2024年5月19日发(作者：千富)
现代农业科技２０１０年第７期 农业基础科学
５一吲哚甲基海因及其工程茵转化产物的高效液相色谱分析
钱凯许琳 严明
（南京工业大学制药与生命科学学院，江苏南京２１０００９）
摘要通过ＲＰ—ＨＰＬＣ同时检测酶水解反应前后底物５－吲哚甲基海因及产物Ｄ一氨甲酰一Ｎ一色氨酸的含量变化，不仅可以检测海因酶
的活性．还能分析酶反应过程的转化效率。采用Ｍｅｒｅｋ公司的Ｐｕｒｏｓｐｈｅｒ ｓＴＡＲ ＲＰ—Ｃ１８ｅ色谱柱（４．６ ｍｍｘ２５０．０ ｍｍ，５ ｍ），以乙腈－２０
ｍｍｏ叽磷酸二氢钾缓冲液（体积比２５：７５）为流动相，磷酸调ｐＨ值为３．０，流速为１．０ｍＬ／ａｒｉｎ，柱温为３０℃，检测波长为２２０ ｎｍ，于１０ｍｉｎ
内很好地实现了各组分的分离。采用外标法进行定量分析．Ｄ一色氨酸、５一吲哚甲基海因和Ｄ一氨甲酰一Ｎ一色氨酸的线性范围分别是
Ｏ．１０ １．００ ｍｇ／ｍＬ（ｒ＝０．９９９ １）、０．２０ ２．００ ｍｅ－／ｍＬ（ｒ＝０．９９８ ９）、０．２０～２．００ ｍｇ／ｍＬ（ｒ＝０．９９８ ９）；酶反应体系中５一吲哚甲基海因和Ｄ一氨甲酰一Ｎ一
色氨酸的加标回收率分别为９９．３％ １００．２％和９８．０％～９９．３％．精密度分别为０．５１％～０．８７％和０．４３％一０．９４％。试验结果表明该法快速简
便、准确可靠。
关键词 高效液相色谱：５一吲哚甲基海因：Ｄ一氨甲酰一Ｎ一色氨酸；Ｄ一色氨酸
中图分类号０６５７．７ 文献标识码Ａ 文章编号１００７—５７３９（２０１０）０７—００１７—０３
ＩＩｉｇｈ Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ Ｌｉｑｕｉｄ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｉｃ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ５－（３－Ｉｎｄｏｌｙｌｍｅｔｈｙ１）ｈｙｄａｎｔｏｉｎ ａｎｄ Ｉｔｓ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ Ｃｏｎｖｅｒｔｅｄ ｂｙ
Ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ Ｂａｃｔｅｒｉａ
ＱＩＡＮＫａｉ ＸＵＬｉｎ‘ＹＡＮＭｉｎｇ
（Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｎａｎｊｉｎｇ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｎａｎｊｉｎｇ Ｊｉａｎｇｓｕ ２１０００９）
Ａｂｓｔｒａｃｔ Ｔｈｅ ＨＰＬＣ ｍｅｔｈｏｄ ｗａｓ ｕｓｅｄ ｔｏ ｄｅｔｅｒｍｉｎｅ ｔｈｅ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓ ｏｆ ｓｕｂｓｔｒａｔｅ ５－（３－Ｉｎｄｏｌｙｌｍｅｔｈｙ１）ｈｙｄａｎｔｏｉｎ，ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａｔｅ ｐｒｏｄｕｃｔ Ｎ—
ｃａｒｂａｍｙｌ—Ｄ—Ｔｒｙｐｔｏｐｈａｎ ａｎｄ ｐｒｏｄｕｃｔ Ｄ－Ｔｒｙｐｔｏｐｈａｎ ｉｎ ｔｈｅ ｒｅａｃｔｉｏｎ ｓｏｌｕｔｉｏｎ．Ｔｈｅ ｓａｍｐｌｅ ｗａｓ ｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄ ｕｓｉｎｇ ａ Ｐｕｒｏｓｐｈｅｒ ＳＴＡＲ ＲＰ—Ｃ１８ｅ ｃｏｌｕｍｎ
（４．６ｍｍｘ２５０．０ｍｍ，５ ｍｐａｒｔｉｃｌｅ ｓｉｚｅ）ａｔｔｈｅｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ ｏｆ３０ ｏＣｗｉｔｈｔｈｅｍｏｂｉｌｅｐｈａｓｅ ｏｆａｃｅｔｏｎｉｔｒｉｌｅ－２ＯｍｍｏＬ／ＬＳｏｄｉｕｍ ａｃｅｔａｔｅ（２５：７５ ｂｙ ｖｏｌｕｍｅ）
ｗｈｉｃｈ ａｄｊｕｓｔｅｄ ｔｏ ｐＨ ３．０ ｗｉｔｈ ｐｈｏｓｐｈｏｉｒｃ ａｃｉｄ ａｔ ａ ｌｆｏｗ ｒａｔｅ ｏｆ １．０ ｍＬ／ｍｉｎ．Ｔｈｅ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｗａｖｅｌｅｎｇｔｈ Ｗａｓ ｓｅｔ ａｔ ２２０ ａｍ．Ｕｎｄｅｒ ｔｈｅｓｅ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ，ｔｈｅ
ｃｏｍｐｏｎｅｎｔｓ ｉｎ ｔｈｅ ｒｅａｃｔｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍ ｗｅｒｅ ｓｅｐａｒａｔｅｄ ｃｏｍｐｌｅｔｅｌｙ ｗｉｔｈｉｎ １０ ｍｉｎ．Ａ ｇｏｏｄ ｌｉｎｅａｒ ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐ ＷａＳ ｏｂｔａｉｎｅｄ ｂｙ ｅｍｐｌｏｙｉｎｇ ｅｘｔｅｒｎａｌ ｓｔａｎｄａｒｄ
ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ａｎａｌｙｓｉｓ．Ｔｈｅ ｌｉｎｅａｒ ｃａｌｉｂｒａｔｉｏｎ ｒａｎｇｅｓ ｆｏｒ ｔｈｅ ｔｈｒｅｅ ｔｒａｇｅｔ ａｎａｌｙｔｅｓ ｗｅｒｅ Ｏ．１０－１．Ｏ０ ｍｇ／ｍＬ（ｒ＝０．９９９ １），０．２０－２．Ｏ０ ｍｇ／ｍＬ（ｒ＝
０．９９８ ９）ｎａｄ ０．２０￣２．Ｏ０ ｍｇ／ｍＬ（ｒ＝０．９９８ ９），ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ．Ｔｈｅ ｒｅｃｏｖｅｒｉｅｓ ｏｆｔｈｅ ｎａａｌｙｔｅｓ ｆｒｏｍ ｓｐｉｋｉｎｇ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ ｗｅｒｅ ９９．３％－１０２．Ｏ％ａｎｄ ９８．０％－
９９－３％，ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ，ｗｉｔｈ ｔｈｅ ｒｅｌａｔｉｖｅ ｓｔａｎｄａｒｄ ｄｅｖｉａｔｉｏｎ ｂｅｉｎｇ ０．５１％－０．８７％ａｎｄ ０．４３％－０．９４％，ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ．Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅ ｍｅｔｈｏｄ ｗａｓ
ｒａｐｉｄ，ｃｏｎｖｅｎｉｅｎｔ ａｎｄ ａｃｃｕｒａｔｅ．
Ｋｅｙｗｏｒｄｓ ＨＰＬＣ；５－（３－Ｉｎｄｏｌｙｌｍｅｔｈｙ１）ｈｙｄａｎｔｏｉｎ；Ｎ－ｃａｒｂａｍｙｌ－Ｄ－Ｔｒｙｐｔｏｐｈａｎ；Ｄ—Ｔｒｙｐｔｏｐｈａｎ
海因酶是能够催化水解海因及其衍生物内酰胺键的一 生成相应的Ｄ一氨甲酰一Ｎ一色氨酸，然后在Ｄ一氨甲酰基氨基
种环酰胺酶（ＥＣ ３．５．２）。根据海因酶作用底物的特异性和产
酸水解酶（Ｄｃａｓｅ）的催化下生成Ｄ一色氨酸。为了更好地开展
物的光学活性的不同，可以将海因酶分为Ｌ一型、Ｄ一型和
海因酶法制备Ｄ一色基酸的研究，有必要建立一种可以同时
ＤＬ一型。海因酶在工业上的应用价值主要是用来生产Ｌ一型 测定酶转化液中海因及其转化产物和中间产物的检测方
和Ｄ一型氨基酸，其作用机理是在Ｌ一型或Ｄ一型海因酶的催
法，以便更好地研究上述２个关键酶的催化机制和催化效
化作用下，使５＇－单取代海因开环形成相应的Ｌ一型或Ｄ一型
果，进而及时掌握并调控整个反应的进程。现有的５一吲哚甲
氨甲酰类氨基酸产物。进而通过化学或酶促降解反应生成
基海因和Ｄ一氨甲酰一Ｎ一色氨酸的检测方法多为光谱学分析
Ｌ一型或Ｄ一型氨基酸。
方法或质谱法ＩＳ］．检测Ｄ一色基酸的方法多为比色和层析法
非天然Ｄ一氨基酸及其衍生物是合成抗菌和抗病毒药
等。这些方法在海因酶法制备Ｄ一色基酸的研究检测过程
物、人工甜味剂、杀虫剂以及拟除虫菊酯的重要中间体 。
中，不能满足监控整个反应进程的需要。随着液相色谱技术
特别是作为半合成抗生素的侧链原料，在医药领域具有十 的发展和研究，采用高效液相色谱（ＨＰＬＣ）对海因和氨甲
分广泛的应用价值。利用海因酶法制备Ｄ一色氨酸具有光学 酰类氨基酸进行分析的方法逐渐成熟［９－１０】。但关于５一吲哚
纯度高、环境污染少、反应温和、操作简单、成本低廉等优
甲基海因和Ｄ一氨甲酰一Ｎ一色氨酸的ＨＰＬＣ检测方法还鲜见
点，并能实现一些化学合成难以进行的反应，日益受到国内
报道。
外学术界与产业界的关注ｆ３－７］。随着当代生物技术的发展． 本文建立的高效液相色谱法，不仅能准确测定５一吲哚
基因工程、细胞工程、酶工程等新技术的注入．微生物转
甲基海因和Ｄ一氨甲酰一Ｎ一色氨酸的含量，且产物Ｄ一色氨酸
化的发展已经具有了高度的研究价值以及广阔的实际应用 也能同时得到分离和测定。该方法能够快速完成酶催化反
前景。
应中底物和产物的定量分析，为生产和研究海因及其酶转
在海因酶法催化合成Ｄ一色氨酸的过程中。首先以５一吲 化产物提供良好的检测和分析平台。
哚甲基海因为前体，经Ｄ一海因酶（ＤＨａｓｅ）催化其开环水解
１材料与方法
基金项目 新一代生物催化和生物转化的科学基础（２００９ＣＢ７２４７００）。
１．１试验仪器与试剂
作者简介钱凯（１９８３一），女，江苏常州人，在读硕士，主要从事生物催
仪器主要有：戴安ＵｌｔｉＭａｔｅ ３０００液相色谱仪。配有戴
化方面的研究工作。
￥通讯作者
安ＬＰＧ一３４００溶剂泵；戴安ＶＷＤ一３４００紫外可调波长检测
收稿日期２Ｏ１Ｏ—Ｏ３—３１
器；戴安ＷＰＳ一３０００ＳＬ自动进样器及Ｃｈｒｏｍｅｌｅｏｎ数据处理
】７
农业基础科学
软件。
试剂主要有：Ｄ一氨甲酰一Ｎ一色氨酸、５一吲哚甲基海因、
Ｄ一色氨酸均由南京工业大学生化重点实验室提供（纯度大
于９９．５％）；乙腈，ＨＰＬＣ级，Ｔｅｄｉａ Ｃｏｍｐａｎｙ；水均为二次蒸馏
水；磷酸、磷酸二氢钾、磷酸氢二钾及其他试剂均为分析纯。
