2024年5月22日发(作者：茅昊天)
柠檬皮中的柠檬苦素对青霉的抑菌活性和机理研究
王辉;曾晓房;冯卫华;于立梅;翟万京;白卫东;曾令钢
【摘 要】通过测定最低抑菌浓度(minimum inhibitory concentration,MIC)和最
小杀菌浓度(minimum fungicidal concentration,MFC)、孢子萌发抑制率、菌丝
生长抑制率确定柠檬皮中柠檬苦素对青霉的抑菌活性;结合总糖含量和蛋白质含量、
碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,AKP)活力等的变化,以及扫描电镜观察对抑菌
机理进行研究.结果 表明:柠檬皮中柠檬苦素对青霉有很强的抑菌活性,对青霉的
MIC和MFC分别为625和2 500 μg/mL,对青霉菌丝生长和孢子萌发抑制的EC5.
值分别为85.618和246.755 μg/mL.柠檬苦素能在短时间内对青霉的细胞壁和细
胞膜造成破坏,使胞内物质大量渗出;且柠檬苦素浓度越高,胞内物质渗出越多.扫描电
镜观察也发现经柠檬苦素处理的青霉外附着渗出物;产孢数量变少,孢子变形;小梗破
损、凹裂;菌丝变细,变形.
【期刊名称】《食品与发酵工业》
【年(卷),期】2019(045)005
【总页数】5页(P75-79)
【关键词】柠檬苦素;青霉;抑菌活性;抑菌机理
【作 者】王辉;曾晓房;冯卫华;于立梅;翟万京;白卫东;曾令钢
【作者单位】仲恺农业工程学院轻工食品学院,广东广州,510550;仲恺农业工程学
院轻工食品学院,广东广州,510550;广东中兴绿丰发展有限公司,广东河源,517000;
仲恺农业工程学院轻工食品学院,广东广州,510550;广东中兴绿丰发展有限公司,广
东河源,517000;仲恺农业工程学院轻工食品学院,广东广州,510550;仲恺农业工程
学院轻工食品学院,广东广州,510550;仲恺农业工程学院轻工食品学院,广东广
州,510550;广东中兴绿丰发展有限公司,广东河源,517000;广东中兴绿丰发展有限
公司,广东河源,517000
【正文语种】中 文
柠檬苦素是含呋喃的三萜类化合物，分子式为C26H30O8，是一种具有高度生物
活性的植物次生代谢产物[1],包括柠檬苦素糖苷和柠檬苦素糖苷配体在内的一系列
化合物，已经分离和鉴定的柠檬苦素类化合物约50多种[2]。柠檬苦素具有抗癌活
性、抑制HIV、镇痛抗炎作用、抗焦虑镇静作用、调节体内胆固醇水平、防止动脉
粥样硬化形成、防虫杀虫活性、抗氧化活性和抑菌活性等功能[3-4]。章斌等[5]的
研究表明，柠檬苦素对细菌有较好的抑菌活性。柠檬苦素在柑橘类植物的种子和皮
中含量非常丰富，但目前国内对柠檬的加工利用大部分局限于柠檬鲜果、柠檬果汁
及柠檬精油等，也有少部分拓展到加工柠檬冻干片及柠檬护肤品等，因此每年产生
大量柠檬果皮废弃物[6]。如果柠檬果皮中的柠檬苦素能得到大量合理利用，提高
其提取效率和使用途径，将具有广阔的工业前景。青霉广泛分布于自然界中，少数
青霉种类能引发人体与动物的各类疾病，而多数青霉能造成柑桔、苹果、梨等水果
的腐烂，青霉病是水果腐烂的最主要原因之一[7-8]。
因此，本文以青霉作为研究对象，探讨柠檬苦素对青霉的抑菌活性以及进行抑菌机
理的研究。为开发柠檬苦素作为天然抑菌剂应用于食品领域提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 原料、试剂与仪器设备
柠檬皮粉，广东中兴绿丰发展有限公司；青霉(Penicillium sp.)、根霉(Rhizopus)、
黑曲霉(Aspergillus niger)由仲恺农业工程学院轻工食品学院微生物实验室保藏；
马铃薯葡萄糖琼脂(PDA)培养基、马铃薯葡萄糖液体(PDB)培养基，广东环凯微生
物科技有限公司；柠檬苦素标准品(纯度99.98%)，济宁天之蓝生物科技有限公司；
