2024年5月19日发(作者：芒驰)
单克隆抗体制备方法
1975年Kohler和Milstein发现将小鼠骨髓瘤细胞与和绵羊红细胞免疫的小鼠脾细胞进行融合，形成
的杂交瘤细胞既可产生抗体，又可无性繁殖，从而创立了单克隆抗体杂交瘤技术。这一技术上的突破使血
清学的研究进入了一个高度精确的新纪元。
采用杂交瘤技术制备单克隆抗体包括动物免疫、细胞融合、选择杂交瘤、检测抗体、杂交瘤细胞的
克隆化、冻存以及单克隆抗体的大量生产，要经过几个月的一系列实验步骤。
主要仪器设备：
超净工作台、CO2恒温培养箱、超低温冰箱（-70℃）、倒置显微镜、精密天平或电子天平、液氮罐、
离心机（水平转子，4000r/min）、37℃水浴箱、纯水装置、滤器、真空泵等。其需要的主要器械包括：100ml、
50ml、25ml细胞培养瓶，10ml、1ml刻度吸管，试管，滴管（弯头、直头），平皿，烧杯，500ml、250ml、
100ml盐水瓶，青霉素小瓶，10ml、5ml、1ml注射器等，96孔、24孔细胞培养板，融合管（50ml圆底
带盖玻璃或塑料离心管），眼科剪刀，眼科镊，血细胞计数板，可调微量加样器（~50ul，~200ul，~1000ul），
弯头针头，200目筛网，小鼠固定装置等。此外，一般的单克隆抗体制备方法大同小异。
方法
动物的选择与免疫
1. 动物的选择
BALB/C小鼠，较温顺，离窝的活动范围小，体弱，食量及排污较小，一般环境洁净的实验室均能饲
养成活。目前开展杂交瘤技术的实验室多选用纯种BALA/C小鼠。
2. 免疫方案
选择合适的免疫方案对于细胞融合杂交的成功，获得高质量的McAb至关重要。一般在融合前两个
月左右根据确立免疫方案开始初次免疫，免疫方案应根据抗原的特性不同而定。
（1）可溶性抗原免疫原性较弱，一般要加佐剂，半抗原应先制备免疫原，再加佐剂。常用佐剂：福
氏完全佐剂、福氏不完全佐剂。
初次免疫 抗原1～50μg加福氏完全佐剂皮下多点注射或脾内注射（一般0.8～1ml,0.2ml/点）
↓3周后
第二次免疫 剂量同上，加福氏不完全佐剂皮下或ip（腹腔内注射）（ip剂量不宜超过0.5ml）
↓3周后
第三次免疫 剂量同一，不加佐剂，ip（5～7天后采血测其效价）
↓2～3周
加强免疫，剂量50～500μg为宜，ip或iv（静脉内注射）
↓3天后 取脾融合
目前，用于可溶性抗原（特别是一些弱抗原）的免疫方案也不断有所更新，如：①将可溶性抗原颗
粒化或固相化，一方面增强了抗原的免疫原性，另一方面可降低抗原的使用量。②改变抗原注入的途径，
基础免疫可直接采用脾内注射。③使用细胞因子作为佐剂，提高机体的免疫应答水平，增强免疫细胞对抗
原的反应性。
（2）颗粒抗原免疫性强，不加佐剂就可获得很好的免疫效果。以细胞性抗原为例，免疫时要求抗原
量为1～2×107个细胞。
初次免疫 1×107/0.5ml ip4 G+ X7
↓2～3周后
第二次免疫 1×107/0.5ml
↓3周后
加强免疫（融合前三天）1×107/0.5ml ip或iv
↓9
取脾融合
T细胞融合
细胞融合前准备
. 骨髓瘤细胞系的选择：骨髓瘤细胞应和免疫动物属于同一品系，这样杂交融合率高，也便于接种杂
交瘤在同一品系小鼠腹腔内产生大量McAb。常用的骨髓瘤细胞系见下表。
用于融合试验的主要骨髓瘤细胞系
名称
来源
BALB/C骨髓瘤
耐药
H L
r1 K
Ig链
P3/X63-Ag8(X63), j: I7 MOPC-210 h! f. {8 y7
p. E, w( W3 p) J- W8
/ O9 G- {+ j% Y5
M) z* ?# P' I6 R! n |5 Y A/ Q E) K( H N3
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J7 F4 p
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P3/X63-Ag8.653(X63-Ag
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P3/X63-Ag86 N/
－
8-氮鸟嘌呤9 P'
8-氮鸟嘌呤
( O1 v" Z3 D& a6
Q( J$ w3 `3 h8 ~; B:
' q" i- N5 M.