工程菌Ｒｏｓｅｔｔａ ｐＥＴ—ＨｙｕＨ由南京工业大学生化重点实验室
构建保存。
１．２色谱条件
色谱柱：Ｍｅｒｃｋ Ｐｕｒｏｓｐｈｅｒ ＳＴＡＲ ＲＰ—Ｃ１８ｅ（４．６ ｍｍｘ２５０．０
ｍｍ，５ ｌａ，ｍ）；流动相：乙腈一２０ ｍｍｏＬ／Ｌ磷酸二氢钾（体积比
２５：７５），用磷酸调ｐＨ值为３．０；流速为１．０ ｍＬ／ｍｉｎ；检测波长
为２２０ ｎｍ；柱温为３Ｏ ｃＩ二，进样量为１０ Ｌ。
１．３标准溶液的配制
准确称取Ｄ一色氨酸、Ｄ一氨甲酰一Ｎ一色氨酸、５一吲哚甲
基海因标准品各０．０１ ｇ，分别加入适量的０．０５ ｍｍｏＬ／Ｌ磷酸
二氢钾一磷酸氢二钾缓冲溶液（ｐＨ值８．０），然后与等比例的
乙醇混合溶解，最后用１０ｍＬ容量瓶定容。
用移液枪分别从上述Ｄ一色氨酸、Ｄ一氨甲酰一Ｎ一色氨
酸、５一吲哚甲基海因的标品溶液中吸取１、２、２ ｍＬ到新的容
量瓶，然后用０．０５ ｍｍｏＬ／ＬｐＨ值８．０的磷酸缓冲一乙腈（１：１）
稀释定容至１０ ｍＬ作为标准溶液，使混合液中Ｄ一色氨酸、
Ｄ一氨甲酰一Ｎ一色氨酸、５一吲哚甲基海因的质量浓度分别为
０．１、０．２、０．２ ｇ／Ｌ。
１．４样品的制备
接种工程菌Ｒｏｓｅｔｔａ ｐＥＴ—ＨｙｕＨ于５ ｍＬ含１００ Ｉ￣ｇ／ｍＬ
氨苄青霉素和３４￣ｇ／ｍＬ氯霉素的ＬＢ培养基，３７℃、２００
ｒ／ｒａｉｎ摇床培养１２ ｈ，按２％的接种量转接于３０ ｍＬ发酵培
养基，培养２ ｈ后加入微量诱导剂于１６ ｏＣ、２００ ｒ／ｍｉｎ诱导培
养１６ ｈ，离心收集菌体。
取适量菌体Ｒｏｓｅｔｔａ ｐＥＴ—ＨｙｕＨ，加入质量浓度为１ Ｌ
的底物——５一吲哚甲基海因（０．５０ ｍｏＵＬ Ｋ２ＨＰＯ４－ＫＨ２ＰＯ 缓
冲液，ｐＨ值８．０）充分混匀，置于５０℃水浴摇床反应，依次取
反应时间为０．５、１．０、２．０ｈ的酶转化液，每次取５００ Ｌ，再加
入５００ Ｌ等体积的乙醇稀释，１２ ０００ ｒ／ｍｉｎ离心５ ａｒｉｎ，取上
清液。经０．２２ Ｉｘｍ的尼龙膜过滤后供ＨＰＬＣ分析。
２结果与分析
２．１检测波长的确定
用移液枪吸取１００ Ｌ标准溶液稀释至３ ｍＬ，用ＶＷＤ一
３４００型紫外可见分光光度计（波长范围１９０～９００ ｎｍ）对稀
释后的标准样品进行扫描，发现在２１０ ｎｍ附近有较明显的
吸收峰，用戴安ＵｌｔｉＭａｔｅ ３０００在上述有吸收峰的波长下分
别进样２ Ｌ检测，发现在２２０ ｎＩｎ处的检测峰面积和峰高
表１各组分在不同吸收波长下对应的响应值
１８
现代农业科技２０１０年第７期
最大、最佳，故选用波长２２０ ｎｍ作为检测波长。各物质在不
同检测波长的响应值如表１所示。
２．２流动相的选择
由于乙腈在２２０ ｎｍ的低波长下噪音小，所以背景干扰
小于其他有机溶剂，且洗脱能力强，故选用乙腈，水系统作为
流动相。按照乙腈浓度的不同配比从５％到４０％，采用乙
睛磷酸二氢钾流动相，磷酸调ｐＨ值为３．０，流速为１．０
ｍＬ／ｍｉｎ。在检测波长为２２０ ｎｍ、柱温为３０ ｃＩ＝的液相条件下
分别对标准溶液进行检测，发现当乙腈浓度低于１５％时，
Ｄ一氨甲酰一Ｎ一色氨酸和５一吲哚甲基海因的保留时间十分
接近，不能将各个组分很好地分离，且分析时间较长。为了
缩短分析时间，逐步提高乙腈的浓度，结果保留时间明显
缩短，而且分离效果也得到改善，最佳浓度配比为２５％
（图１）。但当乙睛浓度超过３０％时，由于出峰时间太快，不
利于各组分的分离。
｛
０ ２ ４ ６ ８ １０ １２ １３
保留时间／／ｍｉｎ
图１ 乙腈浓度为２５％时标准品溶液的色谱
２．３ ｐＨ值的影响
为了调整各色谱峰的间距和峰形，进一步提高柱效和
测量的精确度，用磷酸分别调节乙腈一２０ ｍｍｏＬ／Ｌ磷酸二氢
钾缓冲液（体积比２５：７５）的ｐＨ值为５．０…４ ５ ４．０…３ ５ ３．０和
２．５。结果显示，ｐＨ值越低色谱峰的峰形越好，柱效越高，因
此选择ｐＨ值３．０作为最佳色谱条件（表２）。
表２ ｐＩ－Ｉ值对分离效果的影响
２．４线性关系
将配置的标准溶液分别进样２、４、６、８、１０、１５、２０ 至
ＨＰＬＣ在１．２所述条件下进行检测，每个重复测定３次，测
定的峰面积取平均值。以峰面积为横坐标 、质量浓度为纵
坐标ｙ，绘制标准曲线得到线性方程，如表３所示。
钱凯等：５一吲哚甲基海因及其工程菌转化产物的高效液相色谱分析
∞ ∞ 卯 ∞ ０ ∞
因转化为Ｄ一氨甲酰一Ｎ一色氨酸的工程菌。通过考察不同反
∞
表３方程线性范围
胁
应时间（０、０．５、１．０、２．０ ｈ）酶反应液的色谱图可以发现，随着
反应时间的延长，底物５－吲哚甲基海因（保留时间为８．２８
ｍｉｎ）不断被消耗，产物Ｄ一氨甲酰一Ｎ一色氨酸（保留时间为
６．４３ ｍｉｎ）逐渐积累．且减少量与增加量基本同步（图２）。对
２．５酶转化液中各组成的色谱分析
照为未进行５０℃酶解反应就立即收集菌体的上清液。结果
工程菌Ｒｏｓｅｔｔａ ｐＥＴ—ＨｙｕＨ是南京工业大学生化重点实
验室构建保存的具有Ｄ一海因酶活性，能水解５一吲哚甲基海
表明，在２．２２ ｍｉｎ和２．４９ ｍｉｎ（出峰时间）处的峰可能是菌体
自身代谢的其他产物，含量甚微。另取１ ｍＬ菌液，加入最终
匝
５００