碱性磷酸酶试剂盒，上海酶联生物科技有限公司；考马斯亮蓝-G250、蒽酮，北京
索莱宝科技有限公司；福林试剂(分析纯)，Sigma公司；石油醚、二氯甲烷及无水
乙醇等均为国产分析纯。
扫描电子显微镜(JEOL-6360LV型)、冷冻干燥仪(JFD-320型)、离子溅射仪(JFC-
1600型)，日本电子株式会社；精密数字式电导率仪(DDS-18A型)，上海日岛科
学仪器有限公司；净化工作台(SW-CJ-1FD型)，苏州安泰空气技术有限公司；生
化培养箱(PYX-280S-A型)，韶关市科力实验仪器有限公司；紫外分光光度计(UV-
759型)，上海横摇科技有限公司；手提式压力蒸汽灭菌器(DSX-280型)，上海申
安医疗器械厂；冷冻水浴恒温振荡器(THZ-82型)，金坛市中大仪器厂；旋转蒸发
仪(XHRE-52A型)，郑州豫华仪器制造有限公司。
1.2 试验方法
柠檬皮中柠檬苦素溶液的制备：按照课题组前期的提取方法[9]，得到柠檬苦素结
晶后，用少量15%乙醇溶解制成柠檬苦素溶液，-18 ℃保藏。
菌种活化和孢子悬浮液的制备：将保存在-20 ℃的青霉菌种在PDA培养基上活化
2次后，用无菌生理盐水将孢子洗脱，制成孢子含量为108个/mL的孢子悬浮液，
4 ℃冰箱保藏，备用。
柠檬苦素抑制青霉活性的测定：最低抑菌浓度(minimum inhibibory
concentration, MIC)和最小杀菌浓度(minimum fungicidal concentration,
MFC)的测定参考王巍等[10]和任先伟等[11]的方法，并略作修改。分别采用试管
法和平板法测定柠檬苦素的MIC和MFC。取10支无菌试管，采用倍半浓度稀释
法使8支试管中柠檬苦素质量浓度为10 000～78.125 μg/mL，1支试管为空白
对照，不接种菌液，1支试管为菌液对照组，以等量无菌水代替柠檬苦素溶液。
28 ℃培养2 d后，以试管中无青霉生长的最低柠檬苦素浓度为其MIC。MIC测定
后，在无菌生长的试管中各取100 μL涂布于PDA平板培养基，28 ℃培养5 d后，
以平板培养基上无菌生长的最低柠檬苦素浓度为MFC。
孢子萌发抑制率的测定：在置于培养皿中央的凹玻片中分别加入50 μL青霉孢子
悬液和50 μL不同质量浓度的柠檬苦素溶液，28 ℃培养。以15%乙醇为溶剂对照。
当溶剂对照组的孢子萌发率达70%～80%时，用显微镜观察每个玻片100个孢子
的萌发数。用下列公式计算孢子萌发率和抑制率。以柠檬苦素浓度的对数值作为横
坐标，孢子萌发抑制率为纵坐标，计算柠檬苦素对青霉孢子萌发的毒力方程和半最
大效应浓度
孢子萌发率
(1)
孢子萌发抑制率
(2)
菌丝生长抑制率的测定：调整每个PDA平板培养基含不同质量浓度的柠檬苦素，
以15%乙醇为溶剂对照。从已培养3 d的青霉菌落边缘取直径为4 mm的菌饼，
接种于PDA平板培养基中央，菌丝面朝下，28 ℃培养3 d后，用十字交叉法测
量菌落直径。以柠檬苦素质量浓度的对数值作为横坐标，菌丝生长抑制率为纵坐标，
计算柠檬苦素对青霉菌丝的毒力方程和半最大效应浓度
菌落间距/mm=菌落间距平均值-打孔器直径
(3)
菌丝生长抑制率
(4)
1.3 柠檬苦素抑制青霉的机理
对青霉菌丝体总糖含量的测定：将青霉孢子悬液接种于PDB培养基，28 ℃下150
r/min振荡培养5 d后，加入质量浓度为0、156.25、312.5、625、1 250、2
500 μg/mL的柠檬苦素溶液，继续振荡培养3 d后，过滤得青霉菌丝，用蒸馏水
冲洗菌丝数遍后用滤纸吸干。按照蒽铜比色法[14]测定菌丝含糖量。以加入等量
15%乙醇作为对照。
对青霉胞外可溶性蛋白含量的测定：将青霉孢子悬液接种于PDB培养基，加入柠
檬苦素使其最终浓度为MIC后，28 ℃恒温培养，分别于0、8、16、24、32、
40 h移取孢子悬浮液，1 000 r/min离心10 min，取上清液0.1 mL，采用考马
