2024年3月19日发(作者：屠雅寒)
食管鳞癌中mTOR/p70S6K信号通路的作用及其阻断策略
侯桂琴
【摘要】： 雷帕霉素靶蛋白(target of rapamycin，mTOR)信号通路在肿瘤发生发展中起重要作用，
因而也越来越受到人们的关注。mTOR是一种非典型的丝氨酸／苏氨酸蛋白激酶，属于 磷脂酰肌醇3-激
酶相关激酶(PIKK)家族。在哺乳动物中，mTOR下游有两个主要的靶分子，一个是核糖体S6激酶(S6K)，
另一个是真核翻译起始因 子(eIF4E)结合蛋白1(4E-BP1)。mTOR的激活导致了S6K和4E-BP1的磷酸化，
磷酸化的4E-BP1可以从帽-依赖性翻译起始因子 eIF4E上释放出来，最终增强了与细胞生长有关的基因
的翻译。这两个过程也可能与其他的mTOR靶点一起增强了核糖体的生物合成及一些特殊mRNA的选
择性翻译。许多研究证明，mTOR被认为是肿瘤治疗中重要且有前景的治疗靶点，其抑制剂目前正在进行
临床及临床前研究，试用于多种癌症如肾细胞癌、结肠 癌、乳腺癌、前列腺癌及小细胞肺癌等。 食管鳞
癌是世界上最常见的恶性肿瘤之一，尤其在我国河南省林州市(林县)，食管鳞癌的发生率及死亡率均很高。
但是，mTOR及其信号通路的激活状态在食管 鳞癌中尚未见报道，这促使我们研究mTOR／p70S6K信
号通路在食管鳞癌发生发展中的作用，为治疗食管鳞癌寻找新的靶点。在本研究中，我们检测了食管 鳞
癌细胞系EC9706和Eca109中mTOR及其主要下游因子的激活状态，并检测了雷帕霉素和抗mTOR的
小干扰RNA(siRNA against mTOR，以下简称mTOR-siRNA)对通路中各因子mRNA及蛋白表达的影
响以及对细胞增殖、细胞周期及凋亡的影响。而且，还观察了雷帕霉素和 mTOR-siRNA对裸鼠移植瘤生
长的抑制作用。结果显示，mTOR／p70S6K信号通路在食管鳞癌中是异常激活的，并且癌细胞的分化程
度越低，激活 状态越高；另外，还证实雷帕霉素能特异性抑制mTOR／p70S6K信号通路并诱导细胞凋
亡，而mTOR-siRNA不仅能抑制信号通路，还能提高细胞对 雷帕霉素和顺铂的敏感性。动物实验表明雷
帕霉素和mTOR-siRNA均对肿瘤生长有明显的抑制作用，并且mTOR-siRNA与雷帕霉素联用时抑制效
果 最好。最后我们从人胎盘中克隆野生型抑癌基因PTEN全基因序列，构建真核表达载体并转染食管鳞
癌细胞，筛选出食管鳞癌的PTEN稳定表达株，为进一步研 究PTEN和mTOR／p70S6K信号通路之间
的相互作用打下实验基础。总之，本研究探讨了mTOR／p70S6K信号通路在食管鳞癌发生发展中的作
用，结果提示它可能是食管鳞癌药物治疗的一个有效的分子靶点。 方法 1．mTOR／p70S6K信号通路
在食管鳞癌中的激活状态 采用免疫组织化学和免疫细胞化学及Western blotting检测正常食管组织、经
病理学证实的食管鳞癌组织和低分化食管鳞癌细胞株EC9706和高分化食管鳞癌细胞株Eca109中mTOR
及其下 游因子p70S6K蛋白的表达；并采用RT-PCR检测食管鳞癌细胞系EC9706和Eca109中mTOR、
p70S6K和4E-BP1的mRNA表 达。 2 mTOR／p70S6K信号通路的阻断对食管鳞癌细胞增殖、抗凋亡
和耐药的影响 2．1细胞增殖及迁移能力 CCK-8试剂盒是一种与MTT类似的WST-8化合物，可用于检
测细胞增殖，且比MTT的灵敏度高，因此本研究采用CCK-8试剂盒检测细胞增殖，观察 雷帕霉素及m