４０ｏ
｛
坦
窜
１奢《
ｖ１ｕ／／ 婪
３ ２ ｌ —
∞ ∞ ∞ Ｏ∞
Ｏ １．２５ ２．５Ｏ ３．７５ ５．００ ６．２５ ７．５Ｏ ８．７５ ｌ０．００ ０ １．２５ ２．５０ ３．７５ ５．００ ６．２５ ７．５Ｏ ８．７５ １０．ｏｏ
保留时间／／ｒａｉｎ
保留时间／／ｍｉｎ
图２酶转化液中各组成的色谱
注：ａ反应时间为０．５ ｈ：ｂ反应时间为２．０ｈ。
浓度为１ ｄＥ的底物（５一吲哚甲基海因）反应４ ｈ，Ｄ一氨甲酰一 酸，Ｄ一氨甲酰一Ｎ一色氨酸和５一吲哚甲基海因的测量线性范
Ｎ～色氨酸的转化率可达９８．７％。 围分别是０．１０～１．００、０．２０～２．００、０．２０～２．００ ｍｇ／ｍＬ；Ｄ一氨甲酰一
由于构建含有Ｄ一氨甲酰水解酶（ＤＣａｓｅ）的工程菌的工 Ｎ一色氨酸和５一吲哚甲基海因的加标回收率分别为９９．３％－
作还在进行中，希望能很快将本方法运用到工程菌ＤＣａｓｅ １０２．０％及９８．０％－９９．３％；精密度分别为０．５１％－０．８７％和
活性的测定中。０．４３％－０．９４％。该方法操作简便，准确度高，为该生产过程中
２．６回收率和精密度 工艺条件的优化和过程监控提供了一种十分有效的方法。
取４份反应时间均为２．０ ｈ的酶促反应液２００ Ｌ，其中４参考文献
１份作为本底，依次在余下的３份酶反应液中加入低、中、高 【ｌ】 建波，徐 ・牛 酶法制备Ｄ－对羟基苯甘氨酸的研究［Ｊ］・生物学杂
３种不同浓度的标准溶液各２００ Ｌ，过膜后按１．２所述检测 ［２１封
，
袁 ．海田酶的催化特性及其反应机理【Ｊ】．微生物学通报，
方法和条件进行测定，每个样品连续进样６次，按测定峰面 ２００３，３０（３）：９５—９８．
积的平均值进行计算，测定结果如表４所示。从表４可以看 【。 ； ，欧阳平凯・Ｄ一色氨酸研究进展［ＪＪ・化工进展， ０ｏ ，
出，该方法的回收率和精密度良好。 【４］袁静明，封霞，赵莉霞．非天然Ｄ一型氨基酸生物转化中酶的纯化及其
基因序列ｆＪＩ．山西大学学报：自然科学版，２００２，２５（２）：１５６—１６２．
表４酶促反应液中５一吲哚甲基海因和Ｄ一氨甲
【５】封霞，袁静明．海因酶的催化特性及其反应机理【Ｊ】．微生物学报，
酰一Ｎ一色氨酸的加标回收率和精密度
２ｏｏ３．３０（３）：９５－９８．
『６１ ＪＯＳＥＦ Ａ ＩＥＮＢＵＣＨＮＥＲ，ＭＡＲＴＩＮ ＳＩＥＭＡＮＮ—ＨＥＲＺＢＥＲＧ，ＣＨＲＩ—
ＳＴＯＰＨ ＳＹＬＤＡＴＫ．Ｈｙｄａｎｔｏｉｎａｓｅｓ ａｎｄ ｒｅｌａｔｅｄ ｅｎｚｙｍｅｓ ａｓ ｂｉｏｃａｔａｌｙｓｔｓ ｆｏｒ
ｔｈｅ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆｕｎｎａｔｕｒａｌ ｃｈｉｒａｌ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄｓ［Ｊ］．Ｃｈｅｍｉｃａｌ ｂｉｏｔｅ—ｃｈｎａｌｏｇｙ，
２０ｏ１，１２（６）：５５９—５６３．
【７】马飞，许激扬，何林松，等．双酶法合成Ｄ一（一）一对羟基苯甘氨酸［Ｊ］．中
国药科大学学报．２００１，３２（２）：１５５—１５８．
【８】曹飞，范伟平，韦萍，等．吲哚甲基海因的制备Ⅱ．低碱体系加氢过程
ｆＪ】．化学反应工程与工艺，２００４，２０（４）：６０５—６１０．
３结论与讨论
【９】宋慧敏，屠春燕，欧阳平凯．高效液相色谱法测定Ｄ一对羟基苯甘氨酸
【ＪＪ．南京工业大学学报，２００２，２４（４）：９７—９９．
采用Ｍｅｒｃｋ Ｐｕｒｏｓｐｈｅｒ ＳＴＡＲ ＲＰ—Ｃ１８ｅ（４．６ ｍｍｘ２５０．０
『１０］ＡＮＡ ＩＳＡＢＥＬ ＭＡＲＴＩＮＥＺ—ＧＯＭＥＺ。ＳＥＲＧ１０ ＭＡＲＴＩＮＥＺ—ＲＯＤＲ—
ｍｍ，５ ｔｒｍ），以乙睛一２０ｍｍｏＬ／Ｌ磷酸二氢钾（体积比２５：７５，
ＩＧＵＥＺ，ＪＯＳＥＦＡ ＭＡＲＩＡ ＣＬＥＭＥＮＴＥ—ＪＩＭＥＮＥＺ．ｅｔ ａ１．Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ
ｐＨ值３．０）为流动相，有效地解决了海因酶法生产Ｄ一色氨
ｐｏｌｙｃｉｓｔｒｏｎｉｅ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｏｆ ｈｙｄａｎｔｏｉｎａｓｅ ｐｒｏｃｅｓｓ ｇｅｎｅｓ ｉｎ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ
ｆｏｒ ｔｈｅ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｏｐｔｉｃａｌｌｙ ｐｕｒｅ Ｄ－ａｍｉｎｏ ａｃｉｄｓ【Ｊ】．Ａｐｐｌｉｅｄ ａｎｄ
酸的生产体系中底物、中间产物和产物含量的测定，Ｄ一色氨
Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔｌａｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，２００７，７３（５）：１５２５—１５３１．
１９
