2024年10月7日发(作者：才晴虹)
实用临床医学２０１１年第ｌ２卷第４期ＰｒａｃｔｉｃａｌＣｌｉｎｉｃａｌ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，２０１１，Ｖｏｌ １２，Ｎｏ ４
实时荧光定量ＰＣＲ检测脂多糖
对ＮＲ８３８３细胞ＴＮＦ一．）【ｍＲＮＡ的影响
熊东林 ，丁成志。，曾振国。，钱克俭
（１．深圳市第六人民医院疼痛科，广东深圳５１８０５２；
２．南昌大学第一附属医院重症医学科，南昌３３０００６）
摘要：目的 实时荧光定量ＰＣＲ检测脂多糖（ＬＰＳ）诱导ＮＲ８３８３肺泡巨噬细胞前后ＴＮＦ－ａ ｍＲＮＡ的表达情况。
方法体外培养的肺泡巨噬细胞系ＮＲ８３８３分成ＬＰＳ刺激组和ＰＢＳ（磷酸盐缓冲液）对照组，ＬＰＳ终浓度为
１／ｚｇ・ｍＬ＿。，共培养２ ｈ后，ＴＲＩｚｏｌ法提取细胞总ＲＮＡ，ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｉ实时荧光定量ＰＣＲ检测细胞ＴＮＦ－ａ ｍＲ－
ＮＡ的表达，结合管家基因 Ａｃｔｉｎ进行相对定量分析。结果荧光定量ＰＣＲ未发现非特异性扩增。与对照组比
较，ＬＰＳ刺激组细胞ＴＮＦ－￣ｍＲＮＡ上调了１２４，１倍，差异有统计学意义（Ｐ＜Ｏ．０１）。结论 用于本研究ＴＮＦ＿ａ
ｍＲＮＡ的荧光定量ＰＣＲ检测体系特异性好，结果可靠，为进一步实验奠定了基础。
关键词：实时荧光定量ＰＣＲ；ＮＲ８３８３细胞系；肿瘤坏死因子一ａ；脂多糖
中图分类号：Ｒ４４６．６１ 文献标志码：Ａ 文章编号：１００９－－８１９４（２０１１）０４－－０００１－－０３
Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ＴＮＦ－ａ ｍＲＮＡ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ
ｉｎ Ｌｉｐ０ｐ０ｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ－ｓｔｉｍｕｌａｔｅｄ ＮＲ８３８３ Ｃｅｌｌｓ Ｕｓｉｎｇ
Ｒｅａｌ－Ｔｉｍｅ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ＰＣＲ
ＸＩＯＮＧ Ｄｏｎｇ－ｌｉｎ ，ＤＩＮＧ Ｃｈｅｎｇ－ｚｈｉ。，ＺＥＮＧ Ｚｈｅｎ—ｇｕｏ。，ＱＩＡＮ Ｋｅ－ｊ ｉａｎ。
（１．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｐａｉｎ，Ｓｈｅｎｚｈｅｎ Ｓｉｘｔｈ Ｐｅｏｐｌｅ’Ｓ Ｈｏｓｐｉｔａｌ，Ｓｈｅｎｚｈｅｎ ５ １ ８０５２，Ｃｈｉｎａ；
２．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｃｒｉｔｉｃａｌ Ｃａｒｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，ｔｈｅ Ｆｉｒｓｔ Ａｆｆｉｌｉａｔｅｄ Ｈｏｓｐｉｔａｌ ｏｆ
Ｎａｎｃｈａｎｇ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｎａｎｃｈａｎｇ ３３０００６，Ｃｈｉｎａ）
ＡＢＳＴＲＡＣＴ：Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ Ｔｏ ｄｅｔｅｃｔ ｔｈｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ＴＮＦ—ａ ｍＲＮＡ ｉｎ ｌｉｐｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ（ＬＰＳ）一
ｉｎｄｕｃｅｄ ＮＲ８３８３ ａｌｖｅｏｌａｒ ｍａｃｒｏｐｈａｇｅｓ ｕｓｉｎｇ ｒｅａｌ—ｔｉｍｅ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ＰＣＲ．Ｍｅｔｈｏｄｓ
Ａｌｖｅｏｌａｒ ｍａｃｒｏｐｈａｇｅｓ ｗｅｒｅ ｔｒｅａｔｅｄ ｗｉｔｈ １ ｇ・ｍＬ＿。ＬＰＳ（ＬＰＳ ｇｒｏｕｐ）ｏｒ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ—ｂｕｆｆｅｒｅｄ ｓａ—
ｌｉｎｅ（ｃｏｎｔｒｏｌ ｇｒｏｕｐ）．Ｔｏｔａｌ ＲＮＡ ｗａｓ ｅｘｔｒａｃｔｅｄ ｗｉｔｈ ＴＲＩｚｏｌ ｒｅａｇｅｎｔ ａｎｄ ＴＮＦ—ａ ｍＲＮＡ ｅｘｐｒｅｓ—
ｓｉｏｎ ｗａｓ ｅｘａｍｉｎｅｄ ｂｙ ｒｅａｌ—ｔｉｍｅ ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ＰＣＲ ｕｓｉｎｇ ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ工．Ｒｅｓｕｌｔｓ Ｎｏｎｓｐｅｃｉｉｆｃ ａｍ—
ｐｌｉｉｆｃａｔｉｏｎ ｗａｓ ｎｏｔ ｄｅｔｅｃｔｅｄ．Ｃｏｍｐａｒｅｄ ｗｉｔｈ ｃｏｎｔｒｏｌ ｇｒｏｕｐ，ｔｈｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ＴＮＦ—ｄ ｍＲＮＡ ｉｎ
ＬＰＳ—ｓｔｉｍｕｌａｔｅｄ ｇｒｏｕｐ ｉｎｃｒｅａｓｅｄ １２４．１ ｔｉｍｅｓ（Ｐ￣０．０１）．Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ Ｒｅａｌ—ｔｉｍｅ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｑｕａｎ—
ｔｉｔａｔｉｖｅ ＰＣＲ ｉｓ ａ ｈｉｇｈｌｙ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ａｎｄ ｒｅｌｉａｂｌｅ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｔｈｅ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ＴＮＦ—ｏ【ｍＲＮＡ．
ＫＥＹ ＷＯＲＤＳ：ｒｅａｌ—ｔｉｍｅ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ＰＣＲ；ＮＲ８３８３ ｃｅｌｌ ｌｉｎｅ；ＴＮＦ—Ｏｔ；
ｌｉｐｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ
肺泡巨噬细胞（ａｌｖｅｏｌａｒ ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ，ＡＭ）是肺
伤 。ＮＲ８３８３细胞系是正常大鼠肺泡巨噬细胞在
泡腔内常驻吞噬细胞，是肺组织天然免疫系统的第
一
特定条件下培养数代后形成的细胞系，具有正常肺
道防线Ⅲ。过度激活后的肺泡巨噬细胞可以分泌
泡巨噬细胞的特性，常用于体外肺泡巨噬细胞相关
功能研究 引。实时荧光定量ＰＣＲ（Ｒｅａｌ—Ｔｉｍｅ Ｆｌｕｏ一 大量的炎症介质，造成肺的过度炎症反应，形成肺损