TOR-siRNA联合雷帕霉素或顺铂对细胞增殖的影响；另外，通过愈伤试验观察细胞伤口的愈合能力，检
测雷帕霉素对细胞迁移能力的影响。 2．2 Western Blotting和RT-PCR 提取雷帕霉素或mTOR-siRN
A处理的EC9706细胞总蛋白及不同处理方式的裸鼠食管鳞癌细胞移植瘤组织总蛋白及总RNA，Wester
n Blotting分析mTOR、p70S6K、p-p70S6K、4E-BP1、p-4E-BP1和Akt1／2蛋白表达情况，RT-PC
R检测 mTOR、p70S6K和4E-BP1的mRNA表达情况。并对结果进行分析统计。 2．3细胞周期和细
胞凋亡 用不同浓度雷帕霉素或用mTOR-siRNA单独或二者联合处理细胞，用流式细胞仪检测处于不同细
胞周期的细胞数目及凋亡细胞比例，证实雷帕霉素及 mTOR-siRNA对细胞周期和细胞凋亡的影响；另外，
我们用雷帕霉素处理细胞后，提取细胞总DNA，用DNA Ladder试验分析雷帕霉素的促凋亡作用。 2．4
体内抑瘤试验 把EC9706细胞或转染过mTOR-siRNA的EC9706细胞注入裸鼠皮下，观察食管鳞癌细
胞EC9706的致瘤能力。用雷帕霉素或顺铂对荷瘤裸鼠 治疗两周，测量肿瘤大小，绘制生长曲线，比较
治疗前后裸鼠肿瘤体积及重量的变化，并计算抑瘤率。病理学试验观察成瘤后细胞形态的变化，并用TU
NEL法分 析不同处理方式对裸鼠移植瘤组织中细胞凋亡的影响。免疫组化和Western blotting分析不
同处理方式的裸鼠移植瘤组织中各因子蛋白的表达情况。RT-PCR检测mTOR、p70S6K和4E-BP1的m
RNA表达变化， 3 PTEN表达载体的构建及转染食管鳞癌细胞系EC9706 3．1 PTEN基因克隆及鉴定
根据GenBank上登录的人野生型PTEN用Primer Primer 5.0软件设计抑癌基因PTEN全基因扩增引物
及检测引物，从人胎盘中克隆PTEN全基因序列，与pMD18-T连接，转化大肠杆菌JM109，挑阳性菌
落，测序。把测序结果与GenBank登陆的PTEN序列比对。 3．2载体构建及转染 把序列正确的质粒双
酶切，回收目的片段，定向插入真核表达载体pcDNA3.1(+)中，构建成重组真核表达载体，并用脂质体
把重组载体 pcDNA3.1-PTEN转染食管鳞癌细胞EC9706，用未转染及转染空载体的细胞作为对照。 3．3
稳定表达株筛选及鉴定 细胞转染重组载体24h后，传代并继续培养24h，然后加入高浓度G418筛选稳
定表达株。待对照组细胞全部死亡，继续加入高浓度G418培养两天，然后 降低G418浓度维持培养，
提取筛选出的细胞总蛋白及总RNA，用RT-PCR和Western blotting检测转染细胞株中PTEN的mRN
A及蛋白的表达，并通过绘制细胞生长曲线观察筛选细胞株的生长速度，用未转染和转染空载体的细胞作
为对 照。 4统计学处理 RT-PCR结果均采用BandScan5.0进行灰度分析，Western blotting结果采用
TotalLab2.0软件进行分析，上述试验均分别重复三次。统计学处理均采用SPSS13.0统计软件，统计学
数据用均数± 标准差((?)±s)表示，行单因素方差分析(one-way ANOVA)，P＜0.05具显著性。 结果 1．m
TOR／p70S6K信号通路在食管鳞癌中的激活状态 1．1 mTOR、p70S6K和4E-BP1蛋白的表达 免疫组
织及细胞化学结果显示，mTOR在人正常食管组织中表达较低，但在人食管鳞癌组织及食管鳞癌细胞株E