斯亮蓝G-250 比色法[15]测定蛋白质的含量。以加入等量15%乙醇作为对照。
对青霉胞外碱性磷酸酶(AKP)活力的测定：将青霉孢子悬液接种于PDB培养基，
加入柠檬苦素使其最终浓度为MIC后，于28 ℃下150 r/min振荡孵育0、2、4、
6、8、10 h后，1 000 r/min离心10 min，取上清液按照AKP试剂盒比色法测
定和计算AKP活力[16]。以加入等量15%乙醇作为对照。
扫描电镜观察青霉菌丝体和孢子：取100 μL 106个/mL的青霉孢子悬浮液涂布在
PDA平板培养基上，28 ℃恒温培养48 h后，用打孔器制得直径为4 mm的菌饼，
将菌饼倒置在含有2倍MIC柠檬苦素的PDA培养基上，28 ℃培养48 h。用无菌
的镊子将平板上的菌丝刮下后，经固定、脱水、干燥、喷金后镜检[17]。以加入等
量15%乙醇作为对照。
1.4 数据的统计与分析
每个测定均重复3次。结果表示为平均值±标准偏差。应用SPSS 22.0软件(SPSS
Inc., Chicago, IL, USA)中的One-Way ANOVA对所有数据进行方差分析，利用
邓肯式多重比较对差异显著性进行分析。
2 结果与分析
2.1 柠檬苦素对3种霉菌的MIC和MFC影响
经试管法和平板法试验测定，柠檬苦素对3种霉菌的MIC和MFC结果见表1。
柠檬苦素对青霉的抑制活性最强，黑曲霉次之，根霉最弱。周梦娇等[12]研究了中
草药对青霉的抑菌活性，其中抑菌活性最强的桂枝提取物对青霉的MIC和MFC
为6.25和12.50 mg/mL，相比可知，柠檬苦素对青霉的抑菌活性很强。
表1 柠檬苦素对霉菌的MIC及MFC单位：μg/mL
Table 1 The MIC and MFC of limonoids against mould供试菌MICMFC青霉
6252 500黑曲霉6255 000根霉1 2505 000
2.2 对青霉菌丝生长和孢子萌发的影响
由表2可知，柠檬苦素对青霉菌丝生长抑制的EC50值较小。由图1可知，柠檬
苦素质量浓度为78.125 μg/mL时，对菌丝生长的抑制率已达44.20%，对孢子萌
发的抑制率仅为27.00%；但随质量浓度升高至MIC(625 μg/mL)时，对孢子萌发
的抑制率大于对菌丝生长的抑制率，并随质量浓度升高，两者差值越大。当柠檬苦
素质量浓度达到2 500 μg/mL时，对青霉菌丝生长的抑制率和对青霉孢子萌发的
抑制率分别为87.56%和98.31%，已基本完全抑制青霉孢子的萌发。因此，低浓
度柠檬苦素对青霉菌丝生长具有较好的抑制效果，但高浓度柠檬苦素对青霉孢子萌
发的抑制效果更佳。
表2 柠檬苦素对青霉的毒力回归方程和EC50Table 2 Virulence regression
equation and EC50 oflimonoids against Penicillium项目毒力回归方程决定系
数(R2)EC50/(μg·mL-1)菌丝y=25.642x+0.3170.973785.618孢子y=29.612x-
13.9840.837246.755
图1 柠檬苦素对青霉的菌丝生长和孢子萌发的抑制率Fig.1 Inhibition rate of
limonoids on mycelium growth and spore germination of Penicillium
2.3 柠檬苦素抑制青霉的机理
2.3.1 对细胞膜通透性的影响
2.3.1.1 对菌丝体总糖含量的影响
当细胞膜膜结构遭到破坏时，细胞内容物包括糖类会发生外泄。菌丝体总糖含量的
变化，可以反映细菌膜结构的完整性[18]。由图2可知，随柠檬苦素质量浓度增大，
青霉菌丝体总糖含量显著下降(P<0.05)，但下降趋势逐渐放缓。当柠檬苦素质量
浓度为MIC(625 μg/mL)时，菌丝体内总糖仅为未受柠檬苦素溶液处理的59.39%；