收稿日期：２０１１—０３—１１
基金项目：江西省自然科学基金（２０１０ＧＺＹ０３３９）
作者简介：熊东林（１９６５一），男，学士，副主任医师，主要从事疼痛医学的研究。
・
２ ・ 实用临床医学２０１１年第１２卷第４期ＰｒａｃｔｉｃａｌＣｌｉｎｉｃａｌ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，２０１１，Ｖｏｌ １２，Ｎｏ ４
ｒｅｓｃｅｎｃｅ Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ＰＣＲ，Ｒｅａｌ—Ｔｉｍｅ ｑＰＣＲ）技术
是近些年来发展起来的一种可以用于定量的核酸检
测技术。由于其众多的优点，现已广泛运用于生命
科学领域。本实验选取ＮＲ８３８３肺泡巨噬细胞作为
５ ｍｌｎ。
１．２．５ Ｒｅａｌ—Ｔｉｍｅ ＰＣＲ
ＰＣＲ引物序列参照文献［４—５１，ＴＮＦ—ａ和内参
￣－Ａｃｔｉｎ扩增片段长度分别为１７２ ｂｐ和１０１ ｂｐ。采
用北京全式金生物有限公司的荧光定量检测试剂 研究对象，用ＬＰＳ刺激细胞，采用ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｉ法
Ｒｅａｌ—Ｔｉｍｅ ｑＰＣＲ检测ＴＮＦ—ａ ｍＲＮＡ的表达情况，
为下一步的实验奠定基础。
１材料与方法
１．１材料
大鼠肺泡巨噬细胞系ＮＲ８３８３（购于中国科学
院细胞库）；Ｈａｍ Ｓ Ｆ－１２Ｋ培养基（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ，
美国）；胎牛血清（ＨｙＣｌｏｎｅ，美国）；ＬＰＳ（Ｅ．ｃｏｌｉ
０ｌ１ １：Ｂ４，Ｓｉｇｍａ—Ａｌｄｒｉｃｈ，美国）；ＴＲＩｚｏｌ？Ｒｅａｇｅｎｔ
（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，美国）；ＴｒａｎｓＳｃｒｉｐｔＴＭ Ｇｒｅｅｎ Ｔｗｏ—
Ｓｔｅｐ ｑＲＴ—ＰＣＲ ＳｕｐｅｒＭｉｘ（北京全式金生物有限公
司）；ＤＮＡ Ｍａｒｋｅｒ Ｉ（北京天根生化科技有限公司）；
琼脂糖（西班牙ＢＩＯＷＥＳＴ国内分装）。ＴＮＦ—ａ和
Ｇ—Ａｃｔｉｎ的引物由上海生工生物工程有限公司合成，
氯仿、异丙醇及无水乙醇等均为国产分析纯。
１．２ 方法
１．２．１细胞培养
ＮＲ８３８３细胞培养于含１５ 的胎牛血清、
ｌ＿５ ｇ・Ｌ 碳酸氢钠、２ｒａＭ的Ｌ一谷氨酰胺的
Ｈａｍ＇ｓ Ｆ一１２Ｋ培养基中，置于３７℃、５ 二氧化碳培
养箱中。２～３ ｄ更换培养液，３～４ ｄ传代一次。
１．２．２细胞处理及分组
将ＮＲ８３８３细胞按１×１Ｏ 个・ｍＬ 接种于六
孑Ｌ板，每孔２ ｍＬ。实验分为２组：１）ＬＰＳ刺激组：培
养基中加入ＬＰＳ（终浓度１ ｇ・ｍＬ ）；２）ＰＢＳ对
照组：于培养基中加入与ＬＰＳ溶液等体积的ＰＢＳ。
共培养２ ｈ后离心收集细胞团块，用于提取总
ＲＮＡ。
１．２．３ ＲＮＡ抽提和质量检测
根据Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ公司ＴＲＩｚｏｌ试剂说明书提取
细胞团块中的总ＲＮＡ。所得总ＲＮＡ通过琼脂糖
凝胶电泳和紫外分光光度计来检测ＲＮＡ纯度及浓
度。
１．２．４ 反转录
采用北京全式金生物有限公司反转录试剂盒进
行反转录，所有操作均在冰上完成。反转录反应体
系：１ ｇｇ的总ＲＮＡ、１ Ｌ的Ｏｌｉｇｏ（ｄＴ）１８
（Ｏ．５ ｇ・ Ｌ＿｜１）、１０ Ｌ的２×ＴＳ Ｒｅａｃｔｉｏｎ Ｍｉｘ、
１肚Ｌ的ＴｒａｎｓＳｃｒｉｐｔＴＭ ＲＴ／ＲＩ Ｅｎｚｙｍｅ Ｍｉｘ，补无
核酶水到２０ Ｌ。反应条件：４２℃３０ ｍｉｎ，８５℃
盒。扩增反应体系：１ Ｌ的反转录产物、各０．５ Ｌ
上、下游引物（１０ Ｍ）、１２．５ Ｌ的２×ＴｒａｎｓＳ－
ｃｒｉｐｔＴＭ Ｇｒｅｅｎ ｑＰＣＲ ＳｕｐｅｒＭｉｘ、０．５ Ｌ的Ｐａｓｓｉｖｅ
Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ Ｄｙｅ，补水到２５ Ｌ。在ＡＢＩ７３Ｏ０定量
ＰＣＲ仪上扩增和检测，反应条件：９５℃３０ Ｓ，４０个
扩增循环（９５。Ｃ ５ Ｓ，５７℃２０ Ｓ，７２℃２７ ｓ）。４０个
循环后行溶解曲线步骤，最终扩增产物进行琼脂糖
凝胶电泳，观察有无非特异性扩增及扩增片段长度。
ＴＮＦ—ａ的相对表达量采用２ △ｃ 。 计算，Ｃｔ值为目
标扩增产物达到设定阈值所经历的循环数。
１．２．６统计学方法
采用ＳＰＳＳ１３．０统计软件进行分析，两样本比
较采用ｔ检验，Ｐ＜０．０５表示２组样本差异有统计
学意义。
２ 结果
２．１总ＲＮＡ琼脂糖凝胶电泳
在电泳图上可以观察到三条条带，从上到下分
别为２８ｓＲＮＡ、１８ｓＲＮＡ和５ｓＲＮＡ的条带，其中
２８ｓＲＮＡ的亮度大概是１８ｓＲＮＡ亮度的两倍，各条
带较完整无明显拖尾，点样孑Ｌ干净，说明所提取的总
ＲＮＡ质量较好。见图１。
Ｐ组 Ｌ组
Ｄ
２８ Ｓ
１８ ｓ
５ Ｓ
Ｐ：ＰＢＳ组，Ｌ：ＬＰＳ组，Ｄ：点样孔。
图１总ＲＮＡ电泳图
２．２扩增产物琼脂糖凝胶电泳和溶解曲线分析
电泳图结果：ＴＮＦ一（Ｉｔ和１３－Ａｃｔｉｎ扩增片段长度
分别应为１７２ ｂｐ和１０１ ｂｐ。根据Ｍａｒｋｅｒ指示，扩
增条带为目的条带，电泳图中无杂带，这些说明
ＰＣＲ扩增为特异性扩增。见图２。
实用临床医学２０１１年第ｌ２卷第４期ＰｒａｃｔｉｃａｌＣｌｉｎｉｃａｌ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，２０１１，Ｖｏｌ １２，Ｎｏ ４
・ ３ 。
如图３所示：ＴＮＦ＿ａ和［３－Ａｃｔｉｎ溶解峰都为单
对定量。根据化学发光原理，Ｒｅａｌ—Ｔｉｍｅ ｑＰＣＲ大致
峰，且为特征峰，说明ＰＣＲ扩增为特异性扩增。
Ｌ组 Ｐ组 Ｍ组
● ３００ ｂｐ
Ｔ＿＿－
．．１。‘２Ｏ０ ｂｐ
Ａ－●
Ｉ．－．一１００ ｂｐ
Ｌ：ＬＰＳ组，Ｐ：ＰＢＳ组，Ｍ：Ｍａｒｋｅｒ。
Ａ：１３－Ａｅｔｉｎ（１０１ ｂｐ）；Ｔ：ＴＮＦ—ａ（１７２ ｂｐ）
图２扩增产物电泳图
Ａ Ｊ
ｔ＝
一
Ａ：Ｉ３－Ａｃｔｉｎ的扩增曲线；Ｔ：ＴＮＦ ａ的扩增曲线
图３溶解曲线图
２．３ ＬＰＳ对ＮＲ８３８３细胞ＴＮＦ－ａ ｍＲＮＡ的影响
与对照组比较，ＬＰＳ（１ ・ｍＬ ）刺激ＮＲ８３８３细
胞２ ｈ后ＴＮＦ－ａ上调了１２４．１倍（图４）。
１４０
１２０
饕ｌｏ０
８０
藿 ６０
星 ４０
２。
Ｏ
ＰＢＳ组 ＬＰＳ组
＊Ｐ＜Ｏ．Ｏｌ与对照组比较（ｎ一３）。
图４ ＴＮＦ－￣ｍＲＮＡ表达改变
３讨论
Ｒｅａｌ—Ｔｉｍｅ ｑＰＣＲ是指在反应体系中加入荧光
基团，在扩增过程中通过荧光信号的累积来实时监
测整个ＰＣＲ的过程，可以根据需要进行相对或者绝
可分为两大类：探针类和非探针类。本实验采用的
ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｉ法属于非探针类Ｒｅａｌ—Ｔｉｍｅ ｑＰＣＲ。
ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｉ是一种荧光染料，能够非特异性结合
