2024年5月12日发(作者：前歆然)
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第３ ７卷第３期
上海师范大学学报（自然科学版）
Ｖｏ１．３７．Ｎｏ．３
２ ０ ０ ８年６月
Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｓｈａｎｇｈａｉ Ｎｏｒｍａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ（Ｎａｔｕｒａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）
２ ０ ０ ８，Ｊｕｎ．
磁性纳米粒子的制备及其细胞分离方面的应用
张春明 ，赵梗明２，斯庆苏都 ，谢湘华 ，谭 玲 ，董亚明ｈ
（１．上海师范大学生命－９环境科学学院，上海２００２３４；２．上海师范大学数理信息学院，上海２００２３４；
３．华东理工大学理学院，上海２００２３７）
摘要：介绍了一种始终在溶液中制备Ｆｅ ０ 磁性纳米粒子的化学共沉淀，并对制得的粒子进
行表面修饰的方法．通过ＩＲ，ＸＲＤ和ＡＦＭ等测试仪器对样品进行了表征．结果表明：采用化学
共沉淀的方法制备出的磁性纳米粒子具有单分散性，且粒径比较均一，约在３０ｎｍ．由于制备
过程均在液体中进行，故制备周期短，污染小．同时利用自制的免疫磁性Ｆｅ ０ 纳米粒子能较
好地分离脐血中的ＣＤ１３３细胞，细胞体外扩增明显．
关键词：纳米Ｆｅ Ｏ ；免疫磁性纳米粒子；脐带血；ＣＤ１３３细胞
中图分类号：ＴＱ１３８．１ 文献标识码：Ａ 文章编号：１０００＿５１３７（２００８）０３—０２９１－０５
０ 引 言
磁性纳米颗粒以其优越的物理特性，在生物医学领域具有广泛的应用前景…．通过包裹不同的有
机官能团，可以将这些磁性颗粒运用在蛋白质固定、细胞分离、靶向药物等领域 ．生物细胞分离技术
是一项应用在生物领域中十分重要的纳米技术，它是能否快速获得研究所需细胞标本的关键．以往的细
胞分离技术主要有梯度离心法 Ｊ、流式细胞分选法 等．但这些方法存在纯度不高、制备量偏小、影响
细胞活性等缺点，因此未能被广泛地用于细胞的纯化研究 Ｊ．近几年，随着对磁性纳米粒子研究的深
入，人们开始利用磁性纳米粒子来分离细胞…．单纯的磁性纳米粒子易于团聚、生物兼容性差 Ｊ，因此，
制备超小粒径、分散性好的磁性纳米颗粒具有十分重要的应用价值．
目前纳米Ｆｅ Ｏ 的制备方法主要有：机械球磨法 ，共沉淀法 加 ，乳化法 “ ，水解法 ，水热法
等，这些方法各有优缺点．普通的共沉淀法制备的纳米Ｆｅ Ｏ 粒子粒径分布范围宽，粒径不容易控制，易
团聚，重珊Ｉ生差，且在制备的过程中粒子易受到污染，从而影响其在生物方面的应用．
为了在反应中控制生成颗粒的大小，得到粒径分布均匀的Ｆｅ Ｏ 粒子，本研究在共沉淀法的基础
上，通过控制一系列的反应条件，制得磁性流体，然后直接在其表面包裹ＳｉＯ ，避免了污染．再通过化学
修饰使之成为生物功能化的磁性纳米粒子．利用化学连接方法将单克隆抗体ＣＤ１３３连接到其表面得到
免疫磁性Ｆｅ Ｏ 纳米粒子，利用它从单个核细胞中分离出ＣＤ１３３细胞，并对细胞进行半固体培养，观察
其在体外的扩增情况．
收稿日期：２００７—１２－０５
作者简介：张春明（１９８０一），男，上海师范大学生命与环境科学学院硕士研究生；董亚明（１９５７一），男，博士，上海师
范大学生命与环境科学学院教授．
通讯作者．
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上海师范大学学报（自然科学版）
１ 实验部分
１．１试剂与实验仪器
材料：ＦｅＣ１ ・６Ｈ ０（９９．Ｏ％），ＦｅＣ１ ・４Ｈ Ｏ（９９．５％），氨水（２６％～２８％）、正硅酸乙酯（ＴＥＯＳ）
（上海试剂公司）；Ｎ一（２一氨基乙基）一３一氨基丙基三甲氧基硅烷（ＡＥＡＰＳ）（Ｇｅｅｌ，Ｂｅｌｇｉｕｍ），戊二醛
（中国医药集团上海化学试剂分公司）；磷酸盐缓冲溶液（ＰＢＳ）（自制），ＲＰＭＩ１６４０（自制），以上所用试