2024年5月19日发(作者：千富)
现代农业科技２０１０年第７期 农业基础科学
５一吲哚甲基海因及其工程茵转化产物的高效液相色谱分析
钱凯许琳 严明
（南京工业大学制药与生命科学学院，江苏南京２１０００９）
摘要通过ＲＰ—ＨＰＬＣ同时检测酶水解反应前后底物５－吲哚甲基海因及产物Ｄ一氨甲酰一Ｎ一色氨酸的含量变化，不仅可以检测海因酶
的活性．还能分析酶反应过程的转化效率。采用Ｍｅｒｅｋ公司的Ｐｕｒｏｓｐｈｅｒ ｓＴＡＲ ＲＰ—Ｃ１８ｅ色谱柱（４．６ ｍｍｘ２５０．０ ｍｍ，５ ｍ），以乙腈－２０
ｍｍｏ叽磷酸二氢钾缓冲液（体积比２５：７５）为流动相，磷酸调ｐＨ值为３．０，流速为１．０ｍＬ／ａｒｉｎ，柱温为３０℃，检测波长为２２０ ｎｍ，于１０ｍｉｎ
内很好地实现了各组分的分离。采用外标法进行定量分析．Ｄ一色氨酸、５一吲哚甲基海因和Ｄ一氨甲酰一Ｎ一色氨酸的线性范围分别是
Ｏ．１０ １．００ ｍｇ／ｍＬ（ｒ＝０．９９９ １）、０．２０ ２．００ ｍｅ－／ｍＬ（ｒ＝０．９９８ ９）、０．２０～２．００ ｍｇ／ｍＬ（ｒ＝０．９９８ ９）；酶反应体系中５一吲哚甲基海因和Ｄ一氨甲酰一Ｎ一
色氨酸的加标回收率分别为９９．３％ １００．２％和９８．０％～９９．３％．精密度分别为０．５１％～０．８７％和０．４３％一０．９４％。试验结果表明该法快速简
便、准确可靠。
关键词 高效液相色谱：５一吲哚甲基海因：Ｄ一氨甲酰一Ｎ一色氨酸；Ｄ一色氨酸
中图分类号０６５７．７ 文献标识码Ａ 文章编号１００７—５７３９（２０１０）０７—００１７—０３
ＩＩｉｇｈ Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ Ｌｉｑｕｉｄ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｉｃ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ５－（３－Ｉｎｄｏｌｙｌｍｅｔｈｙ１）ｈｙｄａｎｔｏｉｎ ａｎｄ Ｉｔｓ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ Ｃｏｎｖｅｒｔｅｄ ｂｙ
Ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ Ｂａｃｔｅｒｉａ
ＱＩＡＮＫａｉ ＸＵＬｉｎ‘ＹＡＮＭｉｎｇ
（Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｎａｎｊｉｎｇ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｎａｎｊｉｎｇ Ｊｉａｎｇｓｕ ２１０００９）
Ａｂｓｔｒａｃｔ Ｔｈｅ ＨＰＬＣ ｍｅｔｈｏｄ ｗａｓ ｕｓｅｄ ｔｏ ｄｅｔｅｒｍｉｎｅ ｔｈｅ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓ ｏｆ ｓｕｂｓｔｒａｔｅ ５－（３－Ｉｎｄｏｌｙｌｍｅｔｈｙ１）ｈｙｄａｎｔｏｉｎ，ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａｔｅ ｐｒｏｄｕｃｔ Ｎ—
ｃａｒｂａｍｙｌ—Ｄ—Ｔｒｙｐｔｏｐｈａｎ ａｎｄ ｐｒｏｄｕｃｔ Ｄ－Ｔｒｙｐｔｏｐｈａｎ ｉｎ ｔｈｅ ｒｅａｃｔｉｏｎ ｓｏｌｕｔｉｏｎ．Ｔｈｅ ｓａｍｐｌｅ ｗａｓ ｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄ ｕｓｉｎｇ ａ Ｐｕｒｏｓｐｈｅｒ ＳＴＡＲ ＲＰ—Ｃ１８ｅ ｃｏｌｕｍｎ
（４．６ｍｍｘ２５０．０ｍｍ，５ ｍｐａｒｔｉｃｌｅ ｓｉｚｅ）ａｔｔｈｅｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ ｏｆ３０ ｏＣｗｉｔｈｔｈｅｍｏｂｉｌｅｐｈａｓｅ ｏｆａｃｅｔｏｎｉｔｒｉｌｅ－２ＯｍｍｏＬ／ＬＳｏｄｉｕｍ ａｃｅｔａｔｅ（２５：７５ ｂｙ ｖｏｌｕｍｅ）
ｗｈｉｃｈ ａｄｊｕｓｔｅｄ ｔｏ ｐＨ ３．０ ｗｉｔｈ ｐｈｏｓｐｈｏｉｒｃ ａｃｉｄ ａｔ ａ ｌｆｏｗ ｒａｔｅ ｏｆ １．０ ｍＬ／ｍｉｎ．Ｔｈｅ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｗａｖｅｌｅｎｇｔｈ Ｗａｓ ｓｅｔ ａｔ ２２０ ａｍ．Ｕｎｄｅｒ ｔｈｅｓｅ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ，ｔｈｅ
ｃｏｍｐｏｎｅｎｔｓ ｉｎ ｔｈｅ ｒｅａｃｔｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍ ｗｅｒｅ ｓｅｐａｒａｔｅｄ ｃｏｍｐｌｅｔｅｌｙ ｗｉｔｈｉｎ １０ ｍｉｎ．Ａ ｇｏｏｄ ｌｉｎｅａｒ ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐ ＷａＳ ｏｂｔａｉｎｅｄ ｂｙ ｅｍｐｌｏｙｉｎｇ ｅｘｔｅｒｎａｌ ｓｔａｎｄａｒｄ
ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ａｎａｌｙｓｉｓ．Ｔｈｅ ｌｉｎｅａｒ ｃａｌｉｂｒａｔｉｏｎ ｒａｎｇｅｓ ｆｏｒ ｔｈｅ ｔｈｒｅｅ ｔｒａｇｅｔ ａｎａｌｙｔｅｓ ｗｅｒｅ Ｏ．１０－１．Ｏ０ ｍｇ／ｍＬ（ｒ＝０．９９９ １），０．２０－２．Ｏ０ ｍｇ／ｍＬ（ｒ＝
０．９９８ ９）ｎａｄ ０．２０￣２．Ｏ０ ｍｇ／ｍＬ（ｒ＝０．９９８ ９），ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ．Ｔｈｅ ｒｅｃｏｖｅｒｉｅｓ ｏｆｔｈｅ ｎａａｌｙｔｅｓ ｆｒｏｍ ｓｐｉｋｉｎｇ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ ｗｅｒｅ ９９．３％－１０２．Ｏ％ａｎｄ ９８．０％－
９９－３％，ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ，ｗｉｔｈ ｔｈｅ ｒｅｌａｔｉｖｅ ｓｔａｎｄａｒｄ ｄｅｖｉａｔｉｏｎ ｂｅｉｎｇ ０．５１％－０．８７％ａｎｄ ０．４３％－０．９４％，ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ．Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅ ｍｅｔｈｏｄ ｗａｓ
ｒａｐｉｄ，ｃｏｎｖｅｎｉｅｎｔ ａｎｄ ａｃｃｕｒａｔｅ．
Ｋｅｙｗｏｒｄｓ ＨＰＬＣ；５－（３－Ｉｎｄｏｌｙｌｍｅｔｈｙ１）ｈｙｄａｎｔｏｉｎ；Ｎ－ｃａｒｂａｍｙｌ－Ｄ－Ｔｒｙｐｔｏｐｈａｎ；Ｄ—Ｔｒｙｐｔｏｐｈａｎ
海因酶是能够催化水解海因及其衍生物内酰胺键的一 生成相应的Ｄ一氨甲酰一Ｎ一色氨酸，然后在Ｄ一氨甲酰基氨基
种环酰胺酶（ＥＣ ３．５．２）。根据海因酶作用底物的特异性和产
酸水解酶（Ｄｃａｓｅ）的催化下生成Ｄ一色氨酸。为了更好地开展
物的光学活性的不同，可以将海因酶分为Ｌ一型、Ｄ一型和
海因酶法制备Ｄ一色基酸的研究，有必要建立一种可以同时
ＤＬ一型。海因酶在工业上的应用价值主要是用来生产Ｌ一型 测定酶转化液中海因及其转化产物和中间产物的检测方
和Ｄ一型氨基酸，其作用机理是在Ｌ一型或Ｄ一型海因酶的催
法，以便更好地研究上述２个关键酶的催化机制和催化效
化作用下，使５＇－单取代海因开环形成相应的Ｌ一型或Ｄ一型
果，进而及时掌握并调控整个反应的进程。现有的５一吲哚甲
氨甲酰类氨基酸产物。进而通过化学或酶促降解反应生成
基海因和Ｄ一氨甲酰一Ｎ一色氨酸的检测方法多为光谱学分析
Ｌ一型或Ｄ一型氨基酸。
方法或质谱法ＩＳ］．检测Ｄ一色基酸的方法多为比色和层析法
非天然Ｄ一氨基酸及其衍生物是合成抗菌和抗病毒药
等。这些方法在海因酶法制备Ｄ一色基酸的研究检测过程
物、人工甜味剂、杀虫剂以及拟除虫菊酯的重要中间体 。
中，不能满足监控整个反应进程的需要。随着液相色谱技术
特别是作为半合成抗生素的侧链原料，在医药领域具有十 的发展和研究，采用高效液相色谱（ＨＰＬＣ）对海因和氨甲
分广泛的应用价值。利用海因酶法制备Ｄ一色氨酸具有光学 酰类氨基酸进行分析的方法逐渐成熟［９－１０】。但关于５一吲哚
纯度高、环境污染少、反应温和、操作简单、成本低廉等优
甲基海因和Ｄ一氨甲酰一Ｎ一色氨酸的ＨＰＬＣ检测方法还鲜见
点，并能实现一些化学合成难以进行的反应，日益受到国内
报道。
外学术界与产业界的关注ｆ３－７］。随着当代生物技术的发展． 本文建立的高效液相色谱法，不仅能准确测定５一吲哚
基因工程、细胞工程、酶工程等新技术的注入．微生物转
甲基海因和Ｄ一氨甲酰一Ｎ一色氨酸的含量，且产物Ｄ一色氨酸
化的发展已经具有了高度的研究价值以及广阔的实际应用 也能同时得到分离和测定。该方法能够快速完成酶催化反
前景。
应中底物和产物的定量分析，为生产和研究海因及其酶转
在海因酶法催化合成Ｄ一色氨酸的过程中。首先以５一吲 化产物提供良好的检测和分析平台。
哚甲基海因为前体，经Ｄ一海因酶（ＤＨａｓｅ）催化其开环水解
１材料与方法
基金项目 新一代生物催化和生物转化的科学基础（２００９ＣＢ７２４７００）。
１．１试验仪器与试剂
作者简介钱凯（１９８３一），女，江苏常州人，在读硕士，主要从事生物催
仪器主要有：戴安ＵｌｔｉＭａｔｅ ３０００液相色谱仪。配有戴
化方面的研究工作。
￥通讯作者
安ＬＰＧ一３４００溶剂泵；戴安ＶＷＤ一３４００紫外可调波长检测
收稿日期２Ｏ１Ｏ—Ｏ３—３１
器；戴安ＷＰＳ一３０００ＳＬ自动进样器及Ｃｈｒｏｍｅｌｅｏｎ数据处理
】７
农业基础科学
软件。
试剂主要有：Ｄ一氨甲酰一Ｎ一色氨酸、５一吲哚甲基海因、
Ｄ一色氨酸均由南京工业大学生化重点实验室提供（纯度大
于９９．５％）；乙腈，ＨＰＬＣ级，Ｔｅｄｉａ Ｃｏｍｐａｎｙ；水均为二次蒸馏
水；磷酸、磷酸二氢钾、磷酸氢二钾及其他试剂均为分析纯。