双链ＤＮＡ。结合后，ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｉ能够发射荧光
信号，而未结合的染料发出的荧光极其微弱，这样从
而保证荧光信号的增加与ＰＣＲ产物的增加完全同
步。由于ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｉ使用方便、简单，且价格相
对较低，因此是一些实验室的首选。但由于ＳＹＢＲ
Ｇｒｅｅｎ Ｉ能够和所有双链ＤＮＡ相结合，因此如果有
引物二聚体形成、非特异性扩增等都将影响结果。
但我们可以通过溶解曲线来分析判断ＰＣＲ反应的
特异性。在本试验中ＴＮＦ—ａ和ｆ］－Ａｃｔｉｎ溶解峰都为
单峰，且为特征峰，说明本实验的ＰＣＲ扩增为特异
性扩增。
肺泡巨噬细胞主要存在于肺泡腔和小气道内，
是支气管肺泡灌洗液中数量最多的细胞，可占８０
以上。正常情况下，肺泡巨噬细胞的功能主要是摄
取和吞噬进入肺泡腔的颗粒或细菌，保持肺泡腔的
清洁和防御作用。但在病理条件下，肺泡巨噬细胞
被过度激活，将会导致肺损伤Ｌ７ ］。ＬＰＳ为革兰氏阴
性细菌外壁层中的主要成分，它可以通过肺泡巨噬
细胞表面的Ｔｏｌｌ样受体４（Ｔｏｌｌ—ｌｉｋｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ４，
ＴＬＲ４）来活化核转录因子ＫａｐｐａＢ（ｎｕｃｌｅａｒ ｆａｃｔｏｒ—
ＫａｐｐａＢ，ＮＦ—ＪｃＢ）从而诱导大量的炎症介质和细胞
因子的表达 ］，这其中就包括ＴＮＦ—ａ。ＴＮＦ—ｑ是内
毒素休克或急性肺损伤早期产生的最重要的细胞因
子之一，对炎症或急性肺损伤的发展起着重要的作
用。在本实验中，ＬＰＳ刺激ＮＲ８３８３肺泡巨噬细胞
后，采用ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｉ法Ｒｅａｌ—Ｔｉｍｅ ｑＰＣＲ技术发
现ＴＮＦ—ａ ｍＲＮＡ水平明显增高，这些为下一步的
实验奠定基础。
参考文献：
Ｅｌｉ Ｓｈｅｒｍａｎ Ｍ Ｐ，Ｇａｎｚ Ｔ．Ｈｏｓｔ ｄｅｆｅｎｓｅ ｉｎ ｐｕｌｍｏｎａｒｙ ａｌｖｅｏｌｉ［Ｊ］．
Ａｎｎｕ Ｒｅｖ Ｐｈｙｓｉｏｌ，１９９２，５４：３３１—３５０．
［２］Ｃｈｏｐｒａ Ｍ，Ｒｅｕｂｅｎ Ｊ Ｓ，Ｓｈａｒｍａ Ａ Ｃ．Ａｃｕｔｅ ｌｕｎｇ ｉ￣ｕｒｙ：ａｐｏｐｔｏ—
ｓｉｓ ａｎｄ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ［Ｊ］．Ｅｘｐ Ｂｉｏｌ Ｍｅｄ（Ｍａｙｗｏｏｄ），
２００９，２３４（４）：３６１－３７１．
［３］Ｈｅｌｍｋｅ Ｒ Ｊ，Ｇｅｒｍａｎ Ｖ Ｆ，Ｍａｎｇｏｓ Ｊ Ａ．Ａ ｃｏｎｔｉｎｕｏｕｓ ａｌｖｅｏｌａｒ
ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ ｃｅｌｌ ｌｉｎｅ：ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎｓ ｗｉｔｈ ｆｒｅｓｈｌｙ ｄｅｒｉｖｅｄ ａｌｖｅｏｌａｒ
ｍａｃｒｏｐｈａｇｅｓ［Ｊ］．Ｉｎ Ｖｉｔｒｏ Ｃｅｌｌ Ｄｅｖ Ｂｉｏｌ，１９８９，２５（１）：４４—４８．
［４］Ｐｅｎｇ Ｊ Ｈ，Ｈｕ Ｙ Ｙ，Ｃｈｅｎｇ Ｙ，ｅｔ ａ１．Ｅｆｆｅｃｔ ｏｆｉｉａｎｇｐｉ ｈｕｏｘｕｅ ｄｅ—
ｃｏｃｔｉｏｎ ｏｎ ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ ｃｙｔｏｋｉｎｅ ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ ｐａｔｈｗａｙ ｉｎ ｒａｔ ｌｉｖｅｒ
ｗｉｔｈ ｌｉｐｏｐｏ１ｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ ｃｈａｌｌｅｎｇｅ［Ｊ］．Ｗｏｒｌｄ Ｊ Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ，
２００８，１４（１２）：１８５１－１８５７．
（下转第６页）
实用临床医学２０１１年第ｌ２卷第４期Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，２０１１，Ｖｏｌ １２，Ｎｏ ４
表２ ３组心肌细胞存活率比较 士ｓ
代谢产物５一羟基吲达帕胺的作用比原药作用强。
最新的研究也证明该药可逆转冠脉内壁的重构过
程，提高微血管的功能，改善冠脉血流，降低动脉血
压＿９］。为此，笔者在乳鼠ＬＰＳ损伤模型上对吲达帕
胺的心肌保护作用进行了一系列研究。从本研究的
＊Ｐ＜Ｏ．０１与对照组相比；△Ｐ＜Ｏ．Ｏ１与ＬＰＳ组相比。
结果可见，心肌细胞在吲达帕胺处理后，心肌细胞损
２．４ ３组心肌细胞悬液中ＬＤＨ活性比较
与对照组相比，ＬＰＳ组细胞悬液中ＬＤＨ活性
增加（Ｐ＜０．０１）；吲达帕胺＋ＬＰＳ组细胞悬液中
ＬＤＨ活性较ＬＰＳ组明显减低（Ｐ＜０．０１），与正常对
照组相比无显著性差异（Ｐ＞Ｏ．０５），见表３。
伤减轻，ＬＤＨ活性降低，证实其对ＬＰＳ损伤的心肌
具有保护作用。猜测其机制可能与具有清除氧自由
基、减少细胞钙离子内流等作用有关。
参考文献：
Ａ，Ｔｈｏｔａ Ｖ，Ｄｅｅ Ｌ，ｅｔ ａ１．Ｔｕｍｏｒ ｎｅｃｒｏｓｉｓ ｆａｃｔｏｒ ａｎｄ ｉｎ—
［１］
Ｋｕｍａｒ
ｔｅｒｌｅｕｋｉｎ ｌ ｂｅｔａ ａｒｅ ｒｅｓｐｏｎｓｉｂｌｅ ｆｏｒ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｍｙｏｃａｒｄｉａｌ ｃｅｌｌ ｄｅ—
表３ ３组心肌细胞ＬＤＨ活性比较
士
ｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎｄｕｃｅｄ ｂｙ ｈｕｍａｎ ｓｅｐｔｉｃ ｓｈｏｃｋ ｓｅｒｕｍ［Ｊ］．Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ，
ｌ９９６，１８３：９４９—９５８．
［２３ 韩永芳，壬钟林．吲达帕胺的降压机制及心血管保护作用［Ｊ］．
天津药学，１９９８，１０（４）：１０６—１１１．
［３］
Ｓｐｅｃｔｏｒ Ｄ Ｉ ，Ｇｏｌｄａｍ Ｒ Ｄ。Ｌｅｉｎｗａｎｄ Ｉ Ａ．Ｃｕｌｔｕｒｅ ａｎｄ Ｂｉｏ—
ｃｈｅｍｉｃａｌ Ａｎｎｌｙｓｉｓ ｏｆ Ｃｅｌｌ［Ｍ］．ＮＹ：Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏ—
＊Ｐ＜０．０１与对照组相比；ＡＰ＜０．０１与ＬＰＳ组相比。
ｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，１９９８：１１１－１１９．
ｅｋｓｅｅｖ Ａ Ｅ，Ａｌｅｋｓａｎｄｒｏｖａ Ｉ Ａ，ｅｔ ａ１．Ｕｓｅ ｏｆ ｔｈｅ
［４］
Ｇｏｍｅｚ Ｌ Ａ，Ａｌ
ＭＴＴ ａｓｓａｙ ｉｎ ａｄｕｌｔ ｖｅｎｔｒｉｃｕｌａｒ ｃａｒｄｉｏｍｙｏｃｙｔｅｓ ｔｏ ａｓｓｅｓｓ ｖｉａ—