当柠檬苦素质量浓度为MFC(2 500 μg/mL)时，菌丝体内总糖为未受柠檬苦素溶
液处理的45.73%。因此，柠檬苦素可以对青霉细胞膜造成破坏，使菌体内总糖外
渗，且处理浓度越大，破坏性越强。以上结论与周梦娇等[12]关于中草药能破坏指
状青霉细胞结构，导致菌丝中总糖含量下降，从而达到抑菌效果的结论一致。
图2 柠檬苦素对青霉菌丝总糖含量的影响Fig.2 Effects of limonoids on total
sugar content ofPenicillium注：不同小写字母表示差异显著，P<0.05。
2.3.1.2 对胞外可溶性蛋白的影响
微生物生物膜的磷脂双分子层内镶嵌有大量蛋白质分子。当磷脂双层遭到破坏时，
膜上的蛋白质将流到细胞外，且胞内的蛋白质也会流出。测定菌液中的蛋白质含量，
可以看出磷脂双分子层是否被破坏[19]。由图3可知，经柠檬苦素处理的青霉菌液
中蛋白质含量显著高于CK组(P<0.05)。柠檬苦素作用于青霉菌液后，作用时间为
16 h内，尤其是前8 h，菌液中的蛋白质含量迅速上升，16 h后破坏作用趋于稳
定。说明柠檬苦素在16 h时基本完成了对细胞膜破坏，导致蛋白质大量泄漏，影
响青霉代谢活动的进行[20]。
图3 柠檬苦素对青霉胞外可溶性蛋白质的影响Fig.3 Effect of limonoids on
extracellular soluble protein of Penicillium
2.3.2 对细胞壁完整度的影响
真菌细胞壁是一层重要而坚韧的保护层，在细胞壁和细胞膜之间存在一种叫碱性磷
酸酶(AKP)的物质，正常情况下无法在胞外检测到该种酶的活性。一旦细胞壁遭到
破坏，AKP将渗出至胞外。因此可以通过检测胞外AKP活力的变化来说明细胞壁
的透性是否发生改变[21-22]。由图4可知，经MIC柠檬苦素处理的青霉培养液中
AKP活力明显高于CK组(P<0.05)。MIC柠檬苦素作用后4 h内，菌液中渗出的
AKP活力显著增强(P<0.05)。因此，柠檬苦素对青霉细胞壁的作用很快产生，4 h
内基本破坏了青霉细胞壁，致使AKP酶外泄。
图4 柠檬苦素对青霉胞外AKP酶活力的影响Fig.4 Effect of limonoids on the
activity of extracellular AKP enzyme in Penicillium
2.3.3 对菌丝和孢子形态的影响
由图5可知，经2倍MIC柠檬苦素(2×MIC)处理后的青霉形态与CK组相比发生
较为明显的变化。CK组的青霉孢子(图5-A)呈现完整的球形，形态规则而饱满；
而2×MIC组的青霉孢子(图5-B)欠饱满，有明显的皱缩和变形，外部附着溶出物。
图5 青霉扫描电镜图Fig.5 Scanning electron microscopy (SEM) of
Penicillium
CK组分生孢子梗、梗基、小梗和分生孢子(图5-C)完好且生长旺盛；而2×MIC组
的青霉(图5-D)可观察到，分生孢子生长不旺盛，小梗、分生孢子呈现明显的凹陷，
严重皱缩和变形，各部分均有明显附着溶出物，可能是细胞凹裂而流出的物质。试
验中也观察到青霉菌丝变细，其生长受到抑制，但不是很明显。这与柠檬苦素对抑
制青霉活性的研究结果以及对细胞壁、细胞膜的影响结果一致。
3 结论
柠檬苦素对青霉有强抑菌活性。其抑制青霉的MIC值和MFC值分别为625和2
500 μg/mL；抑制菌丝生长和孢子萌发的EC50值分别为85.618 μg/mL和
246.755 μg/mL。高浓度柠檬苦素对青霉孢子的萌发有较强的抑制作用，并能有
效抑制菌丝生长。因此，柠檬苦素可以作为青霉抑菌剂加以应用。
柠檬苦素在较短的时间内迅速破坏了青霉细胞膜和细胞壁的完整性，并在4 h和
16 h基本完成对青霉细胞膜和细胞壁的破坏，造成大量内容物渗出；而且柠檬苦
素的浓度越高，内容物渗出量越大，即破坏性越大。扫描电镜观察到2×MIC柠檬
