2024年3月25日发(作者：长孙英秀)
不能得到真正的改善（虽然此时动脉血氧分压往往会正常甚至增高）。我们在观察中也发现随着ＰＥＥＰ加至
１５ｃｍＨ２０，患者的平均动脉血压明显下降（Ｐ＜０．０５），心率却显著增加（Ｐ＜０．０５）（见附表）。表明此时，病
人的确是由于ＰＥＥＰ对循环系统的不利影响，使回心血量及心输出量均出现下降，导致循环功能不全，尤其
是当病人休克，血容量不足时，影响更大。０２ＵＣ进一步下降说明ＰＥＥＰ对循环系统已产生较大的副作用，此
时应逐步降低ＰＥＥＰ值，以免加重病情。因此，在ＰＥＥＰ使用期间，必需监测氧利用率的变化，努力寻找最佳
ＰＥＥＰ。最佳ＰＥＥＰ既能提高Ｐａ０２，又能减少对血循环的不利影响，防止０２ＵＣ的进一步下降。其对ＡＲＤＳ的
作用机制为：①在相同的高肺压下给予适当ＰＥＥＰ可明显减轻肺水肿，避免细菌易位：②适当ＰＥＥＰ稳定终末
肺单位，并使之保持开放而保证粘膜屏障完整性；③ＰＥＥＰ可同使肺下垂和非下垂部分膨胀。但是，最佳ＰＥＥＰ
必须个体化，我们认为在１０ｃｍＨ２０左右较为合适，最好不要超过１５ｃｍＨ：Ｏ。
通过研究，我们认为，过高ＰＥＥＰ会招致ＡＲＤＳ患者组织细胞氧利用率的进一步下降，不能真正纠正患
者体内组织细胞的缺氧状态。在使用ＰＥＥＰ治疗ＡＲＤＳ提高患者Ｐａ０２的同时，必需注意到机体组织细胞氧利
用率下降的问题，ＰＥＥＰ最好不要超过１５ｃｍＨ２０，同时应适当增加血容量，纠正休克，增加心脏前负荷，必
要时使用正性肌力药，保证心输出量，以真正改善病人的缺氧状态，为综合治疗ＡＲＤＳ创造有利条件，最终
提高ＡＲＤＳ的抢救成功率。
４、参考文献
［１］中华医学会呼吸病学分会．急性肺损伤／急性呼吸窘迫综合征的诊断标准．中华结核和呼吸杂
志，２０００，２３（４）：２０３．
Ｅ２］何忠杰、古力巴克、陈东等．氧利用率对急危重症的预测作用．中华内科杂志，１９９９，３８（４）：２３１～２３４．
［３］华胜，毕敏，蒋耀光．急性呼吸窘迫综合征氧代谢变化及反比通气效应的实验研究．中华急诊医学杂
志，２００３，１２（１）：１８～２０．
［４］Ｓｉｌｖｉａ
Ｎｕｎｅｓ，ＭＤ，Ｈａｎｓ
Ｕｌｒｉｃｈ
Ｒｏｔｈｅｎ，ＭＤ
Ｄｕｒｉｎｇ
ａｌｌ
ＰｈＤ，Ｌｕｋａｓ
Ｂｒａｎｄｅｒ，ＭＤ，ｅｔ
ａ１．Ｃｈａｎｇｅｓ
ｉｎ
Ｓｐｌａｎｃｈｎｉｃ
Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ
ＡｌｖｅｏｌａｒＲｅｃｒｕｉｔｍｅｎｔ
Ｍａｎｅｕｖｅｒ
ｉｎ
Ｈｅａｌｔｈｙ
Ｐｏｒｃｉｎｅ
Ｌｕｎｇｓ【Ｊ】．Ａｎｅｓｔｈ
Ａｎａｌｇ
２００４；９８：１４３２－１４３８．
［５］景炳文：加强对急性呼吸衰竭的救治．中华急诊医学，２００４，１３（５）：２９７．２９８．
［６］Ｄａｍｂｒｏｓｉｏ
Ｍ，Ｆｉｏｒｅ
Ｃ，ＢｒｉｅｎｚａＮ，ｅｔ
ａ１．Ｒｉｇｈｔ
ｖｅｎｔｒｉｃｕｌａｒ
ｍｙｏｃａｒｄｉａｌ
ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｉｎＡＲＦ
ｐａｔｉｅｎｔｓ：ＰＥＥＰ
ａｓ
ａ
ｃｈａｌｌｅｎｇｅ
ｆｏｒｔｈｅ
ｆｉｇｈｔ
ｈｅａｒｔ［Ｊ】．Ｉｎｔｅｎｓｉｖｅ
Ｃａｒｅ
Ｍｅｄ，１９９６，２２：７７２－７７５．
［７］霍开秀，谢建雄，涂昌弟等．多管官功能障碍综合征患者氧利用率的变化与预后关系．中华急诊医学杂志，
２００３，１２（９）：６０７～６０９．
Ｅ８］郭仓．ＡＲＤＳ与ＭＯＤＳ二者发病机制的相互关联性．中国危重病急救医学，１９９９，１１（２）６９—７０．
ｓｈＲＮＡ对大鼠脑胶质细胞Ｉ
Ｌ－６表达抑制的体外及体内研究
北京崇文区天坛西里６号北京天坛医院急诊科，１０００５０
徐玢于东明刘福生柴奇王强俞艽袁靖
【摘要】
目的、，探讨ＲＮＡ干扰对大鼠脑胶质细胞ＩＬ一６表达的体外抑制作用及其在大鼠创伤脑组织中ＩＬ一６
ｈａｉｒｐｉｎ
ＲＮＡ，
表达的体内抑制作用和脑水肿的影响。方法运用软件设计并合成大鼠ＩＬ－６发夹ＲＮＡ（ｓｍａｌｌ