C9706和Eca109中均呈阳性表达，并且 人食管鳞癌组织中主要在胞浆中表达，而在食管鳞癌细胞中则
胞浆胞核均有表达，且食管鳞癌细胞的分化程度越低，mTOR表达越高。p-p70S6K在这两株 癌细胞中
也呈阳性表达，而p70S6K则表达较弱。 1．2 mTOR、p70S6K和4E-BP1的mRNA表达 在两食管鳞
癌细胞株EC9706和Eca109中mTOR mRNA均有表达，并且在低分化细胞株EC9706中的表达水平高
于高分化细胞株Eca109。而p70S6K和4E-BP1在EC9706中的表达水平 则低于Eca109。 2 mTOR
／p70S6K信号通路阻断策略的体内外研究 2．1雷帕霉素和mTOR-siRNA对细胞增殖和迁移能力的影
响 CCK-8结果表明，雷帕霉素能显著抑制食管鳞癌细胞EC9706的增殖，并且随着雷帕霉素浓度的增加，
对细胞的抑制作用增强。而且在同一浓度下，雷帕霉 素在48h时对细胞的抑制作用大于在24h时的抑制
作用；mTOR-siRNA不但能够抑制细胞增殖，并且mTOR-siRNA处理后细胞对雷帕霉素及顺 铂更加敏
感。伤口愈合实验表明，雷帕霉素处理的细胞迁移能力明显减慢，证实了雷帕霉素能抑制EC9706细胞的
迁移。 2．3雷帕霉素和mTOR-siRNA对通路中各因子蛋白和mRNA表达的影响 Western blotting
结果表明，雷帕霉素和mTOR-siRNA均使mTOR的表达下降，并且使p70S6K和4E-BP1的磷酸化水平
下降，非磷酸化水平升 高，而对mTOR上游因子Akt的表达则无明显影响。RT-PCR分析结果显示，雷
帕霉素和mTOR-siRNA降低了mTOR mRNA表达并使p70S6K和4E-BP1的mRNA水平升高。并且
证实在干扰72h时mTOR的表达最低，说明mTOR-siRNA对mTOR的抑制 作用在72h时最强。 2．4
雷帕霉素和mTOR-siRNA对细胞周期和凋亡的影响 流式细胞术分析结果显示，雷帕霉素使细胞阻滞在G
_1期，并且随雷帕霉素浓度的增加，处于G_1期的细胞数增加，具有明显的剂量依赖性，mTOR- siRN
A也抑制了细胞周期进程，并且二者联合应用时比单独应用对细胞周期的抑制作用更明显。另一方面，雷
帕霉素和mTOR-siRNA也能诱导细胞的凋 亡，并且二者联合应用效果更明显。DNA Ladder试验进一
步证实了雷帕霉素的促凋亡作用。 2．5雷帕霉素和mTOR-siRNA对移植瘤的影响 从肿瘤生长曲线可以
看出，与对照组相比，雷帕霉素及顺铂能明显抑制食管鳞癌细胞EC9706细胞移植瘤的生长，并且二者联
合应用对肿瘤的抑制作用更强。另 一方面，与对照组相比，mTOR-siRNA也能明显抑制肿瘤的生长，并
且siRNA干扰后再用雷帕霉素或顺铂处理则效果更好，其中mTOR-siRNA 与雷帕霉素联合处理效果最
好。病理学检查发现，细胞注射到裸鼠皮下致瘤后，细胞形态基本未变。TUNEL结果证实了雷帕霉素和
mTOR-siRNA能明显 促进细胞凋亡，以二者联合应用促凋亡作用最为显著。免疫组化结果显示，mTOR、
p-p70S6K和p-4E-BP1在细胞中均呈阳性表达，雷帕霉素及 mTOR-siRNA治疗后表达明显减弱，而非
磷酸化的p70S6K和4E-BP1的表达则有所增强。 3 PTEN表达载体的构建及转染食管鳞癌细胞系EC97
06 3．1 PTEN基因克隆及鉴定 PCR扩增的条带非常特异，测序结果与GenBank登陆的PTEN序列完
全一致，说明所扩片段为PTEN基因。 3．2稳定表达株的筛选和鉴定 用G418筛选两周后，对照细胞
