2024年6月10日发(作者：尉新美)
植物有效磷含量的测定
一． 试剂配置：
1．100ml 10%(w/v)的HClO
4
（高氯酸：分子量100.46，相对密度 1.764）
取7.874ml 72%的HClO
4
（国标），定容至100ml。
或用烧杯直接称取13.889g 72%的HClO
4
（国标），加水稀释后，定容到100ml。
计算：13.889g=100ml* 0.1g/ml ÷ 72%
2. 1L 5%(w/v)的HClO
4
（高氯酸：分子量100.46，相对密度 1.764）
取39.3676ml 72%的HClO
4
（国标），定容至1L。
或用烧杯直接称取69.444g 72%的HClO
4
（国标），加水稀释后，定容到1L。
计算：69.444g=1000ml * 0.05g/ml ÷ 72%
3. 250ml 硫酸-钼酸铵 溶液（溶液A）
【即 0.46M H
2
SO
4
中含有 0.4%（w/v）的钼酸铵。浓H
2
SO
4
密度 1.84g/cm
3
,摩尔
浓度18.4M】
1）溶解 1.0g 钼酸铵（NH
4
）
6
Mo
7
O
24
·4H
2
O于约100ml水中；
2）然后徐徐加入 6.25ml 浓H
2
SO
4
（98%）；
3）充分混匀，冷却后定容至250ml。
4. 100ml 10%（w/v）抗坏血酸（VC）溶液 （溶液B）
溶解10g 抗坏血酸于水中，溶解后定容至100ml，储存于棕色瓶中，4℃保存。
5. 工作液：按体积比 6:1 混合溶液A和溶液B
350ml工作液=300ml溶液A + 50ml溶液B
注：工作液需要每天配置，现配现用，配好后放置2小时后再使用。
二．操作步骤：
1. 取0.5g鲜样称重m，用液氮研磨成粉末。待研钵温度上升后，加入1ml的
10%(w/v)的HClO
4
研磨混匀。
2. 在研钵中分两次加入4.5mL的5%高氯酸，共计9ml。第一次加入4.5mL 的
5%高氯酸到研钵中后，将匀浆液转移到新的10ml离心管中；第二次再加入
4.5mL 的5%高氯酸到研钵中后，尽量洗净研钵中的样品，再将液体继续转移
到第一次的10ml离心管中。在冰上放置30min，每隔5min上下颠倒混匀几
次。则样品制备溶液为10ml(V=1ml+9ml=10ml=0.01L)
3. 于4℃，10000g离心10min，取5ml上清液至新的离心管中，用于有效磷的
测定（钼蓝法）。
4. 取1ml(V1)上清液，在上清液中加入2ml的工作液，则反应液为3ml(V2=上
清液+工作液)，反应液于40℃温育20min。
5. 反应液在室温冷却后，观察蓝色深浅，对蓝色过深的样品可适当稀释，地上
部一般要稀释5倍。每个样品吸取200ul到酶标板中，于820nm可见光波下
用酶标仪测定吸收值。
三．磷标线的制作：
1. 磷标准溶液的配置（60ppm Pi）:溶解0.230g 磷酸二氢铵（NH
4
H
2
PO
4
）于水
中，并定容至100ml，即得600ppm的磷标液。将600ppm的磷标液用提取剂
【1:9（10%HClO
4
：5%HClO
4
）】稀释10倍，得60ppm Pi的磷标准溶液。
2. 标准曲线的绘制：将60ppm的磷标液用提取剂稀释，形成稀释标液。再与工
作液反应，生成如下系列标准反应液溶液。用提取剂与工作液的反应液做空
白。
提取剂-V提
60ppm 标液-V标
稀释标液-V稀
工作液-V工
反应液-V反
1ml
0
1ml
2ml
3ml
990ul 980ul 960ul 940ul 920ul 900ul 880ul 860ul 840ul
10ul
1ml
2ml
3ml
20ul
1ml
2ml
3ml
40ul
1ml
2ml
3ml
60ul
1ml
2ml
3ml
80ul
1ml
2ml
3ml
100ul 120ul 140ul 160ul
1ml
2ml
3ml
1ml
2ml
3ml
1ml
2ml
3ml
1ml
2ml
3ml
820ul
180ul
1ml
2ml
3ml
800ul
200ul
1ml
2ml
3ml
系列标液反应液浓度y=60 ppm * (V标/V稀)*(V稀/V反)
浓度y ppm
OD值x
编号
0
BX1
0.2
BX2
0.4
BX3
0.8
BX4
1.2
BX5
1.6
BX6
2.0
BX7
2.4
BX8
2.8
BX9
3.2
3.6
4.0
BX10 BX11 BX12
V稀=V标+V提 ；V反=V稀+V工= V标+V提+V工
四．计算：
植物有效磷含量（mg Pi/g FW）= OD换算值y * (V2/V1)* V / m * C
=y mg/L * （3ml/1ml）* 0.01L / m * C
=0.006y/a mg/g* C
OD换算值y：反应液的OD值x代入标线方程后，反应液中Pi的质量浓度ppm：
mg/L
V：样品制备溶液的ml数，即样品所加提取剂的体积（此为10ml,即0.01L）
M：样品质量m g
V1：上清液的体积（1ml）
V2：反应液总体积（3ml）
C：样品的稀释倍数
