2024年3月8日发(作者:堂慕雁)
Sox9促进间充质干细胞向软骨分化的研究进展
软骨损伤修复是目前临床治疗的难点之一,组织工程学的应用为解决这一难题提供了方向。利用sox9基因转染给间充质干细胞(MSCs)使后者向软骨分化,而获得稳定的软骨细胞及软骨组织,为软骨损伤修复提供的丰富的软骨来源。Sox9能激活软骨细胞外基质基因col2a1、col11a2、COMP、蛋白聚糖基因的轉录因子使其过表达,而胶原蛋白I、胶原蛋白II、蛋白聚糖、糖胺多糖等软骨组织特异性蛋白生成也增加。sox9通过抑制Wnt/β-catenin通路及核心结合蛋白因子2的活性,增加甲状旁腺激素相关肽的表达,抑制软骨细胞过度生长及骨化,从而维持软骨形态及功能。在sox9的机制研究中发现生长因子、sox5和sox6、机械应力、锌指蛋白145、MicroRNAs等参与sox9的表达及调控。目前研究者主要利用病毒或非病毒载体系统将sox9基因转染给间充质干细胞,促进MSCs向软骨分化来获得软骨来源。在体外的动物实验中SOX9基因转染后的MSCs发生了软骨细胞方向的分化,部分动物体内实验证实转染后的间充质干细胞形成了新的软骨组织。这些实验结果提示sox9基因具有应用于软骨修复的组织工程的潜力及优势,是未来软骨工程学的发展方向之一。
标签:sox9基因;间充质干细胞;软骨;分化
软骨组织具有高度分化、细胞含量少、营养供给少等特点。软骨组织一旦发生损害,往往难以完全修复,故软骨损伤或缺失的修复成为临床治疗的难点之一。目前临床上常用的治疗方式主要包括药物治疗及软骨自体移植,但往往只能达到缓解症状的目的[1]。
利用组织工程学方法修复软骨损伤成为目前研究热点之一。间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)是目前应用最为广泛的组织工程细胞。它具有分化为骨、软骨、肌腱、脂肪等组织的多分化潜能,且取材方便,易于培养,自体移植无明显免疫排斥反应,因而被认为是组织工程理想的种子细胞[2,3]。在胚胎时期,骨髓间充质干细胞(BMSCs)向软骨细胞分化并形成透明软骨组织,在这个过程中,sox9被认为是最为重要的调控因子[4,5]。因此,近年来研究者设想在体外和体内实验中利用sox9的调控机制诱导间充质干细胞向软骨细胞分化来获取丰富的软骨组织,为软骨损伤修复提供软骨组织来源。
1 Sox9基因
SOX9基因属于一个带有特征性HMG-DNA结合域的转录因子家族(SOX基因家族),可作用于软骨形成的不同阶段,是软骨形成的必要因素。SOX9基因缺失会导致成软骨发育不全[5]。在对成年大鼠的研究中,发现SOX9对软骨组织的生理作用十分必要,当SOX9基因受到干扰时,可出现严重的Ⅱ型胶原a1链(col2a1)mRNA的丢失,引起关节压缩及退行性变[6]。
2 Sox9促进MSCs向软骨细胞分化的作用机制
在软骨细胞肥大前,SOX9都是促进软骨形成的最主要的调控基因,其作用机制主要有以下几方面:
2.1 Sox9能在间充质干细胞中直接激活细胞外基质基因col2a1、col11a2、软骨寡聚基质蛋白(COMP)及蛋白聚糖(ACAN)的转录因子,使其高表达,而这些基因被认为是软骨标记基因,其表达产物胶原蛋白II、胶原蛋白XI、软骨寡聚基质蛋白、蛋白聚糖是软骨基质的重要组成成分。同时sox9也能促进其他多种软骨组织特异性表达的蛋白及多糖的生成,包括胶原蛋白I、糖胺多糖(GAG)、软骨调节素-1、基质蛋白3、软骨连接蛋白(CRTL1)、维甲酸(CD-RAP)等[7-11]。
2.2 SOX9通过抑制Wnt/β-catenin通路[12]及核心结合蛋白因子2(RUX2)转录因子[13]而抑制软骨细胞肥大并继续骨化,对维持软骨形态及功能起到非常重要的作用。这一作用机制也是后来研究者选择sox9作为诱导MSCs向软骨分化的重要原因之一。