ｓｈＲＮＡ）的ＤＮＡ模板，通过双酶切构建ＩＬ－６ｓｈＲＮＡ的ｐＳＵＰＥＲ载体（ｐＳＵＰＥＲ－ＩＬ－６），经阳离子脂质体转染入
大鼠胶质细胞瘤细胞系Ｃ６，在ＩＦＮ—Ｙ刺激下，培养上清ＥＬＩＳＡ法测定ＩＬ－６、ＩＬ－８水平，验证干扰效果并
筛选最强的目的质粒进行体内实验。自由落体法建立大鼠脑创伤模型，随机分为治疗组、空质粒组、对照组
各１４只，在打击－－２４ｈ、Ｏｈ、＋２４ｈ、＋４８ｈ病灶内注射ｐＳＵＰＥＲ—ＩＬ一６、空质粒或５ｐ１生理盐水，于打击＋２４ｈ、
＋７２ｈ时处死大鼠，检测脑组织ＩＬ一６水平、含水量及含钠量，并在电镜下观察损伤脑组织的细胞结构变化。
结果体外实验结果表明ｐＳＵＰＥＲ—ＩＬ一６能有效转染入大鼠脑胶质瘤Ｃ６细胞系并抑制ＩＬ－６的表达，其中
ｐＳＵＰＥＲ—ＩＬ一６
１的ＲＮＡ干扰效果最强，达６６．６％，而对于ＩＬ一８的表达无影响。体内实验显示，干扰组脑组
结论ＲＮＡ干扰手段可成功抑制大鼠脑胶质细胞体内
织ＩＬ一６水平略低于空质粒组与对照组，差异有统计学意义（Ｐ＜０．０５），但组间脑组织含水量及含钠量差别无
统计学意义，电镜下观察各组细胞结构无明显差异。
及体外的ＩＬ一６表达水平，并具有基因特异性，而对于Ｉ卜６表达体内抑制方法的研究有待于进一步改进。
【关键词ｌ白细胞介素６；ＲＨＡ干扰；脑创伤；脑水肿
．２０ｒ７．
Ｄｏｗｎ－ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ
ｏｆ
ＩＩ广６
ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ
ｉｎ
ｒａｔ
ｇｌｉａｃｙｔｅｕ曩ｉｎｓ
ＲＮＡ王ｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅｉｎｖｉｔｏａｎｄｒｉｖｅ
Ｂｉｎ
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ｙⅡ．Ｆｕ—ＳｈｅｎｇＬｉＩｆ．ｅｔ
ａｌ
１．Ｂｅｉｊｉｎｇ
Ｔｉａｎ
Ｔａｎ
ＨｏｓｐｉｔａＩ，Ｂｅｉ
Ｊｉｎｇ
１０００５０，Ｃｈｉｎａ，２．Ｂｅｉ
Ｊｉｎｇ
Ｎｅｕｒｏｓｕｒｇｉｃａｌ
ｏｎ
Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ
［Ａｂｓｔｒａｃｔ】
ｒａｔ
ｓ
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Ｔｏ
ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅ
ｔｈｅｅｆｆｅｃｔｓｏｆＲＮＡｉｎｔｅｒｆｅｒｅＩＬ一６
ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ
ｏｆ
ｅｄｅｍａ．Ｍｅｔｈｏｄｓ
９１ｉａｃｙｔｅ
ｉｎｖｉｔｏａｎｄｔｒａｕｍａｔｉｃｂｒａｉｎ
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ｓ
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ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｅｄ
ｂｙ
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ｉｇｎｅｄｂｙ
ｓｏｆｔｗａｒｅａｎｄｖｅｃｔｏｒ—ｂａｓｅｄ
ｅｎｚｙｍｅｓ
ｉＲＮＡ
ｐｌａｓｍｉｄｓ（ｐＳＵＰＥＲ—ＩＬ一６）
９１ｉｏｃｙｔｏｍａ
Ａｆｔｅｒ
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ｗｉｔｈ
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ｂｙ