剂均为分析纯；ＣＤ１３３抗体（Ｍｉｌｔｅｎｙｉｂｉｏｔｅｃ）．
测试仪器：红外吸收光谱仪（ＮＩＣＯＬＥＴ３８０）；原子力显微镜（ＡＦＭ）（ＮａｎｏＳｃｏｐｅ ＩＩＩ ａ ＳＰＭ系统
Ｖｅｅｃｏ）；倒置显微镜（Ｊａｐａｎ．Ｎｉｋｏｎ ８１０１８１）；Ｄ—ＭＡＸ ２０００ Ｘ射线衍射仪．
１．２实验过程
１．２．１ 磁性纳米粒子的制备以及ＳｉＯ 的包裹
按３：２比例称取ＦｅＣ１ ・６Ｈ Ｏ和ＦｅＣ１ ・４Ｈ Ｏ固体，分别加入水中配成０．５ｍｏｌ／Ｌ的溶液，将２种
溶液倒人三颈瓶中，混匀．在６０％条件下向此混合溶液中缓慢滴加氨水，超声同时搅拌至ｐＨ为９，反应
完全后，再超声分散１ｈ，搅拌０．５ｈ，磁沉淀，洗涤制得磁性纳米粒子；按比例取１００ ｍＬ的乙醇和水，混
匀，把洗涤好的粒子分散到其中，超声１５ｍｉｎ，转人２５０ｍＬ的三颈瓶，加入ＴＥＯＳ，在一定的搅拌速度下逐
渐加入氨水，恒温水浴下反应５ ｈ磁分离，洗涤，直至清洗液不再浑浊；产物置于真空干燥箱中恒温干
燥，１２ｈ后取出，得到包裹好ＳｉＯ 的磁性纳米粒子．将粒子分散到二次水中备用．
１．２．２纳米粒子的修饰与细胞的分离
量取１ ｍＬ包裹后的Ｆｅ Ｏ 磁性纳米粒子流体，加入到４０ｍＬ甲醇，丙三醇和二次蒸馏水的混合溶液
中，超声混匀．转移至三颈烧瓶中搅拌并缓慢加入ＡＥＡＰＳ，在一定温度下反应５ｈ．沉淀用甲醇洗涤若干
遍，恒温下真空干燥，得到表面修饰氨基的磁性纳米粒子．取适量上述制备的粒子，分散到ＰＢＳ中，配制
成磁性纳米粒子分散体系．向上述体系中加入戊二醛，反应数小时用ＰＢＳ洗涤后重新分散到ＰＢＳ溶液
中，得到纳米粒子分散体系．取１ｍＬ分散液，向其中加入ＣＤ１３３单克隆抗体，常温下反应１２ｈ，磁性分离
用ＰＢＳ洗涤后，重新分散，得到免疫磁性Ｆｅ Ｏ 纳米粒子．
取３０～４０ｍＬ的脐带血，用ＰＢＳ稀释１倍．以４：６比例加入淋巴细胞分离液和稀释后的脐血，按密
度梯度离心法分离单个核细胞，取出单个核细胞（ＭＮＣ）带，用１６４０培养基洗涤２次．为了得到ＣＤ１３３
细胞，将分离出的单个核细胞经洗涤后，向其中加入０．５ｍＬ的上述制备的表面连接有ＣＤ１３３单克隆抗
体的免疫磁性Ｆｅ Ｏ 纳米粒子，充分混匀后，４～８℃下孵育２０～３０ｍｉｎ，磁性分离目标细胞ＣＤ１３３，再用
１６４０洗涤数次，即可得所需ＣＤ１３３细胞．采用甲基纤维素半固体法培养ＣＤ１３３细胞．
２结果与讨论
２．１ １Ｒ分析
图１是Ｆｅ，Ｏ （ａ），ＳｉＯ ／Ｆｅ，Ｏ （ｂ）的红外谱图．谱线ａ中，５８０ｃｍ 处是Ｆｅ，０ 的特征吸收峰；在谱
线ｂ中，１１０４ｃｍ 处的强吸收峰是由组成ＳｉＯ 膜的Ｓｉ—Ｏ—Ｓｉ键的反对称伸缩振动引起的，７９８ｃｍ 附
近的吸收峰是由Ｓｉ—Ｏ—Ｓｉ键的对称伸缩振动引起的，９６３ｃｍ 附近的吸收峰则归属于Ｓｉ—Ｏ键的对称
伸缩振动，表明经过了多次的磁沉淀和洗涤后在Ｆｅ，Ｏ 外层包裹了ＳｉＯ 膜．
从图１中可以看出，粒子改性以后，Ｆｅ—Ｏ的特征吸收峰由５８０ｃｍ 移向５６０．２ｃｍ～，发生了红移，
这可能是由于磁性粒子受纳米尺寸的限制，降低了对表面原子键的束缚，导致表面粒子中局部电子的重
排；当Ｆｅ Ｏ 粒子的尺寸降低到纳米范畴时，其表面结合力常数逐渐变大，因此表现在Ｆｅ—Ｏ的特征吸
收带向较低的波数移动．
２．２ ＸＲＤ分析
图２是Ｆｅ，Ｏ 和ＳｉＯ ／Ｆｅ，Ｏ 的ＸＲＤ谱图．将包裹前后Ｆｅ，Ｏ 的ｘ射线衍射光谱与Ｆｅ Ｏ 的标准谱图
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第３期 张春明，赵梗明，斯庆苏都，等：磁性纳米粒子的制备及其细胞分离方面的应用 ２９３
图１ Ｆｅ３Ｏ４（ａ），ＳｉＯ２／Ｆｅ３Ｏ４（ｂ）的红外光谱图 图２ Ｆｅ３Ｏ４，ＳｉＯ２／Ｆｅ３Ｏ４的ＸＲＤ谱图
相比较可以看出，包裹前后Ｆｅ。Ｏ 的峰形和峰宽基本一致，仅存在Ｆｅ。Ｏ 的一种晶态，都是立方的尖晶石
型结构，结晶度较好，没有ＳｉＯ 衍射峰的存在，说明ＳｉＯ 是以无定型形态存在于Ｆｅ。Ｏ 的表面．这是由于