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Z$ G
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H ?( p$ S; e9 J
L# V3 O2 i M2 B" 0 ~6 Q
P3/NSI-1-Ag4-1(NS-1). P3/X63-Ag83 f#
－ K（不分泌型）
7 ]. L) O a& [6 |/
8-氮鸟嘌呤* B6
Y+ V+ D; Z6 p" N9 @1 d" T; c' t; Q$ b* n E3 @/ y+ O"
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y c
W
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+ X0 Y" e8 ~, m4 s
（X63×BALB/C
脾细胞）杂交瘤 p; ?+
8-氮鸟嘌呤
－
- o- m# `: N:
8 X5 H# e! X%
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g3 d( S# l
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（X63×BALB/C
脾细胞）杂交瘤
8-氮鸟嘌呤
5 k4 V! n* ^!
－
" h5 m& A9 o+ {"
SP2/0-Ag14(SP2/0)
2024年5月19日发(作者：芒驰)
单克隆抗体制备方法
1975年Kohler和Milstein发现将小鼠骨髓瘤细胞与和绵羊红细胞免疫的小鼠脾细胞进行融合，形成
的杂交瘤细胞既可产生抗体，又可无性繁殖，从而创立了单克隆抗体杂交瘤技术。这一技术上的突破使血
清学的研究进入了一个高度精确的新纪元。
采用杂交瘤技术制备单克隆抗体包括动物免疫、细胞融合、选择杂交瘤、检测抗体、杂交瘤细胞的
克隆化、冻存以及单克隆抗体的大量生产，要经过几个月的一系列实验步骤。
主要仪器设备：
超净工作台、CO2恒温培养箱、超低温冰箱（-70℃）、倒置显微镜、精密天平或电子天平、液氮罐、
离心机（水平转子，4000r/min）、37℃水浴箱、纯水装置、滤器、真空泵等。其需要的主要器械包括：100ml、
50ml、25ml细胞培养瓶，10ml、1ml刻度吸管，试管，滴管（弯头、直头），平皿，烧杯，500ml、250ml、
100ml盐水瓶，青霉素小瓶，10ml、5ml、1ml注射器等，96孔、24孔细胞培养板，融合管（50ml圆底
带盖玻璃或塑料离心管），眼科剪刀，眼科镊，血细胞计数板，可调微量加样器（~50ul，~200ul，~1000ul），
弯头针头，200目筛网，小鼠固定装置等。此外，一般的单克隆抗体制备方法大同小异。
方法
动物的选择与免疫
1. 动物的选择
BALB/C小鼠，较温顺，离窝的活动范围小，体弱，食量及排污较小，一般环境洁净的实验室均能饲
养成活。目前开展杂交瘤技术的实验室多选用纯种BALA/C小鼠。
2. 免疫方案
选择合适的免疫方案对于细胞融合杂交的成功，获得高质量的McAb至关重要。一般在融合前两个
月左右根据确立免疫方案开始初次免疫，免疫方案应根据抗原的特性不同而定。
（1）可溶性抗原免疫原性较弱，一般要加佐剂，半抗原应先制备免疫原，再加佐剂。常用佐剂：福
氏完全佐剂、福氏不完全佐剂。
初次免疫 抗原1～50μg加福氏完全佐剂皮下多点注射或脾内注射（一般0.8～1ml,0.2ml/点）
↓3周后
第二次免疫 剂量同上，加福氏不完全佐剂皮下或ip（腹腔内注射）（ip剂量不宜超过0.5ml）
↓3周后
第三次免疫 剂量同一，不加佐剂，ip（5～7天后采血测其效价）
↓2～3周
加强免疫，剂量50～500μg为宜，ip或iv（静脉内注射）
↓3天后 取脾融合
目前，用于可溶性抗原（特别是一些弱抗原）的免疫方案也不断有所更新，如：①将可溶性抗原颗
粒化或固相化，一方面增强了抗原的免疫原性，另一方面可降低抗原的使用量。②改变抗原注入的途径，
基础免疫可直接采用脾内注射。③使用细胞因子作为佐剂，提高机体的免疫应答水平，增强免疫细胞对抗
原的反应性。
（2）颗粒抗原免疫性强，不加佐剂就可获得很好的免疫效果。以细胞性抗原为例，免疫时要求抗原
量为1～2×107个细胞。
初次免疫 1×107/0.5ml ip4 G+ X7
↓2～3周后
第二次免疫 1×107/0.5ml
↓3周后
加强免疫（融合前三天）1×107/0.5ml ip或iv
↓9
取脾融合
T细胞融合
细胞融合前准备
. 骨髓瘤细胞系的选择：骨髓瘤细胞应和免疫动物属于同一品系，这样杂交融合率高，也便于接种杂
交瘤在同一品系小鼠腹腔内产生大量McAb。常用的骨髓瘤细胞系见下表。
用于融合试验的主要骨髓瘤细胞系
名称
来源
BALB/C骨髓瘤
耐药
H L
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Ig链
P3/X63-Ag8(X63), j: I7 MOPC-210 h! f. {8 y7
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