ｂｉｌｉｔｙ：ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ａｄｅｎｏｓｉｎｅ ａｎｄ ｐｏｔａｓｓｉｕｍ ｏｎ ｃｅｌｌｕｌａｒ ｓｕｒｖｉｖａｌ
３讨论
过去有观点认为，心脏几乎不参与体内炎症反
应，甚至与炎症反应毫无关系。然而，近年来研究却
表明，心脏也是一个生成炎性介质的场所，脂多糖是
诱导心肌细胞表达炎症因子的一个有效刺激因素，
［５３
［Ｊ］．Ｊ Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｃａｒｄｉｏｌ，１９９７，２９（４）：１２５５—１２６６．
Ｔａｋａｎｏ Ｈ，Ｎａｇａｉ Ｔ，Ａｓａｋａｗａ Ｍ，ｅｔ ａｔ．Ｐｅｒｏｘｉｓｏｍｅ ｐｒｏｌｉｆｅｒａ—
ｔｏｒ－ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ａｃｔｉｖａｔｏｒｓ ｉｎｈｉｂｉｔ ｌｉｐｏｐｏｌｙｓａｅｃｈａｒｉｄｅ－ｉｎ—
ｄｕｃｅｄ ｔｕｍｏｒ ｎｅｃｒｏｓｉｓ ｆａｃｔｏｒ—ａｌｐｈａ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ ｎｅｏｎａｔａｌ ｒａｔ
ｃａｒｄｉａｃ ｍｙｏｃｙｔｅｓ［Ｊ］．Ｃｉｒｃ Ｒｅｓ，２０００，８７：５９６—６０２．
［６３
黄彬，杜少辉，陈东风，等．牛珀至宝微丸对内毒素休克大鼠心
脏诱导性一氧化氮合酶表达的影响［Ｊ］．中国中西医结合急救
杂志，２００４，１１（２）：９５—９８．
也是感染性休克出现心脏抑制的重要致病分子＿５］。
临床研究表明，慢性心衰患者血清内ＬＰＳ水平显著
增加，ＬＰＳ诱导心肌细胞ｉＮＯＳ表达增加、ｃＮＯＳ表
达降低，ｉＮＯＳ诱导产生大量的ＮＯ，ＮＯ经过一系
列的信号转导，导致胞质内Ｃａ 浓度降低，从而导
致心肌收缩减弱，心肌功能抑制 ］。
吲达帕胺具有清除氧自由基，抗血小板聚集及
抗动脉粥样硬化等作用［７］，但其机制目前尚未明确。
Ａ．Ｔａｍｕｒａ等＿８ 发现吲达帕胺具有自由基清除活
性，它们能抑制由次黄嘌呤一黄嘌呤氧化酶产生的超
氧化合物引起的亚麻酸过氧化反应，能降低烟酰胺一
腺嘌呤二核苷磷酸盐引起大鼠肝线粒体的脂过氧化
反应，能减轻自由基对红细胞膜的氧化损伤，其中，
（上接第３页）
［５］ Ｆｅｆｅｒｍａｎ Ｔ，Ｍａｉｔｉ Ｐ Ｋ，Ｂｅｒｒｉｈ Ａｋｎｉｎ Ｓ，ｅｔ ａ１．０ｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ
ＩＦＮ—ｉｎｄｕｃｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ １ ０ ａｎｄ ｉｔｓ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ＣＸＣＲ３ ｉｎ ｍｙａｓｔｈｅｎｉａ
［７３
Ｍｏｕｈｉｅｄｄｉｎｅ Ｓ，Ｔｒｅｓａｌｌｅｔ Ｎ，Ｂｏｕｃｈｅｒ Ｆ，ｅｔ ａ１．Ｕｌｔｒａｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ
ｂａｓｉｓ ｏｆ ｔｈｅ ｆｒｅｅ－ｒａｄｉｃａｌ ｓｃａｖｅｎｇｉｎｇ ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ｉｎｄａｐａｍｉｄｅ ｉｎ ｅｘ—
ｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ ｍｙｏｃａｒｄｉａｌ ｉｓｃｈｅｍｉａ ａｎｄ ｒｅｐｅｒｆｕｓｉｏｎ［Ｊ］．Ｊ Ｃａｒｄｉｏ—
ｖａｓｅ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ，１９９３，２２（Ｓｕｐｐｌ ６）：Ｓ４７一Ｓ５２．
［８］
Ｔａｍｕｒａ Ａ，Ｓａｔｏ Ｔ，Ｆｕｊｉｉ Ｔ．Ａｎｔｉｏｘｉｄａｎｔ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ｉｎｄａｐａｍｉｄｅ
ａｎｄ ｉｔｓ ｍｅｔａｂｏｌｉｔｅ［Ｊ］．Ｃｈｅｍ Ｐｈａｒｍ Ｂｕｌｌ（Ｔｏｋｙｏ），１９９０，３８
（１）：２５５－２５７．
［９］
Ｎｅｇｌｉａ Ｄ，Ｆｏｍｍｅｉ Ｅ，Ｖａｒｅｌａ Ｃａｒｖｅｒ Ａ，ｅｔ ａ１．Ｐｅｒｉｎｄｏｐｒｉｌ ａｎｄ ｉｎ—
ｄａｐａｍｉｄｅ ｒｅｖｅｒｓｅ ｃｏｒｏｎａｒｙ ｍｉｃｒｏｖａｓｃｕｌａｒ ｒｅｍｏｄｅｌｌｉｎｇ ａｎｄ ｉｍ—
ｐｒｏｖｅ ｆｌｏｗ ｉｎ ａｒｔｅｒｉａｌ ｈｙｐｅｒｔｅｎｓｉ０ｎ［Ｊ］．Ｊ Ｈｙｐｅｒｔｅｎｓ，２０１１，２９
（２）：３６４—３７２．
（责任编辑：况荣华）
ｉ９９２，５２：２３６—２４３．
ｒａ Ｊ，Ｃｈｕｎｇ Ｃ Ｓ，Ｐｅｒｌ Ｍ，ｅｔ ａ１．Ｒｏｌｅ ｏｆ ａｌｖｅｏｌａｒ ｍａｃ—
［８３
Ｌｏｍａｓ Ｎｅｉ
ｒｏｐｈａｇｅ ａｎｄ ｍｉｇｒａｔｉｎｇ ｎｅｕｔｒｏｐｈｉｌｓ ｉｎ ｈｅｍｏｒｒｈａｇｅ—。ｉｎｄｕｃｅｄ ｐｒｉｍ—。
ｇｒａｖｉｓ［Ｊ］．Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ，２００５，１７４（９）：５３２４—５３３１．
［６３ Ｌｉｖａｋ Ｋ Ｊ，Ｓｅｈｍｉｔｔｇｅｎ Ｔ Ｄ．Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｒｅｌａｔｉｖｅ ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ
ｄａｔａ ｕｓｉｎｇ ｒｅａｌ—ｔｉｍｅ ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ＰＣＲ ａｎｄ ｔｈｅ ２（一Ｄｅｈａ Ｄｅｈａ Ｃ
ｉｎｇ ｆｏｒ ＡＬｌ ｓｕｂｓｅｑｕｅｎｔ ｔｏ ｓｅｐｔｉｃ ｃｈａｌｌｅｎｇｅ［Ｊ］．Ａｍ Ｊ Ｐｈｙｓｉｏｌ
Ｌｕｎｇ Ｃｅｌｌ Ｍｏｌ Ｐｈｙｓｉｏｌ，２００６，２９０：５ １－５８．
ｎｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ ｈｕ—
［９］
Ｇｕｈａ Ｍ，Ｍａｃｋｍａｎ Ｎ．ＬＰＳ ｉ
（Ｔ））Ｍｅｔｈｏｄ［Ｊ］．Ｍｅｔｈｏｄｓ，２００１，２５（４）：４０２—４０８．
ｒ７１ Ｇｏｙａ Ｔ，Ａｂｅ Ｍ，Ｓｈｉｍｕｒａ Ｈ，ｅｔ ａ１．Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ ｏｆ ａｌｖｅｏｌａｒ
ｍａｎ ｍｏｎｏｃｙｔｅｓ［Ｊ］．Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌ，２００１，１３（２）：８５—９４．
ｍａｃｒｏｐｈａｇｅｓ ｉｎ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ ｓｅｐｔｉｃ ｌｕｎｇ［Ｊ］．Ｊ Ｌｅｕｋｏｃ Ｂｉｏｌ，
（责任编辑：刘大仁）