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ｗｉｔｈ
ｗｅｒｅ
ｃｅｌｌｓ）ｗａｓ
ｔｒａｎｓｆｅｃｔｅｄｉｎｔｅｒｅｓｔｅｄ
Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ
２０００．ｉｎｄｕｃｅｄ
１ｉｐｏｐｉｌｙａｓｃｃｈａｒｉｄｅ（１９ｎｇ／ｍ１）ｔｏ
ｓｔｉｍｕｌａｔｅ
ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ。ｓｕｐｅｒｎａｔａｎｔｓ
ｆｒｏｍｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ
ｃ０１１ｅｃｔｅｄ２４ｈａｎｄ４８ｈ１ａｔｅｒａｎｄ
ａｓｓａｙｅｄ
ｆｏｒＩＬ－６ａｎｄＩＬ－８
ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎｂｙ
ＥＬＩＳＡ．Ｔｈｅｎｔｈｅ
ｍｏｓｔ
ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ
ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｅｄ
ｔｒａｕｍａｔ
ＶｅＣｔｏｒ
ｗａｓ
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ｔｏ
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ｓｔｕｄｉｅｓｉｎ
ｖｉｖｏ．Ｍａｌｅ
Ｓｐｒａｇｕｅ－Ｄａｗｌｅｙ
ｒａｔ
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ｂｕｉｌｄｅｄ
ｉｃｂｒａｉｎ
ｉｎｊｕｒｙ
ｍｏｄｅｌ
ｂｙ
ｆｒｅｅｆａｌ
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ｐｅｒｃｕｓｓ
ｉｖｅｍｅｔｈｏｄａｎｄｄｉｖｉｄｅｄｉｎｔｏ
ｖｅｃｔｏｒ
ｔｈｒｅｅ
ｇｒｏｕｐｓ
ｒａｎｄｏｍｌｙ：ｔｒｅａｔｍｅｎｔ
ｇｒｏｕｐ（ｎ＝１４），ｅｍｐｔｙ
Ｏｈ、＋２４ｈ、＋４８ｈ
ＴＢＩ，ａｎｉｍａＩｓ
ｗｅｒｅ
ｇｒｏｕｐ（ｎ＝１４），ｃｅｎｔｒｅｌｇｒｏｕｐ（ｎ＝１４）．Ａｆｔｅｒ一２４ｈ，
ｅｍｐｔｙ
ｖｅｃｔｏｒ
ｗｅｒｅ
ｉｎｊｅｃｔｅｄ
ｗｉｔｈ
５１ａ１
ｐＳＵＰＥＲ—ＩＬ一６（０．５ｐｇ／“１）ｏｒ
ｐＳＵＰＥＲ
ｒａｔｓ
（０．５９９／ｐ１）ｏｒ
０．９％Ｓｏｄｉｕｍ
Ｃｈｌｏｒｉｄｅ．Ｔｈｅｎ，ａｔ＋２４ｈ，＋７２ｈ
ａｆｔｅｒ
ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ，７
ｄｅｃａｐｉｔａｔｅｄ
ａｎｄｂｒａｉｎｔｉｓＳＵｅＳ
ｗｅｒｅ
ｏｆｅａｃｈ
ｇｒｏｕｐｓ
ＥＬＩＳＡａｎｄ
ｕｓｅｄｆｏｒｆｏｒｂｒａｉｎｅｄｅｍａｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ．ＩＬ一６
ｓ
ｅｌｅｃｔｒｏｌｌ
ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅｓｔｕｄｙ．ＲｅｓｕｌｔｓｐＳＵＰＥＲ－ＩＬ－６
ｉｎｔｒｅｄｕｃｅｄ
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ｂｅｔｗｅｅｎ
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ｂｒａｉｎ
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ｃｏｎｔｅｎｔ．ｓｏｄｉｕｍ
ｃｏｎｔｅｎｔ
ａｎｄｅｌｅｃｔｒｏｎ
Ｔｈｅ
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ｐｌａｓｍｉｄ—ｅｎｃｏｄｅｄ