制备这种粒子，没有经过煅烧，因此Ｆｅ。Ｏ 表面的ＳｉＯ 为无定型形态的．从图２中还可以看出，ＸＲＤ衍射
峰较宽而不尖锐，这说明磁性粒子的粒径比较细小，根据Ｓｃｈｅｒｒｅｒ公式：Ｄ＝，ｃ Ａ ｃｏｓ０，Ｄ为晶体粒子
的平均粒径（Ｋ＝０．８９； 为衍射角，Ａ是ｘ射线波长为０．１５４０５６ ｎｍ； 为最高峰的半高峰宽）对样品
进行平均粒径的估算，得到所制样品的平均粒径Ｄ＝２０ｎｍ．
２．３ ＡＦＭ分析
图３，４，５分别是Ｆｅ。Ｏ ，ＳｉＯ：／Ｆｅ。Ｏ 及局部放大的ＳｉＯ ／Ｆｅ。Ｏ 的ＡＦＭ图像．由图３可以看出，包裹
前的磁性粒子分散性差，极易团聚．这是因为在分离过程中由于粒子部分磁化，容易造成团聚；且包裹前
的磁性粒子粒径很小，粒子间的范德华作用力较大，也会造成团聚．图４是包裹后的Ｆｅ Ｏ 粒子的ＡＦＭ
图像，由图４可见，改性后Ｆｅ。Ｏ 粒子较改性前团聚程度较轻，分散性大大提高．从图５中可以明显看出
粒子表面包裹了一层物质，即ＳｉＯ，，这与前面的红外谱图分析的结果相符．
由ＡＦＭ图可知，包裹前Ｆｅ Ｏ 粒子的粒径在１５ｎｍ左右，包裹后粒子的粒径在３０ｎｍ左右，外层膜的
厚度为８ｎｍ左右，这与ＸＲＤ的表征结果略有差别，可能是由于在制备粒子粉体的过程中引起硬团聚的
原因．经包裹后的磁性纳米粒子的粒径较小，分散性较好．这是因为包裹了一层ＳｉＯ 后，改变了磁性纳
米粒子的表面活性，大大降低粒子的表面能，阻止磁性粒子因互相接近而引起的颗粒聚集及沉降．总之，
采用对磁性流体直接包裹的方式，避免了粒子在干燥过程中的硬团聚问题，也解决了粒子研磨过程中可
能引入杂质的难题，从而得到较理想的结果，并获得无污染、分散性很好且适用于生物细胞分离的磁性
纳米粒子．
图３未包裹的Ｆｅ３Ｏ４粒子 图４ ＳｉＯ２／Ｆｅ３Ｏ４粒子 图５局部放大ＳｉＯ２／Ｆｅ３Ｏ４粒子
２．４磁性纳米粒子在细胞分离方面的应用
图６，７，８，９分别是利用磁性粒子分离出来的单个核细胞和ＣＤ１３３细胞经培养后的显微图．从图７
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上海师范大学学报（自然科学版） ２００８年
和图９相比较的结果可以看出，用磁性纳米粒子分离出来的ＣＤ１３３细胞与单个核细胞一样，具有很好
的活性，能够很好地增殖，形成了集落．同时也证明了本实验室所制备的免疫磁性纳米粒子不仅能较好
地分离出目标细胞，而且在整个分离过程中对细胞的形态以及活性没有明显的毒副作用，这与［１４］中
报道的对细胞的活性没有影响的结果一致．
图６单个核细胞（ＭＮＣ）（７ｄ）
图７ ＣＤ１３３细胞（７ｄ）
图８单个核细胞（ＭＮＣ）（１４ｄ） 图９ ＣＤ１３３细胞（１４ｄ）单个核细胞（ＭＮＣ）（７ｄ）
３结论
本研究采用化学共沉淀法通过控制实验条件成功地制备了Ｆｅ。Ｏ 纳米粒子，然后直接对其进行表
面包裹ＳｉＯ：，再利用化学修饰和化学连接方法得到了无污染、分散性很好并适用于生物细胞分离的免
疫磁性纳米粒子，实验结果表明：这种免疫磁性Ｆｅ。Ｏ 纳米粒子具有很好的单分散性，且粒径比较的均
一
，
为３０ｎｍ左右．使用自制的免疫磁性Ｆｅ。Ｏ 纳米粒子能较好地分离脐血中的ＣＤ１３３细胞，而且分离与
纯化出来的ＣＤ１３３细胞活力不受影响，与单个核细胞相比具有更强的增殖能力．
参考文献：
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ｒ｝ｒＬ
第３期 张春明，赵梗明，斯庆苏都，等：磁性纳米粒子的制备及其细胞分离方面的应用 ２９５
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ＫＵＨＡＲＡ Ｍ，ＴＡＫＥＹＡＭＡ Ｈ，ＴＡＮＡＫＡ Ｔ，ｅｔ．ａ１．Ｍａｇｎｅｔｉｃ ｃｅｌｌ ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ ｕｓｉｎｇ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｂｉｎｄｉｎｇ ｗｉｔｈ ｐｒｏｔｅｉｎ Ａ ｅｘ－
