘要
一种控制释放药物组合物,含有已经
掺入到可溶性受体中的生物相容性聚合物,
优选的是聚乙烯乙酸乙烯酯或多聚(乳酸－
羟基乙酸),所述载体能够结合到配体上,从
而使配体发挥功能。该可溶性受体优选的
是可溶性形式的TNFα受体。所述组合物
可用于治疗其中需要中和有害作用的疾
病。
法律状态
法律状态公告日
法律状态信息
法律状态
权 利 要 求 说 明 书
1.一种药物组合物，用于控制能够与配体结合的可溶性受体的释放，从而影响配体
的功能，该组合物包括一种生物相容性聚合物材料，在其中掺入了所述可溶性受体。
2.根据权利要求1所述的药物组合物，其中所述的聚合物材料是选自于下列的生物
可溶性非降解性聚合物：乙烯乙酸乙烯酯共聚物(EVAc)，硅橡胶，多糖，聚酰胺，
聚丙烯酸酯，聚乙烯，聚氨酯，聚异丁烯，聚磷腈。
3.根据权利要求1所述的药物组合物，其中所述的聚合物材料是选自于下列的生物
可降解聚合物：聚酯，聚酐，聚原酸酯，聚己内酯，假多氨基酸，多肽，明胶，聚
乳酸，聚羟基乙酸，和聚(乳酸-羟基乙酸)共聚物(PLGA)。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的药物组合物，其中所述的可溶性受体是一种激
素或细胞因子的可溶性受体。
5.根据权利要求4所述的药物组合物，其中所述的可溶性受体是可溶性形式的
TNFα受体。
6.根据权利要求2所述的药物组合物，其中所述的可溶性受体是溶性形式的TNFα
受体。
7.根据权利要求6所述的药物组合物，其中聚合物是聚乙烯乙酸乙烯酯。
8.根据权利要求3所述的药物组合物，其中所述的可溶性受体是可溶性形式的
TNFα受体。
9.根据权利要求8所述的药物组合物，其中聚合物是聚(乳酸-羟基乙酸)。
10.根据权利要求5所述的药物组合物，其中可溶性TNFα受体是可溶性p55 TNFα
受体(p55sTNF-R)。
11.根据权利要求5所述的药物组合物，其中可溶性TNFα受体是可溶性p75 TNFα
受体(p75sTNF-R)。
12.根据权利要求5所述的药物组合物，用于治疗需要中和TNFα的有害作用的疾
病。
13.根据权利要求12所述的药物组合物，用于治疗败血性休克。
14.根据权利要求12所述的药物组合物，用于治疗癌相关性恶病质。
15.根据权利要求12所述的药物组合物，用于治疗自体免疫性疾病。
16.根据权利要求15所述的药物组合物，用于治疗类风湿性关节炎。
17.根据权利要求16所述的药物组合物，进一步包括抗炎剂。
18.根据权利要求15所述的药物组合物，用于治疗多发性硬化。
19.根据权利要求18所述的药物组合物，包括用于治疗多发性硬化的另外的药剂例
如β-干扰素或Copolymer-1。
20.根据权利要求15所述的药物组合物，用于治疗全身性红斑狼疮。
21.根据权利要求12所述的药物组合物，用于治疗移植物抗宿主反应。
22.根据权利要求12所述的药物组合物，用于治疗皮肤延迟型过敏疾病。
23.根据权利要求7所述的药物组合物，它是植入剂形式。
24.根据权利要求9所述的药物组合物，它是植入剂形式。
25.根据权利要求9所述的药物组合物，它是注射液形式。
26.根据权利要求23至25中任一项所述的药物组合物，用于局部注射到关节液中，
用于治疗类风湿性关节炎中的关节炎。
27.根据权利要求23至25中任一项所述的药物组合物，用于鞘内注射到脑脊髓液
中，用于治疗多发性硬化。
28.根据权利要求22所述的药物组合物，用于局部应用。
29.根据权利要求5所述的药物组合物，进一步包括TNFα。
30.根据权利要求29所述的药物组合物，用于增强TNFα的有利作用。
31.根据权利要求30所述的药物组合物，用于治疗肿瘤。
32.根据权利要求30所述的药物组合物，用于治疗病毒，细菌和多细胞寄生物感染。
33.根据权利要求30所述的药物组合物，用于伤口愈合。
34.用于治疗其中需要中和TNFα的有害作用的疾病的方法，包括施用能够释放有
效量的所述TNFα受体可溶形式的权利要求5所述的控释药物组合物。
35.根据权利要求34所述的方法，其中所述疾病选自：败血性休克，癌症相关性恶
病质，自体免疫疾病，移植物抗宿主反应，皮肤延迟型过敏疾病。
36.根据权利要求34所述的方法，其中所述给药步骤包括植入所述控释药物组合物。
37.治疗其中需要增强TNFα的有利作用的疾病的方法，包括施用能够释放有效量
的所述TNFα受体可溶形式和TNFα的权利要求5所述的控释药物组合物。
说 明 书
发明领域
本发明涉及用于从聚合物基质中控制释放可溶性形式的受体的药物组合物。
发明背景
控制释放系统在一定的时期内，以预定的速率释放药物，所述时期可以是几天到几
年。这些系统比常规的药物治疗法具有优点。例如，在摄入或注射标准剂型之后，
血液中药物的水平升高，达到峰值，然后下降。由于各种药物具有一定的治疗范围，
高于该范围产生毒性，而低于该范围没有效果。波动的药物水平可以导致产生交替
的无效和有毒期。相反，控制释放的制剂通过一次给药将药物维持于所需的治疗范
围。控制释放系统的其它优点包括：(i)将药物定位释放到身体的特定部位，从而降
低全身的药物水平；(ii)保存易被身体快速破坏的药物(这对于生物学敏感分子例如
蛋白质特别重要)；(iii)减少了对随访治疗的需求；(iv)提高了舒适感；(v)改善了依
从性。
通过将药物置于聚合物中可获得对药物释放的最佳控制。通常聚合物通过扩散，化
学反应，或溶剂活化而释放药物。
最普遍的释放机理是扩散，从而药物从其在聚合物系统中的起始位置迁移到聚合物
的外表层，然后迁移到身体中。扩散可通过储液囊来实现，其中药物核周围包裹一
层聚合物膜，或将药物核包围于基质中，其中药物穿过聚合物系统均一分布。通过
化学反应例如降解聚合物或从聚合物骨架中裂解该药物，也可以将药物释放。
上述机理也可结合。基于聚合物的特性(例如，扩散控制系统的晶格和孔结构，化
学控制系统的键的水解不稳定性或单体的疏水性)以及系统的设计(例如，厚度和形
状)可以控制从聚合物系统的释放速率。具有不同释放机理的系统的优点是各个系
统能够完成不同的目的。
多年来，控制释放系统仅能缓慢地释放低分子量的药物(＜600)。大分子例如蛋白
质不被认为是合适的候选分子，因为，多肽被认为太大以致于不能穿过聚合物缓慢
地扩散，即使在该聚合物吸胀之后。基于含有粉状大分子的固体疏水聚合物的基质
能够在100天以上的时间内使几乎任何大小的分子释放的发现，从而可控制释放各
种各样的蛋白质，多糖和多核苷酸。参见，Langer，1990。
至今为止，为了控制释放而掺入到聚合物中的蛋白质和多肽主要是效应分子，例如，
胰岛素，这与控制释放与人体中产生的效应分子结合和中和的分子的组合物相反。
肿瘤坏死因子α(TNFα)是有潜效的细胞因子，可激发广谱的生物学应答。TNFα对
许多肿瘤细胞有细胞毒性，可用于肿瘤的治疗。TNFα加强成纤维细胞的生长，并
且起着组织重建剂的作用，因此适合于伤口愈合。它进一步诱导小鼠的移植肿瘤的
出血坏死，加强多型核的嗜中性粒细胞的吞噬和细胞毒性，并且调节许多蛋白质的
表达，包括脂蛋白脂酶，大组织相容性复合物的I型抗原，和细胞因子，例如白细
胞介素-1和白细胞介素-6。已经证明TNFα具有抗病毒，细菌和多细胞特别是细胞
内的寄生虫效应。TNFα似乎对于正常的免疫应答是必要的，但是，量大时，产生
急剧的致病作用。由于TNFα是引起与瘤形成疾病和寄生物血症有关的消瘦症(恶
病质)的主要因子，因此将其称为“恶病质素”。由于抗TNFα的抗体能够保护受感
染的动物，因此，TNFα也是一种在革兰氏阴性脓毒症中细胞毒性的主要起作用者。
已经证明TNFα与几种疾病有关，可列举的例子包括成人呼吸窘迫症，肺纤维变性，
疟疾，传染性肝炎，结核病，炎性肠疾病，败血性休克，AIDS，移植物抗宿主反
应，自体免疫疾病，例如类风湿性关节炎，多发性硬化和青年型糖尿病，和皮肤延
迟型过敏疾病。
由于某些TNFα的作用对宿主有害，使人注意到引起调节TNFα功能的机理。由两
种不同分子种类的细胞表面受体(本文中称为TNF-R)提供对TNFα的应答的细胞内
信号，而TNFα以高亲和力结合到所述受体上。
在身体的几乎所有细胞中表达细胞表面各种TNF-R。一旦TNFα与TNF受体结合，
由TNF受体以信号形式反映出所有TNFα的各种作用，细胞毒性，促生长以及其
它。这些受体的分子量不同的两种形式，55千道尔顿和千75道尔顿已经被描述了，
并且在本文中分别被描述为p55和p75TNF-R。但是，应该注意现有的公开文本将
这两种受体也称作为p60和p80TNF-R。
TNFα的两种受体不仅以细胞结合形式而且以可溶性形式存在，包括从细胞表面形
式蛋白酶裂解衍生得到的完整受体的裂解细胞外区域。这些可溶性的TNFα受体
(sTNF-Rs)能够保持结合TNFα的能力，并且与细胞表面受体一起竞争TNFα，从而
阻止了TNFα的活性。因此，sTNF-Rs起着TNFα活性的生理学减毒作用，保卫其
抵抗潜在的有害作用。但是，也已经有报道，sTNF-Rs也通过稳定其活性，可能是
通过阻止其生物活性三聚体结构降解为非活性的单体而影响TNFα的功能(Aderka
等人，1992)。因此sTNF-Rs以两种不同的途径影响TNFα的活性：它们与细胞表
面受体竞争TNFα和阻止TNFα的有害作用，或它们起缓冲剂的作用并且稳定
TNFα的活性。