2024年10月7日发(作者：才晴虹)
实用临床医学２０１１年第ｌ２卷第４期ＰｒａｃｔｉｃａｌＣｌｉｎｉｃａｌ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，２０１１，Ｖｏｌ １２，Ｎｏ ４
实时荧光定量ＰＣＲ检测脂多糖
对ＮＲ８３８３细胞ＴＮＦ一．）【ｍＲＮＡ的影响
熊东林 ，丁成志。，曾振国。，钱克俭
（１．深圳市第六人民医院疼痛科，广东深圳５１８０５２；
２．南昌大学第一附属医院重症医学科，南昌３３０００６）
摘要：目的 实时荧光定量ＰＣＲ检测脂多糖（ＬＰＳ）诱导ＮＲ８３８３肺泡巨噬细胞前后ＴＮＦ－ａ ｍＲＮＡ的表达情况。
方法体外培养的肺泡巨噬细胞系ＮＲ８３８３分成ＬＰＳ刺激组和ＰＢＳ（磷酸盐缓冲液）对照组，ＬＰＳ终浓度为
１／ｚｇ・ｍＬ＿。，共培养２ ｈ后，ＴＲＩｚｏｌ法提取细胞总ＲＮＡ，ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｉ实时荧光定量ＰＣＲ检测细胞ＴＮＦ－ａ ｍＲ－
ＮＡ的表达，结合管家基因 Ａｃｔｉｎ进行相对定量分析。结果荧光定量ＰＣＲ未发现非特异性扩增。与对照组比
较，ＬＰＳ刺激组细胞ＴＮＦ－￣ｍＲＮＡ上调了１２４，１倍，差异有统计学意义（Ｐ＜Ｏ．０１）。结论 用于本研究ＴＮＦ＿ａ
ｍＲＮＡ的荧光定量ＰＣＲ检测体系特异性好，结果可靠，为进一步实验奠定了基础。
关键词：实时荧光定量ＰＣＲ；ＮＲ８３８３细胞系；肿瘤坏死因子一ａ；脂多糖
中图分类号：Ｒ４４６．６１ 文献标志码：Ａ 文章编号：１００９－－８１９４（２０１１）０４－－０００１－－０３
Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ＴＮＦ－ａ ｍＲＮＡ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ
ｉｎ Ｌｉｐ０ｐ０ｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ－ｓｔｉｍｕｌａｔｅｄ ＮＲ８３８３ Ｃｅｌｌｓ Ｕｓｉｎｇ
Ｒｅａｌ－Ｔｉｍｅ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ＰＣＲ
ＸＩＯＮＧ Ｄｏｎｇ－ｌｉｎ ，ＤＩＮＧ Ｃｈｅｎｇ－ｚｈｉ。，ＺＥＮＧ Ｚｈｅｎ—ｇｕｏ。，ＱＩＡＮ Ｋｅ－ｊ ｉａｎ。
（１．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｐａｉｎ，Ｓｈｅｎｚｈｅｎ Ｓｉｘｔｈ Ｐｅｏｐｌｅ’Ｓ Ｈｏｓｐｉｔａｌ，Ｓｈｅｎｚｈｅｎ ５ １ ８０５２，Ｃｈｉｎａ；
２．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｃｒｉｔｉｃａｌ Ｃａｒｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，ｔｈｅ Ｆｉｒｓｔ Ａｆｆｉｌｉａｔｅｄ Ｈｏｓｐｉｔａｌ ｏｆ
Ｎａｎｃｈａｎｇ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｎａｎｃｈａｎｇ ３３０００６，Ｃｈｉｎａ）
ＡＢＳＴＲＡＣＴ：Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ Ｔｏ ｄｅｔｅｃｔ ｔｈｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ＴＮＦ—ａ ｍＲＮＡ ｉｎ ｌｉｐｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ（ＬＰＳ）一
ｉｎｄｕｃｅｄ ＮＲ８３８３ ａｌｖｅｏｌａｒ ｍａｃｒｏｐｈａｇｅｓ ｕｓｉｎｇ ｒｅａｌ—ｔｉｍｅ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ＰＣＲ．Ｍｅｔｈｏｄｓ
Ａｌｖｅｏｌａｒ ｍａｃｒｏｐｈａｇｅｓ ｗｅｒｅ ｔｒｅａｔｅｄ ｗｉｔｈ １ ｇ・ｍＬ＿。ＬＰＳ（ＬＰＳ ｇｒｏｕｐ）ｏｒ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ—ｂｕｆｆｅｒｅｄ ｓａ—
ｌｉｎｅ（ｃｏｎｔｒｏｌ ｇｒｏｕｐ）．Ｔｏｔａｌ ＲＮＡ ｗａｓ ｅｘｔｒａｃｔｅｄ ｗｉｔｈ ＴＲＩｚｏｌ ｒｅａｇｅｎｔ ａｎｄ ＴＮＦ—ａ ｍＲＮＡ ｅｘｐｒｅｓ—
ｓｉｏｎ ｗａｓ ｅｘａｍｉｎｅｄ ｂｙ ｒｅａｌ—ｔｉｍｅ ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ＰＣＲ ｕｓｉｎｇ ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ工．Ｒｅｓｕｌｔｓ Ｎｏｎｓｐｅｃｉｉｆｃ ａｍ—
ｐｌｉｉｆｃａｔｉｏｎ ｗａｓ ｎｏｔ ｄｅｔｅｃｔｅｄ．Ｃｏｍｐａｒｅｄ ｗｉｔｈ ｃｏｎｔｒｏｌ ｇｒｏｕｐ，ｔｈｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ＴＮＦ—ｄ ｍＲＮＡ ｉｎ
ＬＰＳ—ｓｔｉｍｕｌａｔｅｄ ｇｒｏｕｐ ｉｎｃｒｅａｓｅｄ １２４．１ ｔｉｍｅｓ（Ｐ￣０．０１）．Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ Ｒｅａｌ—ｔｉｍｅ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｑｕａｎ—
ｔｉｔａｔｉｖｅ ＰＣＲ ｉｓ ａ ｈｉｇｈｌｙ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ａｎｄ ｒｅｌｉａｂｌｅ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｔｈｅ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ＴＮＦ—ｏ【ｍＲＮＡ．
ＫＥＹ ＷＯＲＤＳ：ｒｅａｌ—ｔｉｍｅ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ＰＣＲ；ＮＲ８３８３ ｃｅｌｌ ｌｉｎｅ；ＴＮＦ—Ｏｔ；
ｌｉｐｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ
肺泡巨噬细胞（ａｌｖｅｏｌａｒ ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ，ＡＭ）是肺
伤 。ＮＲ８３８３细胞系是正常大鼠肺泡巨噬细胞在
泡腔内常驻吞噬细胞，是肺组织天然免疫系统的第
一
特定条件下培养数代后形成的细胞系，具有正常肺
道防线Ⅲ。过度激活后的肺泡巨噬细胞可以分泌
泡巨噬细胞的特性，常用于体外肺泡巨噬细胞相关
功能研究 引。实时荧光定量ＰＣＲ（Ｒｅａｌ—Ｔｉｍｅ Ｆｌｕｏ一 大量的炎症介质，造成肺的过度炎症反应，形成肺损