ｒｅｓｐｏｎｓｅ
ｇｒｏｕｐｓ．Ｃｏｎｃｌｕｓ
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ｓｈＲＮＡｓ
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ｉｎｖｉｔｒｅｖｉｖｏ．Ｂｕｔｍｅｔｈｏｄ
ｓｈＲＮＡ－ｍｅｄｉａｔｅｄ
ｇｅｎｅ
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ｉｎｖｉｖｏｓｈｏｕｌｄｂｅ
ｄｅｖｅｌｏｐｅｄ
ｉｎｔｅｒｆｅｒｅ；ｔｒａｍａｔｉｃ
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［Ｉｅｙｗｏｒｄｓ】Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ－６；ＲＮＡ
前言
ｂｒａｉｎ
ｉｎｊｕｒｙ；ｂｒａｉｎ
ｅｄｅｍａ
白细胞介素６（Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ一６，ＩＬ一６）在中枢神经系统发育、炎症反应和疾病中有着双重作用ｎ’２１：正常
脑组织中ＩＬ一６的表达水平很低，介导中枢免疫、神经发育、分化和修复等生理作用；而在病理情况下（如脑
损伤、外周免疫刺激、中枢感染及其他中枢神经系统疾病等）ＩＬ－６的表达水平增高心’３】，促进炎性因子产生，
介导一系列的病理生理反应。
ＲＮＡ干扰（ＲＮＡｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ，ＲＮＡｉ）是指由双链ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）引发的转录后基因沉默机制。当细胞内导
入与内源性ｍＲＮＡ同源的ｄｓＲＮＡ时，能够与之结合并诱导其降解，由于ｍＲＮＡ降解发生在转录后水平，又称为
转录后基因沉默（ｐｏｓｔ—ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ
ｇｅｎｅ
ｓｉｌｅｎｃｅｉｎｇ，ＰＴＧＳ）。目前此项技术已广泛用于基因功能、信
号传递和疾病治疗的研究。我们设计并构建表达大鼠ＩＬ一６
ｓｈＲＮＡ的ｐＳＵＰＥＲ质粒，在体外转染大鼠脑胶质瘤
细胞系Ｃ６，观察其对ＩＬ一６表达的抑制作用，筛选出最有效的重组质粒，然后建立大鼠脑创伤模型，进行体
内转染，探讨能否有效介导体内ＩＬ－６的表达抑制，从而为相关疾病的基因治疗提供新策略。
１－材料与方法
１．１材料和试剂菌种和质粒：真核表达载体ｐＳＵＰＥＲ及其对照质粒由中科院生物所细胞生物室惠赠。感受态
ＤＨ５
ａ菌购自天根生物化学有限公司。细胞系：大鼠脑胶质瘤细胞系Ｃ６、Ｃ６一ＧＦＰ（稳定表达绿色荧光蛋白的
Ｃ６细胞系）由神经外科研究所肿瘤室刘福生教授惠赠。主要试剂：产生ｓｈＲＮＡ的ＤＮＡ片段由上海生物工程有
限公司合成。限制性内切酶（ＢｇｌＩＩ、ＨｉｎｄＩＩＩ、Ｘｈｏ
Ｉ和ＢａｍＨ
Ｉ、）和小量质粒提取试剂盒购自Ｔａｋａｒａ公司；
Ｔ４
ＤＮＡ连接酶，转染试剂Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ
２０００、ＲＰＭＩ
１６４０、Ｔｒｉｚｏｌ、ＲＴ－ＰＣＲ试剂盒购自Ｉｎｖｉｔｒｏｇｏｎ公司：
优质胎牛血清购自Ｈｙｃｌｏｎｅ公司；ｒａｔ
物：
ＩＬ－６、ｒａｔＩＬ一８
ＥＬＩＳＡ试剂盒购自ＢｅｎｄｅｒＭｅｄｓｙｓｔｅｍｓ公司。实验动
Ｓｐｒａｇｕｅ—Ｄａｗｌｅｙ大鼠，１２周龄，雄性，１５０—２５０９，购自中国医学科学院动物所。
１．２方法
Ｉ．２．１靶向大鼠ＩＨ的ｓｈＲＮＡ序列设计根据网上软件设计靶向大鼠ＩＬ－６的发夹结构干扰片段的ＤＮＡ序列（表
１），序列长度６０ｂｐ，两端为ＢｇｌＩＩ和ＨｉｎｄＩＩＩ酶切位点，中间为９ｂｐ茎环序列（正义：５’－ＴＴＣＡＡＧＡＧＡ一３’；