全部死亡，对筛选出的细胞扩大培养后进行RT-PCR和Western blotting检测并绘制细胞生长曲线。结
果表明，在转染重组载体的细胞株中PTEN呈高表达，而未转染组及转染空载体组PTEN的表达水平较低。
而 且，瞬时转染的细胞株中PTEN的水平高于筛选出的细胞株，且筛选出的细胞株与未转染组及转染空
载体组相比生长速度明显减慢。 结论 1．本试验首次证实mTOR／p70S6K信号通路在食管鳞癌中是异
常激活的，并且mTOR在分化程度不同的细胞株中激活程度也有差异，分化程度低的细胞 中mTOR的
激活状态高。提示激活的mTOR／p70S6K信号通路在食管鳞癌细胞生长、增殖和抗凋亡中起着重要作用。
2．体外试验显示，雷帕霉素能够特异性地阻断食管鳞癌细胞中mTOR／p70S6K信号通路，下调mTO
R的表达并抑制p70S6K和4E-BP1的磷酸 化，使细胞周期停滞在G_1期，抑制细胞的增殖并诱导细胞
的凋亡。mTOR-siRNA除了具有与类帕霉素类似的作用外，还提高了细胞对雷帕霉素和顺铂的 敏感性。
表明活化的mTOR／p70S6K信号通路可能是食管鳞癌药物靶向治疗中的一个重要分子靶点。 3．雷帕霉
素在裸鼠体内能促进EC9706细胞移植瘤中细胞的凋亡，从而显著抑制这种肿瘤的生长，并且与顺铂具有
协同或相加作用；mTOR-siRNA在 裸鼠体内也能促进肿瘤细胞的凋亡，抑制肿瘤生长，并且能提高细胞
对雷帕霉素和顺铂的敏感性。二者在体内均可有效抑制mTOR／p70S6K信号通路，下调 mTOR的表达，
并抑制p70S6K和4E-BP1的磷酸化。 4．克隆的片段为野生型PTEN基因全序列，筛选出的细胞株为食
管鳞癌的PTEN稳定表达株，为进一步研究PTEN与mTOR／p70S6K信号通路之间 的关系打下实验基
础。
2024年3月19日发(作者：屠雅寒)
食管鳞癌中mTOR/p70S6K信号通路的作用及其阻断策略
侯桂琴
【摘要】： 雷帕霉素靶蛋白(target of rapamycin，mTOR)信号通路在肿瘤发生发展中起重要作用，
因而也越来越受到人们的关注。mTOR是一种非典型的丝氨酸／苏氨酸蛋白激酶，属于 磷脂酰肌醇3-激
酶相关激酶(PIKK)家族。在哺乳动物中，mTOR下游有两个主要的靶分子，一个是核糖体S6激酶(S6K)，
另一个是真核翻译起始因 子(eIF4E)结合蛋白1(4E-BP1)。mTOR的激活导致了S6K和4E-BP1的磷酸化，
磷酸化的4E-BP1可以从帽-依赖性翻译起始因子 eIF4E上释放出来，最终增强了与细胞生长有关的基因
的翻译。这两个过程也可能与其他的mTOR靶点一起增强了核糖体的生物合成及一些特殊mRNA的选
择性翻译。许多研究证明，mTOR被认为是肿瘤治疗中重要且有前景的治疗靶点，其抑制剂目前正在进行
临床及临床前研究，试用于多种癌症如肾细胞癌、结肠 癌、乳腺癌、前列腺癌及小细胞肺癌等。 食管鳞
癌是世界上最常见的恶性肿瘤之一，尤其在我国河南省林州市(林县)，食管鳞癌的发生率及死亡率均很高。
但是，mTOR及其信号通路的激活状态在食管 鳞癌中尚未见报道，这促使我们研究mTOR／p70S6K信
号通路在食管鳞癌发生发展中的作用，为治疗食管鳞癌寻找新的靶点。在本研究中，我们检测了食管 鳞
癌细胞系EC9706和Eca109中mTOR及其主要下游因子的激活状态，并检测了雷帕霉素和抗mTOR的
小干扰RNA(siRNA against mTOR，以下简称mTOR-siRNA)对通路中各因子mRNA及蛋白表达的影
响以及对细胞增殖、细胞周期及凋亡的影响。而且，还观察了雷帕霉素和 mTOR-siRNA对裸鼠移植瘤生