以前将本文中称为p55sTNF-R和p75sTNF-R的两种sTNF-Rs分别命名为TNF结合
蛋白I和II，或TBPI和TBPII(参见例如EP398327，EP412486，和EP433900)。在
本申请中我们利用两种命名：p55sTNF-R或TBPI和p75s TNF-R或TBPII；它们分
别定义相同的蛋白质。
sTNF-Rs以在炎性和非炎性疾病状态下显著增高的浓度组成地存在于血清中。这些
蛋白质的效果可以不同，但取决于其在TNFα作用位点的浓度，其浓度与TNFα局
部浓度的关系，以及就TNF活性的衰退而言sTNF-Rs和TNFα从TNFα作用位点
清除的速率。依据这些参数，在不同的情形下，sTNF-Rs以非常不同的方式影响
TNFα的功能，或通过抑制TNFα的效果或作为TNFα的载体，或者通过延长其功
能扩大TNFα的效果(Aderka等人，1992)。
sTNF-Rs作为抗-TNFα药物的效果可能受许多不同因子的影响：与细胞表面受体的
亲和力相比的sTNF-Rs结合TNFα的亲和力，可溶性受体进入TNFα作用位点的难
易程度，和可溶性受体和它们与TNFα形成的复合物从TNFα形成位点清除的速率。
sTNF-Rs的天然形式可能以最生理相关的方式起作用。但是，其用途受到的大的限
制是它们相当快地从血液中清除。已经制定了几种计划以改善这些分子，所述例子
是所谓的嵌合“免疫吸附”，其中将sTNF-Rs连接到免疫球蛋白分子的Fc部分(由
Hoffman La Roche和Immune开发)，和“PEGulated”sTNF-Rs，其中sTNF-Rs通过
PEG分子交联(由Synergen研制)。两种途径导致二价sTNF-R分子的形成，该分子
有较长的清除时间，并且能够更有效地与三价TNFα分子结合。但是，它们可能比
天然可溶性受体更具免疫原性，并且不会出现它们与TNFα的复合物以非常高的效
率从循环中清除。
由于该细胞因子在身体的某一特定部位的长期形成而造成了TNFα的许多有害作用。
对于在需要的部位维持治疗学上有效的可溶性受体的浓度，较大预见性地限定使用
可溶性形式的TNF受体以防止所述病理状态是困难的。
发明概述
本发明的目的之一是研制治疗学上使用可溶性形式的受体的新方法，所述治疗学应
用可影响它们的配体的功能，例如保护身体免遭它们的配体的有害作用，特别是研
制以不变的速率，在较长的时间期间允许可溶性受体在身体中局部释放的系统。这
些方法是基于将可溶性受体掺入到生物相容性聚合物中，并将其植入到或注射到所
需的身体部位。含有可溶性受体的聚合物的基质能够局部和控制释放天然形式的可
溶性受体。
本发明包括能够结合到其配体并且影响其功能的可溶性受体，所述影响功能的方式
是使其配体的毒害作用中和和/或稳定或增强其活性。所述可溶性受体的例子是激
素的和细胞因子的可溶性受体，并且在优选的实施方案中，可溶性受体是可溶性的
TNFα受体。
因此，本发明的另一目的是提供了治疗学上使用可溶性TNFα的受体以影响TNFα
功能，例如保护身体抵抗TNFα的有害作用的新方法，所述新方法包括控制释放系
统。
因此本发明提供了用于控制释放可溶性受体的药物组合物，其中所述可溶性受体被
掺入到生物相容性聚合体基质中。
可用于本发明组合物中的生物相容性聚合体基质的例子包括，但不限于下列生物相
容性非降解性聚合物：乙烯乙酸乙烯酯共聚物(EVAc)，硅橡胶，多糖例如纤维素，
聚酰胺，聚丙烯酸酯，聚乙烯，聚氨酯，聚异丁烯，聚磷腈，和下列生物降解性聚
合物：聚酯，聚酐，聚原酸酯，聚己内酯，假多氨基酸，多肽，明胶，聚乳酸，聚
羟基乙酸(polyglycolic acid)，和聚乳酸-羟基乙酸(PLGA)共聚物。
在一个优选的实施方案中，将可溶性TNFα受体(sTNF-R)掺入到合适的聚合物中，
例如聚乙烯乙酸乙烯酯基质，或掺入到聚(乳酸-羟基乙酸)微球体中。
本发明的药物组合物可含有p55 sTNF-R或p75sTNF-R。在一个优选的实施方案中，
该组合物含有p55sTNF-R(TBPI)。
一个实施方案中，本发明的药物组合物适用于治疗疾病，其中需要保护身体抵抗配
体例如TNFα的有害作用。将含有sTNF-Rs的该聚合体基质置于所需的身体部位中，
从而在体内恒定维持sTNF-R并且保持长时间。
在另一个实施方案中，本发明的药物组合物可与配体例如TNFα一起使用，以便稳
定和/或增强TNFα的活性，用于需要TNFα的有利作用的任何情况。该实施方案
的一个方面，所述组合物包括TNFα/sTNF-R复合物，通过肿瘤部位给药，TNFα
发挥有效的局部的抗肿瘤功能并且产生较少的全身的不良作用。在该实施例的另一
方面，含有TNF-α/sTNF-R复合物的组合物可用于抗病毒，细菌和寄生物
(parasiticidal)，特别是细胞内的多细胞寄生物的感染和用于伤口治愈。
在另一个实施方案中，本发明包括对患者进行治疗，保护患者免除配体例如TNFα
的有害作用，包括给患者施用本发明的药物组合物，所述药物组合物含有控制释放
形式的有效量的合适的可溶性受体例如sTNF-R。
在又一实施方案中，本发明涉及癌症的治疗，包括在需要治疗的患者的肿瘤部位施
用含有TNFα/sTNF-R复合物的控制释放形式的本发明的药物组合物。
附图简述
附图1显示颗粒大小对TBPI的累积释放的影响。将三个大小范围的TBPI+BSA粉
的颗粒以30％的负载量掺入到乙烯乙酸乙烯酯共聚物(EVAc)基质中：(i)＜
75μm(实心菱形)；(ii)75-250μm(空心正方形)，和(iii)250-425μm(实心圆圈)。
附图2显示负载量对TBPI累积释放的影响。利用75-250μm大小范围的颗粒制备
具有TBPI+BSA负载的EVAc基质：(i)10％负载量(实心菱形)；(ii)30％负载量(空
心正方形)，和(iii)50％的负载量(实心圆圈)。
附图3显示单独的可溶性TNFα受体I(TBPI)或与牛血清白蛋白(BSA)一起掺入到下
列成份的微球体中的累积的释放百分数：(i)聚乳酸-羟基乙酸(PLGA)75∶25(分别是
空心或实心的圆圈)；(ii)PLGA 50∶50(分别是空心和实心的正方形)；(ii)聚-L-乳酸
(PLLA)(分别是空心和实心的三角形)。
附图4a-c显示用产生TNF的中国仓鼠卵(CHO)细胞(CHO/TNF)接种的Balb裸鼠用
TBPI或用鼠抗-TNF单克隆抗体TNF-1(Ab)治疗获得的体内结果，其中：
附图4a图示用如下药剂处理后Balb裸鼠的平均组重量(gr)(i)皮下植入EVAc基质
中的TBPI(实心圆圈)；(ii)TBPI/PLGA的75∶25的植入剂(空心圆圈)；(iii)用
CHO/TNF细胞接种鼠(Ab一次)后五天，注射一次抗-TNF抗体(实心正方形)；(iv)
用CHO/TNF细胞接种鼠五天以后和一星期之后(Ab两次)注射两次抗-TNF抗体(空
心正方形)；和(v)对照，没有任何治疗(实心三角形)；
附图4b表示在鼠血清中生物活性TNFα的水平进行体内评价的结果。在将EVAc
基质中的TBPI(实心圆圈)或75∶25的TBPIPLGA(空心圆圈)植入之后或用抗TNFα
抗体注射一次(实心正方形)或两次(空心正方形)(如在附图4a所示)，从携带产生
TNFα的中国仓鼠卵(CHO)细胞的鼠中收集血清，以及从非治疗的鼠中收集血清(实
心三角形)，通过在环己酰亚胺(25微克/毫升)存在下将其1∶100的稀释液加入到经
培养的MHA2细胞(Hela细胞的衍生物，将其以3×104细胞/9mM的浓
度播种微孔之后24小时)中保持10小时，测定血清中TNFα的生物活性，随后通
过中性红摄取方法评估细胞的存活力(Wallach等人，1984)，和
附图4c表示用如下药剂处理后的小鼠的生存曲线：(i)TBPI/EVAc植入剂(空心正方
形)；(ii)TBPI/PLGA75∶25植入剂(实心圆圈)；(iii)抗-TNF抗体一次(空心三角形)；
(iv)抗-TNF抗体两次(实心三角形)；和(v)对照，没有任何治疗(空心圆圈)；
附图5显示含有TBPI的EVAc基质在鼠体的不同部位植入对TBPI浓度释放的影
响：颈(实心圆圈)，背(空心圆圈)，和胃(实心正方形)。
附图6是图形表示踝关节的肿胀(mm)，显示用含有TBPI的II。
可用于本发明中的聚合物包括但不限于选自于下列的生物相容性不可降解性聚合物：
乙烯乙酸乙烯酯共聚物，硅橡胶，多糖例如纤维素，聚酰胺，聚丙烯酸酯，聚乙烯，
聚异丁烯，聚氨酯，和聚磷腈，和选自于下列的生物可降解性聚合物：聚酯，聚原
酸酯，聚己内酯，多肽，假聚(氨基酸)，明胶，聚酐，聚-L-乳酸，聚-D-乳酸，聚-
D，L-乳酸，聚羟基乙酸，和选自于下列的共聚物：聚-L-乳酸-羟基乙酸，聚-D-乳
酸-羟基乙酸，聚-D，L-乳酸-羟基乙酸，，聚-L-乳酸-D-乳酸，和聚-L-乳酸-D，L-
乳酸。
用于本发明中优选的聚合物是乙烯乙酸乙烯酯共聚物(EVAc)，聚-乳酸-羟基乙酸共
聚物(PLGA)和聚-L-乳酸(PLLA)。
从商品EVAc，如果必要，在纯化之后，例如通过Rhine等人，1980描述的溶剂浇
铸方法，可以制备含有掺入到EVAc基质中的sTNF-R的药物组合物。这些基质构
成了扩散控制的系统，所述系统允许蛋白质均一分布，可重现的动力学以及在几星
期或几个月的期间内生物学活性的sTNF-R的延缓释放。如果EVAc是生物相容性
的并且不可降解的聚合物，那么EVAc基质适合于需要或期望药物释放延长的应用。