反义：５’一ＴＣＴＣＴＴＧＡＡ一３’）分隔反向重复１９ｂｐ靶序列，并以５个Ｔ作为ＲＮＡ聚合酶ＩＩＩ的转录终止子。选
2024年3月25日发(作者：长孙英秀)
不能得到真正的改善（虽然此时动脉血氧分压往往会正常甚至增高）。我们在观察中也发现随着ＰＥＥＰ加至
１５ｃｍＨ２０，患者的平均动脉血压明显下降（Ｐ＜０．０５），心率却显著增加（Ｐ＜０．０５）（见附表）。表明此时，病
人的确是由于ＰＥＥＰ对循环系统的不利影响，使回心血量及心输出量均出现下降，导致循环功能不全，尤其
是当病人休克，血容量不足时，影响更大。０２ＵＣ进一步下降说明ＰＥＥＰ对循环系统已产生较大的副作用，此
时应逐步降低ＰＥＥＰ值，以免加重病情。因此，在ＰＥＥＰ使用期间，必需监测氧利用率的变化，努力寻找最佳
ＰＥＥＰ。最佳ＰＥＥＰ既能提高Ｐａ０２，又能减少对血循环的不利影响，防止０２ＵＣ的进一步下降。其对ＡＲＤＳ的
作用机制为：①在相同的高肺压下给予适当ＰＥＥＰ可明显减轻肺水肿，避免细菌易位：②适当ＰＥＥＰ稳定终末
肺单位，并使之保持开放而保证粘膜屏障完整性；③ＰＥＥＰ可同使肺下垂和非下垂部分膨胀。但是，最佳ＰＥＥＰ
必须个体化，我们认为在１０ｃｍＨ２０左右较为合适，最好不要超过１５ｃｍＨ：Ｏ。
通过研究，我们认为，过高ＰＥＥＰ会招致ＡＲＤＳ患者组织细胞氧利用率的进一步下降，不能真正纠正患
者体内组织细胞的缺氧状态。在使用ＰＥＥＰ治疗ＡＲＤＳ提高患者Ｐａ０２的同时，必需注意到机体组织细胞氧利
用率下降的问题，ＰＥＥＰ最好不要超过１５ｃｍＨ２０，同时应适当增加血容量，纠正休克，增加心脏前负荷，必
要时使用正性肌力药，保证心输出量，以真正改善病人的缺氧状态，为综合治疗ＡＲＤＳ创造有利条件，最终
提高ＡＲＤＳ的抢救成功率。
４、参考文献
［１］中华医学会呼吸病学分会．急性肺损伤／急性呼吸窘迫综合征的诊断标准．中华结核和呼吸杂
志，２０００，２３（４）：２０３．
Ｅ２］何忠杰、古力巴克、陈东等．氧利用率对急危重症的预测作用．中华内科杂志，１９９９，３８（４）：２３１～２３４．
［３］华胜，毕敏，蒋耀光．急性呼吸窘迫综合征氧代谢变化及反比通气效应的实验研究．中华急诊医学杂
志，２００３，１２（１）：１８～２０．
［４］Ｓｉｌｖｉａ
Ｎｕｎｅｓ，ＭＤ，Ｈａｎｓ
Ｕｌｒｉｃｈ
Ｒｏｔｈｅｎ，ＭＤ
Ｄｕｒｉｎｇ
ａｌｌ
ＰｈＤ，Ｌｕｋａｓ
Ｂｒａｎｄｅｒ，ＭＤ，ｅｔ
ａ１．Ｃｈａｎｇｅｓ
ｉｎ
Ｓｐｌａｎｃｈｎｉｃ
Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ
ＡｌｖｅｏｌａｒＲｅｃｒｕｉｔｍｅｎｔ
Ｍａｎｅｕｖｅｒ
ｉｎ
Ｈｅａｌｔｈｙ
Ｐｏｒｃｉｎｅ
Ｌｕｎｇｓ【Ｊ】．Ａｎｅｓｔｈ
Ａｎａｌｇ
２００４；９８：１４３２－１４３８．
［５］景炳文：加强对急性呼吸衰竭的救治．中华急诊医学，２００４，１３（５）：２９７．２９８．
［６］Ｄａｍｂｒｏｓｉｏ
Ｍ，Ｆｉｏｒｅ
Ｃ，ＢｒｉｅｎｚａＮ，ｅｔ
ａ１．Ｒｉｇｈｔ
ｖｅｎｔｒｉｃｕｌａｒ
ｍｙｏｃａｒｄｉａｌ
ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｉｎＡＲＦ
ｐａｔｉｅｎｔｓ：ＰＥＥＰ
ａｓ
ａ
ｃｈａｌｌｅｎｇｅ
ｆｏｒｔｈｅ
ｆｉｇｈｔ
ｈｅａｒｔ［Ｊ】．Ｉｎｔｅｎｓｉｖｅ
Ｃａｒｅ
Ｍｅｄ，１９９６，２２：７７２－７７５．
［７］霍开秀，谢建雄，涂昌弟等．多管官功能障碍综合征患者氧利用率的变化与预后关系．中华急诊医学杂志，
２００３，１２（９）：６０７～６０９．
Ｅ８］郭仓．ＡＲＤＳ与ＭＯＤＳ二者发病机制的相互关联性．中国危重病急救医学，１９９９，１１（２）６９—７０．
ｓｈＲＮＡ对大鼠脑胶质细胞Ｉ
Ｌ－６表达抑制的体外及体内研究
北京崇文区天坛西里６号北京天坛医院急诊科，１０００５０
徐玢于东明刘福生柴奇王强俞艽袁靖
【摘要】
目的、，探讨ＲＮＡ干扰对大鼠脑胶质细胞ＩＬ一６表达的体外抑制作用及其在大鼠创伤脑组织中ＩＬ一６