长的抑制作用。结果显示，mTOR／p70S6K信号通路在食管鳞癌中是异常激活的，并且癌细胞的分化程
度越低，激活 状态越高；另外，还证实雷帕霉素能特异性抑制mTOR／p70S6K信号通路并诱导细胞凋
亡，而mTOR-siRNA不仅能抑制信号通路，还能提高细胞对 雷帕霉素和顺铂的敏感性。动物实验表明雷
帕霉素和mTOR-siRNA均对肿瘤生长有明显的抑制作用，并且mTOR-siRNA与雷帕霉素联用时抑制效
果 最好。最后我们从人胎盘中克隆野生型抑癌基因PTEN全基因序列，构建真核表达载体并转染食管鳞
癌细胞，筛选出食管鳞癌的PTEN稳定表达株，为进一步研 究PTEN和mTOR／p70S6K信号通路之间
的相互作用打下实验基础。总之，本研究探讨了mTOR／p70S6K信号通路在食管鳞癌发生发展中的作
用，结果提示它可能是食管鳞癌药物治疗的一个有效的分子靶点。 方法 1．mTOR／p70S6K信号通路
在食管鳞癌中的激活状态 采用免疫组织化学和免疫细胞化学及Western blotting检测正常食管组织、经
病理学证实的食管鳞癌组织和低分化食管鳞癌细胞株EC9706和高分化食管鳞癌细胞株Eca109中mTOR
及其下 游因子p70S6K蛋白的表达；并采用RT-PCR检测食管鳞癌细胞系EC9706和Eca109中mTOR、
p70S6K和4E-BP1的mRNA表 达。 2 mTOR／p70S6K信号通路的阻断对食管鳞癌细胞增殖、抗凋亡
和耐药的影响 2．1细胞增殖及迁移能力 CCK-8试剂盒是一种与MTT类似的WST-8化合物，可用于检
测细胞增殖，且比MTT的灵敏度高，因此本研究采用CCK-8试剂盒检测细胞增殖，观察 雷帕霉素及m
TOR-siRNA联合雷帕霉素或顺铂对细胞增殖的影响；另外，通过愈伤试验观察细胞伤口的愈合能力，检
测雷帕霉素对细胞迁移能力的影响。 2．2 Western Blotting和RT-PCR 提取雷帕霉素或mTOR-siRN
A处理的EC9706细胞总蛋白及不同处理方式的裸鼠食管鳞癌细胞移植瘤组织总蛋白及总RNA，Wester
n Blotting分析mTOR、p70S6K、p-p70S6K、4E-BP1、p-4E-BP1和Akt1／2蛋白表达情况，RT-PC
R检测 mTOR、p70S6K和4E-BP1的mRNA表达情况。并对结果进行分析统计。 2．3细胞周期和细
胞凋亡 用不同浓度雷帕霉素或用mTOR-siRNA单独或二者联合处理细胞，用流式细胞仪检测处于不同细
胞周期的细胞数目及凋亡细胞比例，证实雷帕霉素及 mTOR-siRNA对细胞周期和细胞凋亡的影响；另外，
我们用雷帕霉素处理细胞后，提取细胞总DNA，用DNA Ladder试验分析雷帕霉素的促凋亡作用。 2．4
体内抑瘤试验 把EC9706细胞或转染过mTOR-siRNA的EC9706细胞注入裸鼠皮下，观察食管鳞癌细
胞EC9706的致瘤能力。用雷帕霉素或顺铂对荷瘤裸鼠 治疗两周，测量肿瘤大小，绘制生长曲线，比较
治疗前后裸鼠肿瘤体积及重量的变化，并计算抑瘤率。病理学试验观察成瘤后细胞形态的变化，并用TU
NEL法分 析不同处理方式对裸鼠移植瘤组织中细胞凋亡的影响。免疫组化和Western blotting分析不
同处理方式的裸鼠移植瘤组织中各因子蛋白的表达情况。RT-PCR检测mTOR、p70S6K和4E-BP1的m
RNA表达变化， 3 PTEN表达载体的构建及转染食管鳞癌细胞系EC9706 3．1 PTEN基因克隆及鉴定