2.3 甲状旁腺激素相关肽(PTHrP)被认为是促进软骨增殖同时抑制软骨细胞肥大及继续骨化的重要因子之一[14]。Sox9能直接与PTHrP基因的启动子结合,使其活性增加;同时还能与印第安刺猬蛋白/胶质瘤相关癌基因同源蛋白2(Ihh/Gli2)通路协同作用,使得PTHrP表达增加[15]。提示PTHrP可能是sox9抑制软骨细胞肥大并骨化过程的必要的下游因子之一。
3影响Sox9促进MSCs向软骨分化作用的因子
Sox9的表达及功能与软骨形成并不存在严格的量效相关性,提示存在其他因子与sox9协同作用并促进软骨形成[16]。
3.1 sox5和sox6 sox5和sox6在软骨形成过程中具有重要作用,它们能协同sox9作用于软骨形成及维持软骨形态的过程。其协同作用的机制可能是Sox5和sox6能促使sox9与它作用区域结合更为稳定和高效[16,17]。如Sox9能直接与蛋白聚糖基因的一个关键的启动子结合,而L-Sox5/Sox6能与蛋白聚糖基因的另外三个具有协同作用的组分结合,从而促进蛋白聚糖的表达[17]。
3.2生长因子 TGF-β及其通路是促进MSCs向软骨细胞分化必要因素之一,其中Smad3和p300能够在染色质转录水平协同促进sox9的转录功能[17,18]。BMP-2在促进间MSCs向软骨细胞分化过程中能有效提高SOX9的表达,并存在量效关系,其作用机制可能是BMP作用于sox9基因的启动子CCAAT序列而促进sox9的表达增加[19]。类胰岛素生长因子1(IGF-1)能促进II型胶原蛋白的合成,然而在抑制SOX9作用后,IGF-1的这种作用也受到抑制,提示IGF-1通过作用于sox9来促进II型胶原蛋白的形成[20]。
综上,可以提示sox9基因可能是这些生长因子促进MSCs向软骨细胞分化的必要的下游因子之一。因此理论上利用SOX9诱导MSCs向软骨细胞分化,可以减少作用通路的长度,降低干扰,增强作用效能。3.3 MicroRNA MicroRNA是
一類长度约20-24个核苷酸的小RNA片段,一些miRNAs通过直接或间接调控sox9基因的表达来调控软骨的形成。其中负向调控因子主要包括:miR-140-5p和miR-140-3p[21]、MicroRNA-145[22]、 MiR-194[23]、 MiR-574-3p[24];正向调控因子主要包括:miR-335-5p[25]、MiR-23b[26]。
3.4机械刺激 循环拉伸应变能改善sox9与其DNA作用位点的亲和力,增加COL2A1的表达[27]。在sox9转染的人间充质干细胞中,机械刺激能协同促进糖胺多糖的表达,同时软骨寡聚基质蛋白的表达增加,后者只在软骨组织中表达[28]。从而间接表明机械刺激能促进sox9作用于间充质干细胞,从而促进MSCs向软骨分化。
另外锌指蛋白145(ZNF145)[29]/前脂肪细胞因子-1(preadipocyte factor1,Pref-1)[30]等也具有促进SOX9在MSCs向软骨分化过程中的调控作用。
4 sox9应用软骨组织工程学的动物体内外实验
4.1动物的体外实验 HirokiTsuchiya首次尝试利用脂质体转染技术将sox9基因转染小鼠骨髓间充质干细胞,发现细胞外基质中胶原蛋白II及蛋白聚糖的表达明显增加。之后他们将转染后的骨髓间充质干细胞植入无胸腺小鼠的关节软骨缺损区,发现胶原蛋白II及蛋白聚糖含量明显增加的白色软骨组织形成,并能在缺损软骨中长期存在[31]。这一实验提示sox9基因应用于软骨修复的可能性。Toshiyuki Ikeda成功将sox5,sox6及sox9转入间充质干细胞、胚胎干细胞等细胞中,获得稳定的软骨细胞及周围细胞基质,胶原蛋白II、COMP、ACAN基因过表达, 糖胺多糖、蛋白聚糖及多糖合成明显增加,从基因及蛋白水平进一步证实sox9的过表达促进了间充质干细胞向软骨细胞分化[32]。阳离子聚合物聚醚酰亚胺改良的PLGA(聚乳酸-羟基乙酸共聚物)颗粒的应用,提高了sox9基因转染给人骨髓间充质干细胞的转染效率,达到了75%[33]。之后这些研究者用同样的载体,将sox5、sox6、sox9同时转染给人的骨髓间充质干细胞, 发现较单独转染sox9或者其他任意两个组合基因,实验组的胶原蛋白II、COMP、ACAN等软骨标记基因过表达量更高, 糖胺多糖、蛋白聚糖、胶原蛋白、多糖等成分表达也更为明显[34]。
