2024年3月29日发(作者：禾映寒)
T淋巴细胞转化试验
（T lynrphocyte transformation test）
正常机体的T淋巴细胞在体外培养过程中，受到特异性抗原或有丝分裂原（植物血凝素或刀豆素等）刺激，
细胞的代谢和形态可发生一系列变化。主要表现为电荷的改变，细胞内蛋白质和核酸合成增加，及以细胞形态可
转化为淋巴母细胞。为此，在体外利用各种刺激剂激发淋巴细胞，根据其转化程度可测定T淋巴细胞的应答功能。
这类方法称为淋巴细胞转化试验（lymphocyte leansformstoin test）简称淋转试验，在临床上现已作为测定人
体细胞免疫功能的指标之一。细胞免疫缺陷时，这种转化功能也降低。目前最常用植物血凝素（PHA）作为分裂
原来检测淋巴细胞转化功能，称PHA刺激淋巴细胞转化试验。
体外引起T淋巴细胞转化的刺激物种类颇多，大致有以下几类：
（1）非特异抗原刺激物，如从豆类中提了的植物血凝素（PHA）和刀豆素A（ConA）等，通称为促有丝分裂
素（mitogen）。
（2）特异性抗原刺激物，如结核菌纯化蛋白衍生物（purifeg protein derivative 简称PPD）等。
（3）组织抗原和抗血清，如同种白细胞，抗淋巴细胞血清等。
上述各种刺激物中以PHA应用最广，在体外淋巴细胞培养中，可使正常人外周血液中T淋巴细胞几乎均起转
化，其所引起的淋巴细胞转化率大大超过特异性抗原的作用。但这种反应与机体是否致敏无关，因此是属于非特
异性的淋转试验。特异性抗原仅能使相应抗原致敏的淋巴细胞发生转化，转化率一般在5-30%左右。虽然T淋巴
细胞对非特异性和特异性抗原的识别过程不同，但被激活后，所发生的分裂和增殖反应却是相同的。因此根据
PHA激活T淋巴细胞分列增殖反应的程度，可以推测T淋巴细胞识别特特异性抗原后的增植反应。从而利用PHA
刺激淋巴细胞转化试验一项非常特异性体外免疫学检测指标，在一定程度上可作为刺激原，因此一般称为PHA
淋巴细胞转化试验。
PHA淋转试验有形态计数法和同位素计数法两种，前者测定转化的淋巴母细胞百分率，后者测定放射性同位
素标记的DNA前身掺入细胞合成DNA的量。
形态计数法的优点是不需要特殊设备，便于一般实验室采用，但判读结果主观因素影响较大，而且有相当数
量的中等大小的淋巴细胞难于分类。此外，在培养过程中单核细胞相对增大，形成似转化的淋巴细胞，容易造成
误计。加上此法的测定效率低，重现性较差，有被同位素掺入法取代的趋向，但要了解被激活淋巴细胞的比例和
形态改变，则仍需应用形态观察法。
淋巴细胞转化试验的操作方法主要有两种：
1、形态学方法：加分裂原共同培养后，观察形态学变化，计算转化为母细胞的百分数；
2、
3
H—胸腺嘧啶核苷掺入法：加分裂原共同培养结束前一定时间，加
3
H标记的胸腺嘧啶核苷，培养后测定
镊入细胞内的放射性物质的相对数量，以间接了发转化程度。
形态学方法比较简单易行，不需特殊设备，但重复性和客观性较差；
3
H掺入法结果客观，准确性好，重复性
好，但需要一定设备条件。
PHA淋转试验形态学检查法
一、目的：
1、了解本技术的原理。
2、掌握操作方法。
3、学会分辨几类细胞形态学上的特点。
二、原理：
将人外周血液或分离的白细胞和PHA混合进行体外培养数日后取培养细胞作涂片染色镜检，可见大部分淋巴
细胞转化为体积较大的淋巴母细胞，细胞核内生成核仁，并有部分细胞发生分裂现象。由于PHA只激发T淋巴细
胞转化，为此计数200个淋巴细胞，可计算出转化细胞的百分离，即得淋巴细胞转化率（简称转化率）。
在正常情况下，PHA淋巴细胞转化率为60-80%，50-60%则偏低，50%下则降低。
三、试验材料：
1、PHA溶液：PHA有粗制品两种。粗制品是含多糖的蛋白质成分，各为PHA-M。精制品为纯蛋白成分，名为
PHA—P。国内虽有少数精制的PHA产品，但仍有待试剂标准化。
目前国内在临床检验中作淋转试验所用PHA一般均为粗制品，没有质量标准。原料来源不同，制备条件差异
均可影响产品的活力。即使属于同一单位供应，各批产品的活力亦不相同。虽可参照说明书而决定其用量，按下
述正式试验方法检测同一标本。如PHA加入量过多，对细胞有毒性；加入量少，不足以刺激淋巴细胞转化，一般
最适浓度为50-200Ug/mL。
PHA粗制品亦可按下法自制：将广东红花云豆（Phaseolus Vulgaris）研磨成粉末，取10g粉末加生理盐水