ｐｒｅｓｓｅｄ ｏｎ ｂａｃｔｅｒｉａｌ ｍａｎｇｅｔｉｃ ｐａｒｔｉｃｌｅ［Ｊ］．Ａｎａｌ Ｃｈｅｍ，２００４，７６：６２０７—６２１３．
Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｍａｇｎｅｔｉｃ ｎａｎｏ－ｐａｒｔｉｃｌｅｓ
ａｎｄ ｔｈｅｉｒ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｉｎ ｃｅｌｌ ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ
ＺＨＡＮＧ Ｃｈｕｎ—ｍｉｎｇ ，ＺＨＡＯ Ｇｅｎｇ—ｍｉｎｇ２
，
ＳＩＱＩＮＧ Ｓｕ—ｄｕ ，
ＸＩＥ Ｘｉａｎｇ—ｈｕａ ，ＴＡＮ Ｌｉｎｇ ，ＤＯＮＧ Ｙａ—ｍｉｎｇ
（１．Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｌｉｆｅ ａｎｄ Ｅｎｖｉｏｒｎｍｅｎｔ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｓｈａｎｇｈａｉ Ｎｏｒｍａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｓｈａｎｇｈａｉ ２００２３４，Ｃｈｉｎａ；
２．Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｍａｔｈｅｍａｔｉｃｓ ａｎｄ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｓｈａｎｇｈａｉ Ｎｏｒｍａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｓｈａｎｇｈａｉ ２００２３４，Ｃｈｉｎａ；
３．Ｓｃｈｏｏｌ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｅａｓｔ Ｃｈｉｎａ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅ ｎａｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｓｈａｎｇｈａｉ ２００２３７，Ｃｈｉｎａ）
Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｆｅｒｒｉｆｅｒｏｕｓ ｏｘｉｄｅ ｎａｎｏ—ｐａｒｔｉｃｌｅｓ ｗｅｒｅ ｐｒｅｐａｒｅｄ ｕｓｉｎｇ ｃｈｅｍｉｃａｌ ＣＯ—ｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎ ｍｅｔｈｏｄ ａｎｄ ｔｈｅｎ ｔｈｅ ｐａｒｔｉｃｌｅｓ ｗｅｒｅ ｍｏｄ—
ｉｆｉｅｄ ｂｙ ｃｈｅｍｉｃａｌ ｒｅａｇｅｎｔ ａｎｄ ｔｈｅ ｗｈｏｌｅ ｐｒｏｃｅｓｓ ｗａｓ ｃａｒｒｉｅｄ ｏｕｔ ｉｎ ａ ｓｏｌｕｔｉｏｎ．Ｉｎｆｒａｒｅｄ ｓｐｅｃｔｒａ．Ｘ—ｒａｙ ｄｉｆｒａｃｔｉｏｎ ａｎｄ ａｔｏｍｉｃ
ｆｏｒｃｅ ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ ｗｅｒｅ ａｐｐｌｉｅｄ ｔｏ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚｅ ｔｈｅ ｍａｇｎｅｔｉｃ ｎａｎｏ—ｐａｒｔｉｃｌｅｓ．Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｉｎｄｉｃａｔｅ ｔｈａｔ ｔｈｅ ｗｅｌｌ ｄｉｓｐｅｒｓｅｄ，ｎｏｎ—ｐｏｉｌｕ—
ｔｅｄ ａｎｄ ｂｉｏ—ｃｏｍｐａｔｉｂｌｅ ｎａｎｏ—ｐａｒｔｉｃｌｅｓ ｗｅｒｅ ｏｂｔａｉｎｅｄ ｗｉｔｈ ｔｈｅｉｒ ａｖｅｒａｇｅ ｄｉａｍｅｔｅｒ ｏｆ ａｒｏｕｎｄ ３０ ｎｍ．ＣＤ１３３ ｃｅｌｌｓ ｗｅｒｅ ｗｅｌｌ ｓｅｐａｒａｔｅｄ