4.2动物的体内实验 曹磊等利用腺病毒将sox9转染给兔的骨髓间充质干细胞,再将含有转染sox9后的兔骨髓间充质干细胞的PGA支架植入兔的全层软骨损伤的部位。得到较好的修复效果:新的软骨细胞及透明软骨特异性的细胞外基质形成,以及软骨形成的标记基因的过表达[35]。
Magali Cucchiarini利用重组腺病毒作为载体将sox9应用于兔体内软骨缺损的修复,发现sox9转然后的间充质干细胞能在体内长期存在,形成新的软骨细胞及软骨基质,并且抑制分化的软骨细胞继续肥大、骨化,同时还能改善软骨下方骨的结构[36]。
5展望
Sox9作为软骨形成及维持软骨形态功能的主要调控因子,将其应用于软骨工程学将是未来软骨损伤修复的重要的方向之一。利用间充质干细胞中sox9基因的过表达,使得软骨标记基因胶原蛋白II、COMP、ACAN基因过表达,相应蛋白及软骨基质主要成分的大量生成,促进转染后间充质干细胞向软骨分化。同时sox9基因的过表达能抑制软骨细胞继续肥大并骨化,从而获得丰富且稳定存在的软骨组织。在体外的动物实验中SOX9基因转染后的MSCs发生了软骨细胞方向的分化,部分动物体内实验证实转染后的间充质干细胞形成了新的软骨组织,并能在体内长期存在。这些实验结果提示sox9基因具有应用于软骨修复的组织工程的潜力及优势,为未来在人体软骨损伤修复应用sox9提供了实验依据。
参考文献:
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2024年3月8日发(作者:堂慕雁)
Sox9促进间充质干细胞向软骨分化的研究进展
软骨损伤修复是目前临床治疗的难点之一,组织工程学的应用为解决这一难题提供了方向。利用sox9基因转染给间充质干细胞(MSCs)使后者向软骨分化,而获得稳定的软骨细胞及软骨组织,为软骨损伤修复提供的丰富的软骨来源。Sox9能激活软骨细胞外基质基因col2a1、col11a2、COMP、蛋白聚糖基因的轉录因子使其过表达,而胶原蛋白I、胶原蛋白II、蛋白聚糖、糖胺多糖等软骨组织特异性蛋白生成也增加。sox9通过抑制Wnt/β-catenin通路及核心结合蛋白因子2的活性,增加甲状旁腺激素相关肽的表达,抑制软骨细胞过度生长及骨化,从而维持软骨形态及功能。在sox9的机制研究中发现生长因子、sox5和sox6、机械应力、锌指蛋白145、MicroRNAs等参与sox9的表达及调控。目前研究者主要利用病毒或非病毒载体系统将sox9基因转染给间充质干细胞,促进MSCs向软骨分化来获得软骨来源。在体外的动物实验中SOX9基因转染后的MSCs发生了软骨细胞方向的分化,部分动物体内实验证实转染后的间充质干细胞形成了新的软骨组织。这些实验结果提示sox9基因具有应用于软骨修复的组织工程的潜力及优势,是未来软骨工程学的发展方向之一。
标签:sox9基因;间充质干细胞;软骨;分化
软骨组织具有高度分化、细胞含量少、营养供给少等特点。软骨组织一旦发生损害,往往难以完全修复,故软骨损伤或缺失的修复成为临床治疗的难点之一。目前临床上常用的治疗方式主要包括药物治疗及软骨自体移植,但往往只能达到缓解症状的目的[1]。