当活性要素借助于通过基质中的通道扩散而从不可降解的聚合物例如EVAc中释放
时，通过较高的蛋白质负载量加强扩散。因此，在优选的实施方案中，将活性蛋白
质与不影响对活性蛋白质的生物应答的中性蛋白质结合，以便提高总蛋白质的负载
量。所述中性蛋白质的例子是牛血清白蛋白(虽然对于人使用来说不是优选的)，人
白蛋白，肌红蛋白，血红蛋白等等。
在本发明的药物组合物中，包含掺入到选自于下列的生物可降解聚合物中的sTNF-
R：聚-L-乳酸，聚羟基乙酸，和其共聚物，商品乳酸和/或羟基乙酸的同聚物或共
聚物，所述组合物配制成微球体形式，适合用于植入或注射应用。按照Cohen et al
所述利用例如改性的溶剂蒸发方法，利用双乳化可以制备微球体。当这些聚合物是
生物可降解时，植入剂易于被注射，避免使用手术和在药物被消耗之后去除装置。
活性剂通过可控制的和预定的释放动力学释放。该系统允许活性成份在几星期或几
个月的期间内延缓释放。
含有sTNF-R的本发明的药物组合物可用于中和急性疾病例如败血性休克，移植物
抗宿主反应(GVHD)，疟疾，传染性肝炎，结核病，或慢性疾病，例如癌症相关的
恶病质，慢性GVHD，或自体免疫疾病，例如类风湿性关节炎，多发性硬化和青
年型糖尿病，全身红斑狼疮和皮肤延迟型过敏疾病中TNFα的有害作用。
本发明的药物组合物可以以适合于sTNF-R的控制释放的方式给药，例如植入，或
局部注射，例如在治疗类风湿性关节炎时关节内注射到关节腔的关节液中，或在治
疗多发性硬化时鞘内注射到脑脊髓液中，或以局部用药剂形式给药，例如用于治疗
皮肤疾病的洗剂。用于治疗类风湿性关节炎的组合物可包括其它的消炎剂，和用于
治疗多发性硬化的组合物可包括抗多发性硬化的其它药剂例如β-干扰素和
Copolymer-1(Cop-1)。
将本发明的含有sTNF-R的组合物设计为可以在体内释放足于阻止TNFα的作用的
量的sTNF-R。在自体免疫疾病的情况下，将该组合物设计成例如释放的sTNF-R
的量足于影响自体免疫疾病的进程和严重性以及提高患者的状态，导致疾病减弱或
缓解。有效量取决于给药途径，待治疗的疾病和患者的状态。在中和TNFα的有害
作用方面，考虑到外源性给药的sTNF-R可以补充内源性形成的sTNF-R，采用已
知的方法(ELISA，参见Aderka等人，1991)对患者的血清中或其它合适的体液中
p55sTNF-R或p75sTNF-R的水平进行测定，可以帮助建立适合所述患者的剂量。
当期望稳定TNFα的活性时，该组合物含有TNFα和sTNF-R的复合物例如1∶1的
比例的复合物，以便在治疗部位给药。
通过下面的实施例和附图以非限制性的方式阐述本发明。
实施例
材料和方法
材料。使用PLGA，50∶50，固有的粘度(iv)为0.51dl/g，和75∶25i.v.为0.48dl/g，
以及PLLA(聚-L-乳酸)，i.v.为0.64dl/g(两者都是从PURAC Biochem BV，Holland
购买)。使用乙烯乙酸乙烯酯共聚物(EVAc)，(40％乙酸乙烯酯)(杜邦)，牛血清白蛋
白(BSA)(Sigma ChemicalCo，USA)，平均分子量为77000-79000的聚乙烯醇(PVA)，
88％羟基化(Aldrich Chemical Co.)和TBPI(p55sTNF-R)(InterPharmLaboratories Ltd.，
Israel)。命名为TNF-1的抗TNFα抗体是本发明人的实验室之一制备的抗人重组
TNFα的鼠单克隆抗体(h)。
方法。通过将药物释放基质置于存在于小瓶中的并且在摇床水浴中搅拌的磷酸缓冲
盐水(PBS，pH7.4)中获得体外释放概况。定期地取样并且通过酶连接的免疫吸附检
测方法(ELISA)分析TBPI，如由Aderka等人，1991描述的。
按三种模式检测聚合物系统的体内效率：(i)按照Oliff等人，1987描述，用产生
TNFα的肿瘤细胞(CHO/TNF)植入小鼠，显示严重的恶病质，导致死亡。(ii)按照
Keffer等人，1991描述，转基因Tg197鼠，定期发展为关节炎。(iii)按照Probert等
人，1993描述，转基因Tg211鼠，在T细胞中表达人TNFαmRNA并且发展为显
著的组织变化和致死的消瘦症。
实施例1
从EVAc基质中控制释放p55sTNF-R/TBPI
将乙烯乙酸乙烯酯共聚物(40％乙烯乙酸酯，重量比)溶于二氯甲烷中得到10％溶液
(w/v)。将TBPI溶液加入到溶于双蒸馏水的牛血清白蛋白(BSA)粉中。将该混合物
冷冻干燥(24小时，5μmHg，-70℃，Frceze Dryer，Lab Conco)成粉末。将
TBPI+BSA粉末过筛得到＜75，75-250，或250-425μm的颗粒。将单一大小范围的
称过重量的粉末加入到玻璃管中的15毫升的聚合物溶液中，将该混合物快速地倾
倒到水平的Teflon模型的盘的中央(直径为1cm，厚度为0.5cm)，该盘预先置于干
冰上冷冻5分钟。在预冷冻期间，用玻璃盘盖在该模型上以阻止过量的霜形成。在
混合物被倾倒之后，将模型在干冰上保留10分钟，将混合物冷冻。(在该阶段的最
后7分钟将该模型再次覆盖)用冷的药刀易于将冷冻的平板撬开，转移到金属丝网
筛，并且在-20℃保持2天。然后将该盘在室温下，在干燥器中温和的家用真空器
(600mtorr)干燥2天以上。干燥导致该盘收缩至直径约0.5cm和厚度为0.1-0.2cm。
将聚合物释放系统浸于PBS介质中。在每个盘中制备EVAc基质的直径0.5cm和
厚度1-2cm的含有22.35μg的TBPI的盘用于体内试验。对于体外试验，该盘含有
4.47，13.41，或22.35μg TBPI(10％，30％和50％负载量)。采用ELISA方法，测
定TBPI与时间的函数关系，检测TBPI的释放(Aderka等人，1991)。
附图1和2显示药物颗粒大小和负载量对从EVAc基质释放的动力学的影响。颗粒
大小显著影响药物释放速率。颗粒大小的增加导致释放速率的提高(附图1)。药物
负载量的提高均一地提高药物释放速率(附图2)。不仅释放的总药物量增加，而且
释放速率提高。
药物颗粒大小和负载量显著影响大分子聚合物释放系统的释放动力学。因为大分子
太大以致于不能穿过聚合膜扩散，通过基质中的通道扩散可能出现持续的释放。在
浇铸期间大分子的掺入可引入这样的通道，通过该通道可扩散溶解的药物。颗粒直
径的增加所引起释放速率的提高，可能是由于在聚合物基质中孔的大通道的形成。
类似地，提高的负载量可提供较简单的途径(较低的弯曲)和用于扩散的较大的孔径，
两者都有利于水和PBS移动到基质，而蛋白质从基质中排出。
实施例2
从PLGA和PLLA微球体中控制释放p55sTNF-R(TBPI)
如Cohen等人，1991描述，利用双乳化以及修饰的溶剂蒸发方法，制备聚(乳酸-羟
基乙酸)(PLGA)，聚-L-乳酸(PLLA)微球体。简单地说，将TBPI溶液或TBPI和
BSA粉末(按照上述实施例1描述制备)溶解于双蒸馏水中，倾倒到溶解于二氯甲烷
中的PLGA或PLLA中。利用超声波检测该混合物30秒(VC-250型，
Sonic& MaterialsInc.)，形成第一惰性乳液(W1/0)。利用磁棒剧烈搅拌混合。将
该乳液倾到2毫升的用二氯甲烷饱和的含水1％聚乙烯醇(PVA)以形成第二乳液
((W1/0)W2)。将得到的双重乳化液倾到200毫升的0.1％PVA并且在室温下连续搅
拌3小时，直到大多数的二氯甲烷被蒸发，留下固体的微球体。通过离心收集微球
体(1000g，10分钟)，利用100微米的孔径的筛过筛，并且冷冻干燥成粉末(16小时，
Freeze Dryer，Lab Conco)。除非另有说明，否则研究工作是用比例为75∶25和
50∶50(L/G)的PLGA和PLLA完成的。
将聚合物释放系统浸于PBS介质中。在每个试验中评估含有18.2微克的TBPI的
0.04克PLGA或PLLA微球体，采用ELISA方法，检测TBPI释放与时间的函数关
系。EVAc(黑柱)，单独的EAVc(灰色柱)植入治疗的或未治疗(对照)(白色柱)的转基
因Tg197关节炎鼠子代的不同发育阶段的关节炎的进展。
附图7是图形表示的踝关节的肿胀(mm)，显示用抗-TNFα抗体每星期一次持续整
个试验期(65天)(黑柱)和一星期一次持续两星期(灰色柱)治疗的和未治疗(对照)(白
色柱)的转基因Tg197关节炎鼠子代的不同发育阶段的关节炎的进展。
附图8图形表示在T细胞中表达人TNFαmRNA的转基因Tg211鼠的平均组重量
(gr)，所述鼠用含有TBPI的EVAc(实心圆圈)，单独的EAVc(空心圆圈)植入治疗或
未治疗(对照)(实心正方形)。
附图9图形表示用抗-TNFα抗体每星期一次持续整个试验期(50天)(实心三角形)和
一星期一次持续两星期(空心三角形)治疗的和未治疗(对照)(实心正方形)的转基因
Tg211鼠的平均组重量(gr)。
附图10表示用含有TBPI的EVAc(实心圆圈)，单独的EAVc(空心圆圈)移植治疗的
或未治疗(对照)(实心正方形)的转基因Tg211鼠的生存曲线。
附图11表示用抗-TNFα抗体每星期一次持续整个试验期(65天)(实心圆圈)和一星期
一次持续两星期(空心圆圈)治疗的和未治疗(对照)(实心正方形)的转基因Tg211鼠
的生存曲线。
优选的实施方案的详述
本发明提供可溶性受体的控制释放，所述受体能够结合到配体上并且影响其配体的