ｕｓｉｎｇ ｔｈｉｓ ｋｉｎｄ ｏｆ ｍａｇｎｅｔｉｃ ｎａｎｏ—ｐａｒｔｉｃｌｅｓ ａｎｄ ａ ｇｏｏｄ ｉｎｃｒｅｍｅｎｔ ｗａｓ ｏｂｔｉａｎｅｄ．
Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ：ｎａｎｏ ｆｅｒｔｉｆｅｒｏｕｓ ｏｘｉｄｅ ｐａｒｔｉｃｌｅｓ；ｉｍｍｕｎｏｍａｇｎｅｔｉｃ ｎａｎｏ—ｐａｒｔｉｃｌｅｓ；ｎａｖｅｌ ｂｌｏｏｄ；ａｔｏｍｉｃ ｆｏｒｃｅ ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ
（责任编辑：郁慧）
2024年5月12日发(作者：前歆然)
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Ｖｏ１．３７．Ｎｏ．３
２ ０ ０ ８年６月
Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｓｈａｎｇｈａｉ Ｎｏｒｍａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ（Ｎａｔｕｒａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）
２ ０ ０ ８，Ｊｕｎ．
磁性纳米粒子的制备及其细胞分离方面的应用
张春明 ，赵梗明２，斯庆苏都 ，谢湘华 ，谭 玲 ，董亚明ｈ
（１．上海师范大学生命－９环境科学学院，上海２００２３４；２．上海师范大学数理信息学院，上海２００２３４；
３．华东理工大学理学院，上海２００２３７）
摘要：介绍了一种始终在溶液中制备Ｆｅ ０ 磁性纳米粒子的化学共沉淀，并对制得的粒子进
行表面修饰的方法．通过ＩＲ，ＸＲＤ和ＡＦＭ等测试仪器对样品进行了表征．结果表明：采用化学
共沉淀的方法制备出的磁性纳米粒子具有单分散性，且粒径比较均一，约在３０ｎｍ．由于制备
过程均在液体中进行，故制备周期短，污染小．同时利用自制的免疫磁性Ｆｅ ０ 纳米粒子能较
好地分离脐血中的ＣＤ１３３细胞，细胞体外扩增明显．
关键词：纳米Ｆｅ Ｏ ；免疫磁性纳米粒子；脐带血；ＣＤ１３３细胞
中图分类号：ＴＱ１３８．１ 文献标识码：Ａ 文章编号：１０００＿５１３７（２００８）０３—０２９１－０５
０ 引 言
磁性纳米颗粒以其优越的物理特性，在生物医学领域具有广泛的应用前景…．通过包裹不同的有
机官能团，可以将这些磁性颗粒运用在蛋白质固定、细胞分离、靶向药物等领域 ．生物细胞分离技术
是一项应用在生物领域中十分重要的纳米技术，它是能否快速获得研究所需细胞标本的关键．以往的细
胞分离技术主要有梯度离心法 Ｊ、流式细胞分选法 等．但这些方法存在纯度不高、制备量偏小、影响
细胞活性等缺点，因此未能被广泛地用于细胞的纯化研究 Ｊ．近几年，随着对磁性纳米粒子研究的深
入，人们开始利用磁性纳米粒子来分离细胞…．单纯的磁性纳米粒子易于团聚、生物兼容性差 Ｊ，因此，
制备超小粒径、分散性好的磁性纳米颗粒具有十分重要的应用价值．
目前纳米Ｆｅ Ｏ 的制备方法主要有：机械球磨法 ，共沉淀法 加 ，乳化法 “ ，水解法 ，水热法
等，这些方法各有优缺点．普通的共沉淀法制备的纳米Ｆｅ Ｏ 粒子粒径分布范围宽，粒径不容易控制，易
团聚，重珊Ｉ生差，且在制备的过程中粒子易受到污染，从而影响其在生物方面的应用．
为了在反应中控制生成颗粒的大小，得到粒径分布均匀的Ｆｅ Ｏ 粒子，本研究在共沉淀法的基础
上，通过控制一系列的反应条件，制得磁性流体，然后直接在其表面包裹ＳｉＯ ，避免了污染．再通过化学
修饰使之成为生物功能化的磁性纳米粒子．利用化学连接方法将单克隆抗体ＣＤ１３３连接到其表面得到
免疫磁性Ｆｅ Ｏ 纳米粒子，利用它从单个核细胞中分离出ＣＤ１３３细胞，并对细胞进行半固体培养，观察
其在体外的扩增情况．
收稿日期：２００７—１２－０５
作者简介：张春明（１９８０一），男，上海师范大学生命与环境科学学院硕士研究生；董亚明（１９５７一），男，博士，上海师