苦素处理后，青霉的分生孢子生长不旺盛；孢子和小梗、分生孢子呈现明显的凹陷、
严重皱缩和变形，有明显胞内物质溶出；菌丝形态也发生了一定程度的变化。这些
变化影响了青霉胞内的正常代谢，进而抑制了青霉的生长和繁殖。
参考文献
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仪(XHRE-52A型)，郑州豫华仪器制造有限公司。
1.2 试验方法
柠檬皮中柠檬苦素溶液的制备：按照课题组前期的提取方法[9]，得到柠檬苦素结
晶后，用少量15%乙醇溶解制成柠檬苦素溶液，-18 ℃保藏。
菌种活化和孢子悬浮液的制备：将保存在-20 ℃的青霉菌种在PDA培养基上活化
2次后，用无菌生理盐水将孢子洗脱，制成孢子含量为108个/mL的孢子悬浮液，
4 ℃冰箱保藏，备用。
柠檬苦素抑制青霉活性的测定：最低抑菌浓度(minimum inhibibory
concentration, MIC)和最小杀菌浓度(minimum fungicidal concentration,
MFC)的测定参考王巍等[10]和任先伟等[11]的方法，并略作修改。分别采用试管
法和平板法测定柠檬苦素的MIC和MFC。取10支无菌试管，采用倍半浓度稀释
法使8支试管中柠檬苦素质量浓度为10 000～78.125 μg/mL，1支试管为空白
对照，不接种菌液，1支试管为菌液对照组，以等量无菌水代替柠檬苦素溶液。
28 ℃培养2 d后，以试管中无青霉生长的最低柠檬苦素浓度为其MIC。MIC测定
后，在无菌生长的试管中各取100 μL涂布于PDA平板培养基，28 ℃培养5 d后，
以平板培养基上无菌生长的最低柠檬苦素浓度为MFC。
孢子萌发抑制率的测定：在置于培养皿中央的凹玻片中分别加入50 μL青霉孢子
悬液和50 μL不同质量浓度的柠檬苦素溶液，28 ℃培养。以15%乙醇为溶剂对照。
当溶剂对照组的孢子萌发率达70%～80%时，用显微镜观察每个玻片100个孢子
的萌发数。用下列公式计算孢子萌发率和抑制率。以柠檬苦素浓度的对数值作为横
坐标，孢子萌发抑制率为纵坐标，计算柠檬苦素对青霉孢子萌发的毒力方程和半最
大效应浓度
孢子萌发率
(1)
孢子萌发抑制率
(2)
菌丝生长抑制率的测定：调整每个PDA平板培养基含不同质量浓度的柠檬苦素，
以15%乙醇为溶剂对照。从已培养3 d的青霉菌落边缘取直径为4 mm的菌饼，
接种于PDA平板培养基中央，菌丝面朝下，28 ℃培养3 d后，用十字交叉法测
量菌落直径。以柠檬苦素质量浓度的对数值作为横坐标，菌丝生长抑制率为纵坐标，
计算柠檬苦素对青霉菌丝的毒力方程和半最大效应浓度
菌落间距/mm=菌落间距平均值-打孔器直径
(3)
菌丝生长抑制率
(4)
1.3 柠檬苦素抑制青霉的机理
对青霉菌丝体总糖含量的测定：将青霉孢子悬液接种于PDB培养基，28 ℃下150
r/min振荡培养5 d后，加入质量浓度为0、156.25、312.5、625、1 250、2
500 μg/mL的柠檬苦素溶液，继续振荡培养3 d后，过滤得青霉菌丝，用蒸馏水
冲洗菌丝数遍后用滤纸吸干。按照蒽铜比色法[14]测定菌丝含糖量。以加入等量
15%乙醇作为对照。
对青霉胞外可溶性蛋白含量的测定：将青霉孢子悬液接种于PDB培养基，加入柠
檬苦素使其最终浓度为MIC后，28 ℃恒温培养，分别于0、8、16、24、32、
40 h移取孢子悬浮液，1 000 r/min离心10 min，取上清液0.1 mL，采用考马
斯亮蓝G-250 比色法[15]测定蛋白质的含量。以加入等量15%乙醇作为对照。
对青霉胞外碱性磷酸酶(AKP)活力的测定：将青霉孢子悬液接种于PDB培养基，
加入柠檬苦素使其最终浓度为MIC后，于28 ℃下150 r/min振荡孵育0、2、4、
6、8、10 h后，1 000 r/min离心10 min，取上清液按照AKP试剂盒比色法测
