2024年2月20日发(作者：甲乐珍)
rt-pcr试验步骤
总RNA提取：
1．用玻璃或强力匀浆器搅匀组织样品，保存于液氮内样品需要用研钵磨碎，每50~100mg 组织加1ml的裂解液RL后匀浆。组织样品容积不能超过RL容积的10%。
2．将匀浆样品剧烈震荡混匀，在15 -30°C条件下孵育5分钟以使核蛋白体完全分解。
3．每1mlRL加0.2ml氯仿。盖紧样品管盖，剧烈振荡15秒并将其在室温下孵育3分钟。4．于4℃12，000rpm 离心10分钟，样品会分成三层：下层有机相，中间层和上层无色的水相，RNA存在于水相中。水相层的容量大约为所加RL体积的60%，把水相转移到新管中，进行下一步操作。
5．加入1倍体积70％乙醇，颠倒混匀（此时可能会出现沉淀）。得到的溶液和可能沉淀一起转入吸附柱RA中（吸附柱套在收集管内）。
6．10，000rpm 离心45秒，弃掉废液，将吸附柱重新套回收集管。
7．加500μl 去蛋白液RE，12，000rpm 离心45秒，弃掉废液。
8．加500μl 去蛋白液RD，12，000rpm 离心45秒，弃掉废液。
9．加入700μl漂洗液RW，12,000 rpm 离心60秒，弃掉废液。加入500μl漂洗液RW，12,000 rpm 离心60秒，弃掉废液。将吸附柱RA放回空收集管中，12,000 rpm离心2分钟，尽量除去漂洗液。
10．取出吸附柱RA，放入一个RNase free离心管中，在吸附膜的中间部位加50-80μl RNase free water（事先在65-70℃水浴中加热效果更好），室温放置2分钟，12,000 rpm 离心1分钟。如果需要较多RNA，可将得到的溶液重新加入离心吸附柱中，离心1分钟,或者另外再加30μl RNase free water，离心1分钟，合并两次洗脱液。
如有DNA污染，请用DNAase消化。
cDNA合成：
1．在冰浴的试管中加入如下反应混合物：
模板RNA：总RNA 2μg
引物：Oligo(dT)18 (0.5μg/μl) 1μl
无RNA 酶去离子水（RNase-free ddH2O）：定容至11μl。
2．轻轻混匀后，在70℃水浴5 分钟后，冰浴。
3．将试管冰浴，再加入如下组分：
5×Reaction Buffer 4μl
RNase Inhibitor (40U/μl) 0.5μl
dNTP Mix(10mmol/L) 2μl
加水至19μl，轻轻混匀后，在37℃水浴5 分钟。
4．轻轻混匀后离心3~5 秒。加入1μl M-MLV RT（200U/μl），终体积为20μl。
5．反应混合物42℃水浴60 分钟。
6．在70℃加热10 分钟结束反应，置冰上进行后续实验或冷冻保存。
定量PCR：
定量PCR反应体系：
cDNA1μl
引物10pm/μl0.4/0.4μl
SYBR PCR mix10μl
去离子水 8.2μl
Total 20μl
反应程序：
循环数Step 温度时间检测说明
1 1 95℃
2 min off 起始模板变性
1 95℃15 sec off 模板变性
2 60-65℃15 sec off 退火
40
3 72℃30 sec on 延伸
80 1 60-66℃10 sec +0.5℃每增加0.5℃反
应十秒
试验仪器：
荧光定量仪器biorad iq5
2024年2月20日发(作者：甲乐珍)
rt-pcr试验步骤
总RNA提取：
1．用玻璃或强力匀浆器搅匀组织样品，保存于液氮内样品需要用研钵磨碎，每50~100mg 组织加1ml的裂解液RL后匀浆。组织样品容积不能超过RL容积的10%。
2．将匀浆样品剧烈震荡混匀，在15 -30°C条件下孵育5分钟以使核蛋白体完全分解。
3．每1mlRL加0.2ml氯仿。盖紧样品管盖，剧烈振荡15秒并将其在室温下孵育3分钟。4．于4℃12，000rpm 离心10分钟，样品会分成三层：下层有机相，中间层和上层无色的水相，RNA存在于水相中。水相层的容量大约为所加RL体积的60%，把水相转移到新管中，进行下一步操作。
5．加入1倍体积70％乙醇，颠倒混匀（此时可能会出现沉淀）。得到的溶液和可能沉淀一起转入吸附柱RA中（吸附柱套在收集管内）。
6．10，000rpm 离心45秒，弃掉废液，将吸附柱重新套回收集管。
7．加500μl 去蛋白液RE，12，000rpm 离心45秒，弃掉废液。
8．加500μl 去蛋白液RD，12，000rpm 离心45秒，弃掉废液。
9．加入700μl漂洗液RW，12,000 rpm 离心60秒，弃掉废液。加入500μl漂洗液RW，12,000 rpm 离心60秒，弃掉废液。将吸附柱RA放回空收集管中，12,000 rpm离心2分钟，尽量除去漂洗液。
10．取出吸附柱RA，放入一个RNase free离心管中，在吸附膜的中间部位加50-80μl RNase free water（事先在65-70℃水浴中加热效果更好），室温放置2分钟，12,000 rpm 离心1分钟。如果需要较多RNA，可将得到的溶液重新加入离心吸附柱中，离心1分钟,或者另外再加30μl RNase free water，离心1分钟，合并两次洗脱液。
如有DNA污染，请用DNAase消化。
cDNA合成：
1．在冰浴的试管中加入如下反应混合物：
模板RNA：总RNA 2μg
引物：Oligo(dT)18 (0.5μg/μl) 1μl
无RNA 酶去离子水（RNase-free ddH2O）：定容至11μl。
2．轻轻混匀后，在70℃水浴5 分钟后，冰浴。
3．将试管冰浴，再加入如下组分：
5×Reaction Buffer 4μl
RNase Inhibitor (40U/μl) 0.5μl
dNTP Mix(10mmol/L) 2μl
加水至19μl，轻轻混匀后，在37℃水浴5 分钟。
4．轻轻混匀后离心3~5 秒。加入1μl M-MLV RT（200U/μl），终体积为20μl。
5．反应混合物42℃水浴60 分钟。
6．在70℃加热10 分钟结束反应，置冰上进行后续实验或冷冻保存。
定量PCR：
定量PCR反应体系：
cDNA1μl
引物10pm/μl0.4/0.4μl
SYBR PCR mix10μl
去离子水 8.2μl
Total 20μl
反应程序：
循环数Step 温度时间检测说明
1 1 95℃
2 min off 起始模板变性
1 95℃15 sec off 模板变性
2 60-65℃15 sec off 退火
40
3 72℃30 sec on 延伸
80 1 60-66℃10 sec +0.5℃每增加0.5℃反
应十秒
试验仪器：
荧光定量仪器biorad iq5