范大学生命与环境科学学院教授．
通讯作者．
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１ 实验部分
１．１试剂与实验仪器
材料：ＦｅＣ１ ・６Ｈ ０（９９．Ｏ％），ＦｅＣ１ ・４Ｈ Ｏ（９９．５％），氨水（２６％～２８％）、正硅酸乙酯（ＴＥＯＳ）
（上海试剂公司）；Ｎ一（２一氨基乙基）一３一氨基丙基三甲氧基硅烷（ＡＥＡＰＳ）（Ｇｅｅｌ，Ｂｅｌｇｉｕｍ），戊二醛
（中国医药集团上海化学试剂分公司）；磷酸盐缓冲溶液（ＰＢＳ）（自制），ＲＰＭＩ１６４０（自制），以上所用试
剂均为分析纯；ＣＤ１３３抗体（Ｍｉｌｔｅｎｙｉｂｉｏｔｅｃ）．
测试仪器：红外吸收光谱仪（ＮＩＣＯＬＥＴ３８０）；原子力显微镜（ＡＦＭ）（ＮａｎｏＳｃｏｐｅ ＩＩＩ ａ ＳＰＭ系统
Ｖｅｅｃｏ）；倒置显微镜（Ｊａｐａｎ．Ｎｉｋｏｎ ８１０１８１）；Ｄ—ＭＡＸ ２０００ Ｘ射线衍射仪．
１．２实验过程
１．２．１ 磁性纳米粒子的制备以及ＳｉＯ 的包裹
按３：２比例称取ＦｅＣ１ ・６Ｈ Ｏ和ＦｅＣ１ ・４Ｈ Ｏ固体，分别加入水中配成０．５ｍｏｌ／Ｌ的溶液，将２种
溶液倒人三颈瓶中，混匀．在６０％条件下向此混合溶液中缓慢滴加氨水，超声同时搅拌至ｐＨ为９，反应
完全后，再超声分散１ｈ，搅拌０．５ｈ，磁沉淀，洗涤制得磁性纳米粒子；按比例取１００ ｍＬ的乙醇和水，混
匀，把洗涤好的粒子分散到其中，超声１５ｍｉｎ，转人２５０ｍＬ的三颈瓶，加入ＴＥＯＳ，在一定的搅拌速度下逐
渐加入氨水，恒温水浴下反应５ ｈ磁分离，洗涤，直至清洗液不再浑浊；产物置于真空干燥箱中恒温干
燥，１２ｈ后取出，得到包裹好ＳｉＯ 的磁性纳米粒子．将粒子分散到二次水中备用．
１．２．２纳米粒子的修饰与细胞的分离
量取１ ｍＬ包裹后的Ｆｅ Ｏ 磁性纳米粒子流体，加入到４０ｍＬ甲醇，丙三醇和二次蒸馏水的混合溶液
中，超声混匀．转移至三颈烧瓶中搅拌并缓慢加入ＡＥＡＰＳ，在一定温度下反应５ｈ．沉淀用甲醇洗涤若干
遍，恒温下真空干燥，得到表面修饰氨基的磁性纳米粒子．取适量上述制备的粒子，分散到ＰＢＳ中，配制
成磁性纳米粒子分散体系．向上述体系中加入戊二醛，反应数小时用ＰＢＳ洗涤后重新分散到ＰＢＳ溶液
中，得到纳米粒子分散体系．取１ｍＬ分散液，向其中加入ＣＤ１３３单克隆抗体，常温下反应１２ｈ，磁性分离
用ＰＢＳ洗涤后，重新分散，得到免疫磁性Ｆｅ Ｏ 纳米粒子．
取３０～４０ｍＬ的脐带血，用ＰＢＳ稀释１倍．以４：６比例加入淋巴细胞分离液和稀释后的脐血，按密
度梯度离心法分离单个核细胞，取出单个核细胞（ＭＮＣ）带，用１６４０培养基洗涤２次．为了得到ＣＤ１３３
细胞，将分离出的单个核细胞经洗涤后，向其中加入０．５ｍＬ的上述制备的表面连接有ＣＤ１３３单克隆抗
体的免疫磁性Ｆｅ Ｏ 纳米粒子，充分混匀后，４～８℃下孵育２０～３０ｍｉｎ，磁性分离目标细胞ＣＤ１３３，再用
１６４０洗涤数次，即可得所需ＣＤ１３３细胞．采用甲基纤维素半固体法培养ＣＤ１３３细胞．
２结果与讨论
２．１ １Ｒ分析
图１是Ｆｅ，Ｏ （ａ），ＳｉＯ ／Ｆｅ，Ｏ （ｂ）的红外谱图．谱线ａ中，５８０ｃｍ 处是Ｆｅ，０ 的特征吸收峰；在谱
线ｂ中，１１０４ｃｍ 处的强吸收峰是由组成ＳｉＯ 膜的Ｓｉ—Ｏ—Ｓｉ键的反对称伸缩振动引起的，７９８ｃｍ 附
近的吸收峰是由Ｓｉ—Ｏ—Ｓｉ键的对称伸缩振动引起的，９６３ｃｍ 附近的吸收峰则归属于Ｓｉ—Ｏ键的对称
伸缩振动，表明经过了多次的磁沉淀和洗涤后在Ｆｅ，Ｏ 外层包裹了ＳｉＯ 膜．
从图１中可以看出，粒子改性以后，Ｆｅ—Ｏ的特征吸收峰由５８０ｃｍ 移向５６０．２ｃｍ～，发生了红移，
这可能是由于磁性粒子受纳米尺寸的限制，降低了对表面原子键的束缚，导致表面粒子中局部电子的重
排；当Ｆｅ Ｏ 粒子的尺寸降低到纳米范畴时，其表面结合力常数逐渐变大，因此表现在Ｆｅ—Ｏ的特征吸
收带向较低的波数移动．
２．２ ＸＲＤ分析
图２是Ｆｅ，Ｏ 和ＳｉＯ ／Ｆｅ，Ｏ 的ＸＲＤ谱图．将包裹前后Ｆｅ，Ｏ 的ｘ射线衍射光谱与Ｆｅ Ｏ 的标准谱图