根据GenBank上登录的人野生型PTEN用Primer Primer 5.0软件设计抑癌基因PTEN全基因扩增引物
及检测引物，从人胎盘中克隆PTEN全基因序列，与pMD18-T连接，转化大肠杆菌JM109，挑阳性菌
落，测序。把测序结果与GenBank登陆的PTEN序列比对。 3．2载体构建及转染 把序列正确的质粒双
酶切，回收目的片段，定向插入真核表达载体pcDNA3.1(+)中，构建成重组真核表达载体，并用脂质体
把重组载体 pcDNA3.1-PTEN转染食管鳞癌细胞EC9706，用未转染及转染空载体的细胞作为对照。 3．3
稳定表达株筛选及鉴定 细胞转染重组载体24h后，传代并继续培养24h，然后加入高浓度G418筛选稳
定表达株。待对照组细胞全部死亡，继续加入高浓度G418培养两天，然后 降低G418浓度维持培养，
提取筛选出的细胞总蛋白及总RNA，用RT-PCR和Western blotting检测转染细胞株中PTEN的mRN
A及蛋白的表达，并通过绘制细胞生长曲线观察筛选细胞株的生长速度，用未转染和转染空载体的细胞作
为对 照。 4统计学处理 RT-PCR结果均采用BandScan5.0进行灰度分析，Western blotting结果采用
TotalLab2.0软件进行分析，上述试验均分别重复三次。统计学处理均采用SPSS13.0统计软件，统计学
数据用均数± 标准差((?)±s)表示，行单因素方差分析(one-way ANOVA)，P＜0.05具显著性。 结果 1．m
TOR／p70S6K信号通路在食管鳞癌中的激活状态 1．1 mTOR、p70S6K和4E-BP1蛋白的表达 免疫组
织及细胞化学结果显示，mTOR在人正常食管组织中表达较低，但在人食管鳞癌组织及食管鳞癌细胞株E
C9706和Eca109中均呈阳性表达，并且 人食管鳞癌组织中主要在胞浆中表达，而在食管鳞癌细胞中则
胞浆胞核均有表达，且食管鳞癌细胞的分化程度越低，mTOR表达越高。p-p70S6K在这两株 癌细胞中
也呈阳性表达，而p70S6K则表达较弱。 1．2 mTOR、p70S6K和4E-BP1的mRNA表达 在两食管鳞
癌细胞株EC9706和Eca109中mTOR mRNA均有表达，并且在低分化细胞株EC9706中的表达水平高
于高分化细胞株Eca109。而p70S6K和4E-BP1在EC9706中的表达水平 则低于Eca109。 2 mTOR
／p70S6K信号通路阻断策略的体内外研究 2．1雷帕霉素和mTOR-siRNA对细胞增殖和迁移能力的影
响 CCK-8结果表明，雷帕霉素能显著抑制食管鳞癌细胞EC9706的增殖，并且随着雷帕霉素浓度的增加，
对细胞的抑制作用增强。而且在同一浓度下，雷帕霉 素在48h时对细胞的抑制作用大于在24h时的抑制
作用；mTOR-siRNA不但能够抑制细胞增殖，并且mTOR-siRNA处理后细胞对雷帕霉素及顺 铂更加敏
感。伤口愈合实验表明，雷帕霉素处理的细胞迁移能力明显减慢，证实了雷帕霉素能抑制EC9706细胞的
迁移。 2．3雷帕霉素和mTOR-siRNA对通路中各因子蛋白和mRNA表达的影响 Western blotting
结果表明，雷帕霉素和mTOR-siRNA均使mTOR的表达下降，并且使p70S6K和4E-BP1的磷酸化水平
下降，非磷酸化水平升 高，而对mTOR上游因子Akt的表达则无明显影响。RT-PCR分析结果显示，雷
帕霉素和mTOR-siRNA降低了mTOR mRNA表达并使p70S6K和4E-BP1的mRNA水平升高。并且