收稿日期：２０１１—０３—１１
基金项目：江西省自然科学基金（２０１０ＧＺＹ０３３９）
作者简介：熊东林（１９６５一），男，学士，副主任医师，主要从事疼痛医学的研究。
・
２ ・ 实用临床医学２０１１年第１２卷第４期ＰｒａｃｔｉｃａｌＣｌｉｎｉｃａｌ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，２０１１，Ｖｏｌ １２，Ｎｏ ４
ｒｅｓｃｅｎｃｅ Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ＰＣＲ，Ｒｅａｌ—Ｔｉｍｅ ｑＰＣＲ）技术
是近些年来发展起来的一种可以用于定量的核酸检
测技术。由于其众多的优点，现已广泛运用于生命
科学领域。本实验选取ＮＲ８３８３肺泡巨噬细胞作为
５ ｍｌｎ。
１．２．５ Ｒｅａｌ—Ｔｉｍｅ ＰＣＲ
ＰＣＲ引物序列参照文献［４—５１，ＴＮＦ—ａ和内参
￣－Ａｃｔｉｎ扩增片段长度分别为１７２ ｂｐ和１０１ ｂｐ。采
用北京全式金生物有限公司的荧光定量检测试剂 研究对象，用ＬＰＳ刺激细胞，采用ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｉ法
Ｒｅａｌ—Ｔｉｍｅ ｑＰＣＲ检测ＴＮＦ—ａ ｍＲＮＡ的表达情况，
为下一步的实验奠定基础。
１材料与方法
１．１材料
大鼠肺泡巨噬细胞系ＮＲ８３８３（购于中国科学
院细胞库）；Ｈａｍ Ｓ Ｆ－１２Ｋ培养基（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ，
美国）；胎牛血清（ＨｙＣｌｏｎｅ，美国）；ＬＰＳ（Ｅ．ｃｏｌｉ
０ｌ１ １：Ｂ４，Ｓｉｇｍａ—Ａｌｄｒｉｃｈ，美国）；ＴＲＩｚｏｌ？Ｒｅａｇｅｎｔ
（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，美国）；ＴｒａｎｓＳｃｒｉｐｔＴＭ Ｇｒｅｅｎ Ｔｗｏ—
Ｓｔｅｐ ｑＲＴ—ＰＣＲ ＳｕｐｅｒＭｉｘ（北京全式金生物有限公
司）；ＤＮＡ Ｍａｒｋｅｒ Ｉ（北京天根生化科技有限公司）；
琼脂糖（西班牙ＢＩＯＷＥＳＴ国内分装）。ＴＮＦ—ａ和
Ｇ—Ａｃｔｉｎ的引物由上海生工生物工程有限公司合成，
氯仿、异丙醇及无水乙醇等均为国产分析纯。
１．２ 方法
１．２．１细胞培养
ＮＲ８３８３细胞培养于含１５ 的胎牛血清、
ｌ＿５ ｇ・Ｌ 碳酸氢钠、２ｒａＭ的Ｌ一谷氨酰胺的
Ｈａｍ＇ｓ Ｆ一１２Ｋ培养基中，置于３７℃、５ 二氧化碳培
养箱中。２～３ ｄ更换培养液，３～４ ｄ传代一次。
１．２．２细胞处理及分组
将ＮＲ８３８３细胞按１×１Ｏ 个・ｍＬ 接种于六
孑Ｌ板，每孔２ ｍＬ。实验分为２组：１）ＬＰＳ刺激组：培
养基中加入ＬＰＳ（终浓度１ ｇ・ｍＬ ）；２）ＰＢＳ对
照组：于培养基中加入与ＬＰＳ溶液等体积的ＰＢＳ。
共培养２ ｈ后离心收集细胞团块，用于提取总
ＲＮＡ。
１．２．３ ＲＮＡ抽提和质量检测
根据Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ公司ＴＲＩｚｏｌ试剂说明书提取
细胞团块中的总ＲＮＡ。所得总ＲＮＡ通过琼脂糖
凝胶电泳和紫外分光光度计来检测ＲＮＡ纯度及浓
度。
１．２．４ 反转录
采用北京全式金生物有限公司反转录试剂盒进
行反转录，所有操作均在冰上完成。反转录反应体
系：１ ｇｇ的总ＲＮＡ、１ Ｌ的Ｏｌｉｇｏ（ｄＴ）１８
（Ｏ．５ ｇ・ Ｌ＿｜１）、１０ Ｌ的２×ＴＳ Ｒｅａｃｔｉｏｎ Ｍｉｘ、
１肚Ｌ的ＴｒａｎｓＳｃｒｉｐｔＴＭ ＲＴ／ＲＩ Ｅｎｚｙｍｅ Ｍｉｘ，补无
核酶水到２０ Ｌ。反应条件：４２℃３０ ｍｉｎ，８５℃
盒。扩增反应体系：１ Ｌ的反转录产物、各０．５ Ｌ
上、下游引物（１０ Ｍ）、１２．５ Ｌ的２×ＴｒａｎｓＳ－
ｃｒｉｐｔＴＭ Ｇｒｅｅｎ ｑＰＣＲ ＳｕｐｅｒＭｉｘ、０．５ Ｌ的Ｐａｓｓｉｖｅ
Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ Ｄｙｅ，补水到２５ Ｌ。在ＡＢＩ７３Ｏ０定量
ＰＣＲ仪上扩增和检测，反应条件：９５℃３０ Ｓ，４０个
扩增循环（９５。Ｃ ５ Ｓ，５７℃２０ Ｓ，７２℃２７ ｓ）。４０个
循环后行溶解曲线步骤，最终扩增产物进行琼脂糖
凝胶电泳，观察有无非特异性扩增及扩增片段长度。
ＴＮＦ—ａ的相对表达量采用２ △ｃ 。 计算，Ｃｔ值为目
标扩增产物达到设定阈值所经历的循环数。
１．２．６统计学方法
采用ＳＰＳＳ１３．０统计软件进行分析，两样本比
较采用ｔ检验，Ｐ＜０．０５表示２组样本差异有统计
学意义。
２ 结果
２．１总ＲＮＡ琼脂糖凝胶电泳
在电泳图上可以观察到三条条带，从上到下分
别为２８ｓＲＮＡ、１８ｓＲＮＡ和５ｓＲＮＡ的条带，其中
２８ｓＲＮＡ的亮度大概是１８ｓＲＮＡ亮度的两倍，各条
带较完整无明显拖尾，点样孑Ｌ干净，说明所提取的总
ＲＮＡ质量较好。见图１。
Ｐ组 Ｌ组
Ｄ
２８ Ｓ
１８ ｓ
５ Ｓ
Ｐ：ＰＢＳ组，Ｌ：ＬＰＳ组，Ｄ：点样孔。
图１总ＲＮＡ电泳图
２．２扩增产物琼脂糖凝胶电泳和溶解曲线分析
电泳图结果：ＴＮＦ一（Ｉｔ和１３－Ａｃｔｉｎ扩增片段长度
分别应为１７２ ｂｐ和１０１ ｂｐ。根据Ｍａｒｋｅｒ指示，扩
增条带为目的条带，电泳图中无杂带，这些说明
ＰＣＲ扩增为特异性扩增。见图２。
实用临床医学２０１１年第ｌ２卷第４期ＰｒａｃｔｉｃａｌＣｌｉｎｉｃａｌ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，２０１１，Ｖｏｌ １２，Ｎｏ ４
・ ３ 。
如图３所示：ＴＮＦ＿ａ和［３－Ａｃｔｉｎ溶解峰都为单
对定量。根据化学发光原理，Ｒｅａｌ—Ｔｉｍｅ ｑＰＣＲ大致
峰，且为特征峰，说明ＰＣＲ扩增为特异性扩增。
Ｌ组 Ｐ组 Ｍ组
● ３００ ｂｐ
Ｔ＿＿－
．．１。‘２Ｏ０ ｂｐ
Ａ－●
Ｉ．－．一１００ ｂｐ
Ｌ：ＬＰＳ组，Ｐ：ＰＢＳ组，Ｍ：Ｍａｒｋｅｒ。
Ａ：１３－Ａｅｔｉｎ（１０１ ｂｐ）；Ｔ：ＴＮＦ—ａ（１７２ ｂｐ）
图２扩增产物电泳图
Ａ Ｊ
ｔ＝
一
Ａ：Ｉ３－Ａｃｔｉｎ的扩增曲线；Ｔ：ＴＮＦ ａ的扩增曲线
图３溶解曲线图
２．３ ＬＰＳ对ＮＲ８３８３细胞ＴＮＦ－ａ ｍＲＮＡ的影响
与对照组比较，ＬＰＳ（１ ・ｍＬ ）刺激ＮＲ８３８３细
胞２ ｈ后ＴＮＦ－ａ上调了１２４．１倍（图４）。
１４０
１２０
饕ｌｏ０
８０
藿 ６０
星 ４０
２。
Ｏ
ＰＢＳ组 ＬＰＳ组
＊Ｐ＜Ｏ．Ｏｌ与对照组比较（ｎ一３）。
图４ ＴＮＦ－￣ｍＲＮＡ表达改变
３讨论
Ｒｅａｌ—Ｔｉｍｅ ｑＰＣＲ是指在反应体系中加入荧光
基团，在扩增过程中通过荧光信号的累积来实时监
测整个ＰＣＲ的过程，可以根据需要进行相对或者绝
可分为两大类：探针类和非探针类。本实验采用的
ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｉ法属于非探针类Ｒｅａｌ—Ｔｉｍｅ ｑＰＣＲ。
ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｉ是一种荧光染料，能够非特异性结合