定和计算AKP活力[16]。以加入等量15%乙醇作为对照。
扫描电镜观察青霉菌丝体和孢子：取100 μL 106个/mL的青霉孢子悬浮液涂布在
PDA平板培养基上，28 ℃恒温培养48 h后，用打孔器制得直径为4 mm的菌饼，
将菌饼倒置在含有2倍MIC柠檬苦素的PDA培养基上，28 ℃培养48 h。用无菌
的镊子将平板上的菌丝刮下后，经固定、脱水、干燥、喷金后镜检[17]。以加入等
量15%乙醇作为对照。
1.4 数据的统计与分析
每个测定均重复3次。结果表示为平均值±标准偏差。应用SPSS 22.0软件(SPSS
Inc., Chicago, IL, USA)中的One-Way ANOVA对所有数据进行方差分析，利用
邓肯式多重比较对差异显著性进行分析。
2 结果与分析
2.1 柠檬苦素对3种霉菌的MIC和MFC影响
经试管法和平板法试验测定，柠檬苦素对3种霉菌的MIC和MFC结果见表1。
柠檬苦素对青霉的抑制活性最强，黑曲霉次之，根霉最弱。周梦娇等[12]研究了中
草药对青霉的抑菌活性，其中抑菌活性最强的桂枝提取物对青霉的MIC和MFC
为6.25和12.50 mg/mL，相比可知，柠檬苦素对青霉的抑菌活性很强。
表1 柠檬苦素对霉菌的MIC及MFC单位：μg/mL
Table 1 The MIC and MFC of limonoids against mould供试菌MICMFC青霉
6252 500黑曲霉6255 000根霉1 2505 000
2.2 对青霉菌丝生长和孢子萌发的影响
由表2可知，柠檬苦素对青霉菌丝生长抑制的EC50值较小。由图1可知，柠檬
苦素质量浓度为78.125 μg/mL时，对菌丝生长的抑制率已达44.20%，对孢子萌
发的抑制率仅为27.00%；但随质量浓度升高至MIC(625 μg/mL)时，对孢子萌发
的抑制率大于对菌丝生长的抑制率，并随质量浓度升高，两者差值越大。当柠檬苦
素质量浓度达到2 500 μg/mL时，对青霉菌丝生长的抑制率和对青霉孢子萌发的
抑制率分别为87.56%和98.31%，已基本完全抑制青霉孢子的萌发。因此，低浓
度柠檬苦素对青霉菌丝生长具有较好的抑制效果，但高浓度柠檬苦素对青霉孢子萌
发的抑制效果更佳。
表2 柠檬苦素对青霉的毒力回归方程和EC50Table 2 Virulence regression
equation and EC50 oflimonoids against Penicillium项目毒力回归方程决定系
数(R2)EC50/(μg·mL-1)菌丝y=25.642x+0.3170.973785.618孢子y=29.612x-
13.9840.837246.755
图1 柠檬苦素对青霉的菌丝生长和孢子萌发的抑制率Fig.1 Inhibition rate of
limonoids on mycelium growth and spore germination of Penicillium
2.3 柠檬苦素抑制青霉的机理
2.3.1 对细胞膜通透性的影响
2.3.1.1 对菌丝体总糖含量的影响
当细胞膜膜结构遭到破坏时，细胞内容物包括糖类会发生外泄。菌丝体总糖含量的
变化，可以反映细菌膜结构的完整性[18]。由图2可知，随柠檬苦素质量浓度增大，
青霉菌丝体总糖含量显著下降(P<0.05)，但下降趋势逐渐放缓。当柠檬苦素质量
浓度为MIC(625 μg/mL)时，菌丝体内总糖仅为未受柠檬苦素溶液处理的59.39%；
当柠檬苦素质量浓度为MFC(2 500 μg/mL)时，菌丝体内总糖为未受柠檬苦素溶
液处理的45.73%。因此，柠檬苦素可以对青霉细胞膜造成破坏，使菌体内总糖外
渗，且处理浓度越大，破坏性越强。以上结论与周梦娇等[12]关于中草药能破坏指
状青霉细胞结构，导致菌丝中总糖含量下降，从而达到抑菌效果的结论一致。