证实在干扰72h时mTOR的表达最低，说明mTOR-siRNA对mTOR的抑制 作用在72h时最强。 2．4
雷帕霉素和mTOR-siRNA对细胞周期和凋亡的影响 流式细胞术分析结果显示，雷帕霉素使细胞阻滞在G
_1期，并且随雷帕霉素浓度的增加，处于G_1期的细胞数增加，具有明显的剂量依赖性，mTOR- siRN
A也抑制了细胞周期进程，并且二者联合应用时比单独应用对细胞周期的抑制作用更明显。另一方面，雷
帕霉素和mTOR-siRNA也能诱导细胞的凋 亡，并且二者联合应用效果更明显。DNA Ladder试验进一
步证实了雷帕霉素的促凋亡作用。 2．5雷帕霉素和mTOR-siRNA对移植瘤的影响 从肿瘤生长曲线可以
看出，与对照组相比，雷帕霉素及顺铂能明显抑制食管鳞癌细胞EC9706细胞移植瘤的生长，并且二者联
合应用对肿瘤的抑制作用更强。另 一方面，与对照组相比，mTOR-siRNA也能明显抑制肿瘤的生长，并
且siRNA干扰后再用雷帕霉素或顺铂处理则效果更好，其中mTOR-siRNA 与雷帕霉素联合处理效果最
好。病理学检查发现，细胞注射到裸鼠皮下致瘤后，细胞形态基本未变。TUNEL结果证实了雷帕霉素和
mTOR-siRNA能明显 促进细胞凋亡，以二者联合应用促凋亡作用最为显著。免疫组化结果显示，mTOR、
p-p70S6K和p-4E-BP1在细胞中均呈阳性表达，雷帕霉素及 mTOR-siRNA治疗后表达明显减弱，而非
磷酸化的p70S6K和4E-BP1的表达则有所增强。 3 PTEN表达载体的构建及转染食管鳞癌细胞系EC97
06 3．1 PTEN基因克隆及鉴定 PCR扩增的条带非常特异，测序结果与GenBank登陆的PTEN序列完
全一致，说明所扩片段为PTEN基因。 3．2稳定表达株的筛选和鉴定 用G418筛选两周后，对照细胞
全部死亡，对筛选出的细胞扩大培养后进行RT-PCR和Western blotting检测并绘制细胞生长曲线。结
果表明，在转染重组载体的细胞株中PTEN呈高表达，而未转染组及转染空载体组PTEN的表达水平较低。
而 且，瞬时转染的细胞株中PTEN的水平高于筛选出的细胞株，且筛选出的细胞株与未转染组及转染空
载体组相比生长速度明显减慢。 结论 1．本试验首次证实mTOR／p70S6K信号通路在食管鳞癌中是异
常激活的，并且mTOR在分化程度不同的细胞株中激活程度也有差异，分化程度低的细胞 中mTOR的
激活状态高。提示激活的mTOR／p70S6K信号通路在食管鳞癌细胞生长、增殖和抗凋亡中起着重要作用。
2．体外试验显示，雷帕霉素能够特异性地阻断食管鳞癌细胞中mTOR／p70S6K信号通路，下调mTO
R的表达并抑制p70S6K和4E-BP1的磷酸 化，使细胞周期停滞在G_1期，抑制细胞的增殖并诱导细胞
的凋亡。mTOR-siRNA除了具有与类帕霉素类似的作用外，还提高了细胞对雷帕霉素和顺铂的 敏感性。
表明活化的mTOR／p70S6K信号通路可能是食管鳞癌药物靶向治疗中的一个重要分子靶点。 3．雷帕霉
素在裸鼠体内能促进EC9706细胞移植瘤中细胞的凋亡，从而显著抑制这种肿瘤的生长，并且与顺铂具有
协同或相加作用；mTOR-siRNA在 裸鼠体内也能促进肿瘤细胞的凋亡，抑制肿瘤生长，并且能提高细胞
对雷帕霉素和顺铂的敏感性。二者在体内均可有效抑制mTOR／p70S6K信号通路，下调 mTOR的表达，
并抑制p70S6K和4E-BP1的磷酸化。 4．克隆的片段为野生型PTEN基因全序列，筛选出的细胞株为食
管鳞癌的PTEN稳定表达株，为进一步研究PTEN与mTOR／p70S6K信号通路之间 的关系打下实验基
础。