2024年3月29日发(作者：军君昊)
测序峰图
测序方法
现代DNA序列测序可分为一二三代。
一代测序
第一代测序技术包括链终止法和化学降解法，其主要特点是以待测 DNA为模板，根据碱
基互补规则采用DNA聚合酶体外合成新链。由于新链中渗入了带有标记的碱基类似物，可用于制 备末端带有标记的 DNA单
链。这些末端带有标记的 DNA单链是一个群体，在凝胶电泳时可以形 成彼此仅差一个碱基的梯形条带。根据末端碱基的特
有标记可以读取待测 DNA的序列组成。
链终止法（Sanger法）
反应分别在4个试管中进行，每一试管中都含有：
1. 待测的DNA单链片段，作为模板；
2. DNA聚合酶；
3. 序列已知且与模板3'端互补的引物；
4. 四种脱氧核苷三磷酸（dATP、dGTP dCTP和dTTP）;
5. 四种双脱氧核苷酸中的一种，作为 DNA链合成的末端终止剂。
在适当条件下进行互补链的合成，由于新掺入的核苷酸只能同新生链 3端的-OH连接，而
2' 3'-双脱氧核苷三磷酸核糖基的 2' 3位-OH的氧已脱掉，失去了和后来的核苷酸连接的可能 性，这时碱基的掺入就
有两种可能性：
1. dNTP掺入新生链，使链继续延伸。
2. 2'3'-ddNTP掺入，使新生链的合成终止
由于两者掺入的几率不同，就形成一套长度不一的 DNA片段。最后通过A、T、G和C四
组反应的凝胶电泳放射自显影图谱，即可读出所测样品互补链的核苷酸序列。
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要求测序时使用的DNA聚合酶不能有5'-3外切酶活性（可将新合成 DNA链的5'末端除去 核苷酸而改变链的长
度）、
这两种活性会产生干扰条带。
3 '-5'外切酶活性（可将错配的碱基除去，再补上正确配对的核苷酸）。
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荧光染料标记物在San ger法中的应用
目前已发现具有不同荧光色彩的标记化合物，可将其分别与指定的 ddNTP结合，如ddATP
标记绿色荧光，ddCTP蓝色荧光，ddTTP红色荧光，ddGTP黑色荧光。这四种标记的 ddNTP混合 加入到一个反应中，聚合链
终止反应完成后，可以获得末端分别带有 A、C、T和G的DNA单链。
毛细管电泳
带电粒子在电场力的驱动下，在毛细管中按其分配系数不同进行高效、快速分离的电泳技 术。
样品心电琳 液中泳动,根 抠物厉利荷/ 质
比差异来 进行分离， 出值愈人，圖 即康
快
2024年3月29日发(作者：军君昊)
测序峰图
测序方法
现代DNA序列测序可分为一二三代。
一代测序
第一代测序技术包括链终止法和化学降解法，其主要特点是以待测 DNA为模板，根据碱
基互补规则采用DNA聚合酶体外合成新链。由于新链中渗入了带有标记的碱基类似物，可用于制 备末端带有标记的 DNA单
链。这些末端带有标记的 DNA单链是一个群体，在凝胶电泳时可以形 成彼此仅差一个碱基的梯形条带。根据末端碱基的特
有标记可以读取待测 DNA的序列组成。
链终止法（Sanger法）
反应分别在4个试管中进行，每一试管中都含有：
1. 待测的DNA单链片段，作为模板；
2. DNA聚合酶；
3. 序列已知且与模板3'端互补的引物；
4. 四种脱氧核苷三磷酸（dATP、dGTP dCTP和dTTP）;
5. 四种双脱氧核苷酸中的一种，作为 DNA链合成的末端终止剂。
在适当条件下进行互补链的合成，由于新掺入的核苷酸只能同新生链 3端的-OH连接，而
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有两种可能性：
1. dNTP掺入新生链，使链继续延伸。
2. 2'3'-ddNTP掺入，使新生链的合成终止
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荧光染料标记物在San ger法中的应用
目前已发现具有不同荧光色彩的标记化合物，可将其分别与指定的 ddNTP结合，如ddATP
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终止反应完成后，可以获得末端分别带有 A、C、T和G的DNA单链。
毛细管电泳
带电粒子在电场力的驱动下，在毛细管中按其分配系数不同进行高效、快速分离的电泳技 术。
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