100ml，放置4℃冰箱浸泡48小时，每隔数小时稍加搅拌。取出后用滤纸过滤或在4℃离心（2，500转/分）30
1
分钟。取滤液或上清液加生理盐水补足至100ml，继而经细菌滤过滤，无菌分装小瓶，冰冻保存，至少可用半年。
如保存时期过长，需再行滴定活力。临用前加10倍生理盐水配成1%浓度。
效价（力）测定：取10支小试管，用生理盐水将植物血凝素（PHA）做倍比稀释（自1 :10,1 :20，1 :40，……
1 :2560）各取0.25ml分别到1-9管，第10管加盐水对照。再往1-10管中各加1%兔血球悬液0.25ml，混匀室
温6-8小时观察血凝现象。按其凝集程度以＋＋＋＋－＋ 表示之。PHA最高稀释度仍呈凝集者为该PHA的效价，
即为一个单位（U）。用时每ml含50单位。如效价为1 :1280，用生理盐水稀释25倍即成。
淋巴细胞转化试验按每毫升培养液加入50U/ml的PHA0.1ml即可。
2、小牛血清：未进食的新生小公牛，以无菌手续从颈动脉放血分离血清，分装后，56℃30分钟灭活，无菌
试验阴性，冰冻保存可长期备用。
3、肝素：取粉末状肝素用HanK’s（PH7.4）配成126单位/毫升，8磅10分钟灭菌，4℃冰箱中保存，用时
可按1ml血液加入0.1ml肝素。
4、培养液：各实验室所用培养液颇多差异，以下仅列举几种：
（1）0.5%水解酪蛋白HanK’S溶液：配制后，15磅高压灭菌15分钟。临用前加最终浓度为20%无菌小牛血
清，并加青霉素（100U/mL）和链霉素（100UG/mL），用10%碳酸氢钠溶液调PH至7.2—7.4。
（2）RPMI—1640培养液：同型的同种异种血清，199营养液或EagieS液（内含小牛血清20%，青霉素100
单位/毫升，链霉素100Ug/mL），用3.5%碳酸氢钠调整PH7.2—7.4。
5、3%明胶：临用时配制。用生理盐水配成3%明胶，沸水融化，分装后，8磅10分钟灭菌。
6、瑞特一基姆沙氏染液
瑞特粉末 0.3g
基姆沙粉末 0.03g
甲醇 100mL
先将两种粉末称好，放乳钵内研细后，慢慢加入甲醇，混匀，放棕色瓶中，塞紧瓶口，充分振荡，放室温待
充分溶解后即可使用。
7、其它：血球计算板，1%冰醋酸，显微镜，水浴，培养瓶试管，吸管等。
四、实验方法：
1、淋巴细胞分离，采集肝素抗凝外周血液（肝素用量20U/mL），可采用以下两种方法之任何一方法进行分
离。
（1）Ficoll-Comray （聚蔗糖——泛影钠）分离淋巴细胞法：
用10毫升的试管，加入3毫升淋巴细胞分层液（比重介于1.0-1.090之间），在这种分层液的界面上，轻
轻加入4毫升左右肝素化的血液，千万不要打乱两液间的液面。然后用1500-2000转/分，离心10-20分钟。此
时即可见到液体分为四层。最下层是红细胞和粒细胞，分层液在它的上层，最上层是血浆层。淋巴细胞在血浆层
和分层液之间，淋巴细胞多时，可呈现一层乳白层。用滴管直接插入淋巴细胞分层液吸取淋巴细胞放入含有
Hank’S液4-5毫升的试管中，充分混匀，1500-2000转/分，离心10分钟，弃去上清，即获得纯淋巴细胞，可
加入适量HanK’S液进行计数，应用浓度为2-3×10
6
/mL，每份需用1毫升。
（2）3%明胶（分子量19万）分离法：将明胶用生理盐水配成3%的溶液，煮沸溶化后，分装试管中，以8
磅10-15分钟灭菌备用。此液应现配现用。用时将肝素抗凝血3份加3%明胶1份（预先放在37℃水浴中）。充
分混匀，一般轻轻晃动动试管30-50次即可，但应注意防止出气泡。
充分混匀后，将试管直立于37℃水浴中约20-30分钟，若试管倾斜30度角度放置，则可加速红细胞的沉淀
速度。待肉眼观察绝大部分红细胞下沉，即可将上部液体移到无菌小试管中，此为淋巴细胞悬液（其中仍含有少
量的粒细胞等）。
将此细胞悬液充分混匀，吸取0.1毫升放在另一小试管中，加入1%醋酸0.9毫升，充分混匀，室温中放置
片刻，取1滴放在血球计数板进行计算，其计算方法如下：
检查细胞活动时，取0.1毫升细胞悬液加入2-3倍量的1%台盼兰，混匀，放置室温5分钟，取1滴于计数
板进行计数，兰染者为死细胞。一般活细胞应保持在96%以上。
此方法易行，一般实验都可进行。这种方法分得的淋巴细胞悬液中仍含有少量的细胞，在PHA转化试验中似
无明显影响。根据需要，亦可采用下述方法混入的红细胞，即将分得的淋巴细胞悬液经800-1000转/分，离心
10分钟，去上清，然后加入Tris-MH
4