工程菌Ｒｏｓｅｔｔａ ｐＥＴ—ＨｙｕＨ由南京工业大学生化重点实验室
构建保存。
１．２色谱条件
色谱柱：Ｍｅｒｃｋ Ｐｕｒｏｓｐｈｅｒ ＳＴＡＲ ＲＰ—Ｃ１８ｅ（４．６ ｍｍｘ２５０．０
ｍｍ，５ ｌａ，ｍ）；流动相：乙腈一２０ ｍｍｏＬ／Ｌ磷酸二氢钾（体积比
２５：７５），用磷酸调ｐＨ值为３．０；流速为１．０ ｍＬ／ｍｉｎ；检测波长
为２２０ ｎｍ；柱温为３Ｏ ｃＩ二，进样量为１０ Ｌ。
１．３标准溶液的配制
准确称取Ｄ一色氨酸、Ｄ一氨甲酰一Ｎ一色氨酸、５一吲哚甲
基海因标准品各０．０１ ｇ，分别加入适量的０．０５ ｍｍｏＬ／Ｌ磷酸
二氢钾一磷酸氢二钾缓冲溶液（ｐＨ值８．０），然后与等比例的
乙醇混合溶解，最后用１０ｍＬ容量瓶定容。
用移液枪分别从上述Ｄ一色氨酸、Ｄ一氨甲酰一Ｎ一色氨
酸、５一吲哚甲基海因的标品溶液中吸取１、２、２ ｍＬ到新的容
量瓶，然后用０．０５ ｍｍｏＬ／ＬｐＨ值８．０的磷酸缓冲一乙腈（１：１）
稀释定容至１０ ｍＬ作为标准溶液，使混合液中Ｄ一色氨酸、
Ｄ一氨甲酰一Ｎ一色氨酸、５一吲哚甲基海因的质量浓度分别为
０．１、０．２、０．２ ｇ／Ｌ。
１．４样品的制备
接种工程菌Ｒｏｓｅｔｔａ ｐＥＴ—ＨｙｕＨ于５ ｍＬ含１００ Ｉ￣ｇ／ｍＬ
氨苄青霉素和３４￣ｇ／ｍＬ氯霉素的ＬＢ培养基，３７℃、２００
ｒ／ｒａｉｎ摇床培养１２ ｈ，按２％的接种量转接于３０ ｍＬ发酵培
养基，培养２ ｈ后加入微量诱导剂于１６ ｏＣ、２００ ｒ／ｍｉｎ诱导培
养１６ ｈ，离心收集菌体。
取适量菌体Ｒｏｓｅｔｔａ ｐＥＴ—ＨｙｕＨ，加入质量浓度为１ Ｌ
的底物——５一吲哚甲基海因（０．５０ ｍｏＵＬ Ｋ２ＨＰＯ４－ＫＨ２ＰＯ 缓
冲液，ｐＨ值８．０）充分混匀，置于５０℃水浴摇床反应，依次取
反应时间为０．５、１．０、２．０ｈ的酶转化液，每次取５００ Ｌ，再加
入５００ Ｌ等体积的乙醇稀释，１２ ０００ ｒ／ｍｉｎ离心５ ａｒｉｎ，取上
清液。经０．２２ Ｉｘｍ的尼龙膜过滤后供ＨＰＬＣ分析。
２结果与分析
２．１检测波长的确定
用移液枪吸取１００ Ｌ标准溶液稀释至３ ｍＬ，用ＶＷＤ一
３４００型紫外可见分光光度计（波长范围１９０～９００ ｎｍ）对稀
释后的标准样品进行扫描，发现在２１０ ｎｍ附近有较明显的
吸收峰，用戴安ＵｌｔｉＭａｔｅ ３０００在上述有吸收峰的波长下分
别进样２ Ｌ检测，发现在２２０ ｎＩｎ处的检测峰面积和峰高
表１各组分在不同吸收波长下对应的响应值
１８
现代农业科技２０１０年第７期
最大、最佳，故选用波长２２０ ｎｍ作为检测波长。各物质在不
同检测波长的响应值如表１所示。
２．２流动相的选择
由于乙腈在２２０ ｎｍ的低波长下噪音小，所以背景干扰
小于其他有机溶剂，且洗脱能力强，故选用乙腈，水系统作为
流动相。按照乙腈浓度的不同配比从５％到４０％，采用乙
睛磷酸二氢钾流动相，磷酸调ｐＨ值为３．０，流速为１．０
ｍＬ／ｍｉｎ。在检测波长为２２０ ｎｍ、柱温为３０ ｃＩ＝的液相条件下
分别对标准溶液进行检测，发现当乙腈浓度低于１５％时，
Ｄ一氨甲酰一Ｎ一色氨酸和５一吲哚甲基海因的保留时间十分
接近，不能将各个组分很好地分离，且分析时间较长。为了
缩短分析时间，逐步提高乙腈的浓度，结果保留时间明显
缩短，而且分离效果也得到改善，最佳浓度配比为２５％
（图１）。但当乙睛浓度超过３０％时，由于出峰时间太快，不
利于各组分的分离。
｛
０ ２ ４ ６ ８ １０ １２ １３
保留时间／／ｍｉｎ
图１ 乙腈浓度为２５％时标准品溶液的色谱
２．３ ｐＨ值的影响
为了调整各色谱峰的间距和峰形，进一步提高柱效和
测量的精确度，用磷酸分别调节乙腈一２０ ｍｍｏＬ／Ｌ磷酸二氢
钾缓冲液（体积比２５：７５）的ｐＨ值为５．０…４ ５ ４．０…３ ５ ３．０和
２．５。结果显示，ｐＨ值越低色谱峰的峰形越好，柱效越高，因
此选择ｐＨ值３．０作为最佳色谱条件（表２）。
表２ ｐＩ－Ｉ值对分离效果的影响
２．４线性关系
将配置的标准溶液分别进样２、４、６、８、１０、１５、２０ 至
ＨＰＬＣ在１．２所述条件下进行检测，每个重复测定３次，测
定的峰面积取平均值。以峰面积为横坐标 、质量浓度为纵
坐标ｙ，绘制标准曲线得到线性方程，如表３所示。
钱凯等：５一吲哚甲基海因及其工程菌转化产物的高效液相色谱分析
∞ ∞ 卯 ∞ ０ ∞
因转化为Ｄ一氨甲酰一Ｎ一色氨酸的工程菌。通过考察不同反
∞
表３方程线性范围
胁
应时间（０、０．５、１．０、２．０ ｈ）酶反应液的色谱图可以发现，随着
反应时间的延长，底物５－吲哚甲基海因（保留时间为８．２８
ｍｉｎ）不断被消耗，产物Ｄ一氨甲酰一Ｎ一色氨酸（保留时间为
６．４３ ｍｉｎ）逐渐积累．且减少量与增加量基本同步（图２）。对
２．５酶转化液中各组成的色谱分析
照为未进行５０℃酶解反应就立即收集菌体的上清液。结果
工程菌Ｒｏｓｅｔｔａ ｐＥＴ—ＨｙｕＨ是南京工业大学生化重点实
验室构建保存的具有Ｄ一海因酶活性，能水解５一吲哚甲基海
表明，在２．２２ ｍｉｎ和２．４９ ｍｉｎ（出峰时间）处的峰可能是菌体
自身代谢的其他产物，含量甚微。另取１ ｍＬ菌液，加入最终
匝
５００