ｈａｉｒｐｉｎ
ＲＮＡ，
表达的体内抑制作用和脑水肿的影响。方法运用软件设计并合成大鼠ＩＬ－６发夹ＲＮＡ（ｓｍａｌｌ
ｓｈＲＮＡ）的ＤＮＡ模板，通过双酶切构建ＩＬ－６ｓｈＲＮＡ的ｐＳＵＰＥＲ载体（ｐＳＵＰＥＲ－ＩＬ－６），经阳离子脂质体转染入
大鼠胶质细胞瘤细胞系Ｃ６，在ＩＦＮ—Ｙ刺激下，培养上清ＥＬＩＳＡ法测定ＩＬ－６、ＩＬ－８水平，验证干扰效果并
筛选最强的目的质粒进行体内实验。自由落体法建立大鼠脑创伤模型，随机分为治疗组、空质粒组、对照组
各１４只，在打击－－２４ｈ、Ｏｈ、＋２４ｈ、＋４８ｈ病灶内注射ｐＳＵＰＥＲ—ＩＬ一６、空质粒或５ｐ１生理盐水，于打击＋２４ｈ、
＋７２ｈ时处死大鼠，检测脑组织ＩＬ一６水平、含水量及含钠量，并在电镜下观察损伤脑组织的细胞结构变化。
结果体外实验结果表明ｐＳＵＰＥＲ—ＩＬ一６能有效转染入大鼠脑胶质瘤Ｃ６细胞系并抑制ＩＬ－６的表达，其中
ｐＳＵＰＥＲ—ＩＬ一６
１的ＲＮＡ干扰效果最强，达６６．６％，而对于ＩＬ一８的表达无影响。体内实验显示，干扰组脑组
结论ＲＮＡ干扰手段可成功抑制大鼠脑胶质细胞体内
织ＩＬ一６水平略低于空质粒组与对照组，差异有统计学意义（Ｐ＜０．０５），但组间脑组织含水量及含钠量差别无
统计学意义，电镜下观察各组细胞结构无明显差异。
及体外的ＩＬ一６表达水平，并具有基因特异性，而对于Ｉ卜６表达体内抑制方法的研究有待于进一步改进。
【关键词ｌ白细胞介素６；ＲＨＡ干扰；脑创伤；脑水肿
．２０ｒ７．
Ｄｏｗｎ－ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ
ｏｆ
ＩＩ广６
ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ
ｉｎ
ｒａｔ
ｇｌｉａｃｙｔｅｕ曩ｉｎｓ
ＲＮＡ王ｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅｉｎｖｉｔｏａｎｄｒｉｖｅ
Ｂｉｎ
ｘｄ。Ｄｏｎｇ－Ｍｉｎｇ
ｙⅡ．Ｆｕ—ＳｈｅｎｇＬｉＩｆ．ｅｔ
ａｌ
１．Ｂｅｉｊｉｎｇ
Ｔｉａｎ
Ｔａｎ
ＨｏｓｐｉｔａＩ，Ｂｅｉ
Ｊｉｎｇ
１０００５０，Ｃｈｉｎａ，２．Ｂｅｉ
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Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ
［Ａｂｓｔｒａｃｔ】
ｒａｔ
ｓ
Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ
Ｔｏ
ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅ
ｔｈｅｅｆｆｅｃｔｓｏｆＲＮＡｉｎｔｅｒｆｅｒｅＩＬ一６
ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ
ｏｆ
ｅｄｅｍａ．Ｍｅｔｈｏｄｓ
９１ｉａｃｙｔｅ
ｉｎｖｉｔｏａｎｄｔｒａｕｍａｔｉｃｂｒａｉｎ
ｗｅｒｅ
ｔｉｓｓｕｅｉｎｖｉｖｏａｎｄｔｈｅｉｎｆｌｕｅｎｃｅｏｆｃｅｒｅｂｒａｌ
ｓ
ｉＲＮＡ
ｔａｒｇｅｔ
ＤＮＡ
ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ
ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｅｄ
ｂｙ
ｄｅｓ
ｉｇｎｅｄｂｙ
ｓｏｆｔｗａｒｅａｎｄｖｅｃｔｏｒ—ｂａｓｅｄ
ｅｎｚｙｍｅｓ
ｉＲＮＡ
ｐｌａｓｍｉｄｓ（ｐＳＵＰＥＲ—ＩＬ一６）
９１ｉｏｃｙｔｏｍａ
Ａｆｔｅｒ
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ｗｅｒｅ
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ｗｅｒｅ
ｃｅｌｌｓ）ｗａｓ