C1数毫升，使之充分混悬，37℃作用5分钟，使红细胞充分溶解，再经100
转/分，离心5分钟，去掉溶血的上清液，然后加HanK’S液或其它等渗液充分混悬，计数，调整到所需要的浓
度即可应用。
2、计数，培养：用3%明胶法分得淋巴细胞进行计数及活动力检查，然后将全部细胞悬液以1500转/分，离
心10-15分钟，去上清，加入一定量的培养液，稀释成为200-300万/mL细胞悬液。每管培养的细胞数为3×10
6
ml
培养液，分离的白细胞可混有少量红细胞，有利淋巴细胞培养。
据试验要求，将上述细胞悬液分装不同管中，每管一般分装1毫升或0.5mL作为培养用。一次试验至少要分
装两管，其中一管加PHA0.1/mL(50U/mLPHA)另管作为对照用。
2
盖好胶塞，防止漏气，影响培养液的PH值，放37℃温箱培养72小时，加PHA管，可见培养液稍变黄，或
见到细胞凝块现象，不加PHA管则化变不大。每天旋转摇匀二次。
3、培养结束后，离心（1,000转/分）10分钟，倒尽上清液，待管壁残留少量液体回至管底，用毛细滴管吹
打使沉淀细胞分散。吸取一滴细胞悬液，滴在清洁玻片上，用滴管前端作刮片，将细胞液轻轻推向一方，一般大
细胞多在尾部，推完迅速用电扇吹干，待干燥后用姬姆萨氏染料固定染色，用油镜观察计数。
4、染色：用Wright-Giemsa氏染色，染色时，先滴此液数滴，盖满血膜，染1-2分钟，染1-2分钟，再滴
以等量的双蒸馏水，与染色液充分混匀，再经3-5分钟，充分水洗，滤纸吸干，镜检。
5、镜检：可按头，体，尾三部分区域观察。如图1表示的方向进行镜检。
6、结果观察，淋巴细胞加PHA分裂原经培养后，可转化为各种形态的母细胞，掌握其形态特点，在确定淋巴细
胞转化上是个关键问题，用形态学方法判断计数转化率，掌握淋巴细胞的形态学至为重要，应根据细胞大小，核
与胞浆的比例，胞浆的染色性和核结构和核仁的有无等待征进行判别。在淋转试验中，常见的淋巴细胞类有如下
几种：核丝分裂相细胞，淋巴母细胞，成熟淋巴细胞，过渡型淋巴母胞和衰老退化母细胞，各种细胞类型的特征
如下（参见表1）。
表1未转化和转化的淋巴细胞形态特征
转化的淋巴细胞
细胞类别 未转化淋巴细胞
母细胞 过渡型
细胞体积（直径） 12-20或更大 12-16 6-8
大小 增 大 增 大 不增大
胞 染色质 疏 松 疏 松 密 集
核 核仁 清晰可见-4个 有或无 无
有丝分裂 +或- - -
增 多 ++ + -
胞
着 色 嗜 碱 嗜 碱 无青色
空 泡 +或- +或- -
浆
伪 足 +或- +或- -
1、[成熟的淋巴细胞]大小基本一致和末梢血液中未经培养的淋巴细胞相一致。核大类似圆形，匀质，用瑞特一
基姆沙氏染色呈深紫色，原浆大多看不到，看到只在核的一边呈弯月形，染色呈蓝色。
2、[过渡型淋巴细胞]大小比成熟的淋巴细胞稍大，和大淋巴细胞基本一致。核质和成熟的淋巴细胞构造相似或
略有疏松，但具有明显的核仁。这点和成熟淋巴细胞是最明显的区别点，原浆嗜硷但不强。
3、[淋巴母细胞]细胞休积明显增大，约12-20Um，达成熟淋巴细胞的3-4倍，甚至更大，形态不整齐。细胞核
膜清楚核染色质疏松呈细网状结构，核内可见1-4个核仁。胞浆变宽，核与细胞比例变小，胞浆碱性明显增加，
胞浆内有时可见小气泡出现，胞浆边缘个别呈伪足状突起。核较成熟淋巴细胞显著增大，核可达5-12U，核质疏
松，核内有数个明显的核仁和分散的空泡，有的还可看到核有分裂象。
4、[网状细胞样淋巴母细胞]细胞轮廓显著增大，其大小约为成熟淋巴细胞数倍以上，形态很不规则，大致呈阿
米巴样。原浆嗜硷性不强，看起来有透明感。核质构造呈细网状，核仁明显，有一至数个。
有的人也将此类型分为下面两类：
（1）过度型母细胞，它是未曾完全转化的细胞，但已具淋巴母细胞的某些特征，比小淋巴细胞大，约12-16Um，
核染色质变松，有的见有核仁，胞浆增多，嗜碱性也见增强。
（2）核丝分裂相细胞：核体呈现有丝分裂，胞内可见组织染色体数对至数十对。
以上4种类型均属于转化细胞，而下述两种则前者不计入，后者为未转化细胞。
衰老退化母细胞：胞浆已部分或全部破碎，有时仅存细胞核（裸核），这类细胞一般不作计数。
成熟的小淋巴细胞：与正常未培养的淋巴细胞一样，核染色体致密，核与细胞比例大，胞浆为轻度嗜碱性。
上述所见，是淋巴细胞转化过程中最常见的形态变化，总的来说，不外1形态大小变化较成熟淋巴细胞为大，皆
在10-15微米以上；2具有明显的核仁变化，核内的核仁少则1个，多则数个以上，这和大淋巴细胞完全不同的，