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第３期 张春明，赵梗明，斯庆苏都，等：磁性纳米粒子的制备及其细胞分离方面的应用 ２９３
图１ Ｆｅ３Ｏ４（ａ），ＳｉＯ２／Ｆｅ３Ｏ４（ｂ）的红外光谱图 图２ Ｆｅ３Ｏ４，ＳｉＯ２／Ｆｅ３Ｏ４的ＸＲＤ谱图
相比较可以看出，包裹前后Ｆｅ。Ｏ 的峰形和峰宽基本一致，仅存在Ｆｅ。Ｏ 的一种晶态，都是立方的尖晶石
型结构，结晶度较好，没有ＳｉＯ 衍射峰的存在，说明ＳｉＯ 是以无定型形态存在于Ｆｅ。Ｏ 的表面．这是由于
制备这种粒子，没有经过煅烧，因此Ｆｅ。Ｏ 表面的ＳｉＯ 为无定型形态的．从图２中还可以看出，ＸＲＤ衍射
峰较宽而不尖锐，这说明磁性粒子的粒径比较细小，根据Ｓｃｈｅｒｒｅｒ公式：Ｄ＝，ｃ Ａ ｃｏｓ０，Ｄ为晶体粒子
的平均粒径（Ｋ＝０．８９； 为衍射角，Ａ是ｘ射线波长为０．１５４０５６ ｎｍ； 为最高峰的半高峰宽）对样品
进行平均粒径的估算，得到所制样品的平均粒径Ｄ＝２０ｎｍ．
２．３ ＡＦＭ分析
图３，４，５分别是Ｆｅ。Ｏ ，ＳｉＯ：／Ｆｅ。Ｏ 及局部放大的ＳｉＯ ／Ｆｅ。Ｏ 的ＡＦＭ图像．由图３可以看出，包裹
前的磁性粒子分散性差，极易团聚．这是因为在分离过程中由于粒子部分磁化，容易造成团聚；且包裹前
的磁性粒子粒径很小，粒子间的范德华作用力较大，也会造成团聚．图４是包裹后的Ｆｅ Ｏ 粒子的ＡＦＭ
图像，由图４可见，改性后Ｆｅ。Ｏ 粒子较改性前团聚程度较轻，分散性大大提高．从图５中可以明显看出
粒子表面包裹了一层物质，即ＳｉＯ，，这与前面的红外谱图分析的结果相符．
由ＡＦＭ图可知，包裹前Ｆｅ Ｏ 粒子的粒径在１５ｎｍ左右，包裹后粒子的粒径在３０ｎｍ左右，外层膜的
厚度为８ｎｍ左右，这与ＸＲＤ的表征结果略有差别，可能是由于在制备粒子粉体的过程中引起硬团聚的
原因．经包裹后的磁性纳米粒子的粒径较小，分散性较好．这是因为包裹了一层ＳｉＯ 后，改变了磁性纳
米粒子的表面活性，大大降低粒子的表面能，阻止磁性粒子因互相接近而引起的颗粒聚集及沉降．总之，
采用对磁性流体直接包裹的方式，避免了粒子在干燥过程中的硬团聚问题，也解决了粒子研磨过程中可
能引入杂质的难题，从而得到较理想的结果，并获得无污染、分散性很好且适用于生物细胞分离的磁性
纳米粒子．
图３未包裹的Ｆｅ３Ｏ４粒子 图４ ＳｉＯ２／Ｆｅ３Ｏ４粒子 图５局部放大ＳｉＯ２／Ｆｅ３Ｏ４粒子
２．４磁性纳米粒子在细胞分离方面的应用
图６，７，８，９分别是利用磁性粒子分离出来的单个核细胞和ＣＤ１３３细胞经培养后的显微图．从图７
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上海师范大学学报（自然科学版） ２００８年
和图９相比较的结果可以看出，用磁性纳米粒子分离出来的ＣＤ１３３细胞与单个核细胞一样，具有很好
的活性，能够很好地增殖，形成了集落．同时也证明了本实验室所制备的免疫磁性纳米粒子不仅能较好
地分离出目标细胞，而且在整个分离过程中对细胞的形态以及活性没有明显的毒副作用，这与［１４］中
报道的对细胞的活性没有影响的结果一致．
图６单个核细胞（ＭＮＣ）（７ｄ）
图７ ＣＤ１３３细胞（７ｄ）
图８单个核细胞（ＭＮＣ）（１４ｄ） 图９ ＣＤ１３３细胞（１４ｄ）单个核细胞（ＭＮＣ）（７ｄ）
３结论
本研究采用化学共沉淀法通过控制实验条件成功地制备了Ｆｅ。Ｏ 纳米粒子，然后直接对其进行表
面包裹ＳｉＯ：，再利用化学修饰和化学连接方法得到了无污染、分散性很好并适用于生物细胞分离的免
疫磁性纳米粒子，实验结果表明：这种免疫磁性Ｆｅ。Ｏ 纳米粒子具有很好的单分散性，且粒径比较的均
一
，
为３０ｎｍ左右．使用自制的免疫磁性Ｆｅ。Ｏ 纳米粒子能较好地分离脐血中的ＣＤ１３３细胞，而且分离与
纯化出来的ＣＤ１３３细胞活力不受影响，与单个核细胞相比具有更强的增殖能力．
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ＺＨＡＮＧ Ｃｈｕｎ—ｍｉｎｇ ，ＺＨＡＯ Ｇｅｎｇ—ｍｉｎｇ２