利用组织工程学方法修复软骨损伤成为目前研究热点之一。间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)是目前应用最为广泛的组织工程细胞。它具有分化为骨、软骨、肌腱、脂肪等组织的多分化潜能,且取材方便,易于培养,自体移植无明显免疫排斥反应,因而被认为是组织工程理想的种子细胞[2,3]。在胚胎时期,骨髓间充质干细胞(BMSCs)向软骨细胞分化并形成透明软骨组织,在这个过程中,sox9被认为是最为重要的调控因子[4,5]。因此,近年来研究者设想在体外和体内实验中利用sox9的调控机制诱导间充质干细胞向软骨细胞分化来获取丰富的软骨组织,为软骨损伤修复提供软骨组织来源。
1 Sox9基因
SOX9基因属于一个带有特征性HMG-DNA结合域的转录因子家族(SOX基因家族),可作用于软骨形成的不同阶段,是软骨形成的必要因素。SOX9基因缺失会导致成软骨发育不全[5]。在对成年大鼠的研究中,发现SOX9对软骨组织的生理作用十分必要,当SOX9基因受到干扰时,可出现严重的Ⅱ型胶原a1链(col2a1)mRNA的丢失,引起关节压缩及退行性变[6]。
2 Sox9促进MSCs向软骨细胞分化的作用机制
在软骨细胞肥大前,SOX9都是促进软骨形成的最主要的调控基因,其作用机制主要有以下几方面:
2.1 Sox9能在间充质干细胞中直接激活细胞外基质基因col2a1、col11a2、软骨寡聚基质蛋白(COMP)及蛋白聚糖(ACAN)的转录因子,使其高表达,而这些基因被认为是软骨标记基因,其表达产物胶原蛋白II、胶原蛋白XI、软骨寡聚基质蛋白、蛋白聚糖是软骨基质的重要组成成分。同时sox9也能促进其他多种软骨组织特异性表达的蛋白及多糖的生成,包括胶原蛋白I、糖胺多糖(GAG)、软骨调节素-1、基质蛋白3、软骨连接蛋白(CRTL1)、维甲酸(CD-RAP)等[7-11]。
2.2 SOX9通过抑制Wnt/β-catenin通路[12]及核心结合蛋白因子2(RUX2)转录因子[13]而抑制软骨细胞肥大并继续骨化,对维持软骨形态及功能起到非常重要的作用。这一作用机制也是后来研究者选择sox9作为诱导MSCs向软骨分化的重要原因之一。
2.3 甲状旁腺激素相关肽(PTHrP)被认为是促进软骨增殖同时抑制软骨细胞肥大及继续骨化的重要因子之一[14]。Sox9能直接与PTHrP基因的启动子结合,使其活性增加;同时还能与印第安刺猬蛋白/胶质瘤相关癌基因同源蛋白2(Ihh/Gli2)通路协同作用,使得PTHrP表达增加[15]。提示PTHrP可能是sox9抑制软骨细胞肥大并骨化过程的必要的下游因子之一。
3影响Sox9促进MSCs向软骨分化作用的因子
Sox9的表达及功能与软骨形成并不存在严格的量效相关性,提示存在其他因子与sox9协同作用并促进软骨形成[16]。
3.1 sox5和sox6 sox5和sox6在软骨形成过程中具有重要作用,它们能协同sox9作用于软骨形成及维持软骨形态的过程。其协同作用的机制可能是Sox5和sox6能促使sox9与它作用区域结合更为稳定和高效[16,17]。如Sox9能直接与蛋白聚糖基因的一个关键的启动子结合,而L-Sox5/Sox6能与蛋白聚糖基因的另外三个具有协同作用的组分结合,从而促进蛋白聚糖的表达[17]。
3.2生长因子 TGF-β及其通路是促进MSCs向软骨细胞分化必要因素之一,其中Smad3和p300能够在染色质转录水平协同促进sox9的转录功能[17,18]。BMP-2在促进间MSCs向软骨细胞分化过程中能有效提高SOX9的表达,并存在量效关系,其作用机制可能是BMP作用于sox9基因的启动子CCAAT序列而促进sox9的表达增加[19]。类胰岛素生长因子1(IGF-1)能促进II型胶原蛋白的合成,然而在抑制SOX9作用后,IGF-1的这种作用也受到抑制,提示IGF-1通过作用于sox9来促进II型胶原蛋白的形成[20]。
综上,可以提示sox9基因可能是这些生长因子促进MSCs向软骨细胞分化的必要的下游因子之一。因此理论上利用SOX9诱导MSCs向软骨细胞分化,可以减少作用通路的长度,降低干扰,增强作用效能。3.3 MicroRNA MicroRNA是