所以在镜下看到有此种变化即可认为是转化的一种显著表现；3核和原浆都增大，尤其原浆增大后，细胞呈阿米
巴样，着色淡染；4转化后往往见到核和胞浆有空泡形成，其数目，是随转化程度而逐渐增加，少则1-2个多则
数十个以上，尤其原浆更为明显；5除上述外，还有些淋巴细胞转化后呈多形态样，宛如骨髓片一样，变化多端。
这些都须在实践中不断总结经验，达到确认无误的程度。
每份标本至少计数200个细胞。按下列公式算出转化率：
转化的淋巴细胞数
转化率＝ 转化的淋巴细胞数＋未转化的淋巴细胞数
3
在细胞培养物内，尚见有其他细胞，如多形核白细胞在培养过程不断变性死亡，经72小时后绝大部衰变或死亡
呈碎片，而嗜酸性细胞还有不少残留，此外还可见到单核细胞培养后形态学上与过渡型母细胞易于混淆，必须注
意鉴别。单核细胞培养后形态学上具有如下特点：核与细胞比例较小，且偏在一旁，核染色质校浓集，胞浆呈蓝
灰色或红褐色，浆内有大小不等的颗粒或吞噬物。
一般计算上述各类细胞，数500个，作好转化细胞和非转化细胞分类。转化率以淋巴母细胞加上过渡型都算在内，
正常人转化率在60-80%间。
按头，体尾三段，实际镜检数出的细胞数量往往超出500个以上，数的越多，则转化率计算也越正确。
（三）影响培养结果的几个问题
淋巴细胞培养时各种条件对淋转试验结果影响很大，分别叙述如下：
1、全部操作过程都应严格无菌，这是体外淋巴细胞转化成败的关键问题。
2、培养液：培养液的营养价值越高，转化率相对地较高，转化的淋巴母细胞形态也较典型，核丝分裂也稍多。
所用的199营养液内含20%小牛血清，在培养淋巴细胞转化上可取得很好的成绩。但由于199营养液制备和购买
都不易得到，因此我们开始作淋巴细胞转化时应用同种异体的同型血清或自家血清培养淋巴细胞，在形态上比
199小牛血清培养结果好，适于临床的应用，是一种便于推广的培养液。但也有报告，个别情况下，同种异体血
清中有某种抑制转化的因子存在，所以在选择血清上也要注意。
培养液的PH：过酸或过碱均会影响细胞生长而降低转化率，最适PH为7.2-7.4。最好用HePeS缓冲剂，它是N-2-
羟乙基-呱嗪-N’-2-乙基磺酸（N-2-hydroxy-piperazine-N’-2-ethanesulphonic acid）的缩写，其分子有磺
酸基和氨基，在P7.2时的缓冲能力很强。它的结构稳定，可以高压灭菌，在培养液中的一般用量为
10-25mM(2.38-5.95mg/mL)，用氢氧化钠溶液调至所需PH。
培养液液面：为使细胞有足够的氧气以维持其新陈代谢，细胞与培养液的接触面要大。培养容器以斜放为宜。
添加的血清：培养液中一般加20%小牛血清。有些实验室用AB型人血浆。如不用血清或血浆，淋巴细胞只对强
有促有丝分裂素有反应，而对有些抗原无反应。但小牛血清也能带入一些抑制或促进细胞生长的物质，并且每批
小牛血清成分并不完全相同，对实验的正确性和重复性有一定影响。尤其用特异性抗原作刺激剂时，本来的反应
较慢，从而更易于受干扰。用全血培养可以省去小牛血清并不影响结果。
3、PHA浓度：PHA可促进淋巴细胞转化形成母细胞，其机制尚不清楚。但加的过多或少都能影响结果，所以PHA
用前必须测定。我们将自制的PHA用兔血球凝集试验测定，定出使用单位，用每毫升50个单位，1ml培养液中
加0.1ml，经多次试验在72小时左右可使淋巴细胞转化达到满意的结果。
4、红细胞：用3%明胶分离淋巴细胞是便于推广的一种方法。操作中应小心地吸取上层液中白细胞，避免混入大
量的红细胞，但无论如何小心，仍有多量的红细胞混入其中，一般来说，对淋巴细胞的转化影响不大。
5、培养时间：在一定限度内，时间越长，转化率越高。但用PHA激发，培养超过4-5天，转化率而下降，通用
培养时间为72小时。如果特异性抗原作为刺激剂，要连续培养5-7天。
6、实验条件尽量固定，若改变条件，尤其培养液，PHA，小牛血清等等，都应预先做好预备试验，找好条件，再
进入正式试验。
7、涂片和计数方法：取细胞作涂片时，特别是全血标本，必须注意将管内细胞扩散。吸取上层细胞作推片，结
果易偏高，因为大的细胞离心后居上层者为多。推片染色后的计数法对转化率的影响极大。一般愈近推片梢部，
淋巴细胞或转化细胞愈多，愈近涂片根部转化细胞愈少，甚至没有。因此，计数时应先行鸟瞰，然后取玻片的前，
中后三段计数或作城墙开计数以提高准确性。
4
2024年3月29日发(作者：禾映寒)
T淋巴细胞转化试验