活性，例如中和具有害作用的配体或稳定/增强配体的活性。所述可溶性受体的例
子是细胞因子例如TNFα，IFN-γ，IL-2，IL-6等的可溶性受体。
在优选的实施方案中，本发明的组合物包括从天然源例如人尿获得的sTNF-
Rs(Engelmann等人，1989；Engelmann等人，1990；Olson等人，1990，Loetscher
等人，1990)，和利用重组技术(EP433900；Nophar等人，1900；Schall等人，1990；
和Loetscher等人，1990)并然后如文献例如EP308378和EP398327中所述进一步纯
化所得的sTNF-Rs。
如本文所述，术语“sTNF-Rs”，“p55sTNF-R”，“p75sTNF＝R”，是指天然来源的或
通过重组技术获得的所有sTNF-Rs，包括但不限于在EP308378和EP398327中描
述的TNF结合蛋白质I和
附图3显示从不同的PLGA共聚物(50∶50或75∶25)或PLLA微球体中TBPI的累
积释放百分数。在2200小时之后可以看到，掺入到微球体中的TBPI只有10％被
释放。在该图中也证明了当TBPI与BSA一起加入(TBP+BSA)时聚合物的TBPI的
累积的释放百分数(实心圆圈，正方形和三角形)高于当没有BSA而仅加入TBPI时
从样品释放的量(空心圆圈，正方形和三角形)。
实施例3
在用CHO/TNFα细胞接种后的小鼠体内，从聚合物基质中释放的TBPI保持其生物
活性
对于下面的TNFα的慢性有害作用，在本实施中使用公知的用于TNFα的恶病质效
应的动物模型，即按照Oliff等人，1987描述，用产生TNFα的肿瘤细胞
(CHO/TNFα)植入的balb裸鼠。
给balb裸鼠皮下接种CHO/TNFα细胞(Korn等人，1988)，以便得到恶病质。利用
该细胞系的新鲜的胰蛋白胨化的悬浮液以1×107细胞/毫升(1毫升/鼠)
接种。利用塑料的3cc注射器的23号针进行注射。将细胞皮下注射到背，颈或腹
区，通过尾部取血每周采集几次血清样品。根据血液中TBPI和TNFα的水平，重
量的降低以及死亡情况，对在用CHO/TNFα细胞接种五天之后植入的聚合物系统
的性能进行评估。
在所述小鼠已经接种了产生TNFα的CHO细胞以获得恶病质的五天后，将上述实
施例1和2的聚合物基质植入或注射到balb裸鼠，根据血液中TBPI和TNFα的水
平，对聚合物系统的性能进行评估(ELISA)。检测的参数是：(1)TBPI的生物学活
性与时间的函数关系；(2)将TBPI治疗与用抗人TNFα的小鼠抗体(在发明人的实验
室制备并且命名为TNF-1)注射一次(用CHO/TNFα细胞接种小鼠五天之后，标记为
Ab-一次)或以互相一星期的间隔注射两次(CHO/TNFα细胞接种五天之后，以及一
星期之后，标记为Ab-两次)治疗进行比较；(3)根据小鼠平均组重量和小鼠死亡率
评价恶病质的进展；(4)移植的部位(颈，背或胃的皮下)。
TNFα可能引起恶病质，并且能够诱导携带肿瘤的动物的重量逐渐损失。在植入了
产生TNFα的肿瘤细胞的小鼠中检查基质的体内效果。以高水平组成型产生TNFα
的1×107CHO/TNFα细胞注射的小鼠显示严重的恶病质并且重量损失，
导致死亡。另外，植入了含有TBPI的聚合物的基质的小鼠其体重增加，而没有死
亡，表明基质释放的TBPI提供了持久的抗TNFα的效果。
为了对携带肿瘤的小鼠中TBPI生物学活性进行评估，在不同的时间点收集血清样
品并且通过测定其对MHA2细胞(对TNFα敏感的HcLa细胞的衍生物)的细胞毒性
而对其中的TNFα的生物学活性进行评估。如附图4b所述，接种含有TBPI的基质
导致血清的TNFα生物学活性延长和显著降低，表明基质释放的TBPI强烈地抑制
TNFα与MHA2细胞的细胞表面TNFα受体的结合。
为了进行比较，用抗TNFα的抗体注射小鼠一次(用CHO/TNFα细胞接种小鼠五天
之后，标记为Ab-一次)或以一星期的间隔注射小鼠两次(CHO/TNFα细胞接种五天
之后，以及一星期之后，标记为Ab-两次)。如附图4a所示，抗体仅在注射之后几
天影响鼠的重量(小鼠保持其体重)，然后它们发展为进展性的消瘦，而当掺入到聚
合物中时TBPI在体内长期存在。
在抗体注射的小鼠的血清中TNFα的生物活性情况表明注射的抗TNFα的抗体
(TNF-1)的效果持续时间短，如在附图4b。
在附图4c中可以看到，用允许TBPI控制和定位释放的聚合物系统治疗的小鼠生
存了50天以上，这与用TNF-1抗体治疗的小鼠不同，当停止注射抗体时后者不能
生存并且发展为恶病质。
这些结果表明基于聚合物控制释放的TBPI的治疗阻止了消瘦症的发展，并且优选
的是注射抗TNFα的抗体，因为它不用每星期注射，并提供了抵抗TNFα的持久的
保护作用。而且由于是天然分子，可溶性的TNFα受体更适用于延长使用。抗
TNFα的抗体迟早将产生抗它们的抗体，这将阻止它们的作用，因此不适用于延长
使用。对于人或人性化的抗体这也是正确的，将会产生抑制其功能的抗个体基因型
抗体。
从植入到小鼠的颈背，背部或胃部的EVAc基质释放TBPI的动力学与基质植入部
位的函数关系没有显著的差异(附图5)。在整个释放期间TBPI的释放动力学保持
不变。
实施例4
在转基因的Tg197小鼠中从聚合物基质释放的TBPI保留其体内生物学活性
根据踝关节肿胀水平，对转基因的Tg197小鼠中实施例1制备的EVAc基质(出生
后14天通过基本手术皮下植入)的性能进行评估。在约4-6周龄时出现病症，为踝
关节肿胀。在9-10周龄时进一步的踝关节肿胀和后腿运动损伤发展为后腿完全失
去运动功能。而且在这些小鼠中重量的逐步损失是共同的特征。但是用含有TBPI
的EVAc基质治疗这些关节炎小鼠完全阻止了踝关节肿胀(附图6)。而且，被治疗
的动物正常地发育，甚至在10周龄时没有显示关节炎迹象或重量的损失。
为了进行比较，在出生后14天用TNF-1抗体每周注射小鼠一次，持续整个治疗期
(65天)或一星期注射小鼠一次，共两周。如附图7所示，仅当每周注射一次维持整
个试验期间时抗体影响肿胀(黑色柱)。每周注射的小鼠显示发育正常并且甚至在10
周龄时没有显示关节炎迹象或重量的损失，而在这些小鼠中运动的损伤是共同的可
见的特征。但是，一星期注射小鼠一次，共两周的小鼠发展为踝关节肿胀和在9-
10用龄时后腿运动损伤发展为后腿完全失去运动功能，逐渐重量损失。
这些结果表明基于聚合物控制释放的TBPI的治疗完全阻止了小鼠关节炎的发展，
并且优选的是注射抗hTNFα的抗体，因为它提供了抵抗TNFα持久保护作用并无
需每星期注射。
实施例5
在转基因的Tg211小鼠中从聚合物基质释放的TBPI保留其体内生物学活性
在T细胞中表达人TNF mRNA的转基因Tg211小鼠发展为明显的组织学变化以及
致死的消瘦症。根据重量的降低和死亡率对出生14天后植入的含有TBPI的聚合
物系统的性能进行评估。每周对动物逐个称重几次。通过基本手术将EVAc基质皮
下植入。
如附图8和10所示，未治疗的小鼠(对照组：实心正方形)发展为严重的进展性重
量损失，导致死亡，而植入了含有TBPI的EVAc基质的小鼠(实心圆圈)，增加了
体重和在整个试验期间存活。
为了进行比较，小鼠在出生后14天用TNF-1抗体每周注射一次，持续整个治疗期
或一星期注射一次，共两周。如附图9所示，以抗TNFα的抗体给药完全阻止了消
瘦症的发展，如果从出生开始每周给药。但是，如果仅每周给药一次，共给药两周，
这些抗体是不起作用的，小鼠发展为消瘦症，导致死亡，如附图11所示。
这些结果表明基于聚合物控制释放的TBPI的治疗完全阻止了小鼠消瘦症的发展，
并且优选的是注射抗hTNFα的抗体。
体内结果显示释放的TBPI保留了其生物学活性，如平均组重量变化所证明(附图
4a)和对TNFα敏感的MHA2活细胞的高百分数所证明(附图4b)。
本文中公开的所有参考文献包括杂志文章或摘要，公开的或对应的美国或外国专利
申请，授权的美国或外国专利，或其它任何参考文献整个引入作为参考，包括所记
载的参考文献中的数据，表，图和正文。另外，在本文中记载的参考文献中记载的
文献的所有内容也全部引入本文作为参考。
对已知的方法步骤，常规的方法步骤，已知的方法或常规的方法的引用不是以任何
方式承认在相关领域内公开，教导或暗示了本发明的任何方面，说明书或实施方案。
前面的特定实施方案的描述已经充分显示本发明的一般特性，以致于通过应用本领
域内技术人员的知识(包括参考文献中记载的内容)容易修饰和/或适用于各种应用例
如特定的实施方案，不需要过度的实验，不会脱离本发明的一般概念。因此，基于
本文提供的教导和指导，所述的适应和修改包括在本文公开的实施方案的等同物的
含义和范围内。应该明白，本文中的短语或术语是为了描述的目的，不是为了限制，
因此根据本文提供的教导和指导，结合本领域内技术人员的知识，本领域内技术人
员可以理解本发明说明书的术语或短语。
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2024年4月25日发(作者：席阳华)
(19)中华人民共和国国家知识产权局
(12)发明专利说明书
(21)申请号 CN96193437.9
(22)申请日 1996.03.01
(71)申请人 耶达研究及发展有限公司;宾-古里安尼格夫大学研究及发展部
地址 以色列雷霍沃特