2024年6月10日发(作者：尉新美)
植物有效磷含量的测定
一． 试剂配置：
1．100ml 10%(w/v)的HClO
4
（高氯酸：分子量100.46，相对密度 1.764）
取7.874ml 72%的HClO
4
（国标），定容至100ml。
或用烧杯直接称取13.889g 72%的HClO
4
（国标），加水稀释后，定容到100ml。
计算：13.889g=100ml* 0.1g/ml ÷ 72%
2. 1L 5%(w/v)的HClO
4
（高氯酸：分子量100.46，相对密度 1.764）
取39.3676ml 72%的HClO
4
（国标），定容至1L。
或用烧杯直接称取69.444g 72%的HClO
4
（国标），加水稀释后，定容到1L。
计算：69.444g=1000ml * 0.05g/ml ÷ 72%
3. 250ml 硫酸-钼酸铵 溶液（溶液A）
【即 0.46M H
2
SO
4
中含有 0.4%（w/v）的钼酸铵。浓H
2
SO
4
密度 1.84g/cm
3
,摩尔
浓度18.4M】
1）溶解 1.0g 钼酸铵（NH
4
）
6
Mo
7
O
24
·4H
2
O于约100ml水中；
2）然后徐徐加入 6.25ml 浓H
2
SO
4
（98%）；
3）充分混匀，冷却后定容至250ml。
4. 100ml 10%（w/v）抗坏血酸（VC）溶液 （溶液B）
溶解10g 抗坏血酸于水中，溶解后定容至100ml，储存于棕色瓶中，4℃保存。
5. 工作液：按体积比 6:1 混合溶液A和溶液B
350ml工作液=300ml溶液A + 50ml溶液B
注：工作液需要每天配置，现配现用，配好后放置2小时后再使用。
二．操作步骤：
1. 取0.5g鲜样称重m，用液氮研磨成粉末。待研钵温度上升后，加入1ml的
10%(w/v)的HClO
4
研磨混匀。
2. 在研钵中分两次加入4.5mL的5%高氯酸，共计9ml。第一次加入4.5mL 的
5%高氯酸到研钵中后，将匀浆液转移到新的10ml离心管中；第二次再加入
4.5mL 的5%高氯酸到研钵中后，尽量洗净研钵中的样品，再将液体继续转移
到第一次的10ml离心管中。在冰上放置30min，每隔5min上下颠倒混匀几
次。则样品制备溶液为10ml(V=1ml+9ml=10ml=0.01L)
3. 于4℃，10000g离心10min，取5ml上清液至新的离心管中，用于有效磷的
测定（钼蓝法）。
4. 取1ml(V1)上清液，在上清液中加入2ml的工作液，则反应液为3ml(V2=上
清液+工作液)，反应液于40℃温育20min。
5. 反应液在室温冷却后，观察蓝色深浅，对蓝色过深的样品可适当稀释，地上
部一般要稀释5倍。每个样品吸取200ul到酶标板中，于820nm可见光波下
用酶标仪测定吸收值。
三．磷标线的制作：
1. 磷标准溶液的配置（60ppm Pi）:溶解0.230g 磷酸二氢铵（NH
4
H
2
PO
4
）于水
中，并定容至100ml，即得600ppm的磷标液。将600ppm的磷标液用提取剂
【1:9（10%HClO
4
：5%HClO
4
）】稀释10倍，得60ppm Pi的磷标准溶液。
2. 标准曲线的绘制：将60ppm的磷标液用提取剂稀释，形成稀释标液。再与工
作液反应，生成如下系列标准反应液溶液。用提取剂与工作液的反应液做空
白。
提取剂-V提
60ppm 标液-V标
稀释标液-V稀
工作液-V工
反应液-V反
1ml
0
1ml
2ml
3ml
990ul 980ul 960ul 940ul 920ul 900ul 880ul 860ul 840ul
10ul
1ml
2ml
3ml
20ul
1ml
2ml
3ml
40ul
1ml
2ml
3ml
60ul
1ml
2ml
3ml
80ul
1ml
2ml
3ml
100ul 120ul 140ul 160ul
1ml
2ml
3ml
1ml
2ml
3ml
1ml
2ml
3ml
1ml
2ml
3ml
820ul
180ul
1ml
2ml
3ml
800ul
200ul
1ml
2ml
3ml
系列标液反应液浓度y=60 ppm * (V标/V稀)*(V稀/V反)
浓度y ppm
OD值x
编号
0
BX1
0.2
BX2
0.4
BX3
0.8
BX4
1.2
BX5
1.6
BX6
2.0
BX7
2.4
BX8
2.8
BX9
3.2
3.6
4.0
BX10 BX11 BX12
V稀=V标+V提 ；V反=V稀+V工= V标+V提+V工
四．计算：
植物有效磷含量（mg Pi/g FW）= OD换算值y * (V2/V1)* V / m * C
=y mg/L * （3ml/1ml）* 0.01L / m * C
=0.006y/a mg/g* C
OD换算值y：反应液的OD值x代入标线方程后，反应液中Pi的质量浓度ppm：
mg/L
V：样品制备溶液的ml数，即样品所加提取剂的体积（此为10ml,即0.01L）
M：样品质量m g
V1：上清液的体积（1ml）
V2：反应液总体积（3ml）
C：样品的稀释倍数