（T lynrphocyte transformation test）
正常机体的T淋巴细胞在体外培养过程中，受到特异性抗原或有丝分裂原（植物血凝素或刀豆素等）刺激，
细胞的代谢和形态可发生一系列变化。主要表现为电荷的改变，细胞内蛋白质和核酸合成增加，及以细胞形态可
转化为淋巴母细胞。为此，在体外利用各种刺激剂激发淋巴细胞，根据其转化程度可测定T淋巴细胞的应答功能。
这类方法称为淋巴细胞转化试验（lymphocyte leansformstoin test）简称淋转试验，在临床上现已作为测定人
体细胞免疫功能的指标之一。细胞免疫缺陷时，这种转化功能也降低。目前最常用植物血凝素（PHA）作为分裂
原来检测淋巴细胞转化功能，称PHA刺激淋巴细胞转化试验。
体外引起T淋巴细胞转化的刺激物种类颇多，大致有以下几类：
（1）非特异抗原刺激物，如从豆类中提了的植物血凝素（PHA）和刀豆素A（ConA）等，通称为促有丝分裂
素（mitogen）。
（2）特异性抗原刺激物，如结核菌纯化蛋白衍生物（purifeg protein derivative 简称PPD）等。
（3）组织抗原和抗血清，如同种白细胞，抗淋巴细胞血清等。
上述各种刺激物中以PHA应用最广，在体外淋巴细胞培养中，可使正常人外周血液中T淋巴细胞几乎均起转
化，其所引起的淋巴细胞转化率大大超过特异性抗原的作用。但这种反应与机体是否致敏无关，因此是属于非特
异性的淋转试验。特异性抗原仅能使相应抗原致敏的淋巴细胞发生转化，转化率一般在5-30%左右。虽然T淋巴
细胞对非特异性和特异性抗原的识别过程不同，但被激活后，所发生的分裂和增殖反应却是相同的。因此根据
PHA激活T淋巴细胞分列增殖反应的程度，可以推测T淋巴细胞识别特特异性抗原后的增植反应。从而利用PHA
刺激淋巴细胞转化试验一项非常特异性体外免疫学检测指标，在一定程度上可作为刺激原，因此一般称为PHA
淋巴细胞转化试验。
PHA淋转试验有形态计数法和同位素计数法两种，前者测定转化的淋巴母细胞百分率，后者测定放射性同位
素标记的DNA前身掺入细胞合成DNA的量。
形态计数法的优点是不需要特殊设备，便于一般实验室采用，但判读结果主观因素影响较大，而且有相当数
量的中等大小的淋巴细胞难于分类。此外，在培养过程中单核细胞相对增大，形成似转化的淋巴细胞，容易造成
误计。加上此法的测定效率低，重现性较差，有被同位素掺入法取代的趋向，但要了解被激活淋巴细胞的比例和
形态改变，则仍需应用形态观察法。
淋巴细胞转化试验的操作方法主要有两种：
1、形态学方法：加分裂原共同培养后，观察形态学变化，计算转化为母细胞的百分数；
2、
3
H—胸腺嘧啶核苷掺入法：加分裂原共同培养结束前一定时间，加
3
H标记的胸腺嘧啶核苷，培养后测定
镊入细胞内的放射性物质的相对数量，以间接了发转化程度。
形态学方法比较简单易行，不需特殊设备，但重复性和客观性较差；
3
H掺入法结果客观，准确性好，重复性
好，但需要一定设备条件。
PHA淋转试验形态学检查法
一、目的：
1、了解本技术的原理。
2、掌握操作方法。
3、学会分辨几类细胞形态学上的特点。
二、原理：
将人外周血液或分离的白细胞和PHA混合进行体外培养数日后取培养细胞作涂片染色镜检，可见大部分淋巴
细胞转化为体积较大的淋巴母细胞，细胞核内生成核仁，并有部分细胞发生分裂现象。由于PHA只激发T淋巴细
胞转化，为此计数200个淋巴细胞，可计算出转化细胞的百分离，即得淋巴细胞转化率（简称转化率）。
在正常情况下，PHA淋巴细胞转化率为60-80%，50-60%则偏低，50%下则降低。
三、试验材料：
1、PHA溶液：PHA有粗制品两种。粗制品是含多糖的蛋白质成分，各为PHA-M。精制品为纯蛋白成分，名为
PHA—P。国内虽有少数精制的PHA产品，但仍有待试剂标准化。
目前国内在临床检验中作淋转试验所用PHA一般均为粗制品，没有质量标准。原料来源不同，制备条件差异
均可影响产品的活力。即使属于同一单位供应，各批产品的活力亦不相同。虽可参照说明书而决定其用量，按下
述正式试验方法检测同一标本。如PHA加入量过多，对细胞有毒性；加入量少，不足以刺激淋巴细胞转化，一般
最适浓度为50-200Ug/mL。
PHA粗制品亦可按下法自制：将广东红花云豆（Phaseolus Vulgaris）研磨成粉末，取10g粉末加生理盐水
100ml，放置4℃冰箱浸泡48小时，每隔数小时稍加搅拌。取出后用滤纸过滤或在4℃离心（2，500转/分）30