，
ＳＩＱＩＮＧ Ｓｕ—ｄｕ ，
ＸＩＥ Ｘｉａｎｇ—ｈｕａ ，ＴＡＮ Ｌｉｎｇ ，ＤＯＮＧ Ｙａ—ｍｉｎｇ
（１．Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｌｉｆｅ ａｎｄ Ｅｎｖｉｏｒｎｍｅｎｔ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｓｈａｎｇｈａｉ Ｎｏｒｍａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｓｈａｎｇｈａｉ ２００２３４，Ｃｈｉｎａ；
２．Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｍａｔｈｅｍａｔｉｃｓ ａｎｄ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｓｈａｎｇｈａｉ Ｎｏｒｍａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｓｈａｎｇｈａｉ ２００２３４，Ｃｈｉｎａ；
３．Ｓｃｈｏｏｌ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｅａｓｔ Ｃｈｉｎａ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅ ｎａｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｓｈａｎｇｈａｉ ２００２３７，Ｃｈｉｎａ）
Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｆｅｒｒｉｆｅｒｏｕｓ ｏｘｉｄｅ ｎａｎｏ—ｐａｒｔｉｃｌｅｓ ｗｅｒｅ ｐｒｅｐａｒｅｄ ｕｓｉｎｇ ｃｈｅｍｉｃａｌ ＣＯ—ｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎ ｍｅｔｈｏｄ ａｎｄ ｔｈｅｎ ｔｈｅ ｐａｒｔｉｃｌｅｓ ｗｅｒｅ ｍｏｄ—
ｉｆｉｅｄ ｂｙ ｃｈｅｍｉｃａｌ ｒｅａｇｅｎｔ ａｎｄ ｔｈｅ ｗｈｏｌｅ ｐｒｏｃｅｓｓ ｗａｓ ｃａｒｒｉｅｄ ｏｕｔ ｉｎ ａ ｓｏｌｕｔｉｏｎ．Ｉｎｆｒａｒｅｄ ｓｐｅｃｔｒａ．Ｘ—ｒａｙ ｄｉｆｒａｃｔｉｏｎ ａｎｄ ａｔｏｍｉｃ
ｆｏｒｃｅ ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ ｗｅｒｅ ａｐｐｌｉｅｄ ｔｏ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚｅ ｔｈｅ ｍａｇｎｅｔｉｃ ｎａｎｏ—ｐａｒｔｉｃｌｅｓ．Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｉｎｄｉｃａｔｅ ｔｈａｔ ｔｈｅ ｗｅｌｌ ｄｉｓｐｅｒｓｅｄ，ｎｏｎ—ｐｏｉｌｕ—
ｔｅｄ ａｎｄ ｂｉｏ—ｃｏｍｐａｔｉｂｌｅ ｎａｎｏ—ｐａｒｔｉｃｌｅｓ ｗｅｒｅ ｏｂｔａｉｎｅｄ ｗｉｔｈ ｔｈｅｉｒ ａｖｅｒａｇｅ ｄｉａｍｅｔｅｒ ｏｆ ａｒｏｕｎｄ ３０ ｎｍ．ＣＤ１３３ ｃｅｌｌｓ ｗｅｒｅ ｗｅｌｌ ｓｅｐａｒａｔｅｄ
ｕｓｉｎｇ ｔｈｉｓ ｋｉｎｄ ｏｆ ｍａｇｎｅｔｉｃ ｎａｎｏ—ｐａｒｔｉｃｌｅｓ ａｎｄ ａ ｇｏｏｄ ｉｎｃｒｅｍｅｎｔ ｗａｓ ｏｂｔｉａｎｅｄ．
Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ：ｎａｎｏ ｆｅｒｔｉｆｅｒｏｕｓ ｏｘｉｄｅ ｐａｒｔｉｃｌｅｓ；ｉｍｍｕｎｏｍａｇｎｅｔｉｃ ｎａｎｏ—ｐａｒｔｉｃｌｅｓ；ｎａｖｅｌ ｂｌｏｏｄ；ａｔｏｍｉｃ ｆｏｒｃｅ ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ
（责任编辑：郁慧）