一類长度约20-24个核苷酸的小RNA片段,一些miRNAs通过直接或间接调控sox9基因的表达来调控软骨的形成。其中负向调控因子主要包括:miR-140-5p和miR-140-3p[21]、MicroRNA-145[22]、 MiR-194[23]、 MiR-574-3p[24];正向调控因子主要包括:miR-335-5p[25]、MiR-23b[26]。
3.4机械刺激 循环拉伸应变能改善sox9与其DNA作用位点的亲和力,增加COL2A1的表达[27]。在sox9转染的人间充质干细胞中,机械刺激能协同促进糖胺多糖的表达,同时软骨寡聚基质蛋白的表达增加,后者只在软骨组织中表达[28]。从而间接表明机械刺激能促进sox9作用于间充质干细胞,从而促进MSCs向软骨分化。
另外锌指蛋白145(ZNF145)[29]/前脂肪细胞因子-1(preadipocyte factor1,Pref-1)[30]等也具有促进SOX9在MSCs向软骨分化过程中的调控作用。
4 sox9应用软骨组织工程学的动物体内外实验
4.1动物的体外实验 HirokiTsuchiya首次尝试利用脂质体转染技术将sox9基因转染小鼠骨髓间充质干细胞,发现细胞外基质中胶原蛋白II及蛋白聚糖的表达明显增加。之后他们将转染后的骨髓间充质干细胞植入无胸腺小鼠的关节软骨缺损区,发现胶原蛋白II及蛋白聚糖含量明显增加的白色软骨组织形成,并能在缺损软骨中长期存在[31]。这一实验提示sox9基因应用于软骨修复的可能性。Toshiyuki Ikeda成功将sox5,sox6及sox9转入间充质干细胞、胚胎干细胞等细胞中,获得稳定的软骨细胞及周围细胞基质,胶原蛋白II、COMP、ACAN基因过表达, 糖胺多糖、蛋白聚糖及多糖合成明显增加,从基因及蛋白水平进一步证实sox9的过表达促进了间充质干细胞向软骨细胞分化[32]。阳离子聚合物聚醚酰亚胺改良的PLGA(聚乳酸-羟基乙酸共聚物)颗粒的应用,提高了sox9基因转染给人骨髓间充质干细胞的转染效率,达到了75%[33]。之后这些研究者用同样的载体,将sox5、sox6、sox9同时转染给人的骨髓间充质干细胞, 发现较单独转染sox9或者其他任意两个组合基因,实验组的胶原蛋白II、COMP、ACAN等软骨标记基因过表达量更高, 糖胺多糖、蛋白聚糖、胶原蛋白、多糖等成分表达也更为明显[34]。
4.2动物的体内实验 曹磊等利用腺病毒将sox9转染给兔的骨髓间充质干细胞,再将含有转染sox9后的兔骨髓间充质干细胞的PGA支架植入兔的全层软骨损伤的部位。得到较好的修复效果:新的软骨细胞及透明软骨特异性的细胞外基质形成,以及软骨形成的标记基因的过表达[35]。
Magali Cucchiarini利用重组腺病毒作为载体将sox9应用于兔体内软骨缺损的修复,发现sox9转然后的间充质干细胞能在体内长期存在,形成新的软骨细胞及软骨基质,并且抑制分化的软骨细胞继续肥大、骨化,同时还能改善软骨下方骨的结构[36]。
5展望
Sox9作为软骨形成及维持软骨形态功能的主要调控因子,将其应用于软骨工程学将是未来软骨损伤修复的重要的方向之一。利用间充质干细胞中sox9基因的过表达,使得软骨标记基因胶原蛋白II、COMP、ACAN基因过表达,相应蛋白及软骨基质主要成分的大量生成,促进转染后间充质干细胞向软骨分化。同时sox9基因的过表达能抑制软骨细胞继续肥大并骨化,从而获得丰富且稳定存在的软骨组织。在体外的动物实验中SOX9基因转染后的MSCs发生了软骨细胞方向的分化,部分动物体内实验证实转染后的间充质干细胞形成了新的软骨组织,并能在体内长期存在。这些实验结果提示sox9基因具有应用于软骨修复的组织工程的潜力及优势,为未来在人体软骨损伤修复应用sox9提供了实验依据。
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