1
分钟。取滤液或上清液加生理盐水补足至100ml，继而经细菌滤过滤，无菌分装小瓶，冰冻保存，至少可用半年。
如保存时期过长，需再行滴定活力。临用前加10倍生理盐水配成1%浓度。
效价（力）测定：取10支小试管，用生理盐水将植物血凝素（PHA）做倍比稀释（自1 :10,1 :20，1 :40，……
1 :2560）各取0.25ml分别到1-9管，第10管加盐水对照。再往1-10管中各加1%兔血球悬液0.25ml，混匀室
温6-8小时观察血凝现象。按其凝集程度以＋＋＋＋－＋ 表示之。PHA最高稀释度仍呈凝集者为该PHA的效价，
即为一个单位（U）。用时每ml含50单位。如效价为1 :1280，用生理盐水稀释25倍即成。
淋巴细胞转化试验按每毫升培养液加入50U/ml的PHA0.1ml即可。
2、小牛血清：未进食的新生小公牛，以无菌手续从颈动脉放血分离血清，分装后，56℃30分钟灭活，无菌
试验阴性，冰冻保存可长期备用。
3、肝素：取粉末状肝素用HanK’s（PH7.4）配成126单位/毫升，8磅10分钟灭菌，4℃冰箱中保存，用时
可按1ml血液加入0.1ml肝素。
4、培养液：各实验室所用培养液颇多差异，以下仅列举几种：
（1）0.5%水解酪蛋白HanK’S溶液：配制后，15磅高压灭菌15分钟。临用前加最终浓度为20%无菌小牛血
清，并加青霉素（100U/mL）和链霉素（100UG/mL），用10%碳酸氢钠溶液调PH至7.2—7.4。
（2）RPMI—1640培养液：同型的同种异种血清，199营养液或EagieS液（内含小牛血清20%，青霉素100
单位/毫升，链霉素100Ug/mL），用3.5%碳酸氢钠调整PH7.2—7.4。
5、3%明胶：临用时配制。用生理盐水配成3%明胶，沸水融化，分装后，8磅10分钟灭菌。
6、瑞特一基姆沙氏染液
瑞特粉末 0.3g
基姆沙粉末 0.03g
甲醇 100mL
先将两种粉末称好，放乳钵内研细后，慢慢加入甲醇，混匀，放棕色瓶中，塞紧瓶口，充分振荡，放室温待
充分溶解后即可使用。
7、其它：血球计算板，1%冰醋酸，显微镜，水浴，培养瓶试管，吸管等。
四、实验方法：
1、淋巴细胞分离，采集肝素抗凝外周血液（肝素用量20U/mL），可采用以下两种方法之任何一方法进行分
离。
（1）Ficoll-Comray （聚蔗糖——泛影钠）分离淋巴细胞法：
用10毫升的试管，加入3毫升淋巴细胞分层液（比重介于1.0-1.090之间），在这种分层液的界面上，轻
轻加入4毫升左右肝素化的血液，千万不要打乱两液间的液面。然后用1500-2000转/分，离心10-20分钟。此
时即可见到液体分为四层。最下层是红细胞和粒细胞，分层液在它的上层，最上层是血浆层。淋巴细胞在血浆层
和分层液之间，淋巴细胞多时，可呈现一层乳白层。用滴管直接插入淋巴细胞分层液吸取淋巴细胞放入含有
Hank’S液4-5毫升的试管中，充分混匀，1500-2000转/分，离心10分钟，弃去上清，即获得纯淋巴细胞，可
加入适量HanK’S液进行计数，应用浓度为2-3×10
6
/mL，每份需用1毫升。
（2）3%明胶（分子量19万）分离法：将明胶用生理盐水配成3%的溶液，煮沸溶化后，分装试管中，以8
磅10-15分钟灭菌备用。此液应现配现用。用时将肝素抗凝血3份加3%明胶1份（预先放在37℃水浴中）。充
分混匀，一般轻轻晃动动试管30-50次即可，但应注意防止出气泡。
充分混匀后，将试管直立于37℃水浴中约20-30分钟，若试管倾斜30度角度放置，则可加速红细胞的沉淀
速度。待肉眼观察绝大部分红细胞下沉，即可将上部液体移到无菌小试管中，此为淋巴细胞悬液（其中仍含有少
量的粒细胞等）。
将此细胞悬液充分混匀，吸取0.1毫升放在另一小试管中，加入1%醋酸0.9毫升，充分混匀，室温中放置
片刻，取1滴放在血球计数板进行计算，其计算方法如下：
检查细胞活动时，取0.1毫升细胞悬液加入2-3倍量的1%台盼兰，混匀，放置室温5分钟，取1滴于计数
板进行计数，兰染者为死细胞。一般活细胞应保持在96%以上。
此方法易行，一般实验都可进行。这种方法分得的淋巴细胞悬液中仍含有少量的细胞，在PHA转化试验中似
无明显影响。根据需要，亦可采用下述方法混入的红细胞，即将分得的淋巴细胞悬液经800-1000转/分，离心
10分钟，去上清，然后加入Tris-MH
4
C1数毫升，使之充分混悬，37℃作用5分钟，使红细胞充分溶解，再经100