４０ｏ
｛
坦
窜
１奢《
ｖ１ｕ／／ 婪
３ ２ ｌ —
∞ ∞ ∞ Ｏ∞
Ｏ １．２５ ２．５Ｏ ３．７５ ５．００ ６．２５ ７．５Ｏ ８．７５ ｌ０．００ ０ １．２５ ２．５０ ３．７５ ５．００ ６．２５ ７．５Ｏ ８．７５ １０．ｏｏ
保留时间／／ｒａｉｎ
保留时间／／ｍｉｎ
图２酶转化液中各组成的色谱
注：ａ反应时间为０．５ ｈ：ｂ反应时间为２．０ｈ。
浓度为１ ｄＥ的底物（５一吲哚甲基海因）反应４ ｈ，Ｄ一氨甲酰一 酸，Ｄ一氨甲酰一Ｎ一色氨酸和５一吲哚甲基海因的测量线性范
Ｎ～色氨酸的转化率可达９８．７％。 围分别是０．１０～１．００、０．２０～２．００、０．２０～２．００ ｍｇ／ｍＬ；Ｄ一氨甲酰一
由于构建含有Ｄ一氨甲酰水解酶（ＤＣａｓｅ）的工程菌的工 Ｎ一色氨酸和５一吲哚甲基海因的加标回收率分别为９９．３％－
作还在进行中，希望能很快将本方法运用到工程菌ＤＣａｓｅ １０２．０％及９８．０％－９９．３％；精密度分别为０．５１％－０．８７％和
活性的测定中。０．４３％－０．９４％。该方法操作简便，准确度高，为该生产过程中
２．６回收率和精密度 工艺条件的优化和过程监控提供了一种十分有效的方法。
取４份反应时间均为２．０ ｈ的酶促反应液２００ Ｌ，其中４参考文献
１份作为本底，依次在余下的３份酶反应液中加入低、中、高 【ｌ】 建波，徐 ・牛 酶法制备Ｄ－对羟基苯甘氨酸的研究［Ｊ］・生物学杂
３种不同浓度的标准溶液各２００ Ｌ，过膜后按１．２所述检测 ［２１封
，
袁 ．海田酶的催化特性及其反应机理【Ｊ】．微生物学通报，
方法和条件进行测定，每个样品连续进样６次，按测定峰面 ２００３，３０（３）：９５—９８．
积的平均值进行计算，测定结果如表４所示。从表４可以看 【。 ； ，欧阳平凯・Ｄ一色氨酸研究进展［ＪＪ・化工进展， ０ｏ ，
出，该方法的回收率和精密度良好。 【４］袁静明，封霞，赵莉霞．非天然Ｄ一型氨基酸生物转化中酶的纯化及其
基因序列ｆＪＩ．山西大学学报：自然科学版，２００２，２５（２）：１５６—１６２．
表４酶促反应液中５一吲哚甲基海因和Ｄ一氨甲
【５】封霞，袁静明．海因酶的催化特性及其反应机理【Ｊ】．微生物学报，
酰一Ｎ一色氨酸的加标回收率和精密度
２ｏｏ３．３０（３）：９５－９８．
『６１ ＪＯＳＥＦ Ａ ＩＥＮＢＵＣＨＮＥＲ，ＭＡＲＴＩＮ ＳＩＥＭＡＮＮ—ＨＥＲＺＢＥＲＧ，ＣＨＲＩ—
ＳＴＯＰＨ ＳＹＬＤＡＴＫ．Ｈｙｄａｎｔｏｉｎａｓｅｓ ａｎｄ ｒｅｌａｔｅｄ ｅｎｚｙｍｅｓ ａｓ ｂｉｏｃａｔａｌｙｓｔｓ ｆｏｒ
ｔｈｅ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆｕｎｎａｔｕｒａｌ ｃｈｉｒａｌ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄｓ［Ｊ］．Ｃｈｅｍｉｃａｌ ｂｉｏｔｅ—ｃｈｎａｌｏｇｙ，
２０ｏ１，１２（６）：５５９—５６３．
【７】马飞，许激扬，何林松，等．双酶法合成Ｄ一（一）一对羟基苯甘氨酸［Ｊ］．中
国药科大学学报．２００１，３２（２）：１５５—１５８．
【８】曹飞，范伟平，韦萍，等．吲哚甲基海因的制备Ⅱ．低碱体系加氢过程
ｆＪ】．化学反应工程与工艺，２００４，２０（４）：６０５—６１０．
３结论与讨论
【９】宋慧敏，屠春燕，欧阳平凯．高效液相色谱法测定Ｄ一对羟基苯甘氨酸
【ＪＪ．南京工业大学学报，２００２，２４（４）：９７—９９．
采用Ｍｅｒｃｋ Ｐｕｒｏｓｐｈｅｒ ＳＴＡＲ ＲＰ—Ｃ１８ｅ（４．６ ｍｍｘ２５０．０
『１０］ＡＮＡ ＩＳＡＢＥＬ ＭＡＲＴＩＮＥＺ—ＧＯＭＥＺ。ＳＥＲＧ１０ ＭＡＲＴＩＮＥＺ—ＲＯＤＲ—
ｍｍ，５ ｔｒｍ），以乙睛一２０ｍｍｏＬ／Ｌ磷酸二氢钾（体积比２５：７５，
ＩＧＵＥＺ，ＪＯＳＥＦＡ ＭＡＲＩＡ ＣＬＥＭＥＮＴＥ—ＪＩＭＥＮＥＺ．ｅｔ ａ１．Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ
ｐＨ值３．０）为流动相，有效地解决了海因酶法生产Ｄ一色氨
ｐｏｌｙｃｉｓｔｒｏｎｉｅ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｏｆ ｈｙｄａｎｔｏｉｎａｓｅ ｐｒｏｃｅｓｓ ｇｅｎｅｓ ｉｎ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ
ｆｏｒ ｔｈｅ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｏｐｔｉｃａｌｌｙ ｐｕｒｅ Ｄ－ａｍｉｎｏ ａｃｉｄｓ【Ｊ】．Ａｐｐｌｉｅｄ ａｎｄ
酸的生产体系中底物、中间产物和产物含量的测定，Ｄ一色氨
Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔｌａｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，２００７，７３（５）：１５２５—１５３１．
１９