双链ＤＮＡ。结合后，ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｉ能够发射荧光
信号，而未结合的染料发出的荧光极其微弱，这样从
而保证荧光信号的增加与ＰＣＲ产物的增加完全同
步。由于ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｉ使用方便、简单，且价格相
对较低，因此是一些实验室的首选。但由于ＳＹＢＲ
Ｇｒｅｅｎ Ｉ能够和所有双链ＤＮＡ相结合，因此如果有
引物二聚体形成、非特异性扩增等都将影响结果。
但我们可以通过溶解曲线来分析判断ＰＣＲ反应的
特异性。在本试验中ＴＮＦ—ａ和ｆ］－Ａｃｔｉｎ溶解峰都为
单峰，且为特征峰，说明本实验的ＰＣＲ扩增为特异
性扩增。
肺泡巨噬细胞主要存在于肺泡腔和小气道内，
是支气管肺泡灌洗液中数量最多的细胞，可占８０
以上。正常情况下，肺泡巨噬细胞的功能主要是摄
取和吞噬进入肺泡腔的颗粒或细菌，保持肺泡腔的
清洁和防御作用。但在病理条件下，肺泡巨噬细胞
被过度激活，将会导致肺损伤Ｌ７ ］。ＬＰＳ为革兰氏阴
性细菌外壁层中的主要成分，它可以通过肺泡巨噬
细胞表面的Ｔｏｌｌ样受体４（Ｔｏｌｌ—ｌｉｋｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ４，
ＴＬＲ４）来活化核转录因子ＫａｐｐａＢ（ｎｕｃｌｅａｒ ｆａｃｔｏｒ—
ＫａｐｐａＢ，ＮＦ—ＪｃＢ）从而诱导大量的炎症介质和细胞
因子的表达 ］，这其中就包括ＴＮＦ—ａ。ＴＮＦ—ｑ是内
毒素休克或急性肺损伤早期产生的最重要的细胞因
子之一，对炎症或急性肺损伤的发展起着重要的作
用。在本实验中，ＬＰＳ刺激ＮＲ８３８３肺泡巨噬细胞
后，采用ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｉ法Ｒｅａｌ—Ｔｉｍｅ ｑＰＣＲ技术发
现ＴＮＦ—ａ ｍＲＮＡ水平明显增高，这些为下一步的
实验奠定基础。
参考文献：
Ｅｌｉ Ｓｈｅｒｍａｎ Ｍ Ｐ，Ｇａｎｚ Ｔ．Ｈｏｓｔ ｄｅｆｅｎｓｅ ｉｎ ｐｕｌｍｏｎａｒｙ ａｌｖｅｏｌｉ［Ｊ］．
Ａｎｎｕ Ｒｅｖ Ｐｈｙｓｉｏｌ，１９９２，５４：３３１—３５０．
［２］Ｃｈｏｐｒａ Ｍ，Ｒｅｕｂｅｎ Ｊ Ｓ，Ｓｈａｒｍａ Ａ Ｃ．Ａｃｕｔｅ ｌｕｎｇ ｉ￣ｕｒｙ：ａｐｏｐｔｏ—
ｓｉｓ ａｎｄ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ［Ｊ］．Ｅｘｐ Ｂｉｏｌ Ｍｅｄ（Ｍａｙｗｏｏｄ），
２００９，２３４（４）：３６１－３７１．
［３］Ｈｅｌｍｋｅ Ｒ Ｊ，Ｇｅｒｍａｎ Ｖ Ｆ，Ｍａｎｇｏｓ Ｊ Ａ．Ａ ｃｏｎｔｉｎｕｏｕｓ ａｌｖｅｏｌａｒ
ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ ｃｅｌｌ ｌｉｎｅ：ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎｓ ｗｉｔｈ ｆｒｅｓｈｌｙ ｄｅｒｉｖｅｄ ａｌｖｅｏｌａｒ
ｍａｃｒｏｐｈａｇｅｓ［Ｊ］．Ｉｎ Ｖｉｔｒｏ Ｃｅｌｌ Ｄｅｖ Ｂｉｏｌ，１９８９，２５（１）：４４—４８．
［４］Ｐｅｎｇ Ｊ Ｈ，Ｈｕ Ｙ Ｙ，Ｃｈｅｎｇ Ｙ，ｅｔ ａ１．Ｅｆｆｅｃｔ ｏｆｉｉａｎｇｐｉ ｈｕｏｘｕｅ ｄｅ—
ｃｏｃｔｉｏｎ ｏｎ ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ ｃｙｔｏｋｉｎｅ ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ ｐａｔｈｗａｙ ｉｎ ｒａｔ ｌｉｖｅｒ
ｗｉｔｈ ｌｉｐｏｐｏ１ｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ ｃｈａｌｌｅｎｇｅ［Ｊ］．Ｗｏｒｌｄ Ｊ Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ，
２００８，１４（１２）：１８５１－１８５７．
（下转第６页）
实用临床医学２０１１年第ｌ２卷第４期Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，２０１１，Ｖｏｌ １２，Ｎｏ ４
表２ ３组心肌细胞存活率比较 士ｓ
代谢产物５一羟基吲达帕胺的作用比原药作用强。
最新的研究也证明该药可逆转冠脉内壁的重构过
程，提高微血管的功能，改善冠脉血流，降低动脉血
压＿９］。为此，笔者在乳鼠ＬＰＳ损伤模型上对吲达帕
胺的心肌保护作用进行了一系列研究。从本研究的
＊Ｐ＜Ｏ．０１与对照组相比；△Ｐ＜Ｏ．Ｏ１与ＬＰＳ组相比。
结果可见，心肌细胞在吲达帕胺处理后，心肌细胞损
２．４ ３组心肌细胞悬液中ＬＤＨ活性比较
与对照组相比，ＬＰＳ组细胞悬液中ＬＤＨ活性
增加（Ｐ＜０．０１）；吲达帕胺＋ＬＰＳ组细胞悬液中
ＬＤＨ活性较ＬＰＳ组明显减低（Ｐ＜０．０１），与正常对
照组相比无显著性差异（Ｐ＞Ｏ．０５），见表３。
伤减轻，ＬＤＨ活性降低，证实其对ＬＰＳ损伤的心肌
具有保护作用。猜测其机制可能与具有清除氧自由
基、减少细胞钙离子内流等作用有关。
参考文献：
Ａ，Ｔｈｏｔａ Ｖ，Ｄｅｅ Ｌ，ｅｔ ａ１．Ｔｕｍｏｒ ｎｅｃｒｏｓｉｓ ｆａｃｔｏｒ ａｎｄ ｉｎ—
［１］
Ｋｕｍａｒ
ｔｅｒｌｅｕｋｉｎ ｌ ｂｅｔａ ａｒｅ ｒｅｓｐｏｎｓｉｂｌｅ ｆｏｒ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｍｙｏｃａｒｄｉａｌ ｃｅｌｌ ｄｅ—
表３ ３组心肌细胞ＬＤＨ活性比较
士
ｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎｄｕｃｅｄ ｂｙ ｈｕｍａｎ ｓｅｐｔｉｃ ｓｈｏｃｋ ｓｅｒｕｍ［Ｊ］．Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ，
ｌ９９６，１８３：９４９—９５８．
［２３ 韩永芳，壬钟林．吲达帕胺的降压机制及心血管保护作用［Ｊ］．
天津药学，１９９８，１０（４）：１０６—１１１．
［３］
Ｓｐｅｃｔｏｒ Ｄ Ｉ ，Ｇｏｌｄａｍ Ｒ Ｄ。Ｌｅｉｎｗａｎｄ Ｉ Ａ．Ｃｕｌｔｕｒｅ ａｎｄ Ｂｉｏ—
ｃｈｅｍｉｃａｌ Ａｎｎｌｙｓｉｓ ｏｆ Ｃｅｌｌ［Ｍ］．ＮＹ：Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏ—
＊Ｐ＜０．０１与对照组相比；ＡＰ＜０．０１与ＬＰＳ组相比。
ｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，１９９８：１１１－１１９．
ｅｋｓｅｅｖ Ａ Ｅ，Ａｌｅｋｓａｎｄｒｏｖａ Ｉ Ａ，ｅｔ ａ１．Ｕｓｅ ｏｆ ｔｈｅ
［４］
Ｇｏｍｅｚ Ｌ Ａ，Ａｌ
ＭＴＴ ａｓｓａｙ ｉｎ ａｄｕｌｔ ｖｅｎｔｒｉｃｕｌａｒ ｃａｒｄｉｏｍｙｏｃｙｔｅｓ ｔｏ ａｓｓｅｓｓ ｖｉａ—