转/分，离心5分钟，去掉溶血的上清液，然后加HanK’S液或其它等渗液充分混悬，计数，调整到所需要的浓
度即可应用。
2、计数，培养：用3%明胶法分得淋巴细胞进行计数及活动力检查，然后将全部细胞悬液以1500转/分，离
心10-15分钟，去上清，加入一定量的培养液，稀释成为200-300万/mL细胞悬液。每管培养的细胞数为3×10
6
ml
培养液，分离的白细胞可混有少量红细胞，有利淋巴细胞培养。
据试验要求，将上述细胞悬液分装不同管中，每管一般分装1毫升或0.5mL作为培养用。一次试验至少要分
装两管，其中一管加PHA0.1/mL(50U/mLPHA)另管作为对照用。
2
盖好胶塞，防止漏气，影响培养液的PH值，放37℃温箱培养72小时，加PHA管，可见培养液稍变黄，或
见到细胞凝块现象，不加PHA管则化变不大。每天旋转摇匀二次。
3、培养结束后，离心（1,000转/分）10分钟，倒尽上清液，待管壁残留少量液体回至管底，用毛细滴管吹
打使沉淀细胞分散。吸取一滴细胞悬液，滴在清洁玻片上，用滴管前端作刮片，将细胞液轻轻推向一方，一般大
细胞多在尾部，推完迅速用电扇吹干，待干燥后用姬姆萨氏染料固定染色，用油镜观察计数。
4、染色：用Wright-Giemsa氏染色，染色时，先滴此液数滴，盖满血膜，染1-2分钟，染1-2分钟，再滴
以等量的双蒸馏水，与染色液充分混匀，再经3-5分钟，充分水洗，滤纸吸干，镜检。
5、镜检：可按头，体，尾三部分区域观察。如图1表示的方向进行镜检。
6、结果观察，淋巴细胞加PHA分裂原经培养后，可转化为各种形态的母细胞，掌握其形态特点，在确定淋巴细
胞转化上是个关键问题，用形态学方法判断计数转化率，掌握淋巴细胞的形态学至为重要，应根据细胞大小，核
与胞浆的比例，胞浆的染色性和核结构和核仁的有无等待征进行判别。在淋转试验中，常见的淋巴细胞类有如下
几种：核丝分裂相细胞，淋巴母细胞，成熟淋巴细胞，过渡型淋巴母胞和衰老退化母细胞，各种细胞类型的特征
如下（参见表1）。
表1未转化和转化的淋巴细胞形态特征
转化的淋巴细胞
细胞类别 未转化淋巴细胞
母细胞 过渡型
细胞体积（直径） 12-20或更大 12-16 6-8
大小 增 大 增 大 不增大
胞 染色质 疏 松 疏 松 密 集
核 核仁 清晰可见-4个 有或无 无
有丝分裂 +或- - -
增 多 ++ + -
胞
着 色 嗜 碱 嗜 碱 无青色
空 泡 +或- +或- -
浆
伪 足 +或- +或- -
1、[成熟的淋巴细胞]大小基本一致和末梢血液中未经培养的淋巴细胞相一致。核大类似圆形，匀质，用瑞特一
基姆沙氏染色呈深紫色，原浆大多看不到，看到只在核的一边呈弯月形，染色呈蓝色。
2、[过渡型淋巴细胞]大小比成熟的淋巴细胞稍大，和大淋巴细胞基本一致。核质和成熟的淋巴细胞构造相似或
略有疏松，但具有明显的核仁。这点和成熟淋巴细胞是最明显的区别点，原浆嗜硷但不强。
3、[淋巴母细胞]细胞休积明显增大，约12-20Um，达成熟淋巴细胞的3-4倍，甚至更大，形态不整齐。细胞核
膜清楚核染色质疏松呈细网状结构，核内可见1-4个核仁。胞浆变宽，核与细胞比例变小，胞浆碱性明显增加，
胞浆内有时可见小气泡出现，胞浆边缘个别呈伪足状突起。核较成熟淋巴细胞显著增大，核可达5-12U，核质疏
松，核内有数个明显的核仁和分散的空泡，有的还可看到核有分裂象。
4、[网状细胞样淋巴母细胞]细胞轮廓显著增大，其大小约为成熟淋巴细胞数倍以上，形态很不规则，大致呈阿
米巴样。原浆嗜硷性不强，看起来有透明感。核质构造呈细网状，核仁明显，有一至数个。
有的人也将此类型分为下面两类：
（1）过度型母细胞，它是未曾完全转化的细胞，但已具淋巴母细胞的某些特征，比小淋巴细胞大，约12-16Um，
核染色质变松，有的见有核仁，胞浆增多，嗜碱性也见增强。
（2）核丝分裂相细胞：核体呈现有丝分裂，胞内可见组织染色体数对至数十对。
以上4种类型均属于转化细胞，而下述两种则前者不计入，后者为未转化细胞。
衰老退化母细胞：胞浆已部分或全部破碎，有时仅存细胞核（裸核），这类细胞一般不作计数。
成熟的小淋巴细胞：与正常未培养的淋巴细胞一样，核染色体致密，核与细胞比例大，胞浆为轻度嗜碱性。
上述所见，是淋巴细胞转化过程中最常见的形态变化，总的来说，不外1形态大小变化较成熟淋巴细胞为大，皆
在10-15微米以上；2具有明显的核仁变化，核内的核仁少则1个，多则数个以上，这和大淋巴细胞完全不同的，