ｔｒａｎｓｆｅｃｔｅｄｉｎｔｅｒｅｓｔｅｄ
Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ
２０００．ｉｎｄｕｃｅｄ
１ｉｐｏｐｉｌｙａｓｃｃｈａｒｉｄｅ（１９ｎｇ／ｍ１）ｔｏ
ｓｔｉｍｕｌａｔｅ
ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ。ｓｕｐｅｒｎａｔａｎｔｓ
ｆｒｏｍｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ
ｃ０１１ｅｃｔｅｄ２４ｈａｎｄ４８ｈ１ａｔｅｒａｎｄ
ａｓｓａｙｅｄ
ｆｏｒＩＬ－６ａｎｄＩＬ－８
ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎｂｙ
ＥＬＩＳＡ．Ｔｈｅｎｔｈｅ
ｍｏｓｔ
ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ
ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｅｄ
ｔｒａｕｍａｔ
ＶｅＣｔｏｒ
ｗａｓ
ｕｓｅｄ
ｔｏ
ａｎｉｍａｌ
ｓｔｕｄｉｅｓｉｎ
ｖｉｖｏ．Ｍａｌｅ
Ｓｐｒａｇｕｅ－Ｄａｗｌｅｙ
ｒａｔ
ｓｗｅｒｅ
ｂｕｉｌｄｅｄ
ｉｃｂｒａｉｎ
ｉｎｊｕｒｙ
ｍｏｄｅｌ
ｂｙ
ｆｒｅｅｆａｌ
１
ｉｎｇｂｏｄｙ
ｐｅｒｃｕｓｓ
ｉｖｅｍｅｔｈｏｄａｎｄｄｉｖｉｄｅｄｉｎｔｏ
ｖｅｃｔｏｒ
ｔｈｒｅｅ
ｇｒｏｕｐｓ
ｒａｎｄｏｍｌｙ：ｔｒｅａｔｍｅｎｔ
ｇｒｏｕｐ（ｎ＝１４），ｅｍｐｔｙ
Ｏｈ、＋２４ｈ、＋４８ｈ
ＴＢＩ，ａｎｉｍａＩｓ
ｗｅｒｅ
ｇｒｏｕｐ（ｎ＝１４），ｃｅｎｔｒｅｌｇｒｏｕｐ（ｎ＝１４）．Ａｆｔｅｒ一２４ｈ，
ｅｍｐｔｙ
ｖｅｃｔｏｒ
ｗｅｒｅ
ｉｎｊｅｃｔｅｄ
ｗｉｔｈ
５１ａ１
ｐＳＵＰＥＲ—ＩＬ一６（０．５ｐｇ／“１）ｏｒ
ｐＳＵＰＥＲ
ｒａｔｓ
（０．５９９／ｐ１）ｏｒ
０．９％Ｓｏｄｉｕｍ
Ｃｈｌｏｒｉｄｅ．Ｔｈｅｎ，ａｔ＋２４ｈ，＋７２ｈ
ａｆｔｅｒ
ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ，７
ｄｅｃａｐｉｔａｔｅｄ
ａｎｄｂｒａｉｎｔｉｓＳＵｅＳ
ｗｅｒｅ
ｏｆｅａｃｈ
ｇｒｏｕｐｓ
ＥＬＩＳＡａｎｄ
ｕｓｅｄｆｏｒｆｏｒｂｒａｉｎｅｄｅｍａｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ．ＩＬ一６
ｓ
ｅｌｅｃｔｒｏｌｌ
ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅｓｔｕｄｙ．ＲｅｓｕｌｔｓｐＳＵＰＥＲ－ＩＬ－６
ｉｎｔｒｅｄｕｃｅｄ
ｅｆｆｅｃｔｉｖｅｌＹ
ｉｎｔｏＣ６ｃｅｌｌ
ｔｈｅ
ｄｅｇｒｅｅ
ｏｆｒｅｄｕｃｔｉｏｎｏｆ
ｐＳＵＰＥＲ－ＩＬ－６
１
ｔｒｅａｔｍｅｎｔ
ｇｒｏｕｐ
ｗａｓ
ａｎｄ
ｉｎｈｉｂｉｔｅｄ
ＩＬ－６
ｎｏｔ
ＩＬ一８
ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ
ｉｎｖｉｔｏ．Ａｎｄ
ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｅｄ
ｔｈｅ
ｂｅｓｔ（６６．６Ｓ）ｉｎ
ａｌｌ
ｔｈａｎｏｔｈｅｒ
ｇｒｏｕｐｓｐｌａｓｍｉｄｓ．ＩＬ一６ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ
ｏｆ
ｗａｓ
ｎｏ
ｄｅｃｒｅａｓｅｄ
ｓｌｉｇｈｔｌｙ
（Ｐ＜０．０５）．ｂｕｔ
ｔｈｅｒｅ
ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ
ｅｘｐｒｅｓＳｉｏｎ
ｂｅｔｗｅｅｎ
ｔｈｏｕｇｈ
ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ
ｏｆ
ｂｒａｉｎ
ｗａｔｅｒ
ｃｏｎｔｅｎｔ．ｓｏｄｉｕｍ
ｃｏｎｔｅｎｔ
ａｎｄｅｌｅｃｔｒｏｎ
Ｔｈｅ
ＲＮＡｉ
ｐｌａｓｍｉｄ—ｅｎｃｏｄｅｄ
ｒｅｓｐｏｎｓｅ
ｇｒｏｕｐｓ．Ｃｏｎｃｌｕｓ
ｉｏｎ
ａ
ｓｈＲＮＡｓ
ａｎｄ
ｃａｎ
ｄｏｗｎ—ｒｅｇｕｌａｒ
ｉｏｎ
ｔｈｅ
ＩＬ－６
ｏｆ
ｐｏｔｅｎｔ
ａｎｄ
ｓｐｅｃｉｆｉｃ
ｉｎｖｉｔｒｅｖｉｖｏ．Ｂｕｔｍｅｔｈｏｄ
ｓｈＲＮＡ－ｍｅｄｉａｔｅｄ
ｇｅｎｅ
ｓｉ
１ｅｎｃｉｎｇ
ｉｎｖｉｖｏｓｈｏｕｌｄｂｅ
ｄｅｖｅｌｏｐｅｄ
ｉｎｔｅｒｆｅｒｅ；ｔｒａｍａｔｉｃ
ｉｎｆｕｔｕｒｅ．
［Ｉｅｙｗｏｒｄｓ】Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ－６；ＲＮＡ
前言
ｂｒａｉｎ
ｉｎｊｕｒｙ；ｂｒａｉｎ
ｅｄｅｍａ
白细胞介素６（Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ一６，ＩＬ一６）在中枢神经系统发育、炎症反应和疾病中有着双重作用ｎ’２１：正常
脑组织中ＩＬ一６的表达水平很低，介导中枢免疫、神经发育、分化和修复等生理作用；而在病理情况下（如脑
损伤、外周免疫刺激、中枢感染及其他中枢神经系统疾病等）ＩＬ－６的表达水平增高心’３】，促进炎性因子产生，
介导一系列的病理生理反应。
ＲＮＡ干扰（ＲＮＡｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ，ＲＮＡｉ）是指由双链ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）引发的转录后基因沉默机制。当细胞内导
入与内源性ｍＲＮＡ同源的ｄｓＲＮＡ时，能够与之结合并诱导其降解，由于ｍＲＮＡ降解发生在转录后水平，又称为
转录后基因沉默（ｐｏｓｔ—ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ
ｇｅｎｅ
ｓｉｌｅｎｃｅｉｎｇ，ＰＴＧＳ）。目前此项技术已广泛用于基因功能、信
号传递和疾病治疗的研究。我们设计并构建表达大鼠ＩＬ一６
ｓｈＲＮＡ的ｐＳＵＰＥＲ质粒，在体外转染大鼠脑胶质瘤
细胞系Ｃ６，观察其对ＩＬ一６表达的抑制作用，筛选出最有效的重组质粒，然后建立大鼠脑创伤模型，进行体
内转染，探讨能否有效介导体内ＩＬ－６的表达抑制，从而为相关疾病的基因治疗提供新策略。
１－材料与方法
１．１材料和试剂菌种和质粒：真核表达载体ｐＳＵＰＥＲ及其对照质粒由中科院生物所细胞生物室惠赠。感受态
ＤＨ５
ａ菌购自天根生物化学有限公司。细胞系：大鼠脑胶质瘤细胞系Ｃ６、Ｃ６一ＧＦＰ（稳定表达绿色荧光蛋白的
Ｃ６细胞系）由神经外科研究所肿瘤室刘福生教授惠赠。主要试剂：产生ｓｈＲＮＡ的ＤＮＡ片段由上海生物工程有
限公司合成。限制性内切酶（ＢｇｌＩＩ、ＨｉｎｄＩＩＩ、Ｘｈｏ
Ｉ和ＢａｍＨ
Ｉ、）和小量质粒提取试剂盒购自Ｔａｋａｒａ公司；
Ｔ４
ＤＮＡ连接酶，转染试剂Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ
２０００、ＲＰＭＩ
１６４０、Ｔｒｉｚｏｌ、ＲＴ－ＰＣＲ试剂盒购自Ｉｎｖｉｔｒｏｇｏｎ公司：
优质胎牛血清购自Ｈｙｃｌｏｎｅ公司；ｒａｔ
物：
ＩＬ－６、ｒａｔＩＬ一８
ＥＬＩＳＡ试剂盒购自ＢｅｎｄｅｒＭｅｄｓｙｓｔｅｍｓ公司。实验动
Ｓｐｒａｇｕｅ—Ｄａｗｌｅｙ大鼠，１２周龄，雄性，１５０—２５０９，购自中国医学科学院动物所。
１．２方法
Ｉ．２．１靶向大鼠ＩＨ的ｓｈＲＮＡ序列设计根据网上软件设计靶向大鼠ＩＬ－６的发夹结构干扰片段的ＤＮＡ序列（表
１），序列长度６０ｂｐ，两端为ＢｇｌＩＩ和ＨｉｎｄＩＩＩ酶切位点，中间为９ｂｐ茎环序列（正义：５’－ＴＴＣＡＡＧＡＧＡ一３’；
反义：５’一ＴＣＴＣＴＴＧＡＡ一３’）分隔反向重复１９ｂｐ靶序列，并以５个Ｔ作为ＲＮＡ聚合酶ＩＩＩ的转录终止子。选