(72)发明人 D·瓦拉赫 J·科斯特 艾利尔兹
(74)专利代理机构 中国专利代理(香港)有限公司
代理人 吴玉和
(51)
A61K38/19
权利要求说明书 说明书 幅图
(10)申请公布号 CN 1182369 A
(43)申请公布日 1998.05.20
(54)发明名称
控制释放可溶性受体的药物组合物
(57)摘要
一种控制释放药物组合物,含有已经
掺入到可溶性受体中的生物相容性聚合物,
优选的是聚乙烯乙酸乙烯酯或多聚(乳酸－
羟基乙酸),所述载体能够结合到配体上,从
而使配体发挥功能。该可溶性受体优选的
是可溶性形式的TNFα受体。所述组合物
可用于治疗其中需要中和有害作用的疾
病。
法律状态
法律状态公告日
法律状态信息
法律状态
权 利 要 求 说 明 书
1.一种药物组合物，用于控制能够与配体结合的可溶性受体的释放，从而影响配体
的功能，该组合物包括一种生物相容性聚合物材料，在其中掺入了所述可溶性受体。
2.根据权利要求1所述的药物组合物，其中所述的聚合物材料是选自于下列的生物
可溶性非降解性聚合物：乙烯乙酸乙烯酯共聚物(EVAc)，硅橡胶，多糖，聚酰胺，
聚丙烯酸酯，聚乙烯，聚氨酯，聚异丁烯，聚磷腈。
3.根据权利要求1所述的药物组合物，其中所述的聚合物材料是选自于下列的生物
可降解聚合物：聚酯，聚酐，聚原酸酯，聚己内酯，假多氨基酸，多肽，明胶，聚
乳酸，聚羟基乙酸，和聚(乳酸-羟基乙酸)共聚物(PLGA)。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的药物组合物，其中所述的可溶性受体是一种激
素或细胞因子的可溶性受体。
5.根据权利要求4所述的药物组合物，其中所述的可溶性受体是可溶性形式的
TNFα受体。
6.根据权利要求2所述的药物组合物，其中所述的可溶性受体是溶性形式的TNFα
受体。
7.根据权利要求6所述的药物组合物，其中聚合物是聚乙烯乙酸乙烯酯。
8.根据权利要求3所述的药物组合物，其中所述的可溶性受体是可溶性形式的
TNFα受体。
9.根据权利要求8所述的药物组合物，其中聚合物是聚(乳酸-羟基乙酸)。
10.根据权利要求5所述的药物组合物，其中可溶性TNFα受体是可溶性p55 TNFα
受体(p55sTNF-R)。
11.根据权利要求5所述的药物组合物，其中可溶性TNFα受体是可溶性p75 TNFα
受体(p75sTNF-R)。
12.根据权利要求5所述的药物组合物，用于治疗需要中和TNFα的有害作用的疾
病。
13.根据权利要求12所述的药物组合物，用于治疗败血性休克。
14.根据权利要求12所述的药物组合物，用于治疗癌相关性恶病质。
15.根据权利要求12所述的药物组合物，用于治疗自体免疫性疾病。
16.根据权利要求15所述的药物组合物，用于治疗类风湿性关节炎。
17.根据权利要求16所述的药物组合物，进一步包括抗炎剂。
18.根据权利要求15所述的药物组合物，用于治疗多发性硬化。
19.根据权利要求18所述的药物组合物，包括用于治疗多发性硬化的另外的药剂例
如β-干扰素或Copolymer-1。
20.根据权利要求15所述的药物组合物，用于治疗全身性红斑狼疮。
21.根据权利要求12所述的药物组合物，用于治疗移植物抗宿主反应。
22.根据权利要求12所述的药物组合物，用于治疗皮肤延迟型过敏疾病。
23.根据权利要求7所述的药物组合物，它是植入剂形式。
24.根据权利要求9所述的药物组合物，它是植入剂形式。
25.根据权利要求9所述的药物组合物，它是注射液形式。
26.根据权利要求23至25中任一项所述的药物组合物，用于局部注射到关节液中，
用于治疗类风湿性关节炎中的关节炎。
27.根据权利要求23至25中任一项所述的药物组合物，用于鞘内注射到脑脊髓液
中，用于治疗多发性硬化。
28.根据权利要求22所述的药物组合物，用于局部应用。
29.根据权利要求5所述的药物组合物，进一步包括TNFα。
30.根据权利要求29所述的药物组合物，用于增强TNFα的有利作用。
31.根据权利要求30所述的药物组合物，用于治疗肿瘤。
32.根据权利要求30所述的药物组合物，用于治疗病毒，细菌和多细胞寄生物感染。
33.根据权利要求30所述的药物组合物，用于伤口愈合。
34.用于治疗其中需要中和TNFα的有害作用的疾病的方法，包括施用能够释放有
效量的所述TNFα受体可溶形式的权利要求5所述的控释药物组合物。
35.根据权利要求34所述的方法，其中所述疾病选自：败血性休克，癌症相关性恶
病质，自体免疫疾病，移植物抗宿主反应，皮肤延迟型过敏疾病。
36.根据权利要求34所述的方法，其中所述给药步骤包括植入所述控释药物组合物。
37.治疗其中需要增强TNFα的有利作用的疾病的方法，包括施用能够释放有效量
的所述TNFα受体可溶形式和TNFα的权利要求5所述的控释药物组合物。
说 明 书
发明领域
本发明涉及用于从聚合物基质中控制释放可溶性形式的受体的药物组合物。
发明背景
控制释放系统在一定的时期内，以预定的速率释放药物，所述时期可以是几天到几
年。这些系统比常规的药物治疗法具有优点。例如，在摄入或注射标准剂型之后，
血液中药物的水平升高，达到峰值，然后下降。由于各种药物具有一定的治疗范围，
高于该范围产生毒性，而低于该范围没有效果。波动的药物水平可以导致产生交替
的无效和有毒期。相反，控制释放的制剂通过一次给药将药物维持于所需的治疗范
围。控制释放系统的其它优点包括：(i)将药物定位释放到身体的特定部位，从而降
低全身的药物水平；(ii)保存易被身体快速破坏的药物(这对于生物学敏感分子例如
蛋白质特别重要)；(iii)减少了对随访治疗的需求；(iv)提高了舒适感；(v)改善了依
从性。
通过将药物置于聚合物中可获得对药物释放的最佳控制。通常聚合物通过扩散，化
学反应，或溶剂活化而释放药物。
最普遍的释放机理是扩散，从而药物从其在聚合物系统中的起始位置迁移到聚合物
的外表层，然后迁移到身体中。扩散可通过储液囊来实现，其中药物核周围包裹一
层聚合物膜，或将药物核包围于基质中，其中药物穿过聚合物系统均一分布。通过
化学反应例如降解聚合物或从聚合物骨架中裂解该药物，也可以将药物释放。
上述机理也可结合。基于聚合物的特性(例如，扩散控制系统的晶格和孔结构，化
学控制系统的键的水解不稳定性或单体的疏水性)以及系统的设计(例如，厚度和形
状)可以控制从聚合物系统的释放速率。具有不同释放机理的系统的优点是各个系
统能够完成不同的目的。
多年来，控制释放系统仅能缓慢地释放低分子量的药物(＜600)。大分子例如蛋白
质不被认为是合适的候选分子，因为，多肽被认为太大以致于不能穿过聚合物缓慢
地扩散，即使在该聚合物吸胀之后。基于含有粉状大分子的固体疏水聚合物的基质
能够在100天以上的时间内使几乎任何大小的分子释放的发现，从而可控制释放各
种各样的蛋白质，多糖和多核苷酸。参见，Langer，1990。
至今为止，为了控制释放而掺入到聚合物中的蛋白质和多肽主要是效应分子，例如，
胰岛素，这与控制释放与人体中产生的效应分子结合和中和的分子的组合物相反。
肿瘤坏死因子α(TNFα)是有潜效的细胞因子，可激发广谱的生物学应答。TNFα对
许多肿瘤细胞有细胞毒性，可用于肿瘤的治疗。TNFα加强成纤维细胞的生长，并
且起着组织重建剂的作用，因此适合于伤口愈合。它进一步诱导小鼠的移植肿瘤的
出血坏死，加强多型核的嗜中性粒细胞的吞噬和细胞毒性，并且调节许多蛋白质的
表达，包括脂蛋白脂酶，大组织相容性复合物的I型抗原，和细胞因子，例如白细
胞介素-1和白细胞介素-6。已经证明TNFα具有抗病毒，细菌和多细胞特别是细胞
内的寄生虫效应。TNFα似乎对于正常的免疫应答是必要的，但是，量大时，产生
急剧的致病作用。由于TNFα是引起与瘤形成疾病和寄生物血症有关的消瘦症(恶
病质)的主要因子，因此将其称为“恶病质素”。由于抗TNFα的抗体能够保护受感
染的动物，因此，TNFα也是一种在革兰氏阴性脓毒症中细胞毒性的主要起作用者。
已经证明TNFα与几种疾病有关，可列举的例子包括成人呼吸窘迫症，肺纤维变性，
疟疾，传染性肝炎，结核病，炎性肠疾病，败血性休克，AIDS，移植物抗宿主反
应，自体免疫疾病，例如类风湿性关节炎，多发性硬化和青年型糖尿病，和皮肤延
迟型过敏疾病。
由于某些TNFα的作用对宿主有害，使人注意到引起调节TNFα功能的机理。由两
种不同分子种类的细胞表面受体(本文中称为TNF-R)提供对TNFα的应答的细胞内
信号，而TNFα以高亲和力结合到所述受体上。
在身体的几乎所有细胞中表达细胞表面各种TNF-R。一旦TNFα与TNF受体结合，
由TNF受体以信号形式反映出所有TNFα的各种作用，细胞毒性，促生长以及其
它。这些受体的分子量不同的两种形式，55千道尔顿和千75道尔顿已经被描述了，
并且在本文中分别被描述为p55和p75TNF-R。但是，应该注意现有的公开文本将
这两种受体也称作为p60和p80TNF-R。
TNFα的两种受体不仅以细胞结合形式而且以可溶性形式存在，包括从细胞表面形
式蛋白酶裂解衍生得到的完整受体的裂解细胞外区域。这些可溶性的TNFα受体
(sTNF-Rs)能够保持结合TNFα的能力，并且与细胞表面受体一起竞争TNFα，从而
阻止了TNFα的活性。因此，sTNF-Rs起着TNFα活性的生理学减毒作用，保卫其
抵抗潜在的有害作用。但是，也已经有报道，sTNF-Rs也通过稳定其活性，可能是