所以在镜下看到有此种变化即可认为是转化的一种显著表现；3核和原浆都增大，尤其原浆增大后，细胞呈阿米
巴样，着色淡染；4转化后往往见到核和胞浆有空泡形成，其数目，是随转化程度而逐渐增加，少则1-2个多则
数十个以上，尤其原浆更为明显；5除上述外，还有些淋巴细胞转化后呈多形态样，宛如骨髓片一样，变化多端。
这些都须在实践中不断总结经验，达到确认无误的程度。
每份标本至少计数200个细胞。按下列公式算出转化率：
转化的淋巴细胞数
转化率＝ 转化的淋巴细胞数＋未转化的淋巴细胞数
3
在细胞培养物内，尚见有其他细胞，如多形核白细胞在培养过程不断变性死亡，经72小时后绝大部衰变或死亡
呈碎片，而嗜酸性细胞还有不少残留，此外还可见到单核细胞培养后形态学上与过渡型母细胞易于混淆，必须注
意鉴别。单核细胞培养后形态学上具有如下特点：核与细胞比例较小，且偏在一旁，核染色质校浓集，胞浆呈蓝
灰色或红褐色，浆内有大小不等的颗粒或吞噬物。
一般计算上述各类细胞，数500个，作好转化细胞和非转化细胞分类。转化率以淋巴母细胞加上过渡型都算在内，
正常人转化率在60-80%间。
按头，体尾三段，实际镜检数出的细胞数量往往超出500个以上，数的越多，则转化率计算也越正确。
（三）影响培养结果的几个问题
淋巴细胞培养时各种条件对淋转试验结果影响很大，分别叙述如下：
1、全部操作过程都应严格无菌，这是体外淋巴细胞转化成败的关键问题。
2、培养液：培养液的营养价值越高，转化率相对地较高，转化的淋巴母细胞形态也较典型，核丝分裂也稍多。
所用的199营养液内含20%小牛血清，在培养淋巴细胞转化上可取得很好的成绩。但由于199营养液制备和购买
都不易得到，因此我们开始作淋巴细胞转化时应用同种异体的同型血清或自家血清培养淋巴细胞，在形态上比
199小牛血清培养结果好，适于临床的应用，是一种便于推广的培养液。但也有报告，个别情况下，同种异体血
清中有某种抑制转化的因子存在，所以在选择血清上也要注意。
培养液的PH：过酸或过碱均会影响细胞生长而降低转化率，最适PH为7.2-7.4。最好用HePeS缓冲剂，它是N-2-
羟乙基-呱嗪-N’-2-乙基磺酸（N-2-hydroxy-piperazine-N’-2-ethanesulphonic acid）的缩写，其分子有磺
酸基和氨基，在P7.2时的缓冲能力很强。它的结构稳定，可以高压灭菌，在培养液中的一般用量为
10-25mM(2.38-5.95mg/mL)，用氢氧化钠溶液调至所需PH。
培养液液面：为使细胞有足够的氧气以维持其新陈代谢，细胞与培养液的接触面要大。培养容器以斜放为宜。
添加的血清：培养液中一般加20%小牛血清。有些实验室用AB型人血浆。如不用血清或血浆，淋巴细胞只对强
有促有丝分裂素有反应，而对有些抗原无反应。但小牛血清也能带入一些抑制或促进细胞生长的物质，并且每批
小牛血清成分并不完全相同，对实验的正确性和重复性有一定影响。尤其用特异性抗原作刺激剂时，本来的反应
较慢，从而更易于受干扰。用全血培养可以省去小牛血清并不影响结果。
3、PHA浓度：PHA可促进淋巴细胞转化形成母细胞，其机制尚不清楚。但加的过多或少都能影响结果，所以PHA
用前必须测定。我们将自制的PHA用兔血球凝集试验测定，定出使用单位，用每毫升50个单位，1ml培养液中
加0.1ml，经多次试验在72小时左右可使淋巴细胞转化达到满意的结果。
4、红细胞：用3%明胶分离淋巴细胞是便于推广的一种方法。操作中应小心地吸取上层液中白细胞，避免混入大
量的红细胞，但无论如何小心，仍有多量的红细胞混入其中，一般来说，对淋巴细胞的转化影响不大。
5、培养时间：在一定限度内，时间越长，转化率越高。但用PHA激发，培养超过4-5天，转化率而下降，通用
培养时间为72小时。如果特异性抗原作为刺激剂，要连续培养5-7天。
6、实验条件尽量固定，若改变条件，尤其培养液，PHA，小牛血清等等，都应预先做好预备试验，找好条件，再
进入正式试验。
7、涂片和计数方法：取细胞作涂片时，特别是全血标本，必须注意将管内细胞扩散。吸取上层细胞作推片，结
果易偏高，因为大的细胞离心后居上层者为多。推片染色后的计数法对转化率的影响极大。一般愈近推片梢部，
淋巴细胞或转化细胞愈多，愈近涂片根部转化细胞愈少，甚至没有。因此，计数时应先行鸟瞰，然后取玻片的前，
中后三段计数或作城墙开计数以提高准确性。
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