ｂｉｌｉｔｙ：ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ａｄｅｎｏｓｉｎｅ ａｎｄ ｐｏｔａｓｓｉｕｍ ｏｎ ｃｅｌｌｕｌａｒ ｓｕｒｖｉｖａｌ
３讨论
过去有观点认为，心脏几乎不参与体内炎症反
应，甚至与炎症反应毫无关系。然而，近年来研究却
表明，心脏也是一个生成炎性介质的场所，脂多糖是
诱导心肌细胞表达炎症因子的一个有效刺激因素，
［５３
［Ｊ］．Ｊ Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｃａｒｄｉｏｌ，１９９７，２９（４）：１２５５—１２６６．
Ｔａｋａｎｏ Ｈ，Ｎａｇａｉ Ｔ，Ａｓａｋａｗａ Ｍ，ｅｔ ａｔ．Ｐｅｒｏｘｉｓｏｍｅ ｐｒｏｌｉｆｅｒａ—
ｔｏｒ－ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ａｃｔｉｖａｔｏｒｓ ｉｎｈｉｂｉｔ ｌｉｐｏｐｏｌｙｓａｅｃｈａｒｉｄｅ－ｉｎ—
ｄｕｃｅｄ ｔｕｍｏｒ ｎｅｃｒｏｓｉｓ ｆａｃｔｏｒ—ａｌｐｈａ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ ｎｅｏｎａｔａｌ ｒａｔ
ｃａｒｄｉａｃ ｍｙｏｃｙｔｅｓ［Ｊ］．Ｃｉｒｃ Ｒｅｓ，２０００，８７：５９６—６０２．
［６３
黄彬，杜少辉，陈东风，等．牛珀至宝微丸对内毒素休克大鼠心
脏诱导性一氧化氮合酶表达的影响［Ｊ］．中国中西医结合急救
杂志，２００４，１１（２）：９５—９８．
也是感染性休克出现心脏抑制的重要致病分子＿５］。
临床研究表明，慢性心衰患者血清内ＬＰＳ水平显著
增加，ＬＰＳ诱导心肌细胞ｉＮＯＳ表达增加、ｃＮＯＳ表
达降低，ｉＮＯＳ诱导产生大量的ＮＯ，ＮＯ经过一系
列的信号转导，导致胞质内Ｃａ 浓度降低，从而导
致心肌收缩减弱，心肌功能抑制 ］。
吲达帕胺具有清除氧自由基，抗血小板聚集及
抗动脉粥样硬化等作用［７］，但其机制目前尚未明确。
Ａ．Ｔａｍｕｒａ等＿８ 发现吲达帕胺具有自由基清除活
性，它们能抑制由次黄嘌呤一黄嘌呤氧化酶产生的超
氧化合物引起的亚麻酸过氧化反应，能降低烟酰胺一
腺嘌呤二核苷磷酸盐引起大鼠肝线粒体的脂过氧化
反应，能减轻自由基对红细胞膜的氧化损伤，其中，
（上接第３页）
［５］ Ｆｅｆｅｒｍａｎ Ｔ，Ｍａｉｔｉ Ｐ Ｋ，Ｂｅｒｒｉｈ Ａｋｎｉｎ Ｓ，ｅｔ ａ１．０ｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ
ＩＦＮ—ｉｎｄｕｃｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ １ ０ ａｎｄ ｉｔｓ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ＣＸＣＲ３ ｉｎ ｍｙａｓｔｈｅｎｉａ
［７３
Ｍｏｕｈｉｅｄｄｉｎｅ Ｓ，Ｔｒｅｓａｌｌｅｔ Ｎ，Ｂｏｕｃｈｅｒ Ｆ，ｅｔ ａ１．Ｕｌｔｒａｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ
ｂａｓｉｓ ｏｆ ｔｈｅ ｆｒｅｅ－ｒａｄｉｃａｌ ｓｃａｖｅｎｇｉｎｇ ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ｉｎｄａｐａｍｉｄｅ ｉｎ ｅｘ—
ｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ ｍｙｏｃａｒｄｉａｌ ｉｓｃｈｅｍｉａ ａｎｄ ｒｅｐｅｒｆｕｓｉｏｎ［Ｊ］．Ｊ Ｃａｒｄｉｏ—
ｖａｓｅ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ，１９９３，２２（Ｓｕｐｐｌ ６）：Ｓ４７一Ｓ５２．
［８］
Ｔａｍｕｒａ Ａ，Ｓａｔｏ Ｔ，Ｆｕｊｉｉ Ｔ．Ａｎｔｉｏｘｉｄａｎｔ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ｉｎｄａｐａｍｉｄｅ
ａｎｄ ｉｔｓ ｍｅｔａｂｏｌｉｔｅ［Ｊ］．Ｃｈｅｍ Ｐｈａｒｍ Ｂｕｌｌ（Ｔｏｋｙｏ），１９９０，３８
（１）：２５５－２５７．
［９］
Ｎｅｇｌｉａ Ｄ，Ｆｏｍｍｅｉ Ｅ，Ｖａｒｅｌａ Ｃａｒｖｅｒ Ａ，ｅｔ ａ１．Ｐｅｒｉｎｄｏｐｒｉｌ ａｎｄ ｉｎ—
ｄａｐａｍｉｄｅ ｒｅｖｅｒｓｅ ｃｏｒｏｎａｒｙ ｍｉｃｒｏｖａｓｃｕｌａｒ ｒｅｍｏｄｅｌｌｉｎｇ ａｎｄ ｉｍ—
ｐｒｏｖｅ ｆｌｏｗ ｉｎ ａｒｔｅｒｉａｌ ｈｙｐｅｒｔｅｎｓｉ０ｎ［Ｊ］．Ｊ Ｈｙｐｅｒｔｅｎｓ，２０１１，２９
（２）：３６４—３７２．
（责任编辑：况荣华）
ｉ９９２，５２：２３６—２４３．
ｒａ Ｊ，Ｃｈｕｎｇ Ｃ Ｓ，Ｐｅｒｌ Ｍ，ｅｔ ａ１．Ｒｏｌｅ ｏｆ ａｌｖｅｏｌａｒ ｍａｃ—
［８３
Ｌｏｍａｓ Ｎｅｉ
ｒｏｐｈａｇｅ ａｎｄ ｍｉｇｒａｔｉｎｇ ｎｅｕｔｒｏｐｈｉｌｓ ｉｎ ｈｅｍｏｒｒｈａｇｅ—。ｉｎｄｕｃｅｄ ｐｒｉｍ—。
ｇｒａｖｉｓ［Ｊ］．Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ，２００５，１７４（９）：５３２４—５３３１．
［６３ Ｌｉｖａｋ Ｋ Ｊ，Ｓｅｈｍｉｔｔｇｅｎ Ｔ Ｄ．Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｒｅｌａｔｉｖｅ ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ
ｄａｔａ ｕｓｉｎｇ ｒｅａｌ—ｔｉｍｅ ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ＰＣＲ ａｎｄ ｔｈｅ ２（一Ｄｅｈａ Ｄｅｈａ Ｃ
ｉｎｇ ｆｏｒ ＡＬｌ ｓｕｂｓｅｑｕｅｎｔ ｔｏ ｓｅｐｔｉｃ ｃｈａｌｌｅｎｇｅ［Ｊ］．Ａｍ Ｊ Ｐｈｙｓｉｏｌ
Ｌｕｎｇ Ｃｅｌｌ Ｍｏｌ Ｐｈｙｓｉｏｌ，２００６，２９０：５ １－５８．
ｎｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ ｈｕ—
［９］
Ｇｕｈａ Ｍ，Ｍａｃｋｍａｎ Ｎ．ＬＰＳ ｉ
（Ｔ））Ｍｅｔｈｏｄ［Ｊ］．Ｍｅｔｈｏｄｓ，２００１，２５（４）：４０２—４０８．
ｒ７１ Ｇｏｙａ Ｔ，Ａｂｅ Ｍ，Ｓｈｉｍｕｒａ Ｈ，ｅｔ ａ１．Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ ｏｆ ａｌｖｅｏｌａｒ
ｍａｎ ｍｏｎｏｃｙｔｅｓ［Ｊ］．Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌ，２００１，１３（２）：８５—９４．
ｍａｃｒｏｐｈａｇｅｓ ｉｎ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ ｓｅｐｔｉｃ ｌｕｎｇ［Ｊ］．Ｊ Ｌｅｕｋｏｃ Ｂｉｏｌ，
（责任编辑：刘大仁）