通过阻止其生物活性三聚体结构降解为非活性的单体而影响TNFα的功能(Aderka
等人，1992)。因此sTNF-Rs以两种不同的途径影响TNFα的活性：它们与细胞表
面受体竞争TNFα和阻止TNFα的有害作用，或它们起缓冲剂的作用并且稳定
TNFα的活性。
以前将本文中称为p55sTNF-R和p75sTNF-R的两种sTNF-Rs分别命名为TNF结合
蛋白I和II，或TBPI和TBPII(参见例如EP398327，EP412486，和EP433900)。在
本申请中我们利用两种命名：p55sTNF-R或TBPI和p75s TNF-R或TBPII；它们分
别定义相同的蛋白质。
sTNF-Rs以在炎性和非炎性疾病状态下显著增高的浓度组成地存在于血清中。这些
蛋白质的效果可以不同，但取决于其在TNFα作用位点的浓度，其浓度与TNFα局
部浓度的关系，以及就TNF活性的衰退而言sTNF-Rs和TNFα从TNFα作用位点
清除的速率。依据这些参数，在不同的情形下，sTNF-Rs以非常不同的方式影响
TNFα的功能，或通过抑制TNFα的效果或作为TNFα的载体，或者通过延长其功
能扩大TNFα的效果(Aderka等人，1992)。
sTNF-Rs作为抗-TNFα药物的效果可能受许多不同因子的影响：与细胞表面受体的
亲和力相比的sTNF-Rs结合TNFα的亲和力，可溶性受体进入TNFα作用位点的难
易程度，和可溶性受体和它们与TNFα形成的复合物从TNFα形成位点清除的速率。
sTNF-Rs的天然形式可能以最生理相关的方式起作用。但是，其用途受到的大的限
制是它们相当快地从血液中清除。已经制定了几种计划以改善这些分子，所述例子
是所谓的嵌合“免疫吸附”，其中将sTNF-Rs连接到免疫球蛋白分子的Fc部分(由
Hoffman La Roche和Immune开发)，和“PEGulated”sTNF-Rs，其中sTNF-Rs通过
PEG分子交联(由Synergen研制)。两种途径导致二价sTNF-R分子的形成，该分子
有较长的清除时间，并且能够更有效地与三价TNFα分子结合。但是，它们可能比
天然可溶性受体更具免疫原性，并且不会出现它们与TNFα的复合物以非常高的效
率从循环中清除。
由于该细胞因子在身体的某一特定部位的长期形成而造成了TNFα的许多有害作用。
对于在需要的部位维持治疗学上有效的可溶性受体的浓度，较大预见性地限定使用
可溶性形式的TNF受体以防止所述病理状态是困难的。
发明概述
本发明的目的之一是研制治疗学上使用可溶性形式的受体的新方法，所述治疗学应
用可影响它们的配体的功能，例如保护身体免遭它们的配体的有害作用，特别是研
制以不变的速率，在较长的时间期间允许可溶性受体在身体中局部释放的系统。这
些方法是基于将可溶性受体掺入到生物相容性聚合物中，并将其植入到或注射到所
需的身体部位。含有可溶性受体的聚合物的基质能够局部和控制释放天然形式的可
溶性受体。
本发明包括能够结合到其配体并且影响其功能的可溶性受体，所述影响功能的方式
是使其配体的毒害作用中和和/或稳定或增强其活性。所述可溶性受体的例子是激
素的和细胞因子的可溶性受体，并且在优选的实施方案中，可溶性受体是可溶性的
TNFα受体。
因此，本发明的另一目的是提供了治疗学上使用可溶性TNFα的受体以影响TNFα
功能，例如保护身体抵抗TNFα的有害作用的新方法，所述新方法包括控制释放系
统。
因此本发明提供了用于控制释放可溶性受体的药物组合物，其中所述可溶性受体被
掺入到生物相容性聚合体基质中。
可用于本发明组合物中的生物相容性聚合体基质的例子包括，但不限于下列生物相
容性非降解性聚合物：乙烯乙酸乙烯酯共聚物(EVAc)，硅橡胶，多糖例如纤维素，
聚酰胺，聚丙烯酸酯，聚乙烯，聚氨酯，聚异丁烯，聚磷腈，和下列生物降解性聚
合物：聚酯，聚酐，聚原酸酯，聚己内酯，假多氨基酸，多肽，明胶，聚乳酸，聚
羟基乙酸(polyglycolic acid)，和聚乳酸-羟基乙酸(PLGA)共聚物。
在一个优选的实施方案中，将可溶性TNFα受体(sTNF-R)掺入到合适的聚合物中，
例如聚乙烯乙酸乙烯酯基质，或掺入到聚(乳酸-羟基乙酸)微球体中。
本发明的药物组合物可含有p55 sTNF-R或p75sTNF-R。在一个优选的实施方案中，
该组合物含有p55sTNF-R(TBPI)。
一个实施方案中，本发明的药物组合物适用于治疗疾病，其中需要保护身体抵抗配
体例如TNFα的有害作用。将含有sTNF-Rs的该聚合体基质置于所需的身体部位中，
从而在体内恒定维持sTNF-R并且保持长时间。
在另一个实施方案中，本发明的药物组合物可与配体例如TNFα一起使用，以便稳
定和/或增强TNFα的活性，用于需要TNFα的有利作用的任何情况。该实施方案
的一个方面，所述组合物包括TNFα/sTNF-R复合物，通过肿瘤部位给药，TNFα
发挥有效的局部的抗肿瘤功能并且产生较少的全身的不良作用。在该实施例的另一
方面，含有TNF-α/sTNF-R复合物的组合物可用于抗病毒，细菌和寄生物
(parasiticidal)，特别是细胞内的多细胞寄生物的感染和用于伤口治愈。
在另一个实施方案中，本发明包括对患者进行治疗，保护患者免除配体例如TNFα
的有害作用，包括给患者施用本发明的药物组合物，所述药物组合物含有控制释放
形式的有效量的合适的可溶性受体例如sTNF-R。
在又一实施方案中，本发明涉及癌症的治疗，包括在需要治疗的患者的肿瘤部位施
用含有TNFα/sTNF-R复合物的控制释放形式的本发明的药物组合物。
附图简述
附图1显示颗粒大小对TBPI的累积释放的影响。将三个大小范围的TBPI+BSA粉
的颗粒以30％的负载量掺入到乙烯乙酸乙烯酯共聚物(EVAc)基质中：(i)＜
75μm(实心菱形)；(ii)75-250μm(空心正方形)，和(iii)250-425μm(实心圆圈)。
附图2显示负载量对TBPI累积释放的影响。利用75-250μm大小范围的颗粒制备
具有TBPI+BSA负载的EVAc基质：(i)10％负载量(实心菱形)；(ii)30％负载量(空
心正方形)，和(iii)50％的负载量(实心圆圈)。
附图3显示单独的可溶性TNFα受体I(TBPI)或与牛血清白蛋白(BSA)一起掺入到下
列成份的微球体中的累积的释放百分数：(i)聚乳酸-羟基乙酸(PLGA)75∶25(分别是
空心或实心的圆圈)；(ii)PLGA 50∶50(分别是空心和实心的正方形)；(ii)聚-L-乳酸
(PLLA)(分别是空心和实心的三角形)。
附图4a-c显示用产生TNF的中国仓鼠卵(CHO)细胞(CHO/TNF)接种的Balb裸鼠用
TBPI或用鼠抗-TNF单克隆抗体TNF-1(Ab)治疗获得的体内结果，其中：
附图4a图示用如下药剂处理后Balb裸鼠的平均组重量(gr)(i)皮下植入EVAc基质
中的TBPI(实心圆圈)；(ii)TBPI/PLGA的75∶25的植入剂(空心圆圈)；(iii)用
CHO/TNF细胞接种鼠(Ab一次)后五天，注射一次抗-TNF抗体(实心正方形)；(iv)
用CHO/TNF细胞接种鼠五天以后和一星期之后(Ab两次)注射两次抗-TNF抗体(空
心正方形)；和(v)对照，没有任何治疗(实心三角形)；
附图4b表示在鼠血清中生物活性TNFα的水平进行体内评价的结果。在将EVAc
基质中的TBPI(实心圆圈)或75∶25的TBPIPLGA(空心圆圈)植入之后或用抗TNFα
抗体注射一次(实心正方形)或两次(空心正方形)(如在附图4a所示)，从携带产生
TNFα的中国仓鼠卵(CHO)细胞的鼠中收集血清，以及从非治疗的鼠中收集血清(实
心三角形)，通过在环己酰亚胺(25微克/毫升)存在下将其1∶100的稀释液加入到经
培养的MHA2细胞(Hela细胞的衍生物，将其以3×104细胞/9mM的浓
度播种微孔之后24小时)中保持10小时，测定血清中TNFα的生物活性，随后通
过中性红摄取方法评估细胞的存活力(Wallach等人，1984)，和
附图4c表示用如下药剂处理后的小鼠的生存曲线：(i)TBPI/EVAc植入剂(空心正方
形)；(ii)TBPI/PLGA75∶25植入剂(实心圆圈)；(iii)抗-TNF抗体一次(空心三角形)；
(iv)抗-TNF抗体两次(实心三角形)；和(v)对照，没有任何治疗(空心圆圈)；
附图5显示含有TBPI的EVAc基质在鼠体的不同部位植入对TBPI浓度释放的影
响：颈(实心圆圈)，背(空心圆圈)，和胃(实心正方形)。
附图6是图形表示踝关节的肿胀(mm)，显示用含有TBPI的II。
可用于本发明中的聚合物包括但不限于选自于下列的生物相容性不可降解性聚合物：
乙烯乙酸乙烯酯共聚物，硅橡胶，多糖例如纤维素，聚酰胺，聚丙烯酸酯，聚乙烯，
聚异丁烯，聚氨酯，和聚磷腈，和选自于下列的生物可降解性聚合物：聚酯，聚原
酸酯，聚己内酯，多肽，假聚(氨基酸)，明胶，聚酐，聚-L-乳酸，聚-D-乳酸，聚-
D，L-乳酸，聚羟基乙酸，和选自于下列的共聚物：聚-L-乳酸-羟基乙酸，聚-D-乳
酸-羟基乙酸，聚-D，L-乳酸-羟基乙酸，，聚-L-乳酸-D-乳酸，和聚-L-乳酸-D，L-
乳酸。
用于本发明中优选的聚合物是乙烯乙酸乙烯酯共聚物(EVAc)，聚-乳酸-羟基乙酸共
聚物(PLGA)和聚-L-乳酸(PLLA)。
从商品EVAc，如果必要，在纯化之后，例如通过Rhine等人，1980描述的溶剂浇