图2 柠檬苦素对青霉菌丝总糖含量的影响Fig.2 Effects of limonoids on total
sugar content ofPenicillium注：不同小写字母表示差异显著，P<0.05。
2.3.1.2 对胞外可溶性蛋白的影响
微生物生物膜的磷脂双分子层内镶嵌有大量蛋白质分子。当磷脂双层遭到破坏时，
膜上的蛋白质将流到细胞外，且胞内的蛋白质也会流出。测定菌液中的蛋白质含量，
可以看出磷脂双分子层是否被破坏[19]。由图3可知，经柠檬苦素处理的青霉菌液
中蛋白质含量显著高于CK组(P<0.05)。柠檬苦素作用于青霉菌液后，作用时间为
16 h内，尤其是前8 h，菌液中的蛋白质含量迅速上升，16 h后破坏作用趋于稳
定。说明柠檬苦素在16 h时基本完成了对细胞膜破坏，导致蛋白质大量泄漏，影
响青霉代谢活动的进行[20]。
图3 柠檬苦素对青霉胞外可溶性蛋白质的影响Fig.3 Effect of limonoids on
extracellular soluble protein of Penicillium
2.3.2 对细胞壁完整度的影响
真菌细胞壁是一层重要而坚韧的保护层，在细胞壁和细胞膜之间存在一种叫碱性磷
酸酶(AKP)的物质，正常情况下无法在胞外检测到该种酶的活性。一旦细胞壁遭到
破坏，AKP将渗出至胞外。因此可以通过检测胞外AKP活力的变化来说明细胞壁
的透性是否发生改变[21-22]。由图4可知，经MIC柠檬苦素处理的青霉培养液中
AKP活力明显高于CK组(P<0.05)。MIC柠檬苦素作用后4 h内，菌液中渗出的
AKP活力显著增强(P<0.05)。因此，柠檬苦素对青霉细胞壁的作用很快产生，4 h
内基本破坏了青霉细胞壁，致使AKP酶外泄。
图4 柠檬苦素对青霉胞外AKP酶活力的影响Fig.4 Effect of limonoids on the
activity of extracellular AKP enzyme in Penicillium
2.3.3 对菌丝和孢子形态的影响
由图5可知，经2倍MIC柠檬苦素(2×MIC)处理后的青霉形态与CK组相比发生
较为明显的变化。CK组的青霉孢子(图5-A)呈现完整的球形，形态规则而饱满；
而2×MIC组的青霉孢子(图5-B)欠饱满，有明显的皱缩和变形，外部附着溶出物。
图5 青霉扫描电镜图Fig.5 Scanning electron microscopy (SEM) of
Penicillium
CK组分生孢子梗、梗基、小梗和分生孢子(图5-C)完好且生长旺盛；而2×MIC组
的青霉(图5-D)可观察到，分生孢子生长不旺盛，小梗、分生孢子呈现明显的凹陷，
严重皱缩和变形，各部分均有明显附着溶出物，可能是细胞凹裂而流出的物质。试
验中也观察到青霉菌丝变细，其生长受到抑制，但不是很明显。这与柠檬苦素对抑
制青霉活性的研究结果以及对细胞壁、细胞膜的影响结果一致。
3 结论
柠檬苦素对青霉有强抑菌活性。其抑制青霉的MIC值和MFC值分别为625和2
500 μg/mL；抑制菌丝生长和孢子萌发的EC50值分别为85.618 μg/mL和
246.755 μg/mL。高浓度柠檬苦素对青霉孢子的萌发有较强的抑制作用，并能有
效抑制菌丝生长。因此，柠檬苦素可以作为青霉抑菌剂加以应用。
柠檬苦素在较短的时间内迅速破坏了青霉细胞膜和细胞壁的完整性，并在4 h和
16 h基本完成对青霉细胞膜和细胞壁的破坏，造成大量内容物渗出；而且柠檬苦
素的浓度越高，内容物渗出量越大，即破坏性越大。扫描电镜观察到2×MIC柠檬
苦素处理后，青霉的分生孢子生长不旺盛；孢子和小梗、分生孢子呈现明显的凹陷、
严重皱缩和变形，有明显胞内物质溶出；菌丝形态也发生了一定程度的变化。这些
变化影响了青霉胞内的正常代谢，进而抑制了青霉的生长和繁殖。
参考文献
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