铸方法，可以制备含有掺入到EVAc基质中的sTNF-R的药物组合物。这些基质构
成了扩散控制的系统，所述系统允许蛋白质均一分布，可重现的动力学以及在几星
期或几个月的期间内生物学活性的sTNF-R的延缓释放。如果EVAc是生物相容性
的并且不可降解的聚合物，那么EVAc基质适合于需要或期望药物释放延长的应用。
当活性要素借助于通过基质中的通道扩散而从不可降解的聚合物例如EVAc中释放
时，通过较高的蛋白质负载量加强扩散。因此，在优选的实施方案中，将活性蛋白
质与不影响对活性蛋白质的生物应答的中性蛋白质结合，以便提高总蛋白质的负载
量。所述中性蛋白质的例子是牛血清白蛋白(虽然对于人使用来说不是优选的)，人
白蛋白，肌红蛋白，血红蛋白等等。
在本发明的药物组合物中，包含掺入到选自于下列的生物可降解聚合物中的sTNF-
R：聚-L-乳酸，聚羟基乙酸，和其共聚物，商品乳酸和/或羟基乙酸的同聚物或共
聚物，所述组合物配制成微球体形式，适合用于植入或注射应用。按照Cohen et al
所述利用例如改性的溶剂蒸发方法，利用双乳化可以制备微球体。当这些聚合物是
生物可降解时，植入剂易于被注射，避免使用手术和在药物被消耗之后去除装置。
活性剂通过可控制的和预定的释放动力学释放。该系统允许活性成份在几星期或几
个月的期间内延缓释放。
含有sTNF-R的本发明的药物组合物可用于中和急性疾病例如败血性休克，移植物
抗宿主反应(GVHD)，疟疾，传染性肝炎，结核病，或慢性疾病，例如癌症相关的
恶病质，慢性GVHD，或自体免疫疾病，例如类风湿性关节炎，多发性硬化和青
年型糖尿病，全身红斑狼疮和皮肤延迟型过敏疾病中TNFα的有害作用。
本发明的药物组合物可以以适合于sTNF-R的控制释放的方式给药，例如植入，或
局部注射，例如在治疗类风湿性关节炎时关节内注射到关节腔的关节液中，或在治
疗多发性硬化时鞘内注射到脑脊髓液中，或以局部用药剂形式给药，例如用于治疗
皮肤疾病的洗剂。用于治疗类风湿性关节炎的组合物可包括其它的消炎剂，和用于
治疗多发性硬化的组合物可包括抗多发性硬化的其它药剂例如β-干扰素和
Copolymer-1(Cop-1)。
将本发明的含有sTNF-R的组合物设计为可以在体内释放足于阻止TNFα的作用的
量的sTNF-R。在自体免疫疾病的情况下，将该组合物设计成例如释放的sTNF-R
的量足于影响自体免疫疾病的进程和严重性以及提高患者的状态，导致疾病减弱或
缓解。有效量取决于给药途径，待治疗的疾病和患者的状态。在中和TNFα的有害
作用方面，考虑到外源性给药的sTNF-R可以补充内源性形成的sTNF-R，采用已
知的方法(ELISA，参见Aderka等人，1991)对患者的血清中或其它合适的体液中
p55sTNF-R或p75sTNF-R的水平进行测定，可以帮助建立适合所述患者的剂量。
当期望稳定TNFα的活性时，该组合物含有TNFα和sTNF-R的复合物例如1∶1的
比例的复合物，以便在治疗部位给药。
通过下面的实施例和附图以非限制性的方式阐述本发明。
实施例
材料和方法
材料。使用PLGA，50∶50，固有的粘度(iv)为0.51dl/g，和75∶25i.v.为0.48dl/g，
以及PLLA(聚-L-乳酸)，i.v.为0.64dl/g(两者都是从PURAC Biochem BV，Holland
购买)。使用乙烯乙酸乙烯酯共聚物(EVAc)，(40％乙酸乙烯酯)(杜邦)，牛血清白蛋
白(BSA)(Sigma ChemicalCo，USA)，平均分子量为77000-79000的聚乙烯醇(PVA)，
88％羟基化(Aldrich Chemical Co.)和TBPI(p55sTNF-R)(InterPharmLaboratories Ltd.，
Israel)。命名为TNF-1的抗TNFα抗体是本发明人的实验室之一制备的抗人重组
TNFα的鼠单克隆抗体(h)。
方法。通过将药物释放基质置于存在于小瓶中的并且在摇床水浴中搅拌的磷酸缓冲
盐水(PBS，pH7.4)中获得体外释放概况。定期地取样并且通过酶连接的免疫吸附检
测方法(ELISA)分析TBPI，如由Aderka等人，1991描述的。
按三种模式检测聚合物系统的体内效率：(i)按照Oliff等人，1987描述，用产生
TNFα的肿瘤细胞(CHO/TNF)植入小鼠，显示严重的恶病质，导致死亡。(ii)按照
Keffer等人，1991描述，转基因Tg197鼠，定期发展为关节炎。(iii)按照Probert等
人，1993描述，转基因Tg211鼠，在T细胞中表达人TNFαmRNA并且发展为显
著的组织变化和致死的消瘦症。
实施例1
从EVAc基质中控制释放p55sTNF-R/TBPI
将乙烯乙酸乙烯酯共聚物(40％乙烯乙酸酯，重量比)溶于二氯甲烷中得到10％溶液
(w/v)。将TBPI溶液加入到溶于双蒸馏水的牛血清白蛋白(BSA)粉中。将该混合物
冷冻干燥(24小时，5μmHg，-70℃，Frceze Dryer，Lab Conco)成粉末。将
TBPI+BSA粉末过筛得到＜75，75-250，或250-425μm的颗粒。将单一大小范围的
称过重量的粉末加入到玻璃管中的15毫升的聚合物溶液中，将该混合物快速地倾
倒到水平的Teflon模型的盘的中央(直径为1cm，厚度为0.5cm)，该盘预先置于干
冰上冷冻5分钟。在预冷冻期间，用玻璃盘盖在该模型上以阻止过量的霜形成。在
混合物被倾倒之后，将模型在干冰上保留10分钟，将混合物冷冻。(在该阶段的最
后7分钟将该模型再次覆盖)用冷的药刀易于将冷冻的平板撬开，转移到金属丝网
筛，并且在-20℃保持2天。然后将该盘在室温下，在干燥器中温和的家用真空器
(600mtorr)干燥2天以上。干燥导致该盘收缩至直径约0.5cm和厚度为0.1-0.2cm。
将聚合物释放系统浸于PBS介质中。在每个盘中制备EVAc基质的直径0.5cm和
厚度1-2cm的含有22.35μg的TBPI的盘用于体内试验。对于体外试验，该盘含有
4.47，13.41，或22.35μg TBPI(10％，30％和50％负载量)。采用ELISA方法，测
定TBPI与时间的函数关系，检测TBPI的释放(Aderka等人，1991)。
附图1和2显示药物颗粒大小和负载量对从EVAc基质释放的动力学的影响。颗粒
大小显著影响药物释放速率。颗粒大小的增加导致释放速率的提高(附图1)。药物
负载量的提高均一地提高药物释放速率(附图2)。不仅释放的总药物量增加，而且
释放速率提高。
药物颗粒大小和负载量显著影响大分子聚合物释放系统的释放动力学。因为大分子
太大以致于不能穿过聚合膜扩散，通过基质中的通道扩散可能出现持续的释放。在
浇铸期间大分子的掺入可引入这样的通道，通过该通道可扩散溶解的药物。颗粒直
径的增加所引起释放速率的提高，可能是由于在聚合物基质中孔的大通道的形成。
类似地，提高的负载量可提供较简单的途径(较低的弯曲)和用于扩散的较大的孔径，
两者都有利于水和PBS移动到基质，而蛋白质从基质中排出。
实施例2
从PLGA和PLLA微球体中控制释放p55sTNF-R(TBPI)
如Cohen等人，1991描述，利用双乳化以及修饰的溶剂蒸发方法，制备聚(乳酸-羟
基乙酸)(PLGA)，聚-L-乳酸(PLLA)微球体。简单地说，将TBPI溶液或TBPI和
BSA粉末(按照上述实施例1描述制备)溶解于双蒸馏水中，倾倒到溶解于二氯甲烷
中的PLGA或PLLA中。利用超声波检测该混合物30秒(VC-250型，
Sonic& MaterialsInc.)，形成第一惰性乳液(W1/0)。利用磁棒剧烈搅拌混合。将
该乳液倾到2毫升的用二氯甲烷饱和的含水1％聚乙烯醇(PVA)以形成第二乳液
((W1/0)W2)。将得到的双重乳化液倾到200毫升的0.1％PVA并且在室温下连续搅
拌3小时，直到大多数的二氯甲烷被蒸发，留下固体的微球体。通过离心收集微球
体(1000g，10分钟)，利用100微米的孔径的筛过筛，并且冷冻干燥成粉末(16小时，
Freeze Dryer，Lab Conco)。除非另有说明，否则研究工作是用比例为75∶25和
50∶50(L/G)的PLGA和PLLA完成的。
将聚合物释放系统浸于PBS介质中。在每个试验中评估含有18.2微克的TBPI的
0.04克PLGA或PLLA微球体，采用ELISA方法，检测TBPI释放与时间的函数关
系。EVAc(黑柱)，单独的EAVc(灰色柱)植入治疗的或未治疗(对照)(白色柱)的转基
因Tg197关节炎鼠子代的不同发育阶段的关节炎的进展。
附图7是图形表示的踝关节的肿胀(mm)，显示用抗-TNFα抗体每星期一次持续整
个试验期(65天)(黑柱)和一星期一次持续两星期(灰色柱)治疗的和未治疗(对照)(白
色柱)的转基因Tg197关节炎鼠子代的不同发育阶段的关节炎的进展。
附图8图形表示在T细胞中表达人TNFαmRNA的转基因Tg211鼠的平均组重量
(gr)，所述鼠用含有TBPI的EVAc(实心圆圈)，单独的EAVc(空心圆圈)植入治疗或
未治疗(对照)(实心正方形)。
附图9图形表示用抗-TNFα抗体每星期一次持续整个试验期(50天)(实心三角形)和
一星期一次持续两星期(空心三角形)治疗的和未治疗(对照)(实心正方形)的转基因
Tg211鼠的平均组重量(gr)。
附图10表示用含有TBPI的EVAc(实心圆圈)，单独的EAVc(空心圆圈)移植治疗的
或未治疗(对照)(实心正方形)的转基因Tg211鼠的生存曲线。
附图11表示用抗-TNFα抗体每星期一次持续整个试验期(65天)(实心圆圈)和一星期
一次持续两星期(空心圆圈)治疗的和未治疗(对照)(实心正方形)的转基因Tg211鼠
的生存曲线。
优选的实施方案的详述
本发明提供可溶性受体的控制释放，所述受体能够结合到配体上并且影响其配体的
活性，例如中和具有害作用的配体或稳定/增强配体的活性。所述可溶性受体的例
子是细胞因子例如TNFα，IFN-γ，IL-2，IL-6等的可溶性受体。
在优选的实施方案中，本发明的组合物包括从天然源例如人尿获得的sTNF-
Rs(Engelmann等人，1989；Engelmann等人，1990；Olson等人，1990，Loetscher
等人，1990)，和利用重组技术(EP433900；Nophar等人，1900；Schall等人，1990；
和Loetscher等人，1990)并然后如文献例如EP308378和EP398327中所述进一步纯
化所得的sTNF-Rs。
如本文所述，术语“sTNF-Rs”，“p55sTNF-R”，“p75sTNF＝R”，是指天然来源的或
通过重组技术获得的所有sTNF-Rs，包括但不限于在EP308378和EP398327中描
述的TNF结合蛋白质I和
附图3显示从不同的PLGA共聚物(50∶50或75∶25)或PLLA微球体中TBPI的累
积释放百分数。在2200小时之后可以看到，掺入到微球体中的TBPI只有10％被
释放。在该图中也证明了当TBPI与BSA一起加入(TBP+BSA)时聚合物的TBPI的
累积的释放百分数(实心圆圈，正方形和三角形)高于当没有BSA而仅加入TBPI时
从样品释放的量(空心圆圈，正方形和三角形)。
实施例3
在用CHO/TNFα细胞接种后的小鼠体内，从聚合物基质中释放的TBPI保持其生物
活性
对于下面的TNFα的慢性有害作用，在本实施中使用公知的用于TNFα的恶病质效
应的动物模型，即按照Oliff等人，1987描述，用产生TNFα的肿瘤细胞
(CHO/TNFα)植入的balb裸鼠。
给balb裸鼠皮下接种CHO/TNFα细胞(Korn等人，1988)，以便得到恶病质。利用
该细胞系的新鲜的胰蛋白胨化的悬浮液以1×107细胞/毫升(1毫升/鼠)
接种。利用塑料的3cc注射器的23号针进行注射。将细胞皮下注射到背，颈或腹
区，通过尾部取血每周采集几次血清样品。根据血液中TBPI和TNFα的水平，重
量的降低以及死亡情况，对在用CHO/TNFα细胞接种五天之后植入的聚合物系统
的性能进行评估。
在所述小鼠已经接种了产生TNFα的CHO细胞以获得恶病质的五天后，将上述实
施例1和2的聚合物基质植入或注射到balb裸鼠，根据血液中TBPI和TNFα的水
平，对聚合物系统的性能进行评估(ELISA)。检测的参数是：(1)TBPI的生物学活
性与时间的函数关系；(2)将TBPI治疗与用抗人TNFα的小鼠抗体(在发明人的实验
室制备并且命名为TNF-1)注射一次(用CHO/TNFα细胞接种小鼠五天之后，标记为
Ab-一次)或以互相一星期的间隔注射两次(CHO/TNFα细胞接种五天之后，以及一
星期之后，标记为Ab-两次)治疗进行比较；(3)根据小鼠平均组重量和小鼠死亡率
评价恶病质的进展；(4)移植的部位(颈，背或胃的皮下)。
TNFα可能引起恶病质，并且能够诱导携带肿瘤的动物的重量逐渐损失。在植入了
产生TNFα的肿瘤细胞的小鼠中检查基质的体内效果。以高水平组成型产生TNFα
的1×107CHO/TNFα细胞注射的小鼠显示严重的恶病质并且重量损失，
导致死亡。另外，植入了含有TBPI的聚合物的基质的小鼠其体重增加，而没有死
亡，表明基质释放的TBPI提供了持久的抗TNFα的效果。
为了对携带肿瘤的小鼠中TBPI生物学活性进行评估，在不同的时间点收集血清样
品并且通过测定其对MHA2细胞(对TNFα敏感的HcLa细胞的衍生物)的细胞毒性
而对其中的TNFα的生物学活性进行评估。如附图4b所述，接种含有TBPI的基质
导致血清的TNFα生物学活性延长和显著降低，表明基质释放的TBPI强烈地抑制
TNFα与MHA2细胞的细胞表面TNFα受体的结合。
为了进行比较，用抗TNFα的抗体注射小鼠一次(用CHO/TNFα细胞接种小鼠五天
之后，标记为Ab-一次)或以一星期的间隔注射小鼠两次(CHO/TNFα细胞接种五天
之后，以及一星期之后，标记为Ab-两次)。如附图4a所示，抗体仅在注射之后几
天影响鼠的重量(小鼠保持其体重)，然后它们发展为进展性的消瘦，而当掺入到聚
合物中时TBPI在体内长期存在。
在抗体注射的小鼠的血清中TNFα的生物活性情况表明注射的抗TNFα的抗体
(TNF-1)的效果持续时间短，如在附图4b。
在附图4c中可以看到，用允许TBPI控制和定位释放的聚合物系统治疗的小鼠生
存了50天以上，这与用TNF-1抗体治疗的小鼠不同，当停止注射抗体时后者不能
生存并且发展为恶病质。
这些结果表明基于聚合物控制释放的TBPI的治疗阻止了消瘦症的发展，并且优选
的是注射抗TNFα的抗体，因为它不用每星期注射，并提供了抵抗TNFα的持久的
保护作用。而且由于是天然分子，可溶性的TNFα受体更适用于延长使用。抗
TNFα的抗体迟早将产生抗它们的抗体，这将阻止它们的作用，因此不适用于延长
使用。对于人或人性化的抗体这也是正确的，将会产生抑制其功能的抗个体基因型
抗体。
从植入到小鼠的颈背，背部或胃部的EVAc基质释放TBPI的动力学与基质植入部
位的函数关系没有显著的差异(附图5)。在整个释放期间TBPI的释放动力学保持
不变。
实施例4
在转基因的Tg197小鼠中从聚合物基质释放的TBPI保留其体内生物学活性
根据踝关节肿胀水平，对转基因的Tg197小鼠中实施例1制备的EVAc基质(出生
后14天通过基本手术皮下植入)的性能进行评估。在约4-6周龄时出现病症，为踝
关节肿胀。在9-10周龄时进一步的踝关节肿胀和后腿运动损伤发展为后腿完全失
去运动功能。而且在这些小鼠中重量的逐步损失是共同的特征。但是用含有TBPI
的EVAc基质治疗这些关节炎小鼠完全阻止了踝关节肿胀(附图6)。而且，被治疗
的动物正常地发育，甚至在10周龄时没有显示关节炎迹象或重量的损失。
为了进行比较，在出生后14天用TNF-1抗体每周注射小鼠一次，持续整个治疗期
(65天)或一星期注射小鼠一次，共两周。如附图7所示，仅当每周注射一次维持整
个试验期间时抗体影响肿胀(黑色柱)。每周注射的小鼠显示发育正常并且甚至在10
周龄时没有显示关节炎迹象或重量的损失，而在这些小鼠中运动的损伤是共同的可
见的特征。但是，一星期注射小鼠一次，共两周的小鼠发展为踝关节肿胀和在9-
10用龄时后腿运动损伤发展为后腿完全失去运动功能，逐渐重量损失。
这些结果表明基于聚合物控制释放的TBPI的治疗完全阻止了小鼠关节炎的发展，
并且优选的是注射抗hTNFα的抗体，因为它提供了抵抗TNFα持久保护作用并无
需每星期注射。
实施例5
在转基因的Tg211小鼠中从聚合物基质释放的TBPI保留其体内生物学活性
在T细胞中表达人TNF mRNA的转基因Tg211小鼠发展为明显的组织学变化以及
致死的消瘦症。根据重量的降低和死亡率对出生14天后植入的含有TBPI的聚合
物系统的性能进行评估。每周对动物逐个称重几次。通过基本手术将EVAc基质皮
下植入。
如附图8和10所示，未治疗的小鼠(对照组：实心正方形)发展为严重的进展性重
量损失，导致死亡，而植入了含有TBPI的EVAc基质的小鼠(实心圆圈)，增加了
体重和在整个试验期间存活。
为了进行比较，小鼠在出生后14天用TNF-1抗体每周注射一次，持续整个治疗期
或一星期注射一次，共两周。如附图9所示，以抗TNFα的抗体给药完全阻止了消
瘦症的发展，如果从出生开始每周给药。但是，如果仅每周给药一次，共给药两周，
这些抗体是不起作用的，小鼠发展为消瘦症，导致死亡，如附图11所示。
这些结果表明基于聚合物控制释放的TBPI的治疗完全阻止了小鼠消瘦症的发展，
并且优选的是注射抗hTNFα的抗体。
体内结果显示释放的TBPI保留了其生物学活性，如平均组重量变化所证明(附图
4a)和对TNFα敏感的MHA2活细胞的高百分数所证明(附图4b)。
本文中公开的所有参考文献包括杂志文章或摘要，公开的或对应的美国或外国专利
申请，授权的美国或外国专利，或其它任何参考文献整个引入作为参考，包括所记
载的参考文献中的数据，表，图和正文。另外，在本文中记载的参考文献中记载的
文献的所有内容也全部引入本文作为参考。
对已知的方法步骤，常规的方法步骤，已知的方法或常规的方法的引用不是以任何
方式承认在相关领域内公开，教导或暗示了本发明的任何方面，说明书或实施方案。
前面的特定实施方案的描述已经充分显示本发明的一般特性，以致于通过应用本领
域内技术人员的知识(包括参考文献中记载的内容)容易修饰和/或适用于各种应用例
如特定的实施方案，不需要过度的实验，不会脱离本发明的一般概念。因此，基于
本文提供的教导和指导，所述的适应和修改包括在本文公开的实施方案的等同物的
含义和范围内。应该明白，本文中的短语或术语是为了描述的目的，不是为了限制，
因此根据本文提供的教导和指导，结合本领域内技术人员的知识，本领域内技术人
员可以理解本发明说